CN112301142A

CN112301142A - 拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12分子标记及其应用

Info

Publication number: CN112301142A
Application number: CN201910695798.9A
Authority: CN
Inventors: 刘成; 计健; 马朋涛; 李根英; 刘任糠; 朱姗颖; 何华纲
Original assignee: Yantai University; CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Yantai University; CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2039-07-30
Also published as: CN112301142B

Abstract

本发明公开了3个特异追踪拟斯卑尔脱山羊草6SS染色体的分子标记（6SS‑1~6SS‑3）及其用法，它涉及分子生物学和遗传育种科学技术领域。其中6SS‑1标记引物的序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，6SS‑2标记引物的序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，6SS‑3标记引物的序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。这些分子标记不仅能追踪来源于拟斯卑尔脱山羊草的Pm12基因，也能追踪来源于簇毛麦的Pm21基因，在聚合育种材料中可同时区分并追踪Pm12基因和Pm21基因，在辅助选择育种及两个基因的聚合育种中具有重要的实用价值。

Description

拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、遗传育种科学技术领域，具体涉及3个特异追踪携带抗白粉病基因Pm12的拟斯卑尔脱山羊草6SS染色体特异性分子标记及其用法。

背景技术

小麦白粉病是由专化性白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tritici）引起的真菌性病害，是我国小麦生产的重要病害之一。近年来，小麦白粉病危害范围不断扩大，呈现由南向北逐渐加强之势。据统计，我国小麦白粉病发病面积平均每年在9000万亩以上。因此，小麦白粉病已成为严重威胁我国粮食生产和安全的重要病害。

发掘抗病基因、培育抗病品种是控制小麦白粉病最经济、有效、环保的途径。在已报道的60多个小麦抗白粉病基因中，来自小麦野生近缘物种的抗病基因提供的抗性往往较强。其中的抗白粉病基因Pm12来自小麦近缘物种拟斯卑尔脱山羊草（基因组为SS），最初由英国John Inne Centre的Miller等将位于拟斯卑尔脱山羊草第6号染色体的短臂（6SS）上的该基因导入普通小麦品种Wembley，创制了抗白粉病种质Wembley Line #31（Miller等.The introduction of a major gene for resistance to powdery mildew of wheat,Erysphe graminis f. sp. tritici, from Aegilops speotoides in to wheat,Triticum aestivum. In: Jorna ML, Slootmaker LAJ (eds) Cereal breeding relatedto integrated cereal production. Pudoc, Netherland, pp 179-183，1988），该基因目前对我国小麦白粉菌仍然具有广谱、高效的抗性，是为数不多的优异抗白粉病基因之一，在小麦抗白粉病育种中具有重要的应用价值。

1996年，Jia等在对Pm12基因进行定位时发展了一套限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）标记（Jia等. RFLP-based maps ofthe homoeologous group-6 chromosomes of wheat and their application in thetagging of Pm12, a powdery mildew resistance gene transferred from Aegilops speltoides to wheat. Theor Appl Genet. 1996, 92:559-565），RFLP是建立在Southern杂交技术上的第一代分子标记，存在检测周期长、一次检测样品数少等不足，难以满足快速、高通量检测的需要。

2007年，Song等发展了一套简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）标记（Song等. Molecular identification of Pm12-carrying introgression lines inwheat using genomic and EST-SSR markers. Euphytica. 2007, 158:95–102），后来发现SSR标记Xcau127可同时追踪拟斯卑尔脱山羊草Pm12基因和簇毛麦Pm21基因（Song等. A‘‘one-marker-for-two-genes’’ approach for efficient molecular discriminationof Pm12 and Pm21 conferring resistance to powdery mildew in wheat. MolBreeding. 2009, 23:357–363）。不过，SSR标记Xcau127检测Pm12和Pm21基因时扩增的DNA条带杂，分辨率较低、稳定性也不高。

发明内容

本发明以簇毛麦抗白粉病基因Pm21附近的基因对应的中国春中的同源基因为对象，根据其内含子长度多态性区域的两侧保守序列设计特异性引物，开发能追踪拟斯卑尔脱山羊草6SS染色体上的抗白粉病基因Pm12的分子标记。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12的分子标记，引物对碱基序列如下：

6SS-1：

F：5’-GTATTCATCAAGTTTACCAGTCCA-3’（SEQ ID NO.1），

R：5’-GAAGAGGACCTTATGACCCAGA-3’（SEQ ID NO.2），

6SS-2：

F：5’-GAACCTACCGCTGGATGGCA-3’（SEQ ID NO.4），

R：5’-CAGCAGAAGGTTGTTAATCAGATGCA-3’（SEQ ID NO.5），

6SS-3：

F：5’-CCAACTCTAGCTGACCGCAGACTA-3’（SEQ ID NO.6），

R：5’-ATTCCATGGTGTAATAGCTCCAACTAC-3’（SEQ ID NO.7），

拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12的分子标记为上述3对引物中的1对以上的组合物。

一种上述拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12分子标记的应用，上述拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12的分子标记对小麦背景中是否含有拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12进行检测或辅助检测。

上述检测或辅助检测的步骤如下：

（1）以待测的可能含有拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12小麦背景系的基因组总DNA为模板，用权利要求1所述的3对引物分别对模板或对照组进行PCR扩增，扩增结果使用凝胶电泳进行检测；

（2）如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中含有特异DNA条带，则说明待测小麦背景系中含有拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12；如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中不含有特异DNA条带，则说明小麦背景系的和基因组中不含有拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12。

若扩增产物中含有480 bp、350 bp或450 bp特异性条带，则待测样品中含有拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12；

若扩增产物中含有250 bp、500 bp和350 bp特异性条带，则待测样品中含有拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm21。

进一步地，上述引物6SS-1、6SS-2和6SS-3的PCR反应体系为：25 µL PCR反应体系中含约10-20 ng模板DNA，1×PCR buffer，200 mmol L-1 dNTP，上、下游引物终浓度各为0.2 µmol L-1，1U Taq DNA聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至25 µL；

PCR反应程序：94℃预变性3分钟；94℃变性20秒，50℃-60℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃延伸5分钟；4℃保存。

所述6SS-1、6SS-2和6SS-3的引物扩增产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用银染法染色。

本发明根据中国春参考基因组第六部分同源群染色体短臂上的基因中多态性较高的内含子区域开发分子标记。本发明公布的3个分子标记6SS-1 ~ 6SS-3不仅能追踪抗白粉病基因Pm12（6SS特异性条带分别为480 bp、350 bp和450 bp），还能追踪抗白粉病基因Pm21（6VS特异性条带分别为250 bp、500 bp和350 bp），可用于Pm12基因和/或Pm21基因的分子标记辅助育种。

实验表明，本发明开发的分子标记6SS-1、6SS-2和6SS-3在实际使用中，所需PCR退火温度较宽（50℃-60℃），扩增稳定性好，分辨率高，不仅能在小麦背景中高效检测出Pm12基因，也能检测来自簇毛麦的Pm21基因，而且能在聚合Pm12和Pm21基因的小麦中同时检测出Pm12基因和Pm21基因。因此，本发明公布的3个分子标记在Pm12或Pm21基因的分子标记辅助选择育种中具有实际应用价值，并可用于Pm12基因和Pm21基因的聚合育种。

本发明的有益效果：

（1）本发明开发了拟斯卑尔脱山羊草6号染色体短臂（6SS）的特异性分子标记6SS-1 ~6SS-3，提供了检测小麦背景中拟斯卑尔脱山羊草6号染色体短臂（6SS）的新方法；

（2）本发明的特异性分子标记，对小麦背景中是否含有拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12进行检测或辅助检测，特异性强，检测准确率高，在群体中不仅能追踪Pm12基因，还能有效区分Pm12和Pm21基因提供的白粉病抗性，可应用于这两个基因的分子标记辅助育种及聚合育种。

附图说明

图1：分子标记6SS-1的PCR扩增结果。M：DNA marker，1：扬麦9号（感白粉病品种），2：Wembley Line #31（携带Pm12基因），3：扬麦18（携带Pm21基因），4-22：Wembley Line #31与扬麦18杂交形成的F₂单株，其中，4-8：同时含有Pm12和Pm21的抗病单株，9-13：只含有Pm12的抗白粉病单株，14-18：只含有Pm21的抗白粉病单株，19-23：不含有Pm12或Pm21的感白粉病单株。黑色箭头为能追踪Pm12的6SS特异性条带，白色箭头为能追踪Pm21的6VS特异性条带。

图2：分子标记6SS-2的PCR扩增结果。各泳道样品顺序见图1说明。

图3：分子标记6SS-3的PCR扩增结果。各泳道样品顺序见图1说明。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明技术方案进行详细说明，应当理解的是，此处所描述的实施方式仅用于说明和解释发明，并不用于限制发明。

实施例：

本发明所用的小麦遗传种质Wembley Line #31（公知公用，Miller等. Theintroduction of a major gene for resistance to powdery mildew of wheat,Erysphe graminis f. sp. tritici, from Aegilops speotoides in to wheat,Triticum aestivum. In: Jorna ML, Slootmaker LAJ (eds) Cereal breeding relatedto integrated cereal production. Pudoc, Netherland, pp 179-183，1988）具有拟斯卑尔脱山羊草第6号染色体短臂（6SS），携带抗白粉病基因Pm12。扬麦18（公知公用，由江苏里下河农业科学研究所育成并提供）是小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系，携带抗白粉病基因Pm21。扬麦9号（公知公用，由江苏里下河农业科学研究所育成并提供）为感白粉病品种。

1、引物的设计与合成

以簇毛麦抗白粉病基因Pm21附近的基因进行BLAST，找到小麦品种中国春（http://wheat-urgi.versailles.inra.fr）中的同源基因，这些基因也都位于小麦第六部分同源群染色的短臂（6AS、6BS、6DS）。将这些具有同源性的序列进行多序列比对分析，根据其内含子长度多态性区域的两侧保守序列设计特异性引物，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

2、拟斯卑尔脱山羊草6SS染色体特异性标记的筛选与检测

（1）PCR扩增：以不含有外源基因的感病小麦品种扬麦9号、携带Pm12基因的小麦遗传种质Wembley Line #31、携带Pm21基因的扬麦18、Wembley Line #31/扬麦18杂交组合的F₂单株为材料，提取基因组DNA后进行PCR扩增，25 µL PCR反应体系中含约10-20 ng模板DNA，1×PCR buffer，200 mmol L-1 dNTP，上、下游引物终浓度各为0.2 µmol L-1，1U Taq DNA聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至25 µL；PCR反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性20秒，50℃-60℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃延伸5分钟；4℃保存。

（2）PCR产物的检测：PCR扩增产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶（29:1）上进行电泳分离，然后采用银染法染色。

（3）PCR结果分析：本发明筛选到3个拟斯卑尔脱山羊草6SS染色体特异的分子标记（6SS-1 ~ 6SS-3），3个标记所用引物的具体序列为：

6SS-1F：5’-GTATTCATCAAGTTTACCAGTCCA-3’（SEQ ID NO.1），

6SS-1R：5’-GAAGAGGACCTTATGACCCAGA-3’（SEQ ID NO.2）；

6SS-2F：5’-GAACCTACCGCTGGATGGCA-3’（SEQ ID NO.3），

6SS-2R：5’-CAGCAGAAGGTTGTTAATCAGATGCA-3’（SEQ ID NO.4）。

6SS-3F：5’-CCAACTCTAGCTGACCGCAGACTA-3’（SEQ ID NO.5），

6SS-3R：5’-ATTCCATGGTGTAATAGCTCCAACTAC-3’（SEQ ID NO.6）；

用这些标记引物进行PCR扩增，可以分别检测到约为480 bp、350 bp和450 bp的拟斯卑尔脱山羊草6SS特异性条带。同时，也可以分别检测到约为250 bp、500 bp和350 bp的簇毛麦6VS特异性条带（图1 ~ 图3）。这些标记具有退火温度宽（50℃ ~ 60℃）、稳定性好、分辨率高等多种优点。同时，分子标记6SS-1 ~ 6SS-3是有效的诊断性分子标记，不仅能追踪来源于拟斯卑尔脱山羊草的Pm12基因，还能在小麦背景下有效区分Pm12基因和Pm21基因。因此，本发明公布的3个分子标记在Pm12和Pm21基因的分子标记辅助选择育种及两个基因的聚合育种中具有重要的实用价值。

<110>山东省农业科学院作物研究所烟台大学

<120>拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12分子标记及其应用

<160>6

<170>Patent In version 3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>

<400>1

gtattcatca agtttaccag tcca 24

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>

<400>2

gaagaggacc ttatgaccca ga 22

<210> 3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>

<400>3

gaacctaccg ctggatggca 20

<210> 4

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>

<400>4

cagcagaagg ttgttaatca gatgca 26

<210> 5

<211>24

<212>DNA

<213> 人工合成

<220>

<221>

<400>5

ccaactctag ctgaccgcag acta 24

<210> 6

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>

<400>6

attccatggt gtaatagctc caactac 27

Claims

1.拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12的分子标记，其特征在于，引物对碱基序列如下：

6SS-1：

F：5’-GTATTCATCAAGTTTACCAGTCCA-3’（SEQ ID NO.1），

R：5’-GAAGAGGACCTTATGACCCAGA-3’（SEQ ID NO.2），

6SS-2：

F：5’-GAACCTACCGCTGGATGGCA-3’（SEQ ID NO.4），

R：5’-CAGCAGAAGGTTGTTAATCAGATGCA-3’（SEQ ID NO.5），

6SS-3：

F：5’-CCAACTCTAGCTGACCGCAGACTA-3’（SEQ ID NO.6），

R：5’-ATTCCATGGTGTAATAGCTCCAACTAC-3’（SEQ ID NO.7），

2.一种权利要求1所述的拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12的分子标记的应用，其特征在于使用权利要求1所述的拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12的分子标记对小麦背景中是否含有拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12进行检测或辅助检测。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于检测或辅助检测的步骤如下：

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，引物6SS-1、6SS-2和6SS-3

的PCR反应体系为：25 µL PCR反应体系中含约10-20 ng模板DNA，1×PCR buffer，200mmol L^-1 dNTP，上、下游引物终浓度各为0.2µmol L^-1，1U Taq DNA聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至25 µL;

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，6SS-1、6SS-2和6SS-3

引物扩增产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用银染法染色。