CN102492779A - 特异性检测西瓜上果斑病菌的pcr方法 - Google Patents

特异性检测西瓜上果斑病菌的pcr方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102492779A
CN102492779A CN2011104528747A CN201110452874A CN102492779A CN 102492779 A CN102492779 A CN 102492779A CN 2011104528747 A CN2011104528747 A CN 2011104528747A CN 201110452874 A CN201110452874 A CN 201110452874A CN 102492779 A CN102492779 A CN 102492779A
Authority
CN
China
Prior art keywords
watermelon
pcr
primer
fruit spot
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2011104528747A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102492779B (zh
Inventor
高必达
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Agricultural University
Original Assignee
Hunan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Agricultural University filed Critical Hunan Agricultural University
Priority to CN 201110452874 priority Critical patent/CN102492779B/zh
Publication of CN102492779A publication Critical patent/CN102492779A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102492779B publication Critical patent/CN102492779B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种特异性检测西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的PCR方法，是根据西瓜上果斑病菌菌系AAC00-1全基因组序列上假定的IV型菌毛蛋白基因(GenBank：CP000512.1)序列设计一对引物，BLAST结果表明这对引物的特异性非常好。用这对引物做PCR检测时不仅可将它种细菌排除，且可区分西瓜上的果斑病菌和甜瓜上的果斑病菌，使用此对引物对可将西瓜上果斑病菌菌株与其它细菌准确区分开来，特异性高。

Description

特异性检测西瓜上果斑病菌的PCR方法
技术领域
本发明涉及一种西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的检测方法，具体涉及一种特异性检测西瓜上果斑病菌的PCR(聚合酶链式反应)技术。
背景技术
在PCR检测方面，PCR引物特异性很难令人满意，一些文献做PCR或实时荧光PCR没有用相近细菌作对照，只介绍了灵敏度而没有介绍特异性，而瓜类作物上除了果斑病菌还有角斑病菌等其它细菌。有的PCR引物设计很不合理，如某学位论文的PCR引物5’-GACCAGCCACACTGGGAC-3’经BLAST居然出现排在前面的序列没有果斑病菌序列。
另一硕士论文中设计的PCR引物也是如此，用其设计的引物做BLAST，结果前30条序列中没有果斑病菌序列。第34-37条才是此果斑病菌的序列，然而序列覆盖率只有90％，其中相同碱基只有95％。
还有一篇论文中也是在16S rDNA区设计的PCR引物，用正向引物做BLAST，前1万个找到的序列都是100％覆盖和100％碱基相同，而果斑病菌的前5千个序列中没有出现，反向引物BLAST前250条序列都是100％覆盖和100％碱基相同。这些100％覆盖和100％碱基相同的序列有不少是植物内生菌，检测时必然有假阳性出现。
因此，采用以上PCR引物检测果斑病菌时，并不能明显区分出果斑病菌和其他病菌，更不能检测出西瓜上果斑病菌，因此检测技术特异性是一个亟待解决的难题。
本人亦试图依据果斑菌16S序列来设计引物，结果未能成功找到特异性好的备选序列。
发明内容
本发明所要解决技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种特异性检测西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的PCR方法，解决了西瓜上果斑病菌PCR检测上引物特异性不好的问题，可以准确地检测西瓜上带果斑病菌的情况。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种特异性检测西瓜上果斑病菌的PCR方法，该方法是以西瓜上果斑病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定，该特异性引物为：
正向引物：5’-GTCCGAGCGTACGTTGAG-3’，
反向引物：5’-ACGGCACCTGACCCGTTG-3’。
详述如下：
一、引物的设计：
发明人利用细菌种间甚至亚种间菌毛蛋白基因核苷酸序列的特异性，从NCBI/GenBank搜索并下载了果斑病菌AAC00-1菌系IV型菌毛蛋白基因(GenBank：CP000512.1全基因组序列上从第3041429个碱基到第3041923个碱基共495个碱基)的核苷酸序列，运用MEGA4.0软件对这些序列进行比对，经BLAST只找到其本身，见图1。
依据此序列用primerBLAST工具设计PCR引物序列如下：
正向引物：5’-GTCCGAGCGTACGTTGAG-3’(如SEQ ID No：1所示)
反向引物：5’-ACGGCACCTGACCCGTTG-3’(如SEQ ID No：2所示)；
上述引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。PCR产物预期大小为333个碱基。
将正向引物和反向引物分别经BLAST检索，见图2和图3。结果表明：该正向引物和反向引物的序列与果斑病菌AAC00-1菌系IV型蛋白基因序列100％相同，而与其它菌的序列最高覆盖率只有88％。
二、病菌的PCR过程：
西瓜上细菌基因组DNA的提取：取西瓜上的果斑细菌在常用的肉汁胨细菌培养基上28℃培养20-30h，得到单菌落，再用无菌牙签挑取单菌落，洗入10μl ddH2O中，99℃处理10min，离心后收集上清液，至于冰上备用。
用上述设计的引物对对果斑细菌总DNA进行扩增，预计扩增片段约为333bp。
PCR扩增体系(25μl)：DNA扩增模板1μl、10×PCR Buffer 2.5μl、dNTPs(10mm)0.5μl、Taq酶(2.5μ/μl)0.5μl、Forward Primer(10mm)1μl、Reverse Primer(10mm)1μl、及dd H2O 18.5μl。
序列扩增条件：预变性94℃5min；循环参数：94℃30sec；56℃30sec；72℃40sec；共30个循环；72℃10min延伸。
三、PCR扩增产物的鉴定：
扩增产物经常规电泳并用凝胶成像系统检查，结果出现的条带与预期的大小相符。PCR产物经克隆在T载体上后测序，测序结果经BLAST，只找到Acidovorax citrulli AAC00-1全基因组序列(gb|CP000512.1|)，与其的第3041605至3041900号碱基相同，见图4。(因测序结果要删除引物序列，所以PCR产物的序列大小只有296个碱基)。
本文中提及的PCR技术包含从PCR衍生的所有技术，如实时荧光PCR。
与现有技术相比，本发明的优点是：本方法使用的一对引物是根据西瓜上果斑病菌菌系AAC00-1全基因组序列上的IV型菌毛蛋白基因序列设计的，使用此对引物做PCR检测时，不仅可将它种细菌排除，将西瓜上果斑病菌与其它细菌准确区分开来，且可区分西瓜上的果斑病菌和甜瓜上的果斑病菌，特异性高。
附图说明：
图1是果斑病菌IV型菌毛蛋白基因序列的BLAST结果。
图2是本发明正向引物的BLAST结果。
图3是本发明反向引物的BLAST结果。
图4是用本发明引物作PCR的扩增产物的碱基序列的BLAST结果。
图5是用本发明设计的引物对作PCR的初步检验结果。
图中：从左至右的5道电泳带依次为：杂菌，西瓜菌株1，甜瓜菌株，西瓜菌株2，Marker。
图6是用本发明设计的引物对作PCR的检验结果。
图中：从左至右的7道电泳带依次为：Marker，西瓜菌株1，西瓜菌株2，甜瓜菌株1，甜瓜菌株2，甜瓜菌株3，杂菌。
图7是甜瓜上果斑菌株16S核糖体RNA基因碱基序列的BLAST结果。
图8是用本发明引物对对接种西瓜果斑病菌的西瓜叶片的PCR检测结果。
图中：从左至右的7道电泳带依次为：第1道为2000Marker，第2-7道为病叶样本。
具体实施方式：
实施例一
从中国农业科学院植保所赵廷昌实验室得到5个果斑菌株(全已做16S核糖体RNA基因测序和BLAST比对经及接种试验)。首先用本发明的引物对对2个西瓜上的菌株(分别采自海南三亚(西瓜菌株1)和黑龙江哈尔滨(西瓜菌株2))和1个甜瓜上的菌株(采自内蒙古临河市)这3个菌株以及1个杂菌做了初步PCR检测。结果只有西瓜上的2个菌株为阳性，扩增出的条带大小与预期的333个碱基相符。甜瓜上的菌株和杂菌均为阴性，见图5。
为保证试验的准确性，又增加了另外2个甜瓜菌株(分别采自新疆(甜瓜菌株2)和海南(甜瓜菌株3))做PCR，结果还是一样，见图6，第2-3道的2个西瓜菌株为阳性，第4-6道的3个甜瓜菌株均为阴性，第7道的杂菌为阴性。
为了确认甜瓜上的3个菌株确为果斑菌，将这3个菌株的16S核糖体RNA基因做了PCR。
16SrDNA序列的扩增：
用16SrDNA序列通用引物对甜瓜上的细菌总DNA进行扩增，引物序列如下：
正向引物16SF为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(如SEQ ID No：3所示)，
反向引物16SR为：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’(如SEQ ID No：4所示)，
预计扩增片段约为1500bp。
PCR扩增体系(25μl)：
DNA扩增模板1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，dNTPs(10mm)0.5μl，Taq酶(2.5μ/μl)0.5μl，Forward Primer(10mm)1μl，Reverse Primer(10mm)1μl，dd H2O 18.5μl。
16SrDNA序列扩增条件：预变性94℃5min；循环参数：94℃30sec；56℃30sec；72℃90sec；共30个循环；72℃10min延伸。
PCR产物测序后做BLAST，见图7，结果表明这3个甜瓜菌株都是果斑菌。
实施例二检测染病西瓜叶片
采用本发明的引物对检测染果斑病的西瓜叶片，PCR检测程序同前，但检测对象不是菌种，而是接种西瓜果斑病菌后发病的西瓜叶片。结果从6个人工接种西瓜果斑病菌的西瓜叶片均得到阳性结果(图8)，扩增出的条带大小与预期的相符。
由以上实施例可知，本发明的该对特异性引物对西瓜上果斑病菌是特异的，采用该引物对对西瓜上果斑病菌作PCR，能准确地将西瓜上果斑病菌与其它细菌准确区分开来，且可区分西瓜上的果斑病菌和甜瓜上的果斑病菌。
Figure IDA0000127074710000011
Figure IDA0000127074710000021

Claims (2)

1.一种特异性检测西瓜上果斑病菌的PCR方法，其特征在于：该方法是以西瓜上果斑病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定，该特异性引物为：
正向引物：5’-GTCCGAGCGTACGTTGAG-3’
反向引物：5’-ACGGCACCTGACCCGTTG-3’。
2.如权利要求1所述的特异性检测西瓜上果斑病菌的PCR方法，其特征在于：所述特异性引物是根据西瓜上果斑病菌AAC00-1菌系IV型菌毛蛋白基因的核苷酸序列设计的，PCR产物大小为333个碱基。
CN 201110452874 2011-12-30 2011-12-30 特异性检测西瓜上果斑病菌的pcr方法 Expired - Fee Related CN102492779B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110452874 CN102492779B (zh) 2011-12-30 2011-12-30 特异性检测西瓜上果斑病菌的pcr方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110452874 CN102492779B (zh) 2011-12-30 2011-12-30 特异性检测西瓜上果斑病菌的pcr方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102492779A true CN102492779A (zh) 2012-06-13
CN102492779B CN102492779B (zh) 2012-12-12

Family

ID=46184641

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201110452874 Expired - Fee Related CN102492779B (zh) 2011-12-30 2011-12-30 特异性检测西瓜上果斑病菌的pcr方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102492779B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102925568A (zh) * 2012-10-24 2013-02-13 中国检验检疫科学研究院 瓜类果斑病菌检测用引物探针及其检测方法
CN106480227A (zh) * 2016-12-29 2017-03-08 福建省农业科学院植物保护研究所 一种西瓜果斑病菌巢式pcr检测方法
CN108179207A (zh) * 2018-03-06 2018-06-19 中国农业科学院植物保护研究所 用于鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的pcr引物和方法
CN108220462A (zh) * 2018-02-02 2018-06-29 北京市农林科学院 一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专用试剂盒
CN113151524A (zh) * 2021-05-19 2021-07-23 浙江大学 一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的引物对及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101899508A (zh) * 2010-08-21 2010-12-01 福建省农业科学院作物研究所 西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101899508A (zh) * 2010-08-21 2010-12-01 福建省农业科学院作物研究所 西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Molecular Plant-Microbe Interactions》 20090831 Ofir Bahar, Tal Goffer, and Saul Burdman Type IV Pili Are Required for Virulence, Twitching Motility, and Biofilm Formation of Acidovorax avenae subsp. citrulli 909-920 1,2 第22卷, 第8期 *
《北方园艺》 20110731 郭立新 西瓜细菌性果斑病菌检测技术研究进展 181-184 1,2 , 第07期 *
OFIR BAHAR, TAL GOFFER, AND SAUL BURDMAN: "Type IV Pili Are Required for Virulence, Twitching Motility, and Biofilm Formation of Acidovorax avenae subsp. citrulli", 《MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS》, vol. 22, no. 8, 31 August 2009 (2009-08-31), pages 909 - 920 *
郭立新: "西瓜细菌性果斑病菌检测技术研究进展", 《北方园艺》, no. 07, 31 July 2011 (2011-07-31), pages 181 - 184 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102925568A (zh) * 2012-10-24 2013-02-13 中国检验检疫科学研究院 瓜类果斑病菌检测用引物探针及其检测方法
CN102925568B (zh) * 2012-10-24 2014-01-15 中国检验检疫科学研究院 瓜类果斑病菌检测用引物探针及其检测方法
CN106480227A (zh) * 2016-12-29 2017-03-08 福建省农业科学院植物保护研究所 一种西瓜果斑病菌巢式pcr检测方法
CN106480227B (zh) * 2016-12-29 2019-07-19 福建省农业科学院植物保护研究所 一种西瓜果斑病菌巢式pcr检测方法
CN108220462A (zh) * 2018-02-02 2018-06-29 北京市农林科学院 一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专用试剂盒
CN108220462B (zh) * 2018-02-02 2022-04-05 北京市农林科学院 一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专用试剂盒
CN108179207A (zh) * 2018-03-06 2018-06-19 中国农业科学院植物保护研究所 用于鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的pcr引物和方法
CN113151524A (zh) * 2021-05-19 2021-07-23 浙江大学 一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的引物对及其应用
CN113151524B (zh) * 2021-05-19 2022-04-26 浙江大学 一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的引物对及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN102492779B (zh) 2012-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Milling et al. Effects of transgenic potatoes with an altered starch composition on the diversity of soil and rhizosphere bacteria and fungi
CN102492779B (zh) 特异性检测西瓜上果斑病菌的pcr方法
Rezzonico et al. Genotypic comparison of Pantoea agglomerans plant and clinical strains
Darwish et al. Identification of Flavobacterium columnare by a species-specific polymerase chain reaction and renaming of ATCC43622 strain to Flavobacterium johnsoniae
Kumar et al. First report of a ‘Candidatus Phytoplasma asteris’(16SrI group) associated with little leaf disease of Solanum melongena (brinjal) in India
He et al. Genetic diversity of Pseudomonas syringae pv. actinidiae strains from different geographic regions in China
CN102559901B (zh) 特异性检测胡萝卜软腐果胶杆菌的pcr方法
Jeong et al. Urease characteristics and phylogenetic status of Bacillus paralicheniformis
Xie et al. First report of Pectobacterium aroidearum causing soft rot of Chinese cabbage in China
CN112176080B (zh) 特异性检测剑麻紫色卷叶病植原体的巢式pcr引物组、试剂盒及检测方法
CN101935695B (zh) 检测水稻植株早衰的分子标记方法
CN102329858B (zh) 甘蔗黑穗病菌巢式pcr快速检测方法
Atkins et al. Use of real‐time quantitative PCR to investigate root and gall colonisation by co‐inoculated isolates of the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia
CN104099408A (zh) 一种马铃薯疮痂病菌定性检测的方法
Arias et al. High intragenomic heterogeneity of 16S rRNA genes in a subset of Vibrio vulnificus strains from the western Mediterranean coast
CN102417934B (zh) 用于检测番茄黄化曲叶病毒的引物、TaqMan探针和试剂盒
CN102703592A (zh) 一种产色葡萄球菌gap基因序列及其引物的获取方法
Kotba et al. Morphological and phylogenetic diversity of Rhizoctoniasolani Kühn (Cantharellales: Ceratobasidiaceae) isolates affecting different hosts plants in Morocco
Sood et al. Genetic diversity among and within cultured cyanobionts of diverse species of Azolla
KR101501361B1 (ko) 웨이셀라 비리데스켄스 동정용 마커 조성물
KR101960412B1 (ko) 콩 들불병 균주의 유전형 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도
Ratinderbir et al. Genetic diversity among Colletotrichum falcatum isolates causing red rot of sugarcane in subtropical region of India
CN107447047B (zh) Dve强弱毒鉴别的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒
CN109338004A (zh) 一种检测灰霉病菌对啶酰菌胺抗性的引物组合、试剂盒和方法
Hosseini et al. First report of a 16SrII phytoplasma associated with a witches' broom disease of Tamarix aphylla in Iran

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20121212

Termination date: 20141230

EXPY Termination of patent right or utility model