CN104877996A

CN104877996A - 簇毛麦6vs染色体特异性分子标记6vs-bh1及其用途

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Publication number: CN104877996A
Application number: CN201510235745.0A
Authority: CN
Inventors: 何华纲; 朱姗颖; 岑波; 汪峰; 别同德
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2015-05-12
Filing date: 2015-05-12
Publication date: 2015-09-02
Anticipated expiration: 2035-05-12
Also published as: CN104877996B

Abstract

本发明涉及一种簇毛麦6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1及其用途，属于分子生物学和遗传育种科学技术领域；本发明所述标记引物6VS-BH1是借助麦类-二穗短柄草比较基因组学手段开发，具体序列为6VS-BH1F：如SEQ ID NO.1所示，6VS-BH1R：如 SEQ ID NO.2所示。分子标记6VS-BH1具有退火温度宽泛（60℃-66℃）、稳定性好、产物亮度强、分辨率高等多种优点。分子标记6VS-BH1是一个共显性标记，不仅能有效追踪小麦背景中的簇毛麦6VS染色体，还能区分纯合体和杂合体，而且能区分携带Pm21基因的易位系T6VS.6AL和携带PmV基因的易位系T6VS.6DL。因此，本发明公布的分子标记6VS-BH1在小麦抗白粉病分子标记辅助选择育种及Pm21基因和PmV基因的聚合育种中具有重要的实用价值。

Description

簇毛麦6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1及其用途

技术领域

本发明涉及一种一种簇毛麦6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1及其用途，属于分子生物学和遗传育种科学技术领域。

背景技术

小麦白粉病是由小麦白粉菌（Blumeria graminis f.sp. tritici）引起的真菌性病害，是影响小麦生产的主要病害之一。培育抗病品种是规避小麦白粉病危害的最经济、有效的途径，其关键是抗白粉病基因的发掘与利用。作为小麦抗白粉病育种的重要野生资源，簇毛麦（Dasypyrum villosum，VV，2n = 2x = 14）对已知小麦白粉菌生理小种表现完全免疫或高抗，其抗病基因已被多个课题组成功转移到普通小麦背景。例如，陈佩度课题组将来自英国剑桥植物园的簇毛麦6VS染色体携带的Pm21基因转移到小麦中，育成小麦-簇毛麦T6VS.6AL易位系，该易位系中的6VS能稳定遗传且对农艺的不利影响少，因而作为抗性亲本被广泛应用于小麦抗白粉病育种，迄今已育成20多个品种，推广面积超过5000万亩（Cao A, Xing L, Wang X, Yang X, Wang W, Sun Y, Qian C, Ni J, Chen Y, Liu D and Chen P. Serine/threonine kinase gene Stpk-V, a key member of powdery mildew resistance gene Pm21, confers powdery mildew resistance in wheat. Proc Natl Acad Sci USA. 2011, 108: 7727-7732.）。前苏联簇毛麦种质No.1026的6VS染色体上携带的PmV基因导入到小麦中，创制了T6VS.6DL易位系（Pm97033等，Li H, Chen X, Xin ZY, Ma YZ, Xu HJ, Chen, XY and Jia X. Development and identification of wheat-Haynaldia villosa T6DL.6VS chromosome translocation lines conferring resistance to powdery mildew. Plant Breeding. 2005, 124: 203-205.），目前也已进一步育成扬麦22等抗白粉病品种。

易位系T6VS.6AL（Pm21基因）和易位系T6VS.6DL（PmV基因）都具有广谱高效的白粉病抗性，在生产上具有重要的应用价值，而开发6VS染色体特异性分子标记对于提高小麦抗白粉病育种效率具有重要意义。目前已公布了一些与6VS上抗白粉病基因Pm21连锁的相关分子标记OPT17₁₄₀₀、OPT17₁₉₀₀ 、SCAR₁₄₀₀、SCAR₁₂₆₅、NAU/XiBao16₁₅₈₆和NAU/XiBao15₉₀₂（Cao, A.Z., X.E. Wang, Y.P. Chen, X.W. Zou, and P.D. Chen, 2006: A sequence-specific PCR marker linked with Pm21 distinguishes chromosomes 6AS, 6BS, 6DS of Triticum aestivum and 6VS of Haynaldia villosa. Plant Breeding 125, 201-205.）。但是，总体而言，这些标记在标记辅助选择育种中大多存在不稳定的缺点，一个原因是由标记类型决定的，如RAPD标记OPT17₁₄₀₀和OPT17₁₉₀₀；其次是由于PCR反应体系和反应条件要求苛刻，PCR结果可重复性差造成的。这些缺点均不利于标记辅助选择技术在小麦育种实践中的应用。此外，绝大多数分子标记不能在小麦背景中同时区分Pm21基因和PmV基因，难以在这两个基因的聚合育种中应用。

前人在开发分子标记时，大多借助已经定位于基因组物理图上的EST（expressed sequence tag, 表达序列标签）序列设计引物（陈升位，陈佩度. 簇毛麦6VS染色体短臂特异性EST标记的开发及缺失定位. 麦类作物学报. 2010, 30(5):798-795.）。但定位在目标染色体区域的EST数量有限，能开发的分子标记也有限。

簇毛麦Stpk-V基因是Pm21位点的关键成员之一，在Pm21基因介导的抗白粉病过程中发挥中重要作用。本发明借助麦类作物-二穗短柄草比较基因组学，利用二穗短柄草Stpk-V同源基因附近的序列搜索小麦基因组中的同源序列，开发分子6VS特异性分子标记，用于快速检测和追踪普通小麦遗传背景中不同来源的6VS易位染色体及其控制的抗白粉病性状，为小麦抗白粉病分子标记辅助选择育种提供新型、实用、高效的分子标记。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记及其用法。

本发明利用比较基因组学原理，围绕簇毛麦抗白粉病基因Stpk-V（GeneBank登录号：HM241655）在二穗短柄草中的同源基因开发分子标记，即利用物理位置与二穗短柄草Stpk-V相近的序列搜索小麦基因组中的同源序列，设计特异性引物，筛选簇毛麦6VS染色体特异性分子标记，为抗白粉病小麦-簇毛麦T6VS.6AL易位系在小麦抗白粉病新品种培育中的应用提供一种新型、实用、高效的分子标记辅助选择技术。

本发明筛选到的6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1的引物如下：

6VS-BH1F：5’- GCCATTATAGTCAAGAGTGCACTAGCTGT -3’ （SEQ ID NO.1），

6VS-BH1R：5’- AGCTCCTCTCGTTCTCCAATGCT -3’ （SEQ ID NO.2）。

该分子标记用于追踪小麦6AS、6DS染色体；还用于在小麦背景中区分小麦-簇毛麦易位系T6VS.6AL（Pm21基因）和易位系T6VS.6DL（PmV基因）中的6VS染色体；并且可用于区分两个易位系是纯合体、还是杂合体。

本发明还提供该分子标记的具体用法，如下：

（1）PCR反应体系：10μL反应体系中含约10-20ng模板DNA，1×PCR buffer，1.5mmol L^-1 MgCl₂，200mmol L^-1 dNTP，两条引物终浓度各为0.2μmol L^-1，0.5U Taq DNA聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至10μL；

（2）PCR反应程序：94℃预变性3分钟；94℃变性20秒，60℃-66℃退火30秒，72℃延伸60秒，32个循环；72℃延伸5分钟；4℃保存；

（3）PCR产物检测：PCR扩增产物经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，用银染法染色。

本发明的有益效果：

本发明公布的分子标记6VS-BH1，具有退火温度宽泛（60℃-66℃）、PCR扩增稳定性好、扩增产物亮度强、电泳检测时分辨率高等多种优点。该标记不仅能追踪小麦6AS、6DS染色体，扩增产物大小分别为456bp和394bp，还能在小麦背景中区分小麦-簇毛麦易位系T6VS.6AL（Pm21基因）和易位系T6VS.6DL（PmV基因）中的6VS染色体，扩增产物大小分别为341bp和271bp，并且能区分这两个易位系是纯合体、还是杂合体。本发明公布的分子标记6VS-BH1集诸多优点于一身，是目前已开发的6VS标记无法比拟的。因此，本发明为抗白粉病小麦-簇毛麦T6VS.6AL易位系在小麦抗白粉病新品种的分子标记辅助育种提供了一种新型、实用、高效的6VS染色体分子标记。

附图说明

图1：多序列比对后引物设计示意图；箭头所示为根据长度多态区域两侧的保守序列设计的引物所在位置。

图2：分子标记6VS-BH1的PCR扩增结果；其中，M：DNA marker，1-14：中国春，扬麦16，扬麦19，N6AT6D，N6BT6D，N6DT6A，簇毛麦（英国剑桥植物园），硬簇麦，DS6V（6A），92R137，扬麦18，簇毛麦（前苏联），Pm97033，扬麦22；其中，92R137和扬麦18均为易位系T6VS.6AL，Pm97033和扬麦22均为易位系T6VS.6DL。

图3：分子标记6VS-BH1在易位系T6VS.6AL（Pm21基因）中的应用；其中，M：DNA marker，1-26：F₂群体单株。

图4：分子标记6VS-BH1在易位系T6VS.6DL（PmV基因）中的应用；其中，M：DNA marker，1-26：F₂群体单株。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：引物的设计与合成

首先以位于6VS染色体上的抗白粉病基因Stpk-V（GeneBank登录号：HQ864471）进行BLAST，找到麦类模式植物二穗短柄草中的同源基因Bradi3g04940（GeneBank登录号：XM_003575353，GeneID：100840649）。以二穗短柄草中的同源基因 Bradi3g04940为中心，从NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）获取其上下游序列，在小麦基因组（http://wheat-urgi.versailles.inra.fr）中进行BLAST分析，获取位于小麦第六部分同源群短臂上（6AS、6BS、6DS）的序列，将这些具有同源性的序列进行多序列比对分析，根据比对结果中具长度多态性区域的两侧保守序列设计5对特异性引物（见图1，表1），引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 本发明设计的引物

实施例2：簇毛麦6VS染色体特异性标记6VS-BH1的筛选

（1）PCR扩增：以簇毛麦、普通小麦、小麦-簇毛麦易位系T6VS.6AL（Pm21基因）、易位系T6VS.6DL（PmV基因）、硬簇麦等为材料（所用材料由南京农业大学、江苏里下河地区农业科学研究所提供，均为公知公用种质材料），提取基因组DNA后进行PCR扩增，10μL PCR反应体系中含约10-20ng模板DNA，1×PCR buffer，1.5mmol/ L MgCl2，200mmol/L dNTP，两条引物终浓度各为0.2μmol/L，0.5U Taq DNA聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至10μL；PCR反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性20秒，60℃-66℃退火30秒，72℃延伸60秒，32个循环；72℃延伸5分钟；4℃保存。

（2）PCR产物的检测：PCR扩增产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶（29:1）上进行电泳分离，采用银染法染色。

（3）PCR结果分析：PCR结果显示，P1-F/ P1-R、P3-F/ P3-R、P4-F/ P4-R、P5-F/ P5-R四对引物的扩增产物在所用的材料中无多态性，而P2-F/ P2-R引物对的PCR扩增产物呈现多态性，即本发明筛选到了一个簇毛麦6VS染色体特异的分子标记，将其命名为6VS-BH1，对应的标记引物重新命名为6VS-BH1F、6VS-BH1R，标记引物的具体序列为：

6VS-BH1F：5’- GCCATTATAGTCAAGAGTGCACTAGCTGT -3’ （SEQ ID NO.1），

6VS-BH1R：5’- AGCTCCTCTCGTTCTCCAATGCT -3’ （SEQ ID NO.2）。

以该标记引物进行PCR扩增，能在普通小麦中扩增到两个条带，大小分别为456bp和394bp，分别来源于6AS染色体和6DS染色体。将小麦-簇毛麦易位系T6VS.6AL（Pm21基因）的6VS染色体、易位系T6VS.6DL（PmV基因）的6VS染色体分别命名为6VS-Pm21和6VS-PmV，该标记能有效区别6VS-Pm21和6VS-PmV，大小分别为341bp和271bp（见图1）。分子标记6VS-BH1具有退火温度宽泛（60℃-66℃）、稳定性好、产物亮度强、分辨率高等多种优点。

实施例3：分子标记6VS-BH1追踪易位系T6VS.6AL（Pm21基因）的6VS染色体

抗白粉病的小麦-簇毛麦易位系T6VS.6AL（Pm21基因）与感白粉病的扬麦9号（由江苏里下河地区农业科学研究所提供，为公知公用种质材料）进行杂交，进而构建F₂遗传群体，二叶期接种白粉菌，进行抗、感表型鉴定，用分子标记6VS-BH1鉴定各单株。在感病单株中仅扩增出6AS、6DS对应条带，而没有6VS-Pm21特异性条带。在抗病纯合体中，仅扩增出6DS和6VS-Pm21特异性条带，而抗病杂合体能同时扩增出6AS、6DS、6VS-Pm21三个条带（见图2）。该结果说明，分子标记6VS-BH1不仅能追踪易位系T6VS.6AL（Pm21基因）中的6VS染色体，还能区分易位染色体是否处于纯合状态。

实施例4：分子标记6VS-BH1追踪易位系T6VS.6DL（PmV基因）的6VS染色体

抗白粉病的小麦-簇毛麦易位系T6VS.6DL（PmV基因）与感白粉病的扬麦9号进行杂交，进而构建F₂遗传群体，用分子标记6VS-BH1鉴定各单株。在感病单株中仅扩增出6AS、6DS对应条带，而没有6VS-PmV特异性条带。在抗病纯合体中，仅扩增出6AS和6VS-PmV特异性条带，而抗病杂合体能同时扩增出6AS、6DS、6VS-PmV三个条带（见图3）。该结果说明，分子标记6VS-BH1不仅能追踪易位系T6VS.6DL（PmV基因）中的6VS染色体，还能区分易位染色体是否处于纯合状态。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏大学

<120> 簇毛麦6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1及其用途

<130> 簇毛麦6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1及其用途

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gccattatag tcaagagtgc actagctgt 29

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agctcctctc gttctccaat gct 23

Claims

1.一种簇毛麦6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1，其特征在于：该分子标记引物序列为：

6VS-BH1F：5’-GCCATTATAGTCAAGAGTGCACTAGCTGT-3’（SEQ ID NO.1），

6VS-BH1R：5’-AGCTCCTCTCGTTCTCCAATGCT-3’ （SEQ ID NO.2）。

2.权利要求1所述的簇毛麦6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1在追踪小麦6AS、6DS染色体中的应用。

3.权利要求1所述的簇毛麦6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1在小麦背景中区分小麦-簇毛麦易位系T6VS.6AL（Pm21基因）和易位系T6VS.6DL（PmV基因）中的6VS染色体中的应用。

4.权利要求1所述的簇毛麦6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1在在区分小麦-簇毛麦易位系T6VS.6AL（Pm21基因）和易位系T6VS.6DL（PmV基因）是纯合体还是杂合体中的应用。

5.一种用权利要求1所述的簇毛麦6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1追踪小麦-簇毛麦T6VS.6AL易位系的方法，其特征在于，用该分子标记引物对待测材料进行PCR扩增，扩增出341bp条带的材料为含有小麦-簇毛麦T6VS.6AL易位染色体的材料。

6.根据权利要求5所述的一种用权利要求1所述的簇毛麦6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1追踪小麦-簇毛麦T6VS.6AL易位系的方法，其特征在于，用该分子标记引物对待测材料进行PCR扩增，同时呈现394bp/341bp双带的单株为易位系T6VS.6AL纯合体，同时呈现456bp/394bp/341bp三带的单株为易位系T6VS.6AL杂合体。

7.一种用权利要求1所述的簇毛麦6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1追踪小麦-簇毛麦T6VS.6DL易位系的方法，其特征在于，用该分子标记引物对待测材料进行PCR扩增，扩增出271bp条带的材料为含有小麦-簇毛麦T6VS.6DL易位染色体的材料。

8.一种用权利要求1所述的簇毛麦6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1追踪小麦-簇毛麦T6VS.6DL易位系的方法，其特征在于，用该分子标记引物对待测材料进行PCR扩增，其中同时呈现456bp/271bp双带的单株为易位系T6VS.6DL纯合体，同时呈现456bp/394bp/271bp三带的单株为易位系T6VS.6DL杂合体。