CN105525015A - 用于沙门氏菌与大肠杆菌o157:h7的多重pcr-elisa检测试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种食品安全检测技术，具体涉及用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒及应用。本发明建立了沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒，本试剂盒根据沙门氏菌的<i>invA</i>基因与大肠杆菌O157:H7的<i>rfbE</i>基因的保守区域设计引物与探针。相对于普通的多重PCR检测方法，多重PCR-ELISA加入了杂交探针，使得此方法能够准确检测到样品中目的基因片段，而不是单纯检测扩增产物分子量的大小，从而增加了检测的特异性，使得此方法能够准确鉴定样品。本方法采用了链霉亲和素-生物素-地高辛-抗地高辛抗体体系，对比普通的多重PCR与ELISA检测，此检测法在敏感性上有了提高；在结果的判定上，此法采用ELISA的显色反应，使结果的判定更加直接。

Description

用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种食品安全检测技术，具体涉及用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒及应用。
背景技术
沙门氏菌(Salmonellaspp.)是近年来国内外广泛重视的人畜共患病原菌，主要引起人类伤寒、急性肠胃炎、菌血症与败血症等病症。该菌分布广泛，多种动物上都分离到该菌，尤其是广泛存在于鸭、鹅等水禽及其蛋类之中，带菌率为30％-40％，家畜与家禽的生前感染与宰后易受污染。人类感染主要是由于食品、饮用水以及环境受到沙门氏菌污染引起的，根据我国疾病预防控制中心公布的中国内陆地区食源性致病菌导致疾病人数统计数据，感染沙门氏菌的病例在整个细菌性食物中毒病例中占据首位。因此国内外对沙门氏菌的监测都非常重视。大肠杆菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7)也是近年来国内外广泛重视的人畜共患病原菌，主要引起腹泻、出血性肠炎与严重继发溶血性尿毒综合症等病症。该菌分布广泛，人与动物的排泄物是大肠杆菌O157:H7的重要传播载体。多种动物上都分离到该菌，尤其是大肠杆菌O157:H7能寄生于牛、猪、鸡、羊、狗等家畜，通过苍蝇、蟑螂和蚊子等媒介动物传播，随着人和动物的排泄物污染生活用水、湖泊、河流等地表水传播以及人与带菌家禽等的接触传播等。人类感染主要是由于大肠杆菌O157:H7污染的食品、饮用水以及环境引起，20世纪末，我国河南、安徽、江苏等地都有大肠杆菌O157:H7大面积暴发，疫情广泛、严重，确诊人数总计达2万人，导致177人死亡。大肠杆菌O157:H7感染的病例在整个细菌性食物中毒病例的致死率居于前列。因此国内外对大肠杆菌O157:H7的监测都非常重视。
目前检测食品中致病菌的方法主要以传统方法为主，但是常规的分离培养与生化鉴定耗时费力、敏感性不高、所需时间长，不利于暴发疫情时的快速诊断，也不符合临床病原菌检测所要求的快速、准确的原则。尽管国内外对沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的诊断技术已进行较为广泛与深入的研究，但缺乏快速、简便、经济的检测技术。近年来发展起来的PCR技术，是一种快速、敏感、特异的检测技术，然而由于该技术判定反应结果时的凝胶电泳易造成污染并需要接触有毒性的染料而具有局限性。此外，荧光定量PCR技术也因其敏感性高、特异性强而得到广泛应用，该法的局限性表现在设备昂贵、成本高与荧光探针保存时间较短等方面。上述方法在高通量检测方面也显得较为繁琐，RiboPrinter全自动细菌鉴别系统(BAX系统)与基因芯片技术能够进行高通量的检测，不过前者仪器本身及所用耗材与试剂均较昂贵，后者的检测稳定性较差，这些方法均不能满足对沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7快速、准确、稳定、经济、高通量的实际检测需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：目前检测食品中致病菌的方法主要以传统方法为主，但是常规的分离培养与生化鉴定耗时费力、敏感性不高、所需时间长，不利于暴发疫情时的快速诊断，也不符合临床病原菌检测所要求的快速、准确的原则。本发明针对上述缺陷，目的在于提供一种敏感性高、特异性强、方便快捷的用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测的试剂盒及应用。
本发明的技术方案如下：
一种用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包含引物组、探针、PCR模板、PCR反应液以及ELISA反应液。
所述引物组由沙门氏菌引物对和大肠杆菌引物对组成。
所述引物组具体为，沙门氏菌上游引物如SEQIDNO：1所示，下游引物如SEQIDNO：2所示；大肠杆菌上游引物如SEQIDNO：3所示，下游引物如SEQIDNO：4所示。
所述沙门氏菌上游引物和大肠杆菌上游引物的5’端均为地高辛标记。
所述探针包括沙门氏菌探针如SEQIDNO：5所示、大肠杆菌探针如SEQIDNO：6所示。
所述沙门氏菌探针和大肠杆菌探针的3’端均为生物素标记。
所述PCR模板为DNA，由增菌培养液培养而成。
所述PCR反应液包括PCRbuffer、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶和ddH2O。
一种用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒的应用，其特征在于，按照以下步骤进行：
(1)多重PCR：PCR模板各1μL，10pmol/μL沙门氏菌上下游引物各0.3μL，10pmol/μL大肠杆菌上下游引物各0.4μL，10×PCRbuffer2.5μL，25mmol/LMgCl21.5μL，2.5mmol/LdNTPs0.3μL，5U/μLTaq酶0.8μL，ddH2O定容至25μL；反应程序为94℃变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸7min，各物料的用量可同比例放大或缩小；
(2)以含有8mg/L链霉亲和素的包被液，包被酶标板，200μL/孔，4℃包被过夜，甩干后以含0.5mL/LTween-20的PBST洗板5次，250μL/孔，每次静置3min，甩干，所述包被液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.8；
(3)40μL变性液中加入5μL地高辛标记的PCR产物，混匀，室温静置30min，再加入200μL50pmol/L生物素标记的探针，混匀，每孔加入上述杂交液200μL，55℃2h，洗板，所述变性液为100mmol/LNaOH溶液，750mmol/LNaCl；
(4)加入100μL以PBS按1:5000稀释的HRP标记的抗地高辛抗体，37℃1h，洗板5次；
(5)加入50μL临时配制的1mg/mLTMB显色液，室温避光显色10min，加入20μLH2SO4终止。
本发明的有益效果是：
(1)本发明建立了沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒，本试剂盒根据沙门氏菌的invA基因与大肠杆菌O157:H7的rfbE基因的保守区域设计引物与探针。相对于普通的多重PCR检测方法，多重PCR-ELISA加入了杂交探针，使得此方法能够准确检测到样品中目的基因片段，而不是单纯检测扩增产物分子量的大小，从而增加了检测的特异性，使得此方法能够准确鉴定样品。本方法采用了链霉素-亲和素-地高辛-抗地高辛抗体系统，对比普通的多重PCR与ELISA检测，由于双标记物的存在，此检测法在敏感性上有了提高；在结果的判定上，此法采用ELISA的显色反应，使结果的判定更加直接。
(2)本发明所建立的检测方法具有敏感性高、特异性强、方便快捷、使用范围广的优点。所需要的仪器为PCR仪与酶标仪，普通实验室就有配置，试剂与耗材已有商品化的成品，容易购买，利于推广。本发明在96孔酶标板中进行，成本低廉，适用于对沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7进行大规模、高通量的检测。
附图说明
图1为单项PCR扩增，其中M为DNAMarker，1为沙门氏菌，2为大肠杆菌O157:H7，3为阴性对照，4为空白对照；
图2为多重PCR引物特异性，其中M为DNAMarker，1为大肠杆菌O157:H7，2为肠炎沙门氏菌，3为鼠伤寒沙门氏菌，4为金黄色葡萄球菌，5为大肠埃希氏菌，6为单增李斯特氏菌，7为痢疾志贺氏菌，8为福氏志贺氏菌，9为阴性对照；
图3为多重PCR敏感性，其中M为Marker，1-9为沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7菌体浓度分别依次为108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL、100CFU/mL的扩增结果，10为阴性对照；
图4为特异性分析；
图5为敏感性分析，其中X为细菌数量；A为沙门氏菌；B为大肠杆菌O157:H7。
具体实施方式
一种用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包含引物组、探针、PCR模板、PCR反应液以及ELISA反应液。
所述引物组由沙门氏菌引物对和大肠杆菌引物对组成。
所述引物组具体为，沙门氏菌上游引物如SEQIDNO：1所示，下游引物如SEQIDNO：2所示；大肠杆菌上游引物如SEQIDNO：3所示，下游引物如SEQIDNO：4所示。
所述沙门氏菌上游引物和大肠杆菌上游引物的5’端均为地高辛标记。
所述探针包括沙门氏菌探针如SEQIDNO：5所示、大肠杆菌探针如SEQIDNO：6所示。
所述沙门氏菌探针和大肠杆菌探针的3’端均为生物素标记。
所述PCR模板为DNA，由增菌培养液培养而成。
所述PCR反应液包括PCRbuffer、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶和超纯水。
一种用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒的应用，其特征在于，按照以下步骤进行：
(1)多重PCR：PCR模板各1μL，沙门氏菌和大肠杆菌的上下游引物各0.5μL，10×PCRbuffer2.5μL，2.5mmol/LMgCl22μL，25mmol/LdNTPs2μL，Taq酶0.2μL，超纯水14.3μL，反应程序为94℃变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸7min，各物料的用量可同比例放大或缩小；
(2)以包被缓冲液稀释链霉亲和素，包被酶标板，200μL/孔，4℃包被过夜，甩干后以含0.5mL/LTween-20的PBST洗板5次，250μL/孔，每次静置3min，甩干，所述包被缓冲液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.8；
(3)40μL变性液中加入5μL地高辛标记的PCR产物，混匀，室温静置30min，再加入200μL10pmol/L生物素标记的探针，混匀，每孔加入上述杂交液200μL，55℃2h，同上法洗板5次，所述变性液为100mmol/LNaOH溶液，750mmol/LNaCl；
(4)加入100μL以PBS稀释的HRP标记的抗地高辛抗体，37℃1h，洗板5次；
(5)加入50μL临时配制的TMB显色液，室温避光显色10min，加入20μLH2SO4终止液。
下面结合具体实施方式进一步阐述本发明：
一、试剂及供应商
PCR体系试剂：TaqDNA聚合酶、dNTPs(10mmol/L)、10×PCRbuffer、6×GlycerolGelLoadingDyeII、DNAMarker、溴化乙锭(EB)贮存液、琼脂糖、50×TAE电泳缓冲液，购自上海生工公司。ELISA试剂：Na2CO3、NaHCO3、NaN3、98％H2SO4、NaOH、NaCl、CH3COONa、C6H8O7、30％H2O2、C6H8O7、C10H14N2Na2O8·2H2O、C3H8O3、Tris-HClBuffer，购自上海生工公司；链霉亲和素、Tween-20、牛血清白蛋白(BSA)、四甲基联苯胺(TMB)、二甲基亚砜(DMSO)，购自北京索莱宝公司；HRP标记小鼠抗地高辛单克隆抗体，购自美国Jackson公司。以上试剂均为化学分析纯。
二、多重PCR反应
(1)PCR模板的制备
用无菌容器称量人工染菌的2mL牛奶，120rpm37℃培养24h。取1mL增菌培养液于1.5mLEP管中，模板制备步骤采用常规细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA作为PCR反应模板。
(2)多重PCR反应
多重PCR：PCR模板各1μL，10pmol/μL沙门氏菌上下游引物各0.3μL，10pmol/μL大肠杆菌上下游引物各0.4μL，10×PCRbuffer2.5μL，25mmol/LMgCl21.5μL，2.5mmol/LdNTPs0.3μL，5U/μLTaq酶0.8μL，ddH2O定容至25μL；反应程序为94℃变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸7min，4℃保存，各物料的用量可同比例放大或缩小；
(3)PCR引物特异性分析
以沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的基因组DNA作为模板，用相应引物进行单一PCR扩增，体系为25μL。取5μL扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝胶成像仪观察结果。凝胶图片显示，泳道1中为535bp条带(沙门氏菌)、泳道2中为393bp条带(大肠杆菌O157:H7)，大小与预期相符，针对沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的设计的引物特异性强(如图1)。
(4)多重PCR异性分析
本试验应用两对引物对8株食源性致病菌菌株进行PCR扩增，验证多重PCR方法特异性。结果显示，只有肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门杀菌与大肠杆菌菌株有PCR反应扩增条带，其他菌株均没有PCR反应扩增条带(如图2)。说明应用多重PCR方法同时检测沙门氏菌与大肠杆菌O157的特异性强。
(5)多重PCR引物敏感性分析
将沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7分别接种于LB液体培养基中，37℃8h摇床培养。对混合菌悬液进行10倍梯度稀释，并用平板计数。取1mL各个稀释度的菌液提取基因组DNA作为模板进行多重PCR反应。对含菌量为108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL、100CFU/mL进行多重PCR敏感性的反应，果显示，多重PCR同时检测沙门氏菌与大肠杆菌O157的敏感性为103CFU/mL(图3)。
三、ELISA反应
(1)将含有8mg/L链霉亲和素的包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.5)，200μL/孔，4℃冰箱包被过夜，甩干后以含0.5mL/LTween-20的PBST洗板3次，250μL/孔，每次静置3min，甩干；
(2)以含2％BSA的PBS稀释液，封闭酶标板，100μL/孔，37℃1h。取出后，同上法洗板3次；
(3)40μL变性液(100mmol/LNaOH、750mmol/LNaCl)中加入5μL地高辛标记的PCR产物，混匀，室温静置30min，再加入200μL生物素标记的探针(50pmol/L)，混匀。每孔加入上述杂交液100μL，55℃2h，同上法洗板4次；
(4)加入100μL以PBS稀释的HRP标记的抗地高辛抗体，37℃1h，洗板5次；
(5)加入100μL临时配制的1mg/mLTMB显色液，室温避光显色10min，加入20μL2mol/LH2SO4终止液。
(6)结果检测
a.阴阳性临界值的分析
应用建立的多重PCR-ELISA方法对30份沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7阴性的样本OD450nm值进行分析，结果如表1。
表1临界值的分析
应用统计学分析软件SPSS对30份阴性样本进行计算：OD450nm的平均值标准偏差SD＝0.0266。阴阳性临界值为0.192，OD450的平均值大于0.192的样品确定是阳性，反之则是阴性。
b.特异性分析
应用建立的多重PCR-ELISA方法检测结果显示，阳性对照pMD/invA与pMD/rfbE的OD450nm值大于2.000，阴性对照OD450nm值小于0.100，大肠杆菌O157:H7与沙门氏菌的的OD450nm值大于2.000，即检测结果为阳性，金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特氏菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌的的OD450nm值在0.0700-0.160之间，均低于临界值0.192，检测结果为阴性。综上，说明针对大肠杆菌O157:H7与沙门氏菌建立的多重PCR-ELISA方法特异性强(如图4)。
c.敏感性分析
阳性对照pMD/invA与pMD/rfbE的OD450nm值大于2.000，阴性对照OD450nm值小于0.100。针对沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的菌液进行10倍梯度稀释后，应用建立的多重PCR-ELISA方法检测。根据检测结果，以细菌数量的对数值为横坐标，OD450nm值为纵坐标做图。结果显示，沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的细菌数量为108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL、100CFU/mL时，OD450nm值均大于0.192(阴阳性临界值)。其中，两种菌细菌数量为100CFU/mL时，OD450nm值在0.280-0.300之间；阴性对照的OD450nm值为0.071；结果判定为阳性。综上，针对沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7建立的多重PCR-ELISA方法敏感性为100CFU/mL(如图5)，比多重PCR方法(如图3)的敏感性高1000倍。
d.重复性分析
批内重复性分析：应用建立的多重PCR-ELISA方法，对同一批次包被的酶标板，重复5次检测OD450nm值。结果显示，4个阳性样本、4个阴性样本与3个对照(1个阴性对照、2个阳性对照pMD/invA与pMD/rfbE)的变异系数分别为2.07％、2.29％、3.17％、4.15％、8.33％、6.06％、7.78％、6.52％、4.44％、5.72％与7.53％，均小于10％，说明建立的多重PCR-ELISA方法具有良好批内重复性与较高的精密度(如表2)。
表2批内重复性检测
注：AV为平均值；SD为标准差；CV为变异系数
批间重复性分析：应用建立的多重PCR-ELISA方法，将5个不同批次包被的酶标板用于检测与批内重复性分析相同的样本。结果显示，4个阳性样本、4个阴性样本与3个对照(1个阴性对照、2个阳性对照pMD/invA与pMD/rfbE)的变异系数分别为1.98％、2.10％、2.21％、3.98％、4.26％、6.52％、4.44％、5.26％、3.27％、3.71％、6.45％，均小于10％，证明建立的多重PCR-ELISA方法具有良好批间重复性与较高的精密度(如表3)。同时试验结果也表明，链亲和素包被的酶标板干燥后在-20℃条件下至少能够保存5个月。
表3批间重复性检测
注：AV为平均值；SD为标准差；CV为变异系数
四、多重PCR-ELISA检测技术的应用
(1)人工污染食品样品多重PCR-ELISA的敏感性分析
对于人工污染相同含菌量的牛奶样品进行多重PCR-ELISA敏感性试验。人工污染的牛奶中的invA基因与rfbE基因均能够在含菌量为100CFU/mL水平检出。通过对多重PCR-ELISA检测的阳性结果比例进行统计分析。在含菌量为108、107、106、105、104、103、102、101、100CFU/mL水平上，牛奶样品的阳性检出率为100％(如表4)。因此，本研究建立的多重PCR-ELISA技术最低能够检出25g食品样品中污染1CFU/mL的沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7。
表4人工污染食品样品多重PCR-ELISA检测的敏感性
(2)实际食品样品的检测结果
利用本研究建立的多重PCR-ELISA方法与国标法对比，从当地超市购买20份牛奶进行检测。多重PCR-ELISA方法对沙门氏菌的检出率为20％，国标法检出率为10％，多重PCR-ELISA方法的检出率高于传统方法；多重PCR-ELISA方法与国标法对大肠杆菌O157:H7均未检出。根据公式计算得到多重PCR-ELISA方法对两种致病菌的敏感性均为100％；沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的特异性分别为95.00％、100％，符合率分别为95.00％、100％(如表5)。按照国标GB/T4789.4-2010对沙门氏菌进行食品样品进行微生物检测，按照GB/T4789.36-2008对大肠杆菌O157:H7进行食品样品进行微生物检测。
表5实际食品样品检测结果
计算出多重PCR-ELISA方法的特异性、敏感性与符合率，计算公式如下：
特异性＝真阴性数/(真阴性数+假阳性数)；
敏感性＝真阳性数/(真阳性数+假阴性数)；
符合率＝(真阳性数+真阴性数)/被检总数。

Claims (9)

1.一种用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组分为：引物组、探针、PCR模板、PCR反应液以及ELISA反应液。
2.如权利要求1所述的用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述引物组由沙门氏菌引物对和大肠杆菌O157引物对组成。
3.如权利要求1或2所述的用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述引物组具体为，沙门氏菌上游引物如SEQIDNO：1所示，下游引物如SEQIDNO：2所示；大肠杆菌O157上游引物如SEQIDNO：3所示，下游引物如SEQIDNO：4所示。
4.如权利要求1或3所述的用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述沙门氏菌上游引物和大肠杆菌O157上游引物的5’端均为地高辛标记。
5.如权利要求1所述的用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述探针包括沙门氏菌探针如SEQIDNO：5所示、大肠杆菌O157探针如SEQIDNO：6所示。
6.如权利要求1或5所述的用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述沙门氏菌探针和大肠杆菌O157探针的3’端均为生物素标记。
7.如权利要求1所述的用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述PCR模板为DNA，由增菌培养液培养而成。
8.如权利要求1所述的用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括10×PCRbuffer、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶和ddH2O。
9.一种用于沙门氏菌与大肠杆菌O157:H7的多重PCR-ELISA检测试剂盒的应用，其特征在于，按照以下步骤进行：
（1）多重PCR：PCR模板各1μL，10pmol/μL沙门氏菌上下游引物各0.3μL，10pmol/μL大肠杆菌上下游引物各0.4μL，10×PCRbuffer2.5μL，25mmol/LMgCl21.5μL，2.5mmol/LdNTPs0.3μL，5U/μLTaq酶0.8μL，ddH2O定容至25μL；反应程序为94℃变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸7min，各物料的用量可同比例放大或缩小；
（2）以含有8mg/L链霉亲和素的包被液，包被酶标板，200μL/孔，4℃包被过夜，甩干后以含0.5mL/LTween-20的PBST洗板5次，250μL/孔，每次静置3min，甩干，所述包被液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.8；
（3）40μL变性液中加入5μL地高辛标记的PCR产物，混匀，室温静置30min，再加入200μL50pmol/L生物素标记的探针，混匀，每孔加入上述杂交液200μL，55℃2h，洗板，所述变性液为100mmol/LNaOH溶液，750mmol/LNaCl；
（4）加入100μL以PBS按1:5000稀释的HRP标记的抗地高辛抗体，37℃1h，洗板5次；
（5）加入50μL临时配制的1mg/mLTMB显色液，室温避光显色10min，加入20μLH2SO4终止。
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