CN113151524B - 一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)的引物对及其应用，属于生物技术领域。所述引物对包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为：5’‑TTCACCGACTACACCAGTGC‑3’；5’‑CATCAGTTCGTAGTGGCGGT‑3’。本发明提供的引物对特异性好且灵敏度高，能够特异性扩增出西瓜细菌性果斑病菌特有的基因片段，利用该引物对实现对西瓜细菌性果斑病菌的准确鉴定，对西瓜细菌性果斑病菌DNA的最低检测浓度达到40pg/μL。利用本发明提供的检测方法可以快速准确鉴定西瓜样品中的西瓜细菌性果斑病菌，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测和鉴别西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)的引物对及检测方法。
背景技术
西瓜是传统的夏令水果，我国作为世界上西瓜种植面积最大的国家，一直将其作为种植业结构调整中优先发展的主导产品，西瓜产业的健康发展在促进农民增收、调节茬口布局、丰富果品市场等方面具有重要的作用，近年来随着生活水平的提高，种植户和消费者也越来越关注瓜果的品质等问题。
西瓜细菌性果斑病于1987年首次在美国发现，此后在世界范围内广泛发生。近年来，我国有20多个省和自治区 受到了西瓜细菌性果斑病的侵染，山东、宁夏、内蒙古和新疆更成为了果斑病发生的重灾区，由于该病害发生危害大、损失重，对我国的西瓜产业存在着巨大的威胁，所以我国已将其列为重要的进境检疫性有害生物和全国农业植物检疫性有害生物，西瓜细菌性果斑病的防控已成为国内外西瓜生产上亟待解决的突出问题。
西甜瓜细菌性果斑病病原为Acidovorax citrulli，它可以侵染多种葫芦科作物，如西瓜、甜瓜、南瓜、黄瓜等，造成蔬果减产甚至绝收。初侵染源主要有种子带菌、其他植物病残体和土壤病残体等，病原菌可以通过灌溉、机械以及农事操作进行传播扩散，种子带菌是病原菌传播最主要的方式，病菌在西瓜种子上可存活19年，目前针对该病原菌无有效的防治方法和抗病品种。
目前，西瓜细菌性果斑病的检测主要以基于聚合酶链式反应(PCR)的分子生物学检测为主，如常规PCR、荧光定量PCR、免疫PCR等，PCR 检测的可靠性对于明确病原菌的种类，监测病原菌的分布，预警病害的发生和流行以及有效的病害防控至关重要，因此，需要设计高度特异的引物来确保PCR检测结果的准确性。21世纪以来，随着基因组学的快速发展和西瓜细菌性果斑病的日趋严重，许多研究开始基于西瓜嗜酸菌 (Acidovorax citrulli)的16S rRNA基因和ITS序列设计引物，但是由于西瓜嗜酸菌16S rRNA基因和ITS序列在嗜酸菌属内有很高的同源性，并不能完全区分开西瓜嗜酸菌和其近缘种，导致设计的引物特异性较低，在检测中常常出现假阳性；还有一些针对细菌的功能基因设计的引物，如针对Acidovorax citrulli的HRP(Hypersensitivereaction and pathogenicity gene)基因设计的引物HB2F2/HB2R2，但是这对引物不能区分西瓜细菌性果斑病菌和嗜酸菌属的另2个种(Acidovorax avenae；Acidovorax cattleyae)；针对 Acidovorax citrulli的YD-repeatprotein设计的引物AC158F/AC158R不能区分有效的区分Acidovorax citrulli和Acidovorax avenae；针对Box-PCR 产物设计的引物BX-L1/BX-S-R2和BoxAACF/BoxAACR2虽然在特异性方面优于其他引物，但不能完全区分开Acidovorax citrulli和Acidovoraxavenae的一些菌株。
综上，为了防止交叉反应，准确的对西瓜细菌性果斑病进行检测，还需要进一步加强设计引物的专化性和灵敏度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够准确鉴定和检疫西瓜细菌性果斑病菌的方法，以克服现有PCR方法检测西瓜细菌性果斑病菌存在的引物特异性低或通用性低、检测易出现假阳性或假阴性的缺点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明利用PGAP进行泛基因组学分析，将西瓜细菌性果斑病菌 (Acidovoraxcitrulli)各菌株的全基因组序列提交至RAST(Rapid Annotation using SubsystemTechnology)原核生物基因组注释网站 (http://rast.nmpdr.org/)进行注释，以消除不同注释工具识别编码基因的差异。从运行PGAP得到的Orthologs_Cluster结果中找到Acidovorax citrulli 种所有菌株都有但其他菌株没有的特异性标志蛋白，将它们的氨基酸序列在NCBI非冗余蛋白数据库中用默认设置进行在线BLASTP检索，排除在其他科属菌株有同源序列的蛋白，最后将特有蛋白的编码基因的核苷酸序列在Acidovorax citrulli种所有菌株全基因组序列组成的数据库中进行本地BLASTN，以再次确定序列仅在种内有高度同源性，确定登录号为WP_017438750.1的蛋白为Acidovorax citrulli特有蛋白。
针对Acidovorax citrulli特有蛋白设计引物，在NCBI数据库中Blast 评估引物对Acidovorax citrulli种各菌株的通用性和特异性。选择通用性和特异性强的引物，对Acidovorax citrulli种各菌株和近缘种进行PCR检测，检验引物的通用性和特异性，确定Acidovorax citrulli的特异引物。
本发明提供了一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli) 的引物对，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为：
上游引物：5’-TTCACCGACTACACCAGTGC-3’；
下游引物：5’-CATCAGTTCGTAGTGGCGGT-3’。
利用上述引物能够特异性扩增出西瓜细菌性果斑病菌的目标片段，长度为102bp。
本发明还提供了所述的引物对在检测西瓜细菌性果斑病菌 (Acidovoraxcitrulli)中的应用。
本发明还提供了所述的引物对在制备检测西瓜细菌性果斑病菌 (Acidovoraxcitrulli)的试剂盒中的应用。
所述试剂盒中包含建立PCR反应体系所需的试剂，除了所述引物对，还包括PCR缓冲液、Taq聚合酶。
进一步的，所述试剂盒中还包含阳性对照和阴性对照。
本发明还提供了一种检测西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)的方法，包括以下步骤：
(1)以待测样品的DNA作为扩增模板，采用所述的引物对，建立PCR 反应体系，进行PCR扩增；
(2)检测扩增产物，若扩增出102bp的DNA片段，则判断待测样品中含有西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)；否则，则判断待测样品中不含西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)。
步骤(1)中，扩增模板采用细菌、提取的细菌DNA或含有细菌/细菌 DNA的粗提液。
本发明所述方法是用DNA引物扩增DNA模板的方法，包括使用常规PCR扩增后通过凝胶电泳检测扩增结果，也可以是其他衍生的方法。检测的结果说明样品中是否含有特定的DNA片段，检测的对象可以是提取纯化的DNA、细菌菌体、含有细菌或细菌DNA的样品(如植物组织、种子等)。
作为优选，以每25μL计，PCR反应体系组成为：40ng/μL的DNA 模板1μL、10μM的上游引物1μL、10μM的下游引物1μL、2×Taq PCR Mix 12.5μL、无菌超纯水补足。
作为优选，PCR扩增程序为：1)94℃预变性5min；2)94℃变30s， 57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；3)72℃延伸5min，4℃终止反应。
作为优选，利用琼脂凝胶电泳技术检测PCR扩增产物。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明提供的引物对特异性好且灵敏度高，能够特异性扩增出西瓜细菌性果斑病菌特有的基因片段，利用该引物对实现对西瓜细菌性果斑病菌的准确鉴定，对西瓜细菌性果斑病菌DNA的最低检测浓度达到40 pg/μL。
(2)利用本发明提供的检测方法可以快速准确鉴定西瓜样品(种子，种苗)中的西瓜细菌性果斑病菌，无需病原菌培养、性状分析等复杂操作，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为以菌体DNA为模板进行PCR检测引物特异性的电泳结果图；其中，M为DNA分子量标准，1泳道为Acidovorax citrulli Aac1，2泳道为A.citrulli Aac2，3泳道为A.citrulli AH01，4泳道为A.citrulli HB02，5 泳道为A.citrulli SD01，6泳道为A.citrulli XJL12，7泳道为A.avenae CGMCC 1.1726T，8泳道为A.oryzae CGMCC 1.1728T，9泳道为A.oryzae RS1，10泳道为A.oryzae RS2，11泳道为A.delafieldii CGMCC 1.2784T，12泳道为A.soli DSM 25157T，13泳道为水代替DNA的阴性对照。
图2为以10倍梯度稀释的西瓜细菌性果斑病菌DNA为模板进行PCR 检测的电泳结果图；M为DNA分子量标准，1-7泳道DNA浓度依次为 40ng/μL、4ng/μL、400pg/μL、40pg/μL、4ng/μL、400fg/μL、40fg/μL 的西瓜细菌性果斑病菌DNA为模板。
图3为对模拟样品进行PCR检测的电泳结果图；其中，M为DNA分子量标准，1泳道为健康西瓜种子样品，2泳道为人工模拟带菌种子样品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于此。若无特别说明，下述实施例中采用的实验方法均为常规技术手段，采用的试剂、原材料均为市售商品。
实施例1
设计用于西瓜细菌性果斑病菌检测的特异引物
1、根据NCBI基因组数据库中西瓜细菌性果斑病菌的基因组序列，用PGAP对西瓜果斑病菌和其近缘种进行泛基因组学分析，找到 Acidovorax citrulli种所有菌株都有但其他近缘种没有的特异性标志蛋白，之后将特有蛋白的编码基因的核苷酸序列在Acidovoraxcitrulli种所有菌株全基因组序列组成的数据库中进行本地BLASTN，以再次确定序列仅在种内有高度同源性，确定登录号为WP_017438750.1的蛋白为Acidovorax citrulli特有蛋白。
2、针对Acidovorax citrulli特有蛋白设计引物，在NCBI数据库中Blast 评估引物对Acidovorax citrulli种各菌株的通用性和特异性。
根据靶标基因设计了20对用于西瓜细菌性果斑病菌检测的引物对：
上游引物Aac1F：5’-TTCACCGACTACACCAGTGC-3’
下游引物Aac1R：5’-CATCAGTTCGTAGTGGCGGT-3’
上游引物Aac2F：5’-CCGCCACTACGAACTGATGT-3’
下游引物Aac2R：5’-TTCGACCAGGAAGATGTCGC-3’
上游引物Aac3F：5’-GACCGGTATCGCTGGTCTTC-3’
下游引物Aac3R：5’-GACCGGTATCGCTGGTCTTC-3’
上游引物Aac4F：5’-GACTATATGCGCAGCGGGAT-3’
下游引物Aac4R：5’-TCGCATCCATGAGTTCCGAG-3’
上游引物Aac5F：5’-GCATCAGTGCATCCTCCACA-3’
下游引物Aac5R：5’-CACCGATGTTTCGTTAGCGG-3’
上游引物Aac6F：5’-ATGCTGCCCACTTACTTCGT-3’
下游引物Aac6R：5’-CCTGAGTGGCAGAGGTTGAT-3’
上游引物Aac7F：5’-ACTCAGTGCTTTGCGCATCT-3’
下游引物Aac7R：5’-GATATTCCGGAGCGAACCCG-3’
上游引物Aac8F：5’-TTCACCGACTACACCAGTGC-3’
下游引物Aac8R：5’-CATCAGTTCGTAGTGGCGGT-3’
上游引物Aac9F：5’-CCGGACATATTATTCGTGGTCA-3’
下游引物Aac9R：5’-GCGTGACTCCTGTAATGCGA-3’
上游引物Aac10F：5’-CCGTCATCCAGCAACTCTCA-3’
下游引物Aac10R：5’-CATACTCCCCAGCTGCCTTG-3’
上游引物Aac11F：5’-ATTGCGCATGACGACAGTTC-3’
下游引物Aac11R：5’-GCATCGCTTTGGATGTCAGG-3’
上游引物Aac12F：5’-ATCGGTGGAGAAGTTTGGCA-3’
下游引物Aac12R：5’-TGTTCGTCACCGTTTTCAGC-3’
上游引物Aac13F：5’-CCTGGGTCGCATCTCCATAC-3’
下游引物Aac13R：5’-CATCCCTTCGATCCAGCTCC-3’
上游引物Aac14F：5’-ATGCAAAAACGCGAATGGCT-3’
下游引物Aac14R：5’-GGAGCATCCCTTCGATCCAG-3’
上游引物Aac15F：5’-CGATCTGTTCTCGGTGCTGT-3’
下游引物Aac15R：5’-ACAACTCCGTGCTGTAGGTG-3’
上游引物Aac16F：5’-CATTGCGGCTTCGATACGTC-3’
下游引物Aac16R：5’-CACAACTCCGTGCTGTAGGT-3’
上游引物Aac17F：5’-CTCAGCTACGACCTGCTCTG-3’
下游引物Aac17R：5’-CCTTCGATCCAGCTCCACTG-3’
上游引物Aac18F：5’-TTCTCGTATCGCTCAAGGCG-3’
下游引物Aac18R：5’-GTATGGAGATGCGACCCAGG-3’
上游引物Aac19F：5’-CTCTCTGCTGTTCGTCTGGG-3’
下游引物Aac19R：5’-GACGTATCGAAGCCGCAATG-3’
上游引物Aac20F：5’-ACGGATGCAAAAACGCGAAT-3’
下游引物Aac20R：5’-CAGAGCAGGTCGTAGCTGAG-3’
经常规PCR实验筛选，仅引物对Aac1F/Aac1R具有良好的特异性。
实施例2
西瓜细菌性果斑病菌分子检测方法的建立
1)待测样品的DNA提取
挑取待检测菌株单菌落于5mL NA液体培养基中，220r·min-1，30℃摇床中震荡培养12h，至浓度为108CFU·mL-1，离心收集菌体，利用 TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，紫外分光光度计Nanodrop 2000检测提取DNA质量和浓度，-20℃备用。
2)PCR扩增体系和方法的建立
PCR扩增反应体系为25μL体系，具体为：1μL DNA模板、1μL上游引物Aac1F、1μL下游引物Aac1R、12.5μL 2×Hieff PCP Master Mix、 9.5μL ddH2O。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s， 72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，4℃终止反应。
扩增结束后，将PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖在0.5×TBE缓冲液中进行电泳检测。
实施例3
西瓜细菌性果斑病菌引物对特异性检测
供试菌株：西瓜细菌性果斑病菌病菌6株，分别为：西瓜嗜酸菌 Acidovoraxcitrulli Aac1，Acidovorax citrulli Aac2，Acidovorax citrulli AH01， Acidovoraxcitrulli HB02，Acidovorax citrulli SD01，Acidovorax citrulli XJL12，均由本实验室保存；
对照菌株6株，分别为：水稻嗜酸菌Acidovorax oryzae RS1和 Acidovoraxoryzae RS2均由本实验室保存，水稻嗜酸菌Acidovorax oryzae CGMCC 1.1728T、燕麦嗜酸菌Acidovorax avenae CGMCC 1.1726T、德拉菲尔德嗜酸菌Acidovorax delafieldiiCGMCC 1.2784T购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，土壤嗜酸菌Acidovorax soli DSM25157T购自中国海洋微生物菌种保藏管理中心。
提取6株西瓜细菌性果斑病菌病菌及6株参比菌株DNA，各取1μL DNA溶液为模板，用引物对Aac1F和Aac1R，在25μL反应体系中，以实施例2的扩增体系及程序进行PCR，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图1所示。
显示从所有Acidovorax citrulli种菌株的基因组DNA中扩增出了102 bp的目标片段，而从其他近缘种细菌基因组DNA中没有扩增出核酸片段。引物Aac1F和Aac1R具有检测和鉴别西瓜细菌性果斑病菌的特异性。
实施例4
西瓜细菌性果斑病菌引物对灵敏度检测
将浓度为40ng/μL的Acidovorax citrulli SD01基因组DNA以10倍系列稀释8个梯度，各取1μL DNA溶液为模板，用引物对Aac1F和Aac1R，在25μL反应体系中，以实施例2的扩增体系及程序进行PCR，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(102bp)，结果如图2所示。显示可检测DNA的最低浓度为40pg/μL。
实施例5
人工模拟带菌西瓜种子检测
将西瓜细菌性果斑病菌在营养琼脂(NA)培养基上划线培养，挑取单菌落于NA液体培养基中，30℃、220rpm/min条件下过夜震荡培养，利用分光光度计测定菌液OD600＝0.8时，菌悬液的浓度为108cfu/mL(连续平板稀释法测定)，用浓度为108cfu/mL的菌悬液浸泡健康西瓜种子2h，倒掉菌悬液后，将带菌种子室温风干，用无菌水浸泡3h后，以健康西瓜种子的浸出液为对照，各取1μL以实施例2的扩增体系及程序进行PCR，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图3所示。
显示从人工带菌西瓜种子浸出液中可扩增出102bp的目标片段，而从健康种子的浸出液中没有扩增出核酸片段。表明引物对Aac1F和Aac1R 检测西瓜细菌性果斑病菌的特异性高，适用于西瓜种子样品的检测。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的引物对及其应用
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cgatctgttc tcggtgctgt 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
acaactccgt gctgtaggtg 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cattgcggct tcgatacgtc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cacaactccg tgctgtaggt 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctcagctacg acctgctctg 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccttcgatcc agctccactg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ttctcgtatc gctcaaggcg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gtatggagat gcgacccagg 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctctctgctg ttcgtctggg 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gacgtatcga agccgcaatg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acggatgcaa aaacgcgaat 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cagagcaggt cgtagctgag 20
Claims (9)
1.一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为：
上游引物：5’-TTCACCGACTACACCAGTGC-3’；
下游引物：5’-CATCAGTTCGTAGTGGCGGT-3’。
2.如权利要求1所述的引物对在检测西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)中的应用。
3.如权利要求1所述的引物对在制备检测西瓜细菌性果斑病菌(Acidovoraxcitrulli)的试剂盒中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、Taq聚合酶。
5.一种检测西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待测样品的DNA作为扩增模板，采用权利要求1所述的引物对，建立PCR反应体系，进行PCR扩增；
(2)检测扩增产物，若扩增出102bp的DNA片段，则判断待测样品中含有西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)；否则，则判断待测样品中不含西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)。
6.如权利要求5所述的检测西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)的方法，其特征在于，扩增模板采用细菌、提取的细菌DNA或含有细菌/细菌DNA的粗提液。
7.如权利要求5所述的检测西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)的方法，其特征在于，以每25μL计，PCR反应体系组成为：40ng/μL的DNA模板1μL、10μM的上游引物1μL、10μM的下游引物1μL、2×Taq PCR Mix 12.5μL、无菌超纯水补足。
8.如权利要求5所述的检测西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：1)94℃预变性5min；2)94℃变30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；3)72℃延伸5min，4℃终止反应。
9.如权利要求5所述的检测西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)的方法，其特征在于，利用琼脂凝胶电泳技术检测PCR扩增产物。
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| 基于环介导等温扩增技术检测瓜类细菌性果斑病菌;赵玉强，田艳丽，罗金燕等;《植物保护》;20151031;第41卷(第5期);第116-120页 * |
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