CN109554449B - 一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重pcr方法 - Google Patents
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Abstract
一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重PCR方法。筛选引物组合及引物序列;致病菌DNA模板制备方法;多重PCR反应体系与PCR扩增;多重PCR产物检测和结果判读。通过两个PCR反应,可高效、特异、灵敏地检测和鉴定出样品中是否存在气单胞菌,以及1~7种不等的毒力基因的多重PCR检测方法。适于快速鉴定鱼类气单胞菌的致病菌株和普通菌株,可适用于鱼类气单胞菌病的分子辅助诊断,以及该类疾病的确诊。适用于水产动物养殖全过程监控,适用于不同样品类型,包括水体、底泥、养殖动物以及水产品等,监控其是否含有气单胞菌、以及是普通或致病性气单胞菌、并可鉴定致病性气单胞菌所含的毒力基因种类、及相对表达量。
Description
技术领域
本发明涉及水生动物病原微生物检测,尤其是涉及鱼类(特别是鳗鲡)致病性气单胞菌的一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重PCR方法。
背景技术
鳗鲡(Angulla spp.),俗称鳗鱼,肉质鲜美,营养价值高,是世界重要的经济鱼类。中国鳗鲡养殖产量约占全球70%,年产值愈百亿元。在目前鳗鲡高密度集约化的养殖过程中,气单胞菌病时有发生,危害严重,经济损失巨大。研究发现,同一种气单胞菌的不同菌株感染后,鳗鲡所表现的症状千差万别,可引起包括烂鳃、赤皮、穿孔、出血性败血症、肠炎和流行性溃疡等;相反,不同种气单胞菌感染后,鳗鲡往往却表现出相同症状。因此,养殖鳗鲡的气单胞菌病正确诊断和科学防控难度大。
气单胞菌属(Aeromonas)普遍存在于水生态系统中,可分离自淡水和河口水、地表水、污水、健康或患病的鱼、食品、动物和人类粪便,可引起人类和鱼类的疾病。目前,已知气单胞菌属有效种25种,其中可引起动物疾病的常见种有:嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、维氏气单胞菌(A.veronii)、温和气单胞菌(A.sobria)、豚鼠气单胞菌(A.caviae)、简达气单胞菌(A.jandaei)、杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)等。研究发现,气单胞菌致病性强弱,与其所携带毒力基因的种类和数量密切相关(Janda JM andAbbottSL.The genus Aeromonas:taxonomy,pathogenicity,and infection.Clin MicrobiolRev.2010;23:35-73.)。目前,研究较深入的毒力基因包括,气溶素(编码基因是Aer,下同)、丝氨酸胞外蛋白酶(ahp)、热敏感性胞外蛋白酶(epr)、细胞毒性肠毒素(act)、热稳定细胞兴奋性肠毒素(ast)、热不稳定性细胞兴奋性肠毒素(alt)、溶血素(hly)等。气溶素是一种细胞通道型毒素,具有溶血性、细胞毒性、肠毒性(Li J,Ni XD,Liu YJ,et al.Detectionof three virulence genes alt,ahp and aerA inAeromonas hydrophila and theirrelationship with actualvirulence to zebrafish.J Appl Microbiol.2011;110:823-830);丝氨酸胞外蛋白酶能够破坏宿主的免疫防御系统,有助于细菌吸附、扩散、繁殖,进而引起感染和组织损伤(Yu HB,Zhang YL,Lau YL,et al.Identification andcharacterization of putative virulence genes and gene clusters in Aeromonashydrophila PPD134/91.Appl Environ Microbiol.2005;71(8):4469-4477);热敏感性胞外蛋白酶可协同其他毒力因子共同作用于宿主(Hu M,Wang N,Pan ZH,et al.Identityand virulence properties of Aeromonas isolates from diseased fish,healthycontrols and water environment in China.Lett Appl Microbiol.2012;55:224-233.);肠毒素包括细胞毒性肠毒素、热稳定细胞兴奋性肠毒素以及热不稳定细胞兴奋性肠毒素,它们可通过与宿主细胞发生不可逆结合,引起水样腹泻、肠胃炎,严重时导致宿主死亡(Kingombe CI,D'Aoust JY,Huys G,et al.Multiplex PCR method for detection ofthree Aeromonas enterotoxin genes.Appl Environ Microbiol.2010;76:425-433.);也有认为肠毒素具有溶血性、细胞毒性和肠毒性(Wang G,Clark CG,Liu C,et al.Detectionand characterization of the hemolysin genes in Aeromonas hydrophila andAeromonas sobria by multiplex PCR.J Clin Microbiol.2003;41:1048-1054.);溶血素可导致机体组织溃疡、败血和坏死等病理变化,临床主要表现为败血症(Beaz-Hidalgo Rand Figueras MJ.Aeromonas spp.whole genomes and virulence factors implicatedin fish disease.J Fish Dis.2013;36(4):371-388.)。同种气单胞菌的不同菌株,因其所携带的毒素基因数量和种类不同,其致病力、临床症状以及其所造成的经济损失等明显不同。尽管常规的细菌生化鉴定方法,可以鉴定细菌到种,然而,却无法确定该种细菌是否具有致病性,结果导致往往是正常菌株,却也采用药物进行防控,这样不仅造成不必要的经济损失,而且增强鱼类应激作用,破坏鱼类正常菌群,降低免疫力,导致药残超标等问题,进一步加重经济损失。此外,研究显示,某些气单胞菌毒力因子可通过水产动物和/或水产品等媒介,引起人畜腹泻和食物中毒。因此,建立快速、便捷、高灵敏度的气单胞菌毒力因子检测和鉴定方法十分重要和必要,它不仅有利于正确诊断鱼类(尤其是鳗鲡)气单胞菌病,以及制定科学防控方案,同时,有利于保障水生动物和水产品安全。
多重PCR技术是基于普通PCR技术而发展起来的一种核酸扩增技术,可同时检测和分析多个靶基因,大幅度提高检测效率,降低检测成本。已报道水生动物气单胞菌的多重PCR检测技术,如方兵等建立了同时检测水生动物源气单胞菌粘附素(aha1)、aerA和alt三个主要毒力基因的多重PCR方法(方兵,李槿年,祖国掌,等.应用多重PCR检测水生动物源气单胞菌安徽分离株的毒力基因型分布.水产学报,2005;29(4):473-477);饶静静等建立了以嗜水气单胞菌白16S rRNA、hlyA、aerA为靶基因的三重PCR技术(饶静静,李寿崧,黄克和,等.致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立.中国水产科学,2007;14(5):749-755);符贵红等建立了以嗜水气单胞菌aer、hly、alt、ahp、act为靶基因的五重PCR检测技术(符贵红,肖丹,胡鲲,等.鲫源嗜水气单胞菌毒力基因多重PCR检测及ERIC-PCR分子分型.海洋渔业,2014;36(6):549-556)。然而,上述技术和方法有的仅针对单一菌种如嗜水气单胞菌设计,或仅涉及少数毒力基因,导致其应用范围受限,无法满足生产实际需求。
本申请人长期从事鳗鲡病害研究,分离、鉴定了数百株鳗鲡源气单胞菌,系统研究分析了其毒力基因。前期研究发现,气溶素(Aer)、溶血素(hlyA)、肠毒素(act、ast、alt)、丝氨酸胞外蛋白酶(ahp)、热敏感性胞外蛋白酶(epr)(熊静,余钦,郭松林,等.7株鳗鲡致病性气单胞菌毒力基因胞外产物及其活性比较.华中农业大学学报,2017;36(1):76-85)等胞外毒素是鳗源气单胞菌最常见的主要毒力因子,对鳗鲡毒性强,造成重大的经济损失,然而,迄今,在养殖生产过程尚未对相关毒力基因进行检测和监控。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重PCR方法。
本发明包括以下步骤:
1)筛选引物组合及引物序列
在步骤1)中,所述筛选引物组合及引物序列的具体方法可为:
通过全基因组分析,寻找靶毒力基因的特征性基因片段,选择其中不同种气单胞菌高度保守的区域,作为设计引物的靶序列,按照引物设计原则,设计并合成多对引物,再通过大量单重PCR实验,筛选出PCR扩增效率高、特异性强的引物序列,最后,根据多重PCR检测原理,筛选出可同时检测气单胞菌1个管家基因和7个毒力基因的多重PCR引物组合。所述多重PCR引物组合,包括管家基因(gyrB)、气溶素基因(Aer)、丝氨酸胞外蛋白酶基因(ahp)、热敏感性胞外蛋白酶基因(epr)、3个肠毒素基因(act、ast、alt)和溶血素基因(hlyA),分别为第1套mPCR引物组合(gyrB,aer,ahpA,epr)和第2套mPCR引物组合(act,ast,alt,hlyA)。
所述管家基因gyrB引物对的核酸序列为:
gyrB-F:5’-AAGCAGATTGGCGACAGCAC-3’,或者该序列的核酸互补序列;
gyrB-R:5’-CGTTCAGGATCTTGCCCTTG-3’,或者该序列的核酸互补序列;
gyrB引物对扩增靶基因片段大小约为880bp。
所述丝氨酸胞外蛋白酶基因(ahpA)引物对的核酸序列为:
ahpA-F:5’-TGCCCATCGCTTCAGTTCA-3’,或者该序列的核酸互补序列;
ahpA-R:5’-GTGCGGCTGAACATGTAGTCA-3’,或者该序列的核酸互补序列;
ahpA引物对扩增靶基因片段大小约为720bp。
所述热敏感性胞外蛋白酶基因(epr)引物对的核酸序列为:
epr-F:5’-GATGTCGCTCTTCTGGGTGT-3’,或者该序列的核酸互补序列;
epr-R:5’-CGTTAACCTGACCCTGACCA-3’,或者该序列的核酸互补序列;
epr引物对扩增靶基因片段大小约为460bp。
所述气溶素基因(aer)引物对的核酸序列为:
aer-F:5’-CTCCAAGATCCCGGTGAAGA-3’,或者该序列的核酸互补序列;
aer-R:5’-TGTCCCACTGGTAGCGAATG-3’,或者该序列的核酸互补序列;
aer引物对扩增靶基因片段大小约为220bp。
所述肠毒素基因(act)引物对的核酸序列为:
act-F:5’-TTCCAGACGGTGACGAAGT-3’,或者该序列的核酸互补序列;
act-R:5’-CAGCCTTGTAGAGCTCGATCT-3’,或者该序列的核酸互补序列;
act引物对扩增靶基因片段大小约为620bp。
所述肠毒素基因(ast)引物对的核酸序列为:
ast-F:5’-GTCAGCGACAGCTTCTTCAT-3’,或者该序列的核酸互补序列;
ast-R:5’-CGTCGTCAAACAGAAAGCC-3’,或者该序列的核酸互补序列;
ast引物对扩增靶基因片段大小为约350bp。
所述肠毒素基因(alt)引物对的核酸序列为:
alt-F:5’-CAAGCTGCCCTACTTCCTCT-3’,或者该序列的核酸互补序列;
alt-R:5’-CCACCGGTATCGAACTTGA-3’,或者该序列的核酸互补序列;
alt引物对扩增靶基因片段大小约为820bp。
所述溶血素基因(hlyA)引物对的核酸序列为:
hlyA-F:5’-ATCAGCGATGCCGAGTGTA-3’,或者该序列的核酸互补序列
hlyA-R:5’-TCCTCGTTGAGCTGGATACC-3’,或者该序列的核酸互补序列
hlyA引物对扩增靶基因片段大小约为220bp。
2)致病菌DNA模板制备方法
在步骤2)中,所述致病菌DNA模板制备方法可为:
①煮沸法:挑取单菌落至LB液体培养基,28~30℃,200rpm,培养10~12h;8000~12000rpm离心,收集菌体重悬于灭菌的双蒸馏水,95~100℃煮沸/裂解10min,8000~12000rpm离心,取上清,备用,或-20℃保存。
②其他常用基因组DNA提取试剂盒,所述其他常用基因组DNA提取试剂盒包括天根组织基因组DNA提取试剂盒等。
3)多重PCR反应体系与PCR扩增
在步骤3)中,所述多重PCR反应体系与PCR扩增的具体方法可为:
①多重PCR扩增的反应体系为:
第1套mPCR反应体系:
第2套mPCR反应体系:
10×PCR buffer mixture:150~220mM Tris-HCl(pH 8.0~8.5),150~250MmKCl,50~150mM(NH4)2SO4,0~20mM MgCl2;
dNTPs mixture:dATP、dGTP、dCTP各(8~20mM),dTTP和dUTP各(5~15mM);
②多重PCR扩增的扩增条件如下:
98℃预变性4min,98℃变性30s,58~60℃退火30s,72℃延伸30s,进行30~35个循环后,然后再72℃温度延伸7min,完成PCR扩增,扩增产物4℃保存。
4)多重PCR产物检测和结果判读
在步骤4)中,所述多重PCR产物检测和结果判读的具体方法可为:
①电泳:对步骤3)中得到的扩增产物进行凝胶电泳检测,1.2%的琼脂糖凝胶,电压为100~140V,电泳30~45min;
②结果判读:
第1套mPCR扩增结果,所述第1套mPCR为检测靶基因为gyrB\ahpA\epr\aer:
若约880bp处出现条带,表明样品中含gyrB基因,属于气单胞菌;
若约720bp处出现条带,表明样品中含有ahpA毒力基因;
若约460bp处出现条带,表明样品中含有epr毒力基因;
若约220bp处出现条带,表明样品中aer含有毒力基因;
若同时在上述不同相应位置出现条带,则表明该样品中含有多个相应的毒力基因。
第2套mPCR扩增结果,所述第2套mPCR为检测靶基因为alt\act\ast\hlyA:
若约820bp处出现条带,表明样品中含有alt毒力基因;
若约620bp处出现条带,表明样品中含有act毒力基因;
若约350bp处出现条带,表明样品中含有ast毒力基因;
若约220bp处出现条带,表明样品中含有hlyA毒力基因。
若同时在上述不同相应位置出现条带,则表明该样品中含有多个相应的毒力基因。
本发明通过两个PCR反应,可高效、特异、灵敏地检测和鉴定出样品中是否存在气单胞菌,以及1~7种不等的毒力基因[包括气溶素(Aer)、溶血素(hlyA)、肠毒素(act、ast、alt)、丝氨酸胞外蛋白酶(ahp)和热敏感性胞外蛋白酶(epr)等7种]的多重PCR检测方法。适于快速鉴定鱼类(尤其是鳗鲡)气单胞菌的致病菌株和普通菌株,可适用于鱼类(尤其是鳗鲡)气单胞菌病的分子辅助诊断,以及该类疾病的确诊。
本发明以气单胞菌属内基因序列高度保守的管家基因(gyrB)为靶基因,可用于确定所检测样品中是否含有气单胞菌。进一步比较分析了鳗鲡源致病性气单胞菌中最重要的7个毒力基因的基因组序列,即气溶素(Aer)、溶血素(hlyA)、肠毒素(act、ast、alt)、丝氨酸胞外蛋白酶(ahp)和热敏感性胞外蛋白酶(epr),筛选出具有不同基因特征、特异性强、区分度高的片段作为靶基因片段,结合多重PCR对产物片段大小区别的要求,以及引物退火温度的兼容性和扩增效率等因素,设计了2套四重PCR,利用该试剂可实现同时检测鳗鲡源致病性气单胞菌7种毒力基因;最后,经过优化反应体系,以及实验可靠性验证等工作,确定了本发明的多重PCR检测技术。本发明不仅具有普通单重PCR技术鉴定致病性菌株毒力基因的能力,而且具有单重PCR所无法比拟的优点,如检测时间短、试剂成本低以及初步比较不同毒力基因的表达量等。本发明特别适用于鳗鲡源致病性气单胞菌的检测该方法,也可适于其他动物的致病性气单胞菌该7种毒力基因检测。
与现有的技术相比,本发明的突出技术效果如下:
本发明只需要提取一次样品的DNA,进行两管PCR反应,即可高敏感性、高特异性地检测和鉴定出样品中是否含有气单胞菌、该气单胞菌是否为致病性菌株、菌株中含有Aer,ahp,epr,act,ast,alt,hlyA等7个毒力基因中的哪几个、以及该菌株中不同毒力基因的相对量等。
本发明的多重PCR检测法,根据气单胞菌的管家基因及7个毒力基因的特征性基因序列做了靶序列,结合引物的扩增效率,以及兼顾基因的种属差异,优化组合,经过实验验证,优选了其中八对PCR引物,组合成两套四重PCR反应体系。与普通PCR方法相比,本发明具有成本低、操作便捷、检测所需时间短、可直观比较多种毒力基因的含量,适于气单胞菌的致病菌株和正常菌株的鉴定和检测,涵盖了水生动物致病性气单胞菌几乎全部的胞外毒素基因。
本发明适用于水产动物养殖全过程监控,适用于不同样品类型,包括水体、底泥、养殖动物(不同发育阶段,不同组织/器官)以及水产品等,监控其是否含有气单胞菌、以及是普通或致病性气单胞菌、并可鉴定致病性气单胞菌所含的毒力基因种类、及相对表达量。
附图说明
图1为8个靶基因的单重PCR扩增的电泳图谱。在图1中,A为第1套体系中4个靶基因(gyrB\ahpA\epr\aer)单重PCR扩增结果;B为第2套体系中4个靶基因(alt\act\ast\hlyA)单重PCR扩增结果。
图2为引物比例对多重PCR扩增影响的电泳图谱。在图2中,以8个靶基因PCR产物混合物为模板(靶基因拷贝数约为2×105copy/μL),在不同引物浓度比例下,多重扩增的不同效果。其中,A为第1套反应体系中靶基因(gyrB\ahpA\epr\Aer)不同引物浓度对4重PCR扩增效果的影响。引物浓度(gyrB:ahpA:epr:aer)分别为:泳道1为0.6:0.4:0.3:0.2;泳道2为0.4:0.3:0.3:0.2;泳道3为0.4:0.3:0.2:0.2;泳道4为0.4:0.2:0.2:0.2;泳道5为0.3:0.3:0.2:0.2;泳道6为0.3:0.2:0.2:0.2;泳道7为0.2:0.2:0.2:0.2。单位为μM。结果显示:不同引物浓度比对多重PCR扩增效率影响不大。后续选择泳道4的引物浓度0.4:0.2:0.2:0.2作为后续研究。B为第2套反应体系中靶基因(alt\act\ast\hlyA)不同引物浓度对4重PCR扩增效果的影响。引物浓度比(alt:act:ast:hlyA)分别为:泳道1为0.8:0.6:0.4:0.2;泳道2为0.6:0.6:0.4:0.2;泳道3为0.4:0.4:0.4:0.2;泳道4为0.2:0.2:0.2:0.2;泳道5为1.0:0.6:0.2:0.2;泳道6为1.0:0.4:0.3:0.2;泳道7为0.8:0.6:0.4:0.2;泳道8为0.8:0.6:0.3:0.2。单位为μM。结果显示:不同引物浓度对扩增效率影响比较大。后续选择泳道3的引物浓度0.4:0.4:0.4:0.2作为后续研究。
图3为退火温度优化的电泳图谱。在图3中,1~6:退火温度依次为56℃,57℃,58℃,59℃,60℃,61℃(第1套反应体系);7~12:退火温度依次为56℃,57℃,58℃,59℃,60℃,61℃(第2套反应体系)。结果显示:不同退火温度对第1套反应体系多重PCR扩增的影响大于第2套反应体系。综合考虑,选择最佳退火温度为59℃。
图4为多重PCR灵敏度测定的电泳图谱。在图4中,将8个靶基因PCR产物的混合物,进行10倍梯度稀释作为模板(靶基因拷贝数调整到2×108~2×101copy/μL)。结果显示:第1套反应体系灵敏度为2×102copy/μL(A);第2套反应体系灵敏度为2×101copy/μL(B)。
图5为多重PCR特异性检测的电泳图谱。在图5中,泳道1~10分别是鳗鲡源的不同种气单胞菌(分别为B1001,B1002,GIMI.172,B1003,B1201,B1004,B1101,B1202,CGMCC1.2205和B1005),经多重PCR扩增后的产物电泳图谱;泳道11~15是不同致病性菌株混合物(分别为B1002&GIMI.172,GIMI.172&B1003,B1003&B1201,B1201&B1004,B1101&B1202);泳道16是8株非气单胞菌(ATCC6538,ATCC9027,ATCC13883,B1401,B1501,B1502,B1503,B1601)的多重PCR扩增产物电泳图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明实施例包括以下步骤:
步骤1:菌株的培养
保种菌株,划线接种于LB平板,28℃过夜培养,挑取单菌落移接到1mL液体LB培养基中,过夜培养(约10~12h)。
步骤2:基因组DNA模板的提取
①利用天根DNA试剂盒抽提基因组DNA;
或②挑取单菌落至LB液体培养基,28~30℃,200rpm,培养10~12h;8000~12000rpm离心,收集菌体重悬于灭菌的双蒸馏水,95~100℃煮沸/裂解10min,8000~12000rpm离心,取上清-20℃保存备用;
或③利用天根组织基因组DNA提取试剂盒,具体参照试剂盒说明书,提取各种组织样本。
步骤3:引物设计
对NBCI数据库中气单胞菌基因组数据库进行多重比对,结合毒力基因的核苷酸序列,通过BLAST多重比对,筛选出不同气单胞菌中该基因的高度保守区域,利用DNAMAN软件设计并优化引物。根据多重PCR检测原理,设计不同片段小大的靶基因扩增引物对。
步骤4:单重PCR扩增方法的建立
首先通过单基因特异性PCR,探索每对引物组扩增对应基因片段的反应体系和反应条件。通过DNA提取试剂盒分别提取实验室保种的18株病原菌基因组DNA,作为各自引物组的扩增模板。通过优化退火温度、引物浓度等反应条件,确定各个靶基因的最佳扩增条件。
PCR反应条件:98℃预变性5min,98℃变性30s,56~61℃退火30~40s,72℃延伸30~60s,进行30~35个循环后,然后72℃终延伸10min。凝胶电泳检测,筛选出扩增成功的引物对。
结果显示:这8个基因在10株不同气单胞菌菌株中的分布不同,从嗜水气单胞菌B1001中同时扩增出了这8个靶基因。而非气单胞菌均没有任何扩增。同时发现,这8个靶基因均可以在56~62℃,引物浓度为0.1~0.8μM,在28~32个扩增循环均可有效扩增预期大小的靶基因片段,扩增效果无明显差异。
步骤5:重组质粒的构建
以B1001基因组为模板,以上述8对引物进行单重PCR扩增,胶回收PCR产物,与PMD19-T载体连接,转化感受态大肠杆菌,构建重组质粒。提取阳性质粒,调整靶基因浓度约1×109copy/μL,建立多重PCR检测方法,研究其最佳反应条件。
步骤6:多重PCR反应体系和反应条件优化试验
在单基因特异性PCR反应的基础上,以B1001为基因组模板或以各个靶基因的阳性质粒为模板,调整靶基因浓度约1×109copy/μL,根据不同靶基因片段大小差异,组合成2套mPCR引物组合:第1套mPCR(检测靶基因gyrB\ahpA\epr\Aer);第2套mPCR(检测靶基因alt\act\ast\hlyA)。
建立多重PCR检测方法,优化反应条件。
①引物浓度的优化
根据多重PCR扩增原理,在多重PCR扩增过程中存在着扩增效率的差异,理论上讲扩增片段越长扩增效率越差。为此,优化了引物终浓度,即从0.2,0.3,0.4,0.6,0.8(μM)。结果显示:不同引物浓度对2套反应体系的扩增效率影响不同,其中,第1套反应体系的扩增效率影响不大,而对第2套的扩增效率影响较大(图1)。综合本发明其他相关的研究结果,选择gyrB:ahpA:epr:aer为0.4:0.2:0.2:0.2(μM)和alt:act:ast:hlyA为0.4:0.4:0.4:0.2(μM)为最佳引物浓度比。
②退火温度的优化
引物比例对多重PCR扩增影响的电泳图谱参见图2。
在单重PCR扩增体系中,8对引物中每一对均可在退火温度为56~61℃时,有效扩增目的产物,因此,拟以上述最佳优化后的引物浓度,对多重PCR进行退火温度的优化。结果显示:第1套反应体系的退火温度为56~60℃时,4对引物的扩增效果均较好,尤其59℃扩增效果最好(图3);而第2套反应体系的退火温度为56~61℃时,扩增效果无明显差异。综合今后的应用前景和实际,选择两套反应体系的退火温度均为59℃。
步骤7:敏感性试验
回收8个靶基因的扩增产物,混合后进行10倍梯度稀释作为模板(调整混合物中每个靶基因拷贝数依次为2×108~2×101copy/μL)。结果显示:第1套反应体系灵敏度为2×102copy/μL;第2套反应体系灵敏度为2×101copy/μL(图4)。
步骤8:特异性试验
以18株试验菌株(本发明所用病原菌信息参见表1)为研究对象,检测两套反应体系的多重PCR扩增的特异性。
表1
结果显示:分别以10株气单胞菌单独为模板,采用2套反应体系进行多重PCR扩增,其结果与单重PCR的结果一致(图5中的A);以菌株混合模板进行多重PCR扩增,结果显示:气单胞菌混合模板,均可有效扩增出预期所有毒力基因,与单重PCR结果一致;非-气单胞菌混合模板,多重PCR结果显示,均无明显条带出现,表明无非-特异性扩增现象,其结果与单独以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、创伤弧菌、溶藻弧菌等非气单胞菌属的病原菌为模板的PCR扩增结果一致(图5中的B)。上述结果说明这2套反应体系特异性良好。
步骤9:人工感染试验后的样本检测
保种菌株嗜水气单胞菌B1001,划线接种于LB平板,28℃过夜培养,挑取单菌落LB液体培养基16~18h,参照国家标准(GB/T4789.2-2003)进行细菌计数,将菌液浓度调整为2×108cfu/mL,接着进行10倍梯度稀释后,人工感染日本鳗鲡,鳗鲡规格(80±10)g,腹腔感染,分别在12h,24h,36h,48h。
1)取临床症状明显的鳗鲡6尾,解剖取病灶部位,分别取鳃、肝脏、肾脏等组织/器官。按照天根组织提取试剂盒方法提取组织DNA进行检测。结果显示:自12h开始就可以在鳃、肝脏、肾脏中检测B1001菌株的各个毒力基因。
2)取健康相同鳗鲡中相同组织按上述方法制的的DNA模板为阴性模板。检测结果为阴性。
步骤10:临床检测
组织样本:于福建省诏安某养鳗场分别取表观正常与有明显发病症状(鳍条发红,红头,肝肿大充血)的鳗鲡分别为10尾和3尾(取样时,发病鳗鲡少),分别取其肝脏、肾脏等组织器官。按照步骤9中的方法进行检测。结果显示:表观正常的鳗鲡中仅有1尾检测了ast和hlyA毒力基因,其他尾均没有检测到上述毒力基因;在3尾具有症状的鳗鲡肝脏和肾脏部位,则同时检测到了aerA、ahpA、epr和ast和hlyA等5个毒力基因。
序列表
<110> 集美大学
<120> 一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重PCR方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 1
aagcagattg gcgacagcac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 2
cgttcaggat cttgcccttg 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 3
tgcccatcgc ttcagttca 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 4
gtgcggctga acatgtagtc a 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 5
gatgtcgctc ttctgggtgt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 6
cgttaacctg accctgacca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 7
ctccaagatc ccggtgaaga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 8
tgtcccactg gtagcgaatg 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 9
ttccagacgg tgacgaagt 19
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 10
cagccttgta gagctcgatc t 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 11
gtcagcgaca gcttcttcat 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 12
cgtcgtcaaa cagaaagcc 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 13
caagctgccc tacttcctct 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 14
ccaccggtat cgaacttga 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 15
atcagcgatg ccgagtgta 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 16
tcctcgttga gctggatacc 20
Claims (1)
1.一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重PCR方法,其特征在于所述方法不涉及疾病诊断与治疗,包括以下步骤:
1)筛选引物组合及引物序列;
所述筛选引物组合具体为:
通过全基因组分析,寻找靶毒力基因的特征性基因片段,选择其中不同种气单胞菌高度保守的区域,作为设计引物的靶序列,按照引物设计原则,设计并合成多对引物,再通过大量单重PCR实验,筛选出扩增效率高、特异性强的引物序列,最后,根据多重PCR原理,筛选出一种同时检测气单胞菌1个管家基因和7个毒力基因的多重PCR引物组合,所述多重PCR引物组合包括:管家基因gyrB,气溶素基因Aer,丝氨酸胞外蛋白酶基因ahp,热敏感性胞外蛋白酶基因epr,3个肠毒素基因act、ast、alt和溶血素基因hlyA;并组合成两套四重PCR引物,分别为第1套mPCR引物组合和第2套mPCR引物组合,所述第1套mPCR引物组合包括gyrB、aer、ahpA、epr;所述第2套mPCR引物组合包括act、ast、alt、hlyA;
所述引物序列,具体为:
所述管家基因gyrB引物对的核酸序列为:
gyrB-F:5’-AAGCAGATTGGCGACAGCAC-3’,或者该序列的核酸互补序列;
gyrB-R:5’-CGTTCAGGATCTTGCCCTTG-3’,或者该序列的核酸互补序列;
gyrB引物对扩增靶基因片段大小约为880bp;
所述丝氨酸胞外蛋白酶基因(ahpA)引物对的核酸序列为:
ahpA-F:5’-TGCCCATCGCTTCAGTTCA-3’,或者该序列的核酸互补序列;
ahpA-R:5’-GTGCGGCTGAACATGTAGTCA-3’,或者该序列的核酸互补序列;
ahpA引物对扩增靶基因片段大小约为720bp;
所述热敏感性胞外蛋白酶基因(epr)引物对的核酸序列为:
epr-F:5’-GATGTCGCTCTTCTGGGTGT-3’,或者该序列的核酸互补序列;
epr-R:5’-CGTTAACCTGACCCTGACCA-3’,或者该序列的核酸互补序列;
epr引物对扩增靶基因片段大小约为460bp;
所述气溶素基因(aer)引物对的核酸序列为:
aer-F:5’-CTCCAAGATCCCGGTGAAGA-3’,或者该序列的核酸互补序列;
aer-R:5’-TGTCCCACTGGTAGCGAATG-3’,或者该序列的核酸互补序列;
aer引物对扩增靶基因片段大小约为220bp;
所述肠毒素基因(act)引物对的核酸序列为:
act-F:5’-TTCCAGACGGTGACGAAGT-3’,或者该序列的核酸互补序列;
act-R:5’-CAGCCTTGTAGAGCTCGATCT-3’,或者该序列的核酸互补序列;
act引物对扩增靶基因片段大小约为620bp;
所述肠毒素基因(ast)引物对的核酸序列为:
ast-F:5’-GTCAGCGACAGCTTCTTCAT-3’,或者该序列的核酸互补序列;
ast-R:5’-CGTCGTCAAACAGAAAGCC-3’,或者该序列的核酸互补序列;
ast引物对扩增靶基因片段大小为约350bp;
所述肠毒素基因(alt)引物对的核酸序列为:
alt-F:5’-CAAGCTGCCCTACTTCCTCT-3’,或者该序列的核酸互补序列;
alt-R:5’-CCACCGGTATCGAACTTGA-3’,或者该序列的核酸互补序列;
alt引物对扩增靶基因片段大小约为820bp;
所述溶血素基因(hlyA)引物对的核酸序列为:
hlyA-F:5’-ATCAGCGATGCCGAGTGTA-3’,或者该序列的核酸互补序列
hlyA-R:5’-TCCTCGTTGAGCTGGATACC-3’,或者该序列的核酸互补序列
hlyA引物对扩增靶基因片段大小约为220bp;
2)多重PCR反应体系与扩增条件;
所述多重PCR反应体系,具体为:
①多重PCR扩增的反应体系为:
第1套mPCR反应体系:
第2套mPCR反应体系:
10×PCR buffer mixture:150~220mM Tris-HCl,pH 8.0~8.5,150~250Mm KCl,50~150Mm(NH4)2SO4,0~20mM MgCl2;
dNTPs mixture:dATP、dGTP、dCTP各8~20mM,dTTP和dUTP各5~15mM;
②多重PCR的扩增条件如下:
98℃预变性4min,98℃变性30s,58~60℃退火30s,72℃延伸30s,进行30~35个循环后,然后再72℃温度延伸7min,完成PCR扩增,扩增产物4℃保存;
3)多重PCR产物检测和结果判读,具体方法为:
①电泳:对步骤2)中得到的扩增产物进行凝胶电泳检测,1.2%的琼脂糖凝胶,电压为100~140V,电泳30~45min;
②结果判读:
第1套mPCR扩增结果,所述第1套mPCR为检测靶基因为gyrB\ahpA\epr\aer:
若约880bp处出现条带,表明样品中含gyrB基因,属于气单胞菌;
若约720bp处出现条带,表明样品中含有ahpA毒力基因;
若约460bp处出现条带,表明样品中含有epr毒力基因;
若约220bp处出现条带,表明样品中aer含有毒力基因;
若同时在上述不同相应位置出现条带,则表明该样品中含有多个相应的毒力基因;
第2套mPCR扩增结果,所述第2套mPCR为检测靶基因为alt\act\ast\hlyA:
若约820bp处出现条带,表明样品中含有alt毒力基因;
若约620bp处出现条带,表明样品中含有act毒力基因;
若约350bp处出现条带,表明样品中含有ast毒力基因;
若约220bp处出现条带,表明样品中含有hlyA毒力基因;
若同时在上述不同相应位置出现条带,则表明该样品中含有多个相应的毒力基因。
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