CN108277288A

CN108277288A - 牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒

Info

Publication number: CN108277288A
Application number: CN201711374178.2A
Authority: CN
Inventors: 孔令聪; 马红霞; 许淑玉
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2018-07-13

Abstract

本发明公开了一种牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒，通过对牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌进行比较基因组学分析，筛选出其种间特异基因；多重PCR反应最佳退火温度为54.5℃；最佳循环次数30次；可同时进行三种病原菌的检测；多杀性巴氏杆菌最低检测浓度10^‑2ng/μL，溶血曼氏杆菌最低检测浓度10^‑ ¹ng/μL，牛支原体最低检测浓度10¹ng/μL；构建的特异基因PCR‑ELISA检测方法，对牛呼吸系统疾病主要病原的快速诊断得到良好效果。

Description

牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒

技术领域

本发明属动物疾病检验检测技术领域，具体涉及牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒。

背景技术

近年来，牛呼吸系统疾病已经成为危害我国肉牛养殖的主要疾病之一，该病多发于经长途运输的育肥架子牛，具有较高的发病率和死亡率。据统计，在我国该病单场发病率高达60%，病原感染后造成严重的后果，如牛肺部出现纤维素化，胸腔器官粘连，肺部脓肿或形成慢性，不致死，但可导致广泛、持久地肺部损伤，治疗效果差，易复发。动物存活下来，生产性能也低下，严重影响了我国畜牧业的健康发展。

在牛支原体感染动物机体造成机体损伤，同时在各种条件的应激下，机体免疫力下降严重，促使了其他条件性致病菌的混合感染，并增强了其他病原微生物对动物机体的侵蚀损伤能力。混合感染的常见病原主要有多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌等。但上述病原均为苛养菌，具有难分离、难培养等特点，目前，国内外的确诊方法主要集中在病原体的分离鉴定、血清学检测、基因诊断三个方面。鉴于M.bovis分离鉴定难度大、灵敏性低等缺点，不能做为早期快速诊断M.bovis感染的方法，也难以作为常规检查方法普及。应用常规的诊断方法诊断多杀性巴氏杆菌Pm虽然具有许多优点，但由于Pm抵抗力不强，在直射阳光、干燥、无菌蒸馏水和生理盐水中迅速死亡，且诊断时存在费时、费力、敏感性低、漏诊、误诊的缺点。因此，开发一套可快速、准确鉴定上述病原的方法已迫在眉睫。

随着后基因组时代的到来，比较基因组分析已为差异基因的比较和特异性基因的筛选奠定了基础，我们可通过Genbank已登录的全基因组序列，筛选出种间特异基因，进一步通过种间特异基因构建相关病原菌鉴定方法。其中，基于特异基因的PCR-ELISA技术，因其具有PCR的高敏感性、探针的特异性、酶标仪直接读取结果的客观性等优点已成为当前兽医临床检测病原的重要手段。通过对牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌进行比较基因组学分析，筛选出其种间特异基因，进一步构建特异基因的PCR-ELISA检测方法，对牛呼吸系统疾病主要病原的快速诊断具有重要意义。

发明内容

本发明目的是提供一种能够快速诊断鉴别牛支原体M.bovis、多杀性巴氏杆菌Pm、溶血曼氏杆菌Mh的多重PCR-ELISA检测试剂盒。

牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒，它是牛支原体M.bovis、多杀性巴氏杆菌Pm、溶血曼氏杆菌Mh多重PCR-ELISA检测试剂盒；

所述的检测试剂盒包括下述引物和探针：

OPPD/F：TTTTAGCTCTTTTTGAACAAAT

OPPD/R：GGCTCTCATTAAGAATGTC

Po-probe：CACCAAAAATACAAAGACCAAAAGA

kmt-1F：ATCCGCTATTTACCCAGTG

kmt-1R：CTACCGACAAGCCCACTC

Pk-probe：GATTGCCGCGAAATTGAGTT

Mh F：TGGGCAATACGAACTACTCGGG

Mh R: CTTTAATCGTATTCGCAG

Pm-probe: CGGTTTGGATTACCCTGCC；

所述的引物5’端标记地高辛，所述的探针5’端标记生物素；

所述的检测试剂盒还包括：过氧化物酶标记的抗地高辛抗体；

所述的多重PCR的反应条件为：

预变性 95℃ 3min

变性 95℃ 45s

退火 54.5℃ 45s

延伸 72℃ 1min

保存 72℃ 10min

变性-延伸 30个循环。

本发明提供了牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒，通过对牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌进行比较基因组学分析，筛选出其种间特异基因；多重PCR反应最佳退火温度为54.5℃；最佳循环次数30次；可同时进行三种病原菌的检测；多杀性巴氏杆菌最低检测浓度10^-2ng/μL，溶血曼氏杆菌最低检测浓度10^-1ng/μL，牛支原体最低检测浓度10¹ng/μL；构建特异基因的PCR-ELISA检测方法，对牛呼吸系统疾病主要病原的快速诊断得到良好效果。

附图说明

图1 梯度PCR确定最佳退火温度，M为DL2000Marker，1-12退火温度为49℃、49.4℃、50.5℃、51.3℃、52.1℃、52.9℃、53.8℃、54.5℃、55.2℃、55.7℃、56℃；

图2 最佳循环次数；

图3 确定多重PCR最低检测浓度，M为DL2000Marker，1-8:10²、10¹、10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5ng/μL；

图4 引物特异性PCR扩增结果；M为DL2000Marker，1为多杀性巴氏杆菌，2为牛支原体，3为溶血曼氏杆菌；

图5 PCR阴性对照组检测结果，M为DL2000Marker，1为沙门氏菌，2为大肠杆菌，3为金黄色葡萄球菌，4为链球菌。

具体实施方式

实施例1 多重PCR反应

1、特异性基因筛选

a. genebank上收录的牛支原体M.bovis、多杀性巴氏杆菌Pm、溶血曼氏杆菌Mh的全部基因组序列；

b.分别将上述基因组序列与动物nt库以及细菌nt库（去除了M.bovis、Pm、Mh）进行比较分析；

c.将没有比对到数据库的序列留下来，进行orthomcl聚类分析，最终得到特异基因；

d.将特异性基因进行了功能注释和功能分析。

e.特异、敏感性基因的筛选。

2、特异性引物及探针的设计

根据三种病原微生物的特异保守基因片段，找到退火温度相近且无互补的碱基序列合成引物并在5’端标记地高辛，探针合成并在5’端标记生物素，结果如表1所示。

3、多重PCR建立及条件优化

1）利用梯度PCR确定最佳退火温度

分别以49℃、49.4℃、50.5℃、51.3℃、52.1℃、52.9℃、53.8℃、54.5℃、55.2℃、55.7℃、56℃的退火温度进行梯度多重PCR反应，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳退火温度，结果如图1所示，结果表明，54.5℃为最佳退火温度。

2、比较不同循环次数对PCR扩增效率的影响

分别以24、28、30、32、34个循环次数进行多重PCR反应，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，确定最佳循环次数（见图2），结果表明，30次循环为最佳循环次数。

3、三种病原菌的最低检测浓度的确定

分别提取M.bovis、Pm、Mh的基因组DNA进行定量，然后分别作10倍梯度稀释，每个稀释度取1µL为模板，采用已优化的多重PCR反应条件分别对上述不同稀释度的DNA进行多重PCR扩增，反应结束后进行凝胶电泳检测，以检测建立的多重PCR的敏感性；结果如图3，可以看出三种病原菌的最低检测浓度为：多杀性巴氏杆菌最低检测浓度10^-2ng/μL，溶血曼氏杆菌最低检测浓度10^-1ng/μL，牛支原体最低检测浓度10¹ng/μL。

扩增出的巴氏杆菌序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；扩增出的牛支原体M.bovis序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；增出的溶血曼氏杆菌Mh序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

实施例2 PCR-ELISA建立及条件优化

1、酶标板均匀性检测

取酶标板两条，共15孔，每孔加100μL 1:3000倍稀释的酶标二抗，37℃温育2小时，洗涤后，加ABTS底物溶液显色，37℃温育，酶标仪读取数据，根据OD值检测酶标板的吸附均匀度。

2、链霉亲和素最佳包被浓度和过氧化物酶标记的抗地高辛抗体最佳稀释度的筛选

采用方阵滴定法，将链霉亲和素由10μɡ/mL作5个连续2倍稀释，每个稀释度包被一个纵行。将过氧化物酶标记的抗地高辛抗体分别进行1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000倍比稀释，按次序将每个稀释度的抗体加入酶标板，与包被液浓度形成方阵；结果见表2，当P/N＞2时，样品OD_405nm≥0.331判定为阳性，≤0.331判定为阴性。当链霉亲和素浓度为5μg/mL，过氧化物酶标记的抗地高辛抗体为1000倍稀释时，P/N值最大=3.512。

+：表示阳性PCR产物OD_405nm值（P）；-：表示阴性PCR产物OD_405nm值（N）

3、最佳封闭条件筛选(封闭液浓度及封闭时间)

分别用0.1%BSA、0.2%BSA、0.3%BSA、0.4%BSA、0.5%BSA作封闭液，选出最佳浓度。封闭20min、25min、30min、35min、40min，确定最佳封闭时间。如表3、4所示，当封闭液为0.5％BSA时，P/N值最大=4.282；当封闭时间为30min时，P/N值最大=2.692。

4、最佳显色时间

分别选择20min、25min、30min、35min为显色时间。酶标仪读数，确定最佳显色时间。如表5所示，当显色时间为20min时，P/N值最大=8.490。

5、杂交条件的确定

将PCR扩增产物与探针分别进行热变性杂交和化学变性杂交。

1）热变性杂交

将完成的PCR扩增产物在PCR仪中进行95℃变性3min，68℃退火杂交7min，退火完成后立即加入200μLPBS稀释，将杂交产物加入到包被好的酶标版上，37℃作用30min。P/N值如表6所示。

2）化学变性杂交

变性液：0.1mol/L NaOH，0.3mol/L NaCl。选取不同的杂交缓冲液，如表7、8所示，当变性液为NaOH，杂交缓冲液为含0.1％的SDS，24.9％的异硫氰酸胍的PBS溶液时，P/N值最大=5.586。

6、探针浓度

取10μLPCR扩增产物与10μL（0.1mmol、0.5mmol、1mmol、5mmol）探针杂交。酶标仪读数，确定最佳探针浓度。如表9所示，当探针浓度为0.5mmol/10 L时P/N值最大=4.033。

7、阴阳性判定标准的确定

通过对20个阴性样品的分析，根据公式：阴性样品的平均OD值+3×标准差=阴阳性标准的临界值,得出阴阳性的判定标准。如表10所示，阴阳性标准的临界值为：0.148+0.061×3=0.331

实施例3 PCR-ELISA检测方法的初步应用

1、特异性检测

应用建立的多重PCR-ELISA方法分别对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、链球菌、沙门式菌常见致病菌进行特异性试验，结果见图4、图5，检测结果均为阴性；利用特异性引物分别单独检测阳性菌和阴性对照菌，均能从阳性菌扩增出特异性条带，而从阴性对照菌中未扩增出任何条带。表明该多重PCR特异性良好。

2、灵敏度检测

取地高辛标记的PCR产物，用双蒸水做10倍倍比稀释，分别取5μL进行ELISA检测，设阴性对照和空白对照，结果见表11，多杀性巴氏杆菌最低检测浓度：10^-4ng/mL；溶血曼氏杆菌最低检测浓度：10^-3ng/mL；牛支原体最低检测浓度：10^-1ng/mL。

3、重复性检测

实验中设有阳性和阴性对照，每份样品都设置3组平行孔，取三孔平均值减去本底值为该样品的吸光度。

实施例4 牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒的操作

1、试剂：液体培养基，酶标板，链霉亲和素，地高辛标记的上游引物混合物、下游引物混合物，封闭液，变性液，探针杂交缓冲溶液，洗涤缓冲液，过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，ABST底物显色液，阳性对照，阴性对照。

2、临床样本基因组提取

在无菌条件下取少量组织样品，按一定比例加入生理盐水，浸泡后进行研磨，将研磨液过滤加入至液体培养基中培养，按照DNA小量抽提试剂盒的说明书进行DNA提取，作为PCR模板。

PCR体系（25μL）各组分用量如下表12所示。

反应条件见下表13。变性-延伸30个循环。

3、杂交：20μL变性液中加5μL地高辛标记的PCR产物，混匀置室温10min。加入探针杂交缓冲液至250μL，混匀。

4、PCR-ELISA术式

（1）浓度为5μg/mL的链霉亲和素包被酶标版，4℃过夜或37℃下2-4h。

（2）取出后弃去液体，每孔加250μLPBST缓冲液，洗涤3次，每次3min，每次都需甩干。

（3）每孔加0.5%BSA封闭液200μL，37℃温育30min。

（4）取出后弃去液体，每孔加250μLPBST缓冲液，洗涤3次，每次3min，每次都需甩干。

（5）每孔加200μL探针杂交反应液，37℃温育2h。

（6）取出后弃去液体，每孔加250μLPBST缓冲液，洗涤3次，每次3min，每次都需甩干。

（7）每孔加200μL过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，37℃温育30min。

（8）取出后弃去液体，每孔加250μLPBST缓冲液，洗涤5次，每次3min，每次都需甩干。

（9）每孔加200μLABST底物显色液，37℃避光显色20min。

（10）酶标仪（405nm）读取OD值。

5、结果判定

当P/N＞2时，样品OD_405nm≥0.331 判定为阳性，OD_405nm≤0.331判定为阴性。

序列表

<110> 吉林农业大学

<120> 牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒

<141> 2017-12-19

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 1

atccgctatt tacccagtgg ggcggtgcga atgaaccgat tgccgcgaaa ttgagtttta 60

tgccacttga aatgggaaat ggcattattt tatggctcgt tgtgagtggg cttgtcggta 120

g 121

<210> 2

<211> 1912

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 2

ttttagctct ttttgaacaa atacgtcaag agtacaatat atcaataatt ttaatttcgc 60

ataacattag tgttgtcgct aagttttgtg aatatattta tgttatgtat gctggcaaaa 120

ttgttgaaag aggaactaga aaagatattt ttactaatcc agctcaccct tatacatgag 180

cgcttatctc ggctatacct gaaaatgatg atgagagatt attctcaatt caaggaaccc 240

caccagatat ggcaaactta cctatcggtg acccttttgc acctagaaat gactttgcct 300

tagaaattga ctatgaaaaa gaaccaccat taattgaaat taatagtcat cataaagcag 360

caacgtgact acttcaccct gatgcaccaa aaatacaaag accaaaagaa ttagaacata 420

gactaaaaag ttttagaaag gtatttaaag acgatgaaga ataacgacaa taaaaaagtc 480

attttagaaa ttcaagatct taaaaagtac tttttaaata acggtaaggt caacaaagct 540

gttgatggtg tgtcatttaa attacatgaa ggtgaaatag tcggtctaat tggtgagtca 600

ggaagtggaa aaaccactgt tggacgttca attctaaggc tttatgacga ttttaatggt 660

tttgttactt tagatgatca aatcattagc ggagaaagca tttctaaaaa acgcgaaaag 720

tttttgcgta aaagagtgca aatgatcttt caagatccac acgcgtcttt aaacggccaa 780

aaaactatct atagcattct taaagaacct ttagttgtca ataacataat taagcaaaaa 840

actgatgatc tatttagtga ctgaaaaaaa gttactgaga actttcaatt tacatttttg 900

ctttatgcta aaaagttaaa aattaaaaac cttaaggcaa ttaatgagcc atctagcaca 960

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aaagagctaa ccaacaaaat aaggttagat gtaatcaaaa aatataagtc taagttaagt 1500

tatttatcaa tagatcaaat tcgtaaattt attgctgaat taaacaaata tactaatagt 1560

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aatattcaaa atcaaattaa gcaattagac aaagacattc ttaatgagag cc 1912

<210> 3

<211> 227

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 3

tgggcaatac gaactactcg gggaatcaat tgatgatgct gccggtgaag cctttgacaa 60

aacaggcaaa ctactcggtt tggattaccc tgccggtgta gcgatgtcaa aattagccga 120

atccggcacg ccaaatcgtt ttaaattccc tcgtccaatg accgacagac cgggactgga 180

tttcagtttc tccggtttaa aaacctttgc tgcgaatacg attaaag 227

Claims

1.牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒，它是牛支原体M.bovis、多杀性巴氏杆菌Pm、溶血曼氏杆菌Mh多重PCR-ELISA检测试剂盒；

所述的检测试剂盒包括下述引物和探针：

OPPD/F：TTTTAGCTCTTTTTGAACAAAT

OPPD/R：GGCTCTCATTAAGAATGTC

Po-probe：CACCAAAAATACAAAGACCAAAAGA

kmt-1F：ATCCGCTATTTACCCAGTG

kmt-1R：CTACCGACAAGCCCACTC

Pk-probe：GATTGCCGCGAAATTGAGTT

Mh F：TGGGCAATACGAACTACTCGGG

Mh R: CTTTAATCGTATTCGCAG

Pm-probe: CGGTTTGGATTACCCTGCC。

2.根据权利要求1所述的牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒，其特征在于：所述的引物5’端标记地高辛，所述的探针5’端标记生物素。

3.根据权利要求2所述的牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒还包括：过氧化物酶标记的抗地高辛抗体。

4. 根据权利要求1、2或3所述的牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒，其特征在于：所述的多重PCR的反应条件为：

预变性 95℃ 3min

变性 95℃ 45s

退火 54.5℃ 45s

延伸 72℃ 1min

保存 72℃ 10min

变性-延伸 30个循环。