CN106086209B - 一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒。所述试剂盒中包括flhB基因检测引物，所述flhB基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。本发明的试剂盒能快速高通量鉴定鸡白痢/伤寒沙门菌，可作为沙门菌传统血清学分型的辅助方法，并为鸡白痢/伤寒沙门菌的监测与实验室诊断提供了一种简单快速、重复性好的新方法。

Description

一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒。

背景技术

沙门菌病是公共卫生学上有重要意义的传染病之一，其病原沙门菌属于肠杆菌科，蛋、家畜和肉制品是主要传播媒介，可引起多种畜禽疾病，造成全身性败血症和肠炎。鸡白痢和鸡伤寒分别是由鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌引起的，鸡白痢沙门菌主要感染2～3周龄的雏鸡，引起白色下痢，病死率较高，而成年鸡感染后病死率较低，但可长期带毒排毒。鸡伤寒沙门菌对雏鸡、成年鸡均可致病，以引起贫血、白细胞增多、出血为特征。因而，鸡白痢/伤寒沙门菌是我国养鸡业中危害严重的细菌。目前，根据Kauffman-White(K-W)血清型分型方法，依据沙门菌菌体抗原及鞭毛抗原的不同，沙门菌目前的血清型有2600种以上，中国已报道了292种不同的血清型，分属于35个O群。

传统的检测方法即非选择性和选择性增菌、生化特性及血清学鉴定很费力、耗时，需4-7天才能完成，其它如抗体检测法，虽然快速，但其高假阳性使之不适于常规检测。因此，急需一些快速、特异、敏感的检测方法，以及时发现鸡白痢和鸡伤寒沙门菌，这对于鸡白痢和鸡伤寒的有效防控意义重大。

发明内容

针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒及其制备和应用。

为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括flhB基因检测引物，所述flhB基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

本发明的试剂盒采用PCR检测技术进行flhB基因检测，根据扩增及检测情况可分析判断检测对象是否属于鸡白痢/伤寒沙门菌。因此，引物的设计是本发明试剂盒的关键。

基于本发明所述试剂盒是采用PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：无菌水(ddH₂O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR检测液。

所述PCR检测液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR检测液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有无菌水(ddH₂O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶。加入本发明的引物、待检样本DNA提取物或者样本菌液即可获得PCR反应体系。

优选地，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有鸡白痢/伤寒沙门菌flhB基因表达的DNA样本。

优选地，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为非鸡白痢/伤寒沙门菌的DNA样本。

本发明的第二方面，提供了前述快速鉴定鸡白痢/伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述flhB基因检测引物；

(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；

(4)PCR反应结束后，分析结果。

优选地，所述方法为非疾病诊断目的的方法。

步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。

优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：(a)94℃5min；(b)94℃45s；(c)55℃45s；(d)72℃30s，步骤(b)～(d)循环30次，(e)72℃10min。

本发明的第三方面，提供了前述试剂盒在制备flhB基因检测产品中的用途。

优选地，所述检测产品用于检测和筛选鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过广泛而深入的研究，首次报道鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB基因与其它血清型沙门菌flhB基因的差异，即鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB基因的内部缺少197bp的核苷酸序列，以特异性引物通过PCR技术验证了flhB基因在不同血清型沙门菌及其它细菌中的分布及片段大小。本发明的试剂盒能快速高通量鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌，可作为沙门菌传统血清学分型的辅助方法，并为鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的监测与实验室诊断提供了一种简单快速、重复性好的新方法。

附图说明

图1：为在NCBI全基因组数据库中Blastn搜索肠炎沙门菌flhB基因；其中，“Description”为含有flhB基因的细菌名称，“Query cover”为搜索到的基因占目标基因全长的覆盖比率，“Ident”为flhB基因核苷酸序列的相似性，红框表示仅有鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB基因缺少一段核苷酸序列。

图2：为鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB基因与其它血清型沙门菌flhB基因的差异示意图；其中，SP为鸡白痢沙门菌，SG鸡伤寒沙门菌。红色箭头表示flhB引物位置，鸡白痢和鸡伤寒沙门菌扩增的目的条带为182bp，而非鸡白痢和鸡伤寒沙门菌扩增的目的条带为379bp。

图3：为PCR鉴定flhB基因在不同血清型沙门菌和其它细菌中的分布和片段大小图片；其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道C50041、C50336、SL5928、T3、T9、T8、G2、ZX、Y7、Y8和C500为：flhB基因片段(379bp处有目的条带)，泳道S06004、9855和SG9为：flhB基因片段(182bp处有目的条带)；C50041和C50336为肠炎沙门菌，S06004和6508为鸡白痢沙门菌，SG9为鸡伤寒沙门菌，SL5928为都柏林沙门菌，T3为乌干达沙门菌，T9为火鸡沙门菌，T8为鸭沙门菌，G2为伦敦沙门菌，ZX为罗森沙门菌，Y7为德尔卑沙门菌，Y8为鼠伤寒沙门菌，C500为猪霍乱沙门菌；H37Rv为结核分枝杆菌，11168和110为空肠弯曲菌，S19为布鲁氏菌，EGDe和JS15为李斯特菌，1314和1352为大肠杆菌。

图4：为鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒灵敏度；其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道1-8为鸡白痢沙门菌S06004基因组，浓度依次为58.5ng/μl、5.85ng/μl、585pg/μl、58.5pg/μl、5.85pg/μl、585fg/μl、58.5fg/μl、5.85fg/μl。

图5：为PCR鉴定鸡场分离的1～24株沙门菌样品中的鸡白痢和鸡伤寒沙门菌，其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道1～24为鸡场分离的沙门菌；可扩增出182bp flhB目的条带的泳道为鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1生物信息学方法鉴定flhB基因的分布

在NCBI中使用Blastn在线比对软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在全基因组数据库中搜索flhB基因，搜索结果表明所有鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB基因的内部缺少197bp的核苷酸序列，其基因长度是其它血清型沙门菌flhB长度的83％(图1)。

鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

GTGGCAGAAGAGAGCGACGACGACAAAACAGAAGCCCCCACACCCCACCGACTTGAAAAAGCGCGGGAAGAAGGGCAGATCCCCCGTTCCAGAGAACTGACCTCACTGCTGATATTGCTGGTGGGCGTTTGTATTATTTGGTTCGGCGGCGAGTCGTTAGCGCGGCAACTGGCGGGAATGCTCTCAGCAGGCCTGCACTTCGATCACCGTATGGTGAACGATCCTAACCTGATCCTGGGGCAGATAATTTTGCTGATTAAAGCGGCGATGATGGCACTGCTACCGCTCATCGCGGGCGTGGTACTGGTGGCGCTTATCTCGCCGGTTATGCTTGGCGGCCTGATTTTTAGCGGTAAGTCGCTACAGCCAAAATTTTCTAAATTAAACCCGCTGCCGGGAATTAAGCGCATGTTTTCGGCGCAGACCGGCGCGGAACTGCTAAAAGCGGTGTTGAAATCCACGCTGGTCGGCTGCGTTACCGGCTTTTATCTCTGGTATCACTGGCCACAAATGATGCGCCTGATGGCGGAGTCGCCGATCGTCGCAATGGGGAATGCGCTGGATCTGGTTGGACTCTGCGCGTTACTGGTGGTACTGGGCGTGATTCCGATGGTGGGATTTGACGTGTTTTTCCAGATCTTTAGCCACCTGAAAAAATTACGCATGTCGCGGCAGGACATTCGCGACGAATTTAAAGAGAGCGAAGGCGATCCGCATGTTAAGGGCAAAATTCGCCAGATGCAACGCGCCGCCGCTGGCGCGGGCATTATATCGCCACGCCGAAATCGGTCAGCAAATTCCCGGGCAGTTATATGCTGCCGTTGCGGAAGTGTTGGCCTGGGTCTGGCAGCTTAAACGCTGGCGGCTTGCGGGCGGGCAACGTCCTCCACAACCTGAGAACCTTCCGGTGCCAGAAGCGCTGGATTTTATGAACGAGAAGAATACTGATGGCTAA。

非鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

GTGGCAGAAGAGAGCGACGACGACAAAACAGAAGCCCCCACACCCCACCGACTTGAAAAAGCGCGGGAAGAAGGGCAGATCCCCCGTTCCAGAGAACTGACCTCACTGCTGATATTGCTGGTGGGCGTTTGTATTATTTGGTTCGGCGGCGAGTCGTTAGCGCGGCAACTGGCGGGAATGCTCTCAGCAGGCCTGCACTTCGATCACCGTATGGTGAACGATCCTAACCTGATCCTGGGGCAGATAATTTTGCTGATTAAAGCGGCGATGATGGCACTGCTACCGCTCATCGCGGGCGTGGTACTGGTGGCGCTTATCTCGCCGGTTATGCTTGGCGGCCTGATTTTTAGCGGTAAGTCGCTACAGCCAAAATTTTCTAAATTAAACCCGCTGCCGGGAATTAAGCGCATGTTTTCGGCGCAGACCGGCGCGGAACTGCTAAAAGCGGTGTTGAAATCCACGCTGGTCGGCTGCGTTACCGGCTTTTATCTCTGGTATCACTGGCCACAAATGATGCGCCTGATGGCGGAGTCGCCGATCGTCGCAATGGGGAATGCGCTGGATCTGGTTGGACTCTGCGCGTTACTGGTGGTACTGGGCGTGATTCCGATGGTGGGATTTGACGTGTTTTTCCAGATCTTTAGCCACCTGAAAAAATTACGCATGTCGCGGCAGGACATTCGCGACGAATTTAAAGAGAGCGAAGGCGATCCGCATGTTAAGGGCAAAATTCGCCAGATGCAACGCGCCGCCGCGCAGCGCCGCATGATGGAAGATGTGCCGAAAGCGGACGTCATTGTCACTAACCCGACGCACTATTCCGTGGCGCTGCAGTATGACGAAAACAAAATGAGCGCGCCGAAAGTGGTCGCGAAGGGGGCTGGATTAATAGCGCTGCGCATTCGCGAGATCGGCGCTGAACATCGGGTTCCCACTTTAGAAGCGCCGCCGCTGGCGCGGGCATTATATCGCCACGCCGAAATCGGTCAGCAAATTCCCGGGCAGTTATATGCTGCCGTTGCGGAAGTGTTGGCCTGGGTCTGGCAGCTTAAACGCTGGCGGCTTGCGGGCGGGCAACGTCCTCCACAACCTGAGAACCTTCCGGTGCCAGAAGCGCTGGATTTTATGAACGAGAAGAATACTGATGGCTAA。

实施例2试剂盒的制备

引物设计与合成：以flhB基因为模板，设计并分析引物，并根据基因组DNA序列情况，从中选择最佳检测用引物对，为更好显示鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB基因缺失的中间片段所带来的差异，选择缺失片段附近的序列进行引物设计(图2)，其核苷酸序列如下表1所示：

表1

上述引物对可单独包装，也可以配成PCR检测液。所述PCR检测液中，上述引物对的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。

也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR检测液。

进一步地，所述试剂盒还可以含有无菌水(ddH₂O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂等等。

实施例3试剂盒检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的特异性鉴定

采用实施例2所述试剂盒中的引物，以不同血清型沙门菌和其它细菌的基因组分别为模板，PCR方法鉴定flhB基因在不同细菌中的分布特点。

PCR反应体系为(25μL)：ddH₂O 16.25μL，dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，flhB-F 1μL，flhB-R 1μL，模板2μL，rTaq酶0.25μL。

PCR程序为94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃30s，30个循环；72℃10min。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，PCR电泳结果表明所有鸡白痢和鸡伤寒沙门菌基因组为模板的泳道中均有182bp目的条带(图3)，而其它血清型沙门菌的扩增条带为379bp。表明以实施例2所述试剂盒中特定的flhB扩增引物，可以通过PCR方法快速鉴定未知细菌是否为鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。

实施例4试剂盒检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的灵敏性鉴定

采用实施例2所述试剂盒中的引物，将鸡白痢沙门菌S06004基因组依次10倍稀释，以稀释的基因组为模板，鉴定试剂盒检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的灵敏性。

PCR反应体系为(25μL)：ddH₂O 16.25μL，dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，flhB-F 1μL，flhB-R 1μL，模板2μL，rTaq酶0.25μL。

PCR程序为94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃30s，30个循环；72℃10min。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，PCR电泳结果表明基于flhB的PCR检测试剂盒可检测5.85pg/μl的鸡白痢沙门菌基因组(图4)。

实施例5试剂盒在鸡场的应用

采用实施例2中试剂盒，检测24株鸡场分离的沙门菌，可快速准确地检测出鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。具体步骤如下：

1)沙门菌的分离

本试验中样品采自江苏某鸡场，样品的采集、增菌及沙门菌的分离和生理生化鉴定参考现有技术中已建立方法(Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int JFood Microbiol,2016)，本次试验共分离鉴定了24株沙门菌。

2)PCR方法检测样本中鸡白痢和鸡伤寒沙门菌

将24株沙门菌分别接种到LB液体培养基中，37℃180rpm过夜培养，次日，以菌液为模板扩增flhB基因，PCR反应体系为(25μL)：ddH₂O 16.25μL，dNTP 2μL，10×PCR buffer2.5μL，flhB-F 1μL，flhB-R 1μL，模板(菌液)2μL，rTaq酶0.25μL。PCR程序为94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃30s，30个循环；72℃10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，可扩增出182bp flhB目的条带的细菌则为鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。结果显示24株沙门菌中共有10株含182bp flhB目的条带，分别是4、5、8、12、13、14、16、19、22和24(图5)，这些沙门菌即为鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。

3)沙门菌的传统血清型鉴定

本次试验分离的24株沙门菌的血清型鉴定参考现有技术中已建立方法(Li Y,etal.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)，血清型鉴定结果表明24株沙门菌中共有10株鸡白痢沙门菌，分别为4、5、8、12、13、14、16、19、22和24，PCR检测结果与血清型鉴定结果完全一致。

在本实施例中，采用血清型鉴定的方法，将24株沙门菌中的鸡白痢和鸡伤寒沙门菌筛选出来，需要至少2天的时间。而采用本发明实施例2的检测试剂盒，仅需3个小时，即可将24株沙门菌中的鸡白痢和鸡伤寒沙门菌准确筛选出来，且正确率为100％。

综上所述，本发明试剂盒相较于传统血清型鉴定方法的优势：

传统血清型鉴定需购买特定的沙门菌血清型鉴定试剂盒，价格昂贵，步骤繁琐，尤其在大样本中分离特定的血清型沙门菌(如鸡白痢和鸡伤寒沙门菌)时，需耗费大量时间(至少两天)，且工作量庞大，其结果是由肉眼进行判断，因而可能存在人为误差；而本发明试剂盒的检测方法操作简单，成本非常低，且对细菌的存在形式没有要求(单菌落、冻存菌液或新鲜菌液均可)，整个鉴定过程在三小时内即可完成(包含PCR和琼脂糖凝胶电泳)，且准确率达到100％。

因此，本发明的一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒，有利于简化沙门菌血清型鉴定的传统步骤，为在大量样本中筛选鸡白痢和鸡伤寒沙门菌提供了一种快速鉴定的新方法。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括flhB基因检测引物，所述flhB基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有无菌水、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性对照或阴性对照中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含鸡白痢/伤寒沙门菌flhB基因的DNA样本。

5.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为非鸡白痢/伤寒沙门菌的DNA样本。

6.如权利要求1～5任一权利要求所述的检测试剂盒的使用方法，所述方法为非疾病诊断目的的方法，包括如下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有权利要求1中的所述的flhB基因检测引物；

(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；

(4)PCR反应结束后，分析结果。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：(a)94℃5min；(b)94℃45s；(c)55℃45s；(d)72℃30s，步骤(b)～(d)循环30次，(e)72℃10min。

8.如权利要求1～5任一权利要求所述的检测试剂盒在制备flhB基因检测产品中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述检测产品用于检测和筛选鸡白痢/伤寒沙门菌。