CN109957622A - 一种检测鸭传染性浆膜炎的rpa-lfd可视化试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测鸭传染性浆膜炎的RPA‑LFD可视化试剂盒及其应用；所述试剂盒包含RPA‑LFD引物对和探针，所述引物对的上游引物、下游引物，探针序列依次如SEQ ID NO.1～3所示；其中，下游引物5’端用生物素Biotin标记；探针5’端用羧基荧光素FAM标记，3’端用C3‑Spacer修饰，且离5’端第32位碱基被四氢呋喃替代。所述试剂盒将RPA技术结合核酸试纸条技术用于检测鸭疫里氏杆菌，可以在常温等温条件下扩增、试纸条可视化检测，不需要PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、电泳槽等复杂的仪器设备，且RPA不需要复杂的样品处理，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。

Description

一种检测鸭传染性浆膜炎的RPA-LFD可视化试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及预防兽医学检验技术领域，具体地，涉及一种检测鸭传染性浆膜炎的试剂盒及其应用，更具体地，涉及一种检测鸭疫里氏杆菌的RPA-LFD可视化试剂盒及其应用。

背景技术

鸭传染性浆膜炎(Infectious serositis of duck)是由鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起的鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种接触性、败血性传染病。目前，RA已呈全球性分布，在有一定规模的养鸭地区几乎都有鸭传染性浆膜炎的发生，这是造成养鸭业经济损失的主要病原菌之一。

RA属于黄杆菌科、里氏杆菌属，是革兰阴性小杆菌，无芽孢，不能运动，有荚膜，瑞氏染色呈两极浓染。多为单个存在，少数成对排列。菌体宽0.2mm～0.4mm，长1mm～5mm。基因组大小约为2309519bp。

初次分离可将肝、脑等病料接种于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)或巧克力琼脂平板，在含有5％～10％的二氧化碳环境中培养，生成的菌落表面光滑、稍凸起、圆形，直径1mm～1.5mm。RA不能在普通琼脂与麦康凯培养基上生长，在血琼脂上不产生溶血。室温下大多数菌株在固体培养基上存活3d～4d，4℃条件下，肉汤培养物可存活2～3周。

RA主要感染雏禽，感染率有时可达90％以上，病死率受饲养管理、卫生条件及其他应激因素的影响，差异很大。发病和带菌禽类是本病的主要传染源；呼吸道、消化道和损伤的皮肤是本病的主要传播途径。本病一年四季均可发生，往往伴随育雏季节出现较多发病。

临床症状特点为眼和鼻有分泌物、排绿色稀粪，共济失调和抽搐。病变特征是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪样输卵管炎等。

目前RA有血清学诊断方法与分子生物学检测方法，其中血清学检测方法包含凝集试验、琼脂糖凝胶免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验、荧光抗体技术。凝集试验鉴定具有简单快捷的特性，用于血清分型及生化特性的分辨，试管凝集虽然操作繁琐但能够准确鉴定血清型与测定抗体效价；琼脂糖凝胶免疫扩散试验是在电解质参与的条件下抗原抗体在琼脂糖胶内发生反应并形成肉眼可见的沉淀，可检测到10种RA血清型并将其分为5个亚型；酶联免疫吸附试验可以检测RA的效价、分离纯化RA抗原与RA全菌裂解物，其检测靶标为脂多糖、菌体超声破裂解物及协同溶血素基因融合蛋白；荧光抗体技术分为直接荧光技术与间接荧光技术，使用直接荧光技术鉴定只能鉴定到6株RA分离株，间接免疫荧光具有良好的特异性及敏感性，目前有能够用于RA急性死亡病例的快速诊断，但异种血清型之间的反应强度具有明显的差异。RA的分子生物学检测技术包含PCR技术与荧光定量PCR技术。PCR技术具有特异性强、灵敏度高、操作简单的优势，RA的PCR检测方法多以16S rRNA在所有生物体中高度保守，该基因通常确定细菌间的系统发育关系；荧光定量PCR用于病原的定性与定量检测。

上述所述的传统检测方案确实已经发展成熟，也符合准确、结果可靠的要求，但大都存在着特异性与敏感性差、操作繁琐、费时费力等缺点，实际操作费时费力且敏感度低，不能满足兽医临床现场检测的需要，需求昂贵的仪器，具有一定的局限性。为了更好的诊断和监测该病，研制一种快速、简便、准确的检测方法迫在眉睫。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足和缺陷，提供一种用于检测鸭疫里氏杆菌的RPA-LFD引物对和探针，可以快速、简便且准确的检测鸭疫里氏杆菌。

本发明的另一目的在于提供一种检测鸭传染性浆膜炎的RPA-LFD检测试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种检测鸭疫里氏杆菌的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种用于检测鸭疫里氏杆菌的RPA-LFD引物对和探针，所述引物对的上游引物、下游引物，探针序列依次如SEQ ID NO.1～3所示；其中，下游引物5’端用生物素Biotin标记；探针5’端用羧基荧光素FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且离5’端第32位碱基被四氢呋喃替代。具体地，所述序列如下所示：

上游引物：AAAACTTGGTAACTCCGAGGTGTCTGGTGC(SEQ ID NO.1)

下游引物：(Biotin)AGTTTACCAGGTAGTCCCGCTCCTCCCATA(SEQ ID NO.2)

探针：(6-FAM)-ATGCTTACCAACTTCCTAGAAGAAAACCCAA-(THF)-CGAGGCTAAACAGA-C3Spacer(SEQ ID NO.3)。

本发明针对鸭疫里氏杆菌gyr B基因设计了一系列RPA-LFD扩增引物，最终筛选到上述RPA-LFD引物对和探针，所述引物对和探针特异性好，可以区分鸭疫里氏杆菌与家禽其他常见病原如大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等；灵敏度高，能够将痕量的核酸模板扩增到可以检测的水平，可检测到48fg含量的DNA模板。

本发明还请求保护所述RPA-LFD引物对和探针在制备鸭传染性浆膜炎检测试剂盒中的应用。

一种检测鸭传染性浆膜炎的RPA-LFD可视化试剂盒，包含上述RPA-LFD引物对和探针。

优选地，所述RPA-LFD反应体系为：水解缓冲液29.5μL，ddH₂O 9.2μL，10μM上游引物2.1μL，10μM下游引物2.1μL，10μM探针0.6μL，模板4μL，PRA冻干酶粉5mg，280mM醋酸镁2.5μL，共50μL。

优选地，所述RPA-LFD反应程序为25～40℃下反应20～40min。

更优选地，所述RPA-LFD反应程序为37℃下反应20min。

优选地，所述试剂盒还包含重组酶聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液、醋酸镁溶液和核酸检测试纸条。

更优选地，所述水解缓冲液为Rehydration Buffer。

更优选地，所述醋酸镁溶液为280mM醋酸镁溶液。

更优选地，所述核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。

优选地，所述试剂盒还包括全封闭式靶核酸快速检测装置，所述全封闭式靶核酸快速检测装置通过将核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到。

优选地，所述试剂盒还包含阴性对照模板和/或阳性对照模。

本发明还请求保护上述RPA-LFD引物对和探针或RPA-LFD检测试剂盒在检测鸭疫里氏杆菌中的应用。

一种检测鸭疫里氏杆菌的方法，包括如下步骤：

S1.提取待测样品DNA；

S2.以步骤S1的DNA为模板，采用上述引物对和探针进行PPA-LFD反应；

S3.根据步骤S2的检测结果进行结果判定。

优选地，步骤S2所述PPA-LFD反应具体为：

S1.以步骤S1的DNA为模板，采用上述引物对和探针配制反应体系：将2.1μL10μM上游引物、2.1μL 10μM下游引物、0.6μL 10μM探针、29.5μL水解缓冲液、4μL待检测样品DNA和水混匀，涡旋并离心后添加至冷冻干燥的重组酶聚合酶冻干酶粉里面，反复吹打混匀，然后加入2.5μL醋酸镁溶液得到50μL反应混合物；

S2.将步骤S1中得到的反应混合物25～40℃下反应20～40min；

S3.将步骤S2恒温反应后的产物用核酸检测试纸条进行检测，2～5min后观察结果。

具体地，所述结果判断标准为：

阴性：试纸条质控区(C线)出现一条红色条带，检测区(T线)没有条带。阴性结果表明样本中不含目的核酸片段，或其数量低于试纸条的最低检测限；

阳性：试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区(C线)，一条位于检测区(T线)。阳性结果表明样本中含有待检测的核酸片段，且其数量达到或高于试纸条的最低检出量，即所检测的样本感染了鸭疫里氏杆菌；

无效：试纸条质控区(C线)和检测区(T线)均未出现条带，提示所用的试纸条和反应试剂可能已经损坏、失效或者操作有误。

本发明的鸭传染性浆膜炎检测试剂盒的反应原理为：

重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)是一个在重组酶聚合酶介导下，模拟生物体内DNA复制过程的等温扩增技术。具有操作简便、反应时间短、特异性强、敏感性高的特点，于37℃～39℃，恒温反应20min即可对目的片段完成扩增。

重组酶聚合酶等温扩增技术是被称为可以替代PCR的核酸检测技术。其扩增原理是，重组酶与引物结合形成复合物后，寻找匹配的DNA同源序列，紧密结合发生重组，在单链DNA结合蛋白的作用下，模板DNA开始解链，引物与模板DNA配对，在bsu DNA聚合酶的作用下复制延伸，对目的片段进行指数级扩增。RPA与PCR不同，整个过程仅需要在37℃～39℃等温条件下反应15min～20min即可得到扩增产物，不需要高温变性和退火的过程，整个反应简单、快速、高效。RPA反应可以在水浴锅或者直接用人体温进行加热，反应结束后可直接通过侧向流动层析试纸条读取检测结果。

在整个反应体系中，需要生物素标记的反向引物和羧基荧光素(FAM)标记的特异性探针，该探针5'端进行抗原标记FAM，3'端标记聚合酶延伸封闭基团C3-spacer，在距羧基荧光基团约30个碱基处有一个四氢呋喃脱碱基位点(tetrahydrofuran abasic-sitemimic，THF)该位点可被大肠杆菌核酸外切酶Nfo识别并进行切割，产生自由的羟基末端，然后便在DNA聚合酶的作用下延伸。此时形成的扩增产物为5'端含有6-FAM，3'端含有生物素的二元复合物。将经RPA扩增后的产物用于核酸试纸条检测，基于抗原抗体免疫反应，含有FAM-Biotin双标记扩增子与抗FAM抗体的金标颗粒结合成三元复合物，该复合物在免疫层析试纸条上自下由上进行扩散，当扩散到标有生物素抗体的检测线上时，该复合物即被捕获并显色，其他未被捕获的探针和金标颗粒标记的抗FAM的抗体形成的不含生物素的两元复合物继续向上扩散，当扩散至被标记有羊抗FAM抗体的质控线时被捕获显色。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明针对鸭疫里氏杆菌gyr B基因设计、筛选获得了SEQ ID NO.1～3所示的RPA-LFD引物对和探针，所述引物对和探针特异性好，可以区分鸭疫里氏杆菌与家禽其他常见病原如大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等；灵敏度高，能够将痕量的核酸模板扩增到可以检测的水平，本发明所建立的检测方法可检测到48fg含量的DNA模板，可以检测到重组质粒的最低检测限达10²拷贝/反应，且重复性好。

(2)本发明采用RPA-LFD建立了快速检测鸭疫里氏杆菌的方法，通过特异性和灵敏度评价，可用于现场临床检测，为鸭疫里氏杆菌的现场检测提供了一种灵敏、可靠的新方法。

(3)本发明采用一次性核酸检测装置为全封闭式靶核酸扩增产物快速检测装置。核酸试纸条使用时核酸产物的交叉污染以及外泄容易造成假阳性的发生，采用全封闭式靶核酸扩增产物快速检测装置，避免了气溶胶的扩散污染。

(4)本发明的检测方法与PCR相比，不用经过变性、退火、延伸三个步骤，在常温下20min左右即可完成反应。不需要复杂的仪器设备，适合于现场检测；可以在常温等温条件下扩增、试纸条可视化检测，不需要PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、电泳槽等复杂的仪器设备，且RPA不需要复杂的样品处理，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。

附图说明

图1为本发明鸭疫里氏杆菌RPA-LFD检测方法建立结果图，分别表示为1：ddH₂O(空白对照)；2：鸭疫里氏杆菌(阳性)。

图2为本发明鸭疫里氏杆菌RPA-LFD检测方法反应温度优化结果图，分别表示为1：ddH₂O(空白对照)；2：35℃；3：36℃；4：37℃；5：38℃；6：39℃；7：40℃。

图3为本发明鸭疫里氏杆菌RPA-LFD检测方法反应时间优化结果图，分别表示为1：ddH₂O(空白对照)；2：10min；3：15min；4：20min；5：25min；6：30min；7：35min；8：40min。

图4为本发明鸭疫里氏杆菌RPA-LFD检测试剂盒的特异性实验结果图，图中1～7的模板分别为1：ddH2O(空白对照)；2：RA(阳性对照)；3：大肠杆菌；4：巴氏杆菌；5：沙门氏菌；6：葡萄球菌。

图5为本发明鸭疫里氏杆菌RPA-LFD检测方法DNA含量敏感性试验结果图，DNA的初始浓度为237.3μg/mL，然后进行10倍倍比稀释，取2μL作为模板。分别表示为1：ddH₂O(空白对照)；2：237.3μg/mL；3：23.73μg/mL；4：2.373μg/mL；5：0.2373μg/mL；6：0.2373×10^-1μg/mL；7：0.2373×10^-2μg/mL；8：0.2373×10^-3μg/mL；9：0.2373×10^-4μg/mL；10：0.2373×10^-5μg/mL。

图6为鸭疫里氏杆菌的PCR检测方法DNA含量敏感性试验结果图，DNA的初始浓度为237.3μg/mL，然后进行10倍倍比稀释。分别表示为1：ddH₂O(空白对照)；2：237.3μg/mL；3：23.73μg/mL；4：2.373μg/mL；5：0.2373μg/mL；6：0.2373×10^-1μg/mL；7：0.2373×10^-2μg/mL；8：0.2373×10^-3μg/mL；9：0.2373×10^-4μg/mL；10：0.2373×10^-5μg/mL。

图7为本发明鸭疫里氏杆菌RPA-LFD检测方法的重组质粒拷贝数敏感性分析，将拷贝数为10¹⁰拷贝/μL的重组质粒作为初始浓度，然后进行10倍梯度稀释。分别表示为1：ddH₂O(空白对照)；2：10¹⁰拷贝/反应；3：10⁹拷贝/反应；4：10⁸拷贝/反应；5：10⁷拷贝/反应；6：10⁶拷贝/反应；7：10⁵拷贝/反应；8：10⁴拷贝/反应；9：10³拷贝/反应；10：10²拷贝/反应；11：10¹拷贝/反应。

图8为鸭疫里氏杆菌的PCR检测方法的重组质粒拷贝数敏感性分析，将拷贝数为10¹⁰拷贝/μL的重组质粒作为初始浓度，然后进行10倍梯度稀释。分别表示为1：ddH2O(空白对照)；2：10¹⁰拷贝/反应；3：10⁹拷贝/反应；4：10⁸拷贝/反应；5：10⁷拷贝/反应；6：10⁶拷贝/反应；7：10⁵拷贝/反应；8：10⁴拷贝/反应；9：10³拷贝/反应；10：10²拷贝/反应；11：10¹拷贝/反应。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

TwistAmp nfo Kit购自英国TwistDX公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；提取病毒DNA/RNA试剂盒购自OMEGA Bio-Tek公司；M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、2×Taq PCR Mix DNA聚合酶、随机引物、dNTP(2.5mM)、琼脂糖购自TakaRa公司；全封闭式靶核酸扩增产物快速检测装置购自杭州优思达生物技术有限公司。

实施例1鸭疫里氏杆菌扩增RPA-LFD引物及探针的设计和筛选

发明人通过对来自于Genbank中的鸭疫里氏杆菌gyr B基因的CP007204.1、JN969059.1、CP003787.1、CP029760.1、CP007503.1的同源序列进行比对分析，确定鸭疫里氏杆菌gyrB基因的保守区域，并以此作为RPA引物设计的模板。根据RPA引物设计原则，针对该区域设计了多对RPA-LFD引物和探针，以期能够检测到尽可能多的鸭疫里氏杆菌。为了建立一种快速、敏感的检测方法，需要进行多次引物的筛选，引物个别碱基差异会对扩增效果产生影响，所以，在保守基因区域，设计一系列梯度候选物，两两组合从中选择最佳引物。

RPA探针设计遵循以下原则：探针5’端标记FAM基团，中间THF替代G或C(dSpacer)，且dSpacer两侧尽量避免G、C，dSpacer距5’端至少30个碱基，距3’端至少15个碱基，3’端修饰C3-spacer。

最终，发明人筛选获得了最佳的RPA-LFD引物和探针，在筛选出的最佳引物中，将探针相对应的引物的5’标记生物素(Biotin)。RPA-LFD反应体系中引物与探针核苷酸序列如下所示：

上游引物：AAAACTTGGTAACTCCGAGGTGTCTGGTGC(SEQ ID NO.1)

下游引物：(Biotin)AGTTTACCAGGTAGTCCCGCTCCTCCCATA(SEQ ID NO.2)

探针：(6-FAM)-ATGCTTACCAACTTCCTAGAAGAAAACCCAA-(THF)-CGAGGCTAAACAGA-C3Spacer(SEQ ID NO.3)。

实施例2鸭疫里氏杆菌RPA-LFD反应

1、细菌DNA抽提

(1)取＜3mL的菌液，4,000xg离心10min,弃上清；

(2)加100μL TE buffer悬浮菌体(吸打或涡旋)，加10μL lysozyme solution(50mg/mL)，混匀，37℃孵育10min；

(3)(选做)若是革兰氏阳性菌，加25mg Glass Powder高速涡旋5min，转移上清液至1.5mL离心管；

(4)加100μL Buffer BTL，20μL Proteinase K solution，涡旋混匀，55℃孵育不超过1h(一般30min)；

(5)加5μL RNase A，混匀，室温放置5min；

(6)10,000xg离心2min，转移上清到一新的1.5mL离心管；

(7)加220μL Buffer BDL，混匀，65℃孵育10min；

(8)加220μL无水乙醇，混匀；

(9)转移混合液到套着2mL收集管的HiBind DNA Mini column中，10,000xg离心1min，弃滤液；

(10)加500μL HBC Buffer到柱子中，10,000xg离心1min，弃滤液；

(11)加700μL DNA Wash buffer到柱子中，10,000xg离心1min，弃滤液；

(12)重复步骤(11)；

(13)将柱子重新套回2mL离心管，12,000xg离心2min；

(14)将柱子转移到一新的1.5mL离心管，加50-100μL 65℃预热的Elution Buffer到柱子基质上，室温放置3-5min，10,000xg离心1min；

(15)重复步骤14，滤液可收集到同一离心管中。

2、RA RPA-试纸条检测体系的建立

具体操作步骤如下：

①以ddH₂O作为阴性对照，以细菌DNA为模板作为阳性对照，分别加入下列组分：29.5μL水解缓冲液(rehydration buffer)，9.2μL的ddH₂O，2.1μL上游引物(10μM)，2.1μL下游引物(10μM)，0.6μL探针(10μM)，4μL模板；

②将上述47.5μL混合液转移到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAMP Nfo Kit反应管中，经移液器反复吹打直至完全溶解；

③加入2.5μL的280mM的醋酸镁溶液，反应即刻发生；

④将反应管放入37℃的水浴中；

⑤反应5min后，取出反应管，上下颠倒混匀，短暂离心后继续放入37℃水浴中反应15min；

⑥反应结束后，用核酸试纸条密闭反应装置进行检测，通过试纸条的显色进行结果判定。检测结果的判定：试纸条上质控线和检测线都出现红色条带的为阳性样品；仅在质控线上出现红色条带的为阴性样品。试验结果如图1所示。表明成功建了了鸭疫里氏杆菌RPA-LFD反应体系。

实施例3鸭疫里氏杆菌RPA-LFD检测方法反应条件的优化

(1)首先，我们确定RPA-LFD检测方法的最佳反应温度，我们分别试验了在35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃不同温度下的反应，并且将反应时间设定为20min。试验结果如图2所示，在37℃条件下检测线显色最亮即反应产物的量最多。表明该试验的最佳反应温度为37℃，因此，我们选择37℃作为该检测方法的反应温度。

(2)其次，我们确定在37℃条件下，不同的孵育时间对于扩增结果的影响，我们试验了10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min的实验结果，试验结果如图3所示，在扩增10min和15min的时候，试纸条上出现了微弱的条带；当反应时间在20min～40min之间时试纸条带上没有出现可观测的差异。因此，我们选择20min作为该检测方法的反应时间。

实施例4鸭疫里氏杆菌RPA-LFD检测方法特异性分析

使用鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌做病原特异性分析实验。反应体系如实施例2所述，反应条件为确定的优化条件，扩增产物使用全封闭式靶核酸检测装置进行检测，试验结果如图4所示：仅以RA核酸为模板的阳性对照组出现两条红色条带，一条位于质控区，另一条位于检测区；其余均是只在质控区出现一条红色条带。表明该检测方法特异性良好，可以有效区分鸭疫里氏杆菌与家禽其他常见病原。

实施例5鸭疫里氏杆菌RPA-LFD检测方法敏感性分析

对所建立的RA RPA核酸试纸条检测方法与传统的RA PCR方法进行DNA含量敏感性分析和重组质粒拷贝数敏感性分析；所述RA PCR的引物为：

上游引物：5’-TTCACGGTGTAGGGGTTTCA-3’(SEQ ID NO.4)；

下游引物：5’-CCATAGGAGATTTACGCTGT-3’(SEQ ID NO.5)。

(1)RA RPA核酸试纸条检测方法的DNA含量敏感性分析

将初始浓度为237.3μg/mL的RA DNA进行10倍倍比稀释，然后以此作为模板，进行RPA核酸试纸条和PCR琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图5显示：RARPA核酸试纸条检测方法最低检测限达47.46fg，与常规PCR检测方法(图6)相比，敏感性高两个数量级。表明，RA RPA核酸试纸条检测方法敏感性更高，而且用核酸试纸条进行检测，操作方便，节省时间，结果直观，肉眼可读。

(2)RA RPA-LFD检测方法的重组质粒拷贝数敏感性分析

将拷贝数为10¹⁰拷贝/μL的重组质粒作为初始浓度，10倍梯度稀释后，分别用PCR琼脂糖凝胶电泳法和RPA-LFD方法进行检测。结果显示，常规PCR琼脂糖凝胶电泳法(图8)可以检测到重组质粒的最低检测限达10⁴拷贝/反应，RPA-LFD检测方法(图7)可以检测到重组质粒的最低检测限达10²拷贝/反应。两者相比，RA RPA-LFD检测方法的敏感性更高。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种检测鸭传染性浆膜炎的RPA-LFD可视化试剂盒及其应用

<141> 2019-03-27

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 鸭传染性浆膜炎(Infectious serositis of duck)

<400> 1

aaaacttggt aactccgagg tgtctggtgc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 鸭传染性浆膜炎(Infectious serositis of duck)

<400> 2

agtttaccag gtagtcccgc tcctcccata 30

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 鸭传染性浆膜炎(Infectious serositis of duck)

<400> 3

atgcttacca acttcctaga agaaaaccca aaggctaaac aga 43

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 鸭传染性浆膜炎(Infectious serositis of duck)

<400> 4

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<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 鸭传染性浆膜炎(Infectious serositis of duck)

<400> 5

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Claims (10)

1.一种用于检测鸭疫里氏杆菌的RPA-LFD引物对和探针，其特征在于，所述引物对的上游引物、下游引物，探针序列依次如SEQ ID NO.1～3所示；其中，下游引物5’端用生物素Biotin标记；探针5’端用羧基荧光素FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且离5’端第32位碱基被四氢呋喃替代。

2.权利要求1所述的RPA-LFD引物对和探针在制备鸭传染性浆膜炎检测试剂盒中的应用。

3.一种检测鸭传染性浆膜炎的RPA-LFD可视化试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述RPA-LFD引物对和探针。

4.根据权利要求3所述的RPA-LFD可视化试剂盒，其特征在于，所述RPA-LFD反应体系为：水解缓冲液29.5μL，ddH₂O 9.2μL，10μM上游引物2.1μL，10μM下游引物2.1μL，10μM探针0.6μL，模板4μL，PRA冻干酶粉5mg，280mM醋酸镁2.5μL，共50μL。

5.根据权利要求3所述的RPA-LFD可视化试剂盒，其特征在于，所述RPA-LFD反应程序为25～40℃下反应20～40min。

6.根据权利要求3所述的RPA-LFD可视化试剂盒，其特征在于，还包含重组酶聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液、醋酸镁溶液和核酸检测试纸条。

7.根据权利要求3所述的RPA-LFD可视化试剂盒，其特征在于，还包含阴性对照模板和/或阳性对照模。

8.权利要求1所述的RPA-LFD引物对和探针或权利要求3所述RPA-LFD可视化试剂盒在检测鸭疫里氏杆菌中的应用。

9.一种检测鸭疫里氏杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取待测样品DNA；

S2.以步骤S1的DNA为模板，采用权利要求1所述引物对和探针进行PPA-LFD反应；

S3.根据步骤S2的检测结果进行结果判定。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，步骤S2所述PPA-LFD反应具体为：

S1.以步骤S1的DNA为模板，采用权利要求1所述引物对和探针配制反应体系：将2.1μL10μM上游引物、2.1μL 10μM下游引物、0.6μL 10μM探针、29.5μL水解缓冲液、4μL待检测样品DNA和水混匀，涡旋并离心后添加至冷冻干燥的重组酶聚合酶冻干酶粉里面，反复吹打混匀，然后加入2.5μL醋酸镁溶液得到50μL反应混合物；

S2.将步骤S1中得到的反应混合物25～40℃下反应20～40min；

S3.将步骤S2恒温反应后的产物用核酸检测试纸条进行检测。