CN101386857A - 一种与番茄抗病性状相关的分子标记克隆及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于番茄分子标记制备技术领域。制备得到三段与番茄抗病性状相关的分子标记，它们的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述。定义了这些分子标记的相关碱基的突变位点，检测分析表明，这些碱基突变引起序列标签位点(STS)多态性。本发明已将Tm－2^a，I－2，Cf－9和Mi等四种抗病基因进行聚合，根据分子标记辅助选择，选育成多抗番茄自交系和F₁抗病番茄杂交组合。本发明为番茄分子标记辅助育种有提供了一些有用的分子标记。

Description

一种与番茄抗病性状相关的分子标记克隆及应用

技术领域

本发明属于蔬菜抗病分子育种技术领域，具体涉及一种与番茄抗病性状相关的分子标记克隆及应用，为番茄的抗病基因的标记辅助选择提供一种分子标记。

背景技术

蔬菜作物在农业生产和农业产业结构中占重要地位，也是我国出口创汇的重要作物。蔬菜生产中的病危害日益严重，每年因病害可使蔬菜作物减产10％—20％，严重时可能导致绝产，因此培育抗病品种是最有效的控制病害发生的途径。目前蔬菜功能基因组的研究发展很快，番茄已经启动了测序工作，一些染色体已经测序超过一半，很多控制抗病基因已经被克隆。但目前抗病育种选育过程中所使用的分子标记与目标基因存在一定遗传距离，易发生重组交换而分离，影响选择的准确性，且大多数标记产物需要先进行酶切后才能电泳凝胶分离开来，使用起来很不方便，不利于高通量的筛选。

发明内容

本发明的目的在于克服现有现有技术的缺陷，制备一种与番茄抗病性状相关的分子标记及应用，为番茄的抗病基因的标记辅助选择提供有用的分子标记。

本发明的技术方案如下：

申请人制备了3种与番茄抗病性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所述。

在序列表SEQ ID NO：1的312bp处有1个A312-G312的碱基突变，在2298bp处有1个G2298-C2298的碱基突变，在2299bp处有1个T2299-G2299的碱基突变，导致序列标签位点多态性(STS)。

在序列表SEQ ID NO：2的3477bp处有1个A3477-G3477的碱基突变，在3516bp处有1个T3516-A3516的碱基突变，在3517bp处有1个G3517-C3517的碱基突变，在3606bp处有1个T3606-C3606的碱基突变，在3692bp处有1个C3692-G3692的碱基突变，在3693bp-3713bp之间有10bp的碱基插入，导致STS多态性。

在序列表SEQ ID NO：3的405bp处有1个A405-T405的碱基突变，在485bp处有1个G485-C485的碱基突变，516bp处有1个A516-C516的碱基突变，在517bp处有1个T517-G517的碱基突变，在530bp处有1个G530-A530的碱基突变，在610bp处有1个A610-C610的碱基突变，在672bp处有1个G672-A672的碱基突变，在715bp处有1个T715-C715的碱基突变，在725bp处有1个C725-G725的碱基突变，在806bp处有1个C806-A806的碱基突变，在847bp处有1个A847-G847的碱基突变，在997bp处有1个A997-C997的碱基突变，在1145bp处有1个A1145-G1145的碱基突变，在1171bp处有1个T1171-A1171的碱基突变，在1381bp处有1个A1381-T1381的碱基突变，在1543bp处有1个A1543-C1543的碱基突变，在1075bp-1081bp之间有6bp的碱基缺失，导致STS多态性。

申请人根据上述SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列特征，分别设计引物，发展为STS标记。所述SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的引物对分别为：

SEQ ID NO：1：正向引物为5＇-GCC TCA TTC AAC TTC CTT CTG G-3＇，反向引物为5＇-GCC AGT ATATAA CGG TCT AAA C-3＇。

SEQ ID NO：2：正向引物为5＇-CCA TCT CTC AAG GAA CTG CGT C-3＇，反向引物为5＇-GTA GTG GTGTGA GCA ATG GGC A-3＇。

SEQ ID NO：3：正向引物为C1：5＇-GTT CTT ATC CTT TAA CAC CCA-3＇，反向引物为C2：5＇-TCC CTCCAA ATT ATT ACT TCC-3＇。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是Tm-2a(基因登录号：AF536199)分子标记的和核苷酸序列，在312bp处有1个A312-G312的碱基突变，在2298bp处有1个G2298-C2298的碱基突变，在2299bp处有1个T2299-G2299的碱基突变。

序列表SEQ ID NO：2是I2(基因登录号：AF118127)分子标记的和核苷酸序列，在3477bp处有1个A3477-G3477的碱基突变，在3516bp处有1个T3516-A3516的碱基突变，在3517bp处有1个G3517-C3517的碱基突变，在3606bp处有1个T3606-C3606的碱基突变，在3692bp处有1个C3692-G3692的碱基突变，在3693bp-3713bp之间有10bp的碱基插入。

序列表SEQ ID NO：3是Cf-9(基因登录号：AJ002236)分子标记的和核苷酸序列。在405bp处有1个A405-T405的碱基突变，在485bp处有1个G485-C485的碱基突变，516bp处有1个A516-C516的碱基突变，在517bp处有1个T517-G517的碱基突变，在530bp处有1个G530-A530的碱基突变，在610bp处有1个A610-C610的碱基突变，在672bp处有1个G672-A672的碱基突变，在715bp处有1个T715-C715的碱基突变，在725bp处有1个C725-G725的碱基突变，在806bp处有1个C806-A806的碱基突变，在847bp处有1个A847-G847的碱基突变，在997bp处有1个A997-C997的碱基突变，在1145bp处有1个A1145-G1145的碱基突变，在1171bp处有1个T1171-A1171的碱基突变，在1381bp处有1个A1381-T1381的碱基突变，在1543bp处有1个A1543-C1543的碱基突变，在1075bp-1081bp之间有6bp的碱基缺失。

图1：Mi-1基因及等位序列在翻译起始之前的intron的比对结果

图2：Tm-2a基因分子标记对单株的检测。泳道1-6分别为A111、A114、A53、A115、A113；7泳道为LA1221；CK：空白对照；M：Marker

图3：烟草花叶病毒接种不同番茄植株后的叶部特征。A为A53，B为LA1221。

图4：I-2基因分子标记对单株的PCR检测。1-6分别为A53、A101、A112、A114、中蔬五号、中蔬六号；7-8为LA3847、LA4026 CK：空白对照M：Marker

图5：Mi-1基因分子标记对单株的检测。左为LA2819(抗病)；右为A53(敏感对照)；M：Marker

图6：根结线虫接种番茄植株的特征。A：番茄植株三叶期接种根接线虫后植株生长势情况。左为LA2819，右为A53。B：番茄植株三叶期接种根接线虫后根部特征。左为LA2819，右为A53

图7：Cf-9基因分子标记对单株的检测。1泳道为Ont7719，2-7泳道分别为Ont7717、Ont7516、V121、Vetomold、Leaf mould resister、Money maker；CK：空白对照；M：Marker

具体实施方式

实施例1：番茄抗烟草花叶病毒基因Tm-2^a标记的创建与应用

步骤如下：

(1)根据文献上找到Tm-2^a基因以及其等位基因tm-2的登录号，Tm-2^a基因登录号为AF536201，等位基因tm-2的登录号为AF536199。

(2)经过比对软件分析两序列后发现，搜索到SNP位点3处，分别为：312A/G；22982299GT/CG。

(3)设计引物并合成。根据Tm-2a基因22982299GT/CG设计PCR引物，引物3＇端与Tm-2a基因互补，并在引物3＇端第三位人为的引入错配。引物序列如下：

A1：5＇-GCC TCA TTC AAC TTC CTT CTG G-3＇；

A2：5＇-GCC AGT ATA TAA CGG TCT AAA C-3＇。

(4)PCR扩增与电泳检测。PCR反应总体积为25μL，10×PCR Buffer 2.5μL，3.0mM MgCl₂，0.2mM dNTP，各引物0.2μM，20-50ng模板，Taq酶0.5U。

PCR热循环程序：94℃变性5min，然后94℃ 45s、59℃ 45s、72℃ 1min进行33个循环，最后72℃延伸8min，结果用1％琼脂糖电压5V/cm条件下电泳30-40min，终结果用EB染色，凝胶成像系统上显示(见图2)。

含Tm-2^a的株系能检测出469bp的片断；而不含Tm-2^a的株系不能检测到产物。

(5)将PCR检测的植株接种病毒鉴定，在两片真叶期摩擦接种烟草花叶病毒(邵碧英等，烟草花叶病毒弱毒株的筛选及其交互保护作用，福建农业大学学报，2001，30(3)：297-303)，两周后调查发病情况，确认Tm-2^a分子标记的正确性(见图3)。

实施例2：番茄抗枯萎病基因I-2标记的创建与应用

步骤如下：

(1)在文献上找到I-2基因以及其等位基因信息，I-2基因登录号为AF118127，I-2的等位基因i-2序列仅知道291bp长的片断，

(2)通过比对软件分析I-2与等位基因部分序列，搜索到5个SNP位点和1个插入突变位点，分别为：3477A/G、35163517TG/AC、3606T/C、3692C/G、3693-3713位插入10个碱基。

(3)设计引物并合成，根据i-2基因缺失序列两端来设计引物，其中等位基因特异引物与I-2基因互补，引物序列如下：

B1：5＇-CCA TCT CTC AAG GAA CTG CGT C-3＇；

B2：5＇-GTA GTG GTG TGA GCA ATG GGC A-3＇。

(4)PCR扩增与电泳检测PCR反应总体积为25μL，10×PCR Buffer 2.5μL，3.0mM MgCl₂，0.2mM dNTP，各引物0.2μM，20-50ng模板，Taq酶0.5U；

PCR热循环程序：94℃变性5min，然后94℃ 1min、58℃ 1min、72℃ 75s进行33个循环，最后72℃延伸10min，结果用1％琼脂糖电压10V/cm条件下电泳30-40min，终结果用EB染色，凝胶成像系统上显示。

含I-2基因的株系能检测出601bp的片断；而不含I-2基因的株系能检测出723bp的片断(见图4)。

(5)将PCR检测的植株接种镰孢属的番茄萎蔫病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici，刘晖等，山东农业大学学报：自然科学版，1991，22(4)：356-360)鉴定，在两片真叶期浸根接种镰孢菌，3周后调查发病情况，确认I-2分子标记的正确性。

实施例3：番茄抗叶霉病基因Cf-9标记的创建与利用

(1)据根相关文献信息找到Cf-9基因与其等位基因的信息，Cf-9基因序列登录号为AJ002236，Cf-9的等位基因Cf-0的序列登录号为AY639604。

(2)通过比对软件分析，搜索到16个SNP位点和1个插入突变位点。分别为405A/T、485G/C、516517AT/CG、530G/A、610A/C、672G/A、715T/C、725C/G、806C/A、847A/G、997A/C、1145A/G、1171T/A、1381A/T、1543A/C、1075-1081位缺失6个碱基。

(3)设计引物并合成，根据Cf-9基因缺失序列处来设计引物，等位基因特异引物在3＇端与Cf-9基因互补配对，故该条引物与Cf-0在3＇端发生错配。引物序列如下：

C1：5＇-GTT CTT ATC CTT TAA CAC CCA-3＇；

C2：5＇-TCC CTC CAA ATT ATT ACT TCC-3＇。

(4)PCR扩增与电泳检测PCR反应总体积为25μL，10×PCR Buffer 2.5μL，3.0mM MgCl₂，0.2mM dNTP，上游引物0.16μM，下游引物0.24μM，20-50ng模板，Taq酶0.5U；

PCR热循环程序：94℃变性5min，然后94℃ 1min、57℃ 1min、72℃ 75s进行34个循环，最后72℃延伸10min，结果用1％琼脂糖电压10V/cm条件下电泳30-40min，终结果用EB(溴化乙啶)染色，凝胶成像系统上显示。

所有材料中仅Ont7719(Cf-9/Cf-9)能扩增出约415bp大小的片段，在其他几个番茄品系中没有任何产物。因此该特异引物能特异检测Cf-9基因，可用于基因标记辅助育种(见图7)。

(5)将PCR检测的植株叶霉病菌接种鉴定，在四片真叶期喷雾法接种番茄叶霉病菌(顾沛雯等，番茄叶霉病菌生物学特性研究，宁夏农学院学，2004，25(3)：21-23)(10⁶个/ml)，两周后进行病情调查，确认Cf-9分子标记的正确性。

实施例4：番茄抗根结线虫基因Mi-1标记的创建与应用

(1)据根相关文献信息找到Mi-1及其等位序列的信息。Mi-1基因的序列登录号为U81378，等位基因mi-1C的序列登录号为DQ863290。

(2)通过比对软件分析，发现Mi-1与mi-1C在翻译起始前的内含子(intron 1)序列存在很大差异(见图1)。

(3)设计引物并合成，根据Mi-1的intron 1两端序列来设计引物来扩增intron 1全长序列。引物序列如下：

D1：5＇TTC TCT AGC TAA ACT TCA GCC-3＇

D2：5＇-TTT TCG TTT TTC CAT GAT TCT AC-3＇

(4)PCR扩增与电泳检测PCR反应总体积为25μL，10×PCR Buffer 2.5μL，3.0mM MgCl₂，0.2mM dNTP，上下游引物各0.2M，20-50ng模板，Taq酶0.5U。PCR热循环程序：94℃变性5min，然后94℃ 1min、58℃ 1min、72℃ 75s进行34个循环，最后72℃延伸10min，结果用1％琼脂糖电压10V/cm条件下电泳30-40min，终结果用EB染色，凝胶成像系统上显示。

含Mi-1基因的株系能检测出大小为556bp和1353bp的片断；而不含Mi-1基因的株系能检测出大小为1287bp的片断(见图5)。

(5)将PCR检测的植株进行南方根结线虫M8005(Meloidogyne incognita，赵洪海等，采自烟台市的南方根结线虫的描述，莱阳农学院学报，2000，17(2)：81-85)接种鉴定，在20d苗龄时灌根法接种2000条/株的根接线虫。30d后观察根部发病情况，确认Mi-1分子标记的正确性(见图6)。

实施例5：抗病功能标记在优质多抗番茄品种(品系)选育中的应用

(1)引进国外多抗性番茄品种Keepsake 3275，购自美国福罗里达州番茄育种公司(Tomato GrowersSupply Company)，自交得到F₂分离群体；

(2)对F₂单株进行PCR检测，结合田间经济性状调查(如第1开花节位，结实率，单果重等)，选择含有三种抗性基因且性状优良的植株，F₂单株继续自交得到F₃群体；

(3)对F₃单株进行PCR检测(表1)，结合田间经济性状调查，选择含有三种抗性基因且性状优良的植株，F₃单株继续自交得到F₄群体；

(4)对F₄单株进行PCR检测(表2)，结合田间经济性状调查，选择三种抗病基因已纯合且性状优良的植株，得到的优质多抗自交系与多个优良自交系(如中蔬5号)杂交。

(5)通过调查经济性状与抗病性，选择配合力好的组合用于实践生产。

表1  利用分子标记辅助选择对番茄分离群体F₃的单株检测结果

表2  利用分子标记辅助选择对番茄分离群体F₄的单株检测结果(部分)

表3  本发明中所创建的标记与前人所创建的标记对比

本发明利用可隆的基因序列信息开发基因特异标记，并结合抗病接种鉴定或抗病品系来验证基因标记的准确性，所获得的4个抗病基因特异引物均能有效的区分抗病与敏感番茄材料，且在检测过程中无需酶切、准确度高(表3)。

通过本发明提供的分子标记用于抗病基因分子标记的筛选，以及抗病品种杂交一代种子纯度的DNA检测、选育多抗性蔬菜品种。可对不同来源的蔬菜种质资源进行快速和早期鉴定、科学指导抗病亲本的选择，大大降低苗期抗病接种鉴定的工作量，提高抗病育种选择效率，节约成本，加快品种选育的进程。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种与番茄抗病性状相关的分子标记克隆及应用

<130>

<141>2008-10-15

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>9837

<212>DNA

<213>番茄(Lycopersicon esculentum)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(9837)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(2299)..(2299)

<223>

<221>mutation

<222>(2298)..(2298)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(312)..(312)

<223>

<400>1

<210>2

<211>3801

<212>DNA

<213>番茄(Lycopersicon esculentum)

<220>

<221>mutation

<222>(3477)..(3477)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(1)..(3801)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(3693)..(3713)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(3692)..(3692)

<220>

<221>mutation

<222>(3606)..(3606)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(3517)..(3517)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(3516)..(3516)

<223>

<400>2

<210>3

<211>2592

<212>DNA

<213>番茄(Lycopersicon esculentum)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2592)

<223>

<220>

<221>mutation

<223>

<220>

<221>mutation

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(1381)..(1381)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(1171)..(1171)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(1145)..(1145)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(997)..(997)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(847)..(847)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(806)..(806)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(725)..(725)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(715)..(715)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(672)..(672)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(610)..(610)

<223>

<221>mutation

<222>(530)..(530)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(517)..(517)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(516)..(516)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(485)..(485)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(405)..(405)

<223>

<400>3

Claims (10)

1、一种与番茄抗病性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。

2、一种与番茄抗病性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所述。

3、一种与番茄抗病性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所述。

4、根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，在序列表SEQ ID NO：1的312bp处有1个A312-G312的碱基突变，在2298bp处有1个G2298-C2298的碱基突变，在2299bp处有1个T2299-G2299的碱基突变，导致序列标签位点多态性(STS)。

5、根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，在序列表SEQ ID NO：2的3477bp处有A3477-G3477的碱基突变，在3516bp处有T3516-A3516的碱基突变，在3517bp处有G3517-C3517的碱基突变，在3606bp处有T3606-C3606的碱基突变，在3692bp处有C3692-G3692的碱基突变，在3693bp-3713bp之间有10bp的碱基插入，导致STS多态性。

6、根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于，在序列表SEQ ID NO：3的的405bp处有A405-T405的碱基突变，在485bp处有G485-C485的碱基突变，516bp处有A516-C516的碱基突变，在517bp处有T517-G517的碱基突变，在530bp处有G530-A530的碱基突变，在610bp处有A610-C610的碱基突变，在672bp处有G672-A672的碱基突变，在715bp处有T715-C715的碱基突变，在725bp处有C725-G725的碱基突变，在806bp处有C806-A806的碱基突变，在847bp处有A847-G847的碱基突变，在997bp处有A997-C997的碱基突变，在1145bp处有A1145-G1145的碱基突变，在1171bp处有T1171-A1171的碱基突变，在1381bp处有A1381-T1381的碱基突变，在1543bp处有A1543-C1543的碱基突变，在1075bp-1081bp之间有6bp的碱基缺失，导致STS多态性。

7、检测权利要求4所述的分子标记的引物对，所述的引物对的正向引物为5′-GCC TCATTCAAC TTC CTT CTG G-3′，反向引物为5′-GCC AGT ATA TAA CGG TCTAAA C-3′。

8、检测权利要求5所述的分子标记的引物对，所述的引物对的正向引物为5′-CCA TCT CTCAAG GAA CTG CGT C-3′，反向引物为5′-GTA GTG GTG TGA GCA ATG GGC A-3′。

9、检测权利要求6所述的分子标记的引物对，所述的引物对的正向引物为C1:5′-GTT CTTATC CTT TAA CAC CCA-3′，反向引物为C2:5′-TCC CTC CAA ATT ATT ACT TCC-3′。

10、权利要求4-6任1项所述的分子标记在番茄分子标记辅助育种中的应用。

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