CN108359739B

CN108359739B - 一个抗赤霉病相关基因TaRLK-B的SNP标记引物及其应用

Info

Publication number: CN108359739B
Application number: CN201810370075.7A
Authority: CN
Inventors: 肖进; 刘玉; 张婷; 王海燕; 袁春霞; 李子昂; 夏中华; 别同德; 王秀娥
Original assignee: JIANGSU LIXIAHE REGION AGRICULTURAL RESEARCH INSTITUTE; Jiangsu Ruihua Agriculture Science And Technology Co ltd; Nanjing Agricultural University
Current assignee: JIANGSU LIXIAHE REGION AGRICULTURAL RESEARCH INSTITUTE; Jiangsu Ruihua Agriculture Science And Technology Co ltd; Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-04-24
Filing date: 2018-04-24
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2038-04-24
Also published as: CN108359739A

Abstract

本发明公开了一个抗赤霉病相关基因TaRLK‑B的SNP标记引物及其应用。用于追踪抗小麦赤霉病Fhb1的抗病候选基因TaRLK‑B的SNP标记的引物组合，所述的引物组合由SEQ ID NO.1‑4所示序列组成，分别在望水白和Alondra’s中进行PCR扩增，获得两种基因型，可作为TaRLK‑B基因的SNP标记。在作图群体和自然群体，进行标记分析和抗病性的连锁或关联分析，评价该标记在选育抗病的应用价值，表明不仅可以特异鉴定TaRLK‑B，可特异追踪位于3BS上的抗赤霉病基因Fhb1。

Description

一个抗赤霉病相关基因TaRLK-B的SNP标记引物及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，公布一个基于Fhb1的抗病候选基因TaRLK-B的单核苷酸位点多态性(SNP)，开发了一个SNP功能型的分子标记，在生产上可用于选育抗赤霉病相关基因TaRLK-B。

背景技术

小麦是世界上种植面积最大的粮食作物以及人类最重要的粮食来源之一。小麦在开花和籽粒灌浆时期，气候往往温湿多雨，容易感染小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)，导致小麦严重减产和加工品质下降，病麦粒中含有能引起人畜中毒的单端孢霉烯类真菌毒素，严重威胁小麦安全生产。在我国以长江中下游麦区为主要流行区域，近年来由于全球气候变暖、耕作制度变更等影响，小麦赤霉病有逐渐向黄淮麦区、北方麦区等扩展趋势。

不同科学家对小麦抗赤霉病QTLs/基因进行定位研究，发现几乎每条小麦染色体上都有抗病位点分布，凸显其遗传的复杂性。其中位于小麦3B染色体短臂上(3BS)抗病位点Fhb1被反复报道(Waldron et al.,1999；Anderson et al.,2001；Zhang et al.,2004)，可解释25-40％的表型变异，在目前鉴定的抗性QTLs中抗性贡献率也最高。望水白是来自江苏的一个高抗小麦赤霉病的地方品种，在3BS也存在主效QTL Fhb1(Yu et al.,2008)。本实验室前期在快中子辐射望水白后代中鉴定了一个Fhb1缺失的感病突变体(Xiao et al.,2011)，进一步证实该位点在抗病中的重要作用。其它的抗赤霉病主效QTLs包括位于6BS染色体的Fhb2(Cuthbert et al.,2007)、5AS染色体的Fhb4(Xue et al.,2010)和4BS染色体的Fhb5(Xue et al.,2011)。近年来小麦基因组研究飞速发展，国际小麦基因组测序协作组织(IWGSC)于2014年7月公布了中国春小麦每条染色体(臂)的基因组序列，特别是小麦3B染色体序列，是采用BAC-by-BAC测序策略创建高精度小麦基因组序列图谱。这些信息的公布，为我们挖掘3B染色体上重要功能基因提供重要的信息(Choulet et al.,2014)。

植物抗病基因是指经典遗传学上寄主可控制某个病原单个或部分小种抗性的主效基因。随着越来越多的抗病基因被分离，人们逐渐认识到有一些抗病基因属于类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinase，RLK)家族成员。RLK是一类分布于细胞膜表面的跨膜蛋白，通常包括一个膜外受体结构域、一个跨膜结构域和一个胞内激酶结构域，用于识别和传递内源或外源信号，在抗病过程中识别病原菌信号物，将胞外信号转导到胞内，诱导植物发生抗病防卫反应。拟南芥中负责识别鞭毛蛋白的FLS2(Flagellin-sensing 2)和延伸因子的EFR(LRR-RLK EF-Th receptor)都是富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶(Leucine-rich repeat receptor-like kinase，LRR-RLK)(Gomez-Gomez,et al.,2000；Zipfel,et al.,2006)。水稻负责识别白叶枯病菌Ax21蛋白的XA21也属于LRR-RLK家族(Song et al.,2001)。水稻抗褐飞虱主基因Bph3位点是一个基因簇，为四个编码植物凝集素类受体激酶(OsLecRK)(Liu et al.,2014)。从以上研究成果我们得到启示，对于复杂的小麦抗赤霉病性状，可以从以下途径寻求克隆抗病基因突破口：分析小麦-赤霉菌互作的差异表达基因，筛选具有类受体蛋白激酶结构域基因，从基因染色体定位、序列特征分析、表达特征分析、转基因沉默或过表达功能验证等多个层次开展工作，验证其在抗病过程中的作用。

前期研究，通过创制小麦地方品种望水白感赤霉病突变体NAUH117，结合数字基因表达谱技术(DGE)，对该基因的表达特征分析、利用大麦条纹花叶病毒(BSMV)瞬间沉默和转基因功能验证，表明TaRLK-B在小麦抗赤霉病中发挥作用，是Fhb1的抗病候选基因，并于2013年5月，申请获批了一项发明专利，为“一个受体蛋白激酶基因及其表达载体和应用”，专利号为ZL201110428520.9。进一步的克隆分析表明，TaRLK-B具有不同单倍型，即在不同材料中存在单核苷酸位点多态性(SNP)。本专利根据SNP位点差异，开发了一个基于常规PCR扩增检测的SNP标记，作为TaRLK-B的功能标记，以便于选育抗赤霉病主效基因TaRLK-B。

发明内容

本发明目的是开发一个与抗赤霉病主效基因Fhb1紧密连锁的分子标记引物，在生产上直接用于选育TaRLK-B。本发明是根据前期定位的结果，在定位的Fhb1区段克隆一个抗病候选基因TaRLK-B，根据该基因在不同材料的单核苷酸位点多态性(SNP)，开发了一个SNP分子标记，该标记与Fhb1紧密连锁。

为了实现该目的，本发明采用以下技术方案：

用于追踪抗小麦赤霉病Fhb1的抗病候选基因TaRLK-B的SNP标记的引物组合，所述的引物组合由SEQ ID NO.1-4所示序列组成。

本发明所述的引物组合在抗小麦赤霉病分子辅助选择育种中的应用。

所述的引物组合在抗小麦赤霉病品种望水白基因组DNA中PCR扩增出178bp的特征条带，在感小麦赤霉病品种Alondr’s基因组DNA中扩增出212bp的特征条带。

本发明所述的引物组合在特异鉴定TaRLK-B和/或特异追踪位于3BS上的抗赤霉病基因Fhb1中的应用。

用于追踪抗小麦赤霉病Fhb1的抗病候选基因TaRLK-B的SNP标记在抗小麦赤霉病分子辅助选择育种中的应用；所述的SNP标记的引物组合如SEQ ID NO.1-4所示；利用该引物组合在抗小麦赤霉病品种望水白基因组DNA中PCR扩增出178bp的特征条带，在感小麦赤霉病品种Alondr’s基因组DNA中扩增出212bp的特征条带。

用于追踪抗小麦赤霉病Fhb1的抗病候选基因TaRLK-B的SNP标记在特异鉴定TaRLK-B和/或特异追踪位于3BS上的抗赤霉病基因Fhb1中的应用；所述的SNP标记的引物组合如SEQ ID NO.1-4所示；利用该引物组合在抗小麦赤霉病品种望水白基因组DNA中PCR扩增出178bp的特征条带，在感小麦赤霉病品种Alondr’s基因组DNA中扩增出212bp的特征条带。

特异追踪小麦抗赤霉病基因TaRLK-B的分子标记方法，其特征在于利用权利要求1所述的SNP标记的引物组合PCR扩增小麦基因组DNA，能够扩增出178bp的特征条带的小麦为携带小麦抗赤霉病基因TaRLK-B的小麦；扩增出212bp的特征条带的小麦为未携带小麦抗赤霉病基因TaRLK-B的小麦。

有益效果：

1、本发明中公开的能特异追踪小麦抗赤霉病基因TaRLK-B的分子标记方法，是基于功能基因的SNP位点差异设计的，可以建立功能基因与抗病位点的联系。

2、本发明中公开的能特异追踪小麦抗赤霉病基因TaRLK-B的分子标记方法，简单易行、方便快捷、技术稳定。

3、本发明中公开的SNP分子标记与抗赤霉病基因Fhb1紧密连锁，分子标记辅助选择的效率和准确性高。

附图说明

图1、小麦TaRLKs的3个部分同源基因的结构模式图

图2、TaRLK-B基因的SNP位点差异

图3、根据第233位SNP位点差异，设计四引物组合扩增，开发SNP分子标记

图4、SNP标记方法中的四引物组合在望水白和Alondra’s中扩增结果

图5、SNP标记方法中的四引物组合在22个自然群体中扩增结果

图6、SNP标记方法中的四引物组合在RIL作图群体中扩增结果。W：望水白；A：Alondra's。

具体实施方式

实施例1分别在抗病品种望水白和感病品种Alondra’s中克隆TaRLK-B，比较序列差异

根据已公布的中国春序列设计特异引物(TaRLK-F：ATGGCTGTGGTGAGTGCCTCTT(SEQID NO.5)；TaRLK-R：TCACCTGGGGCCTGATAC(SEQ ID NO.6))，克隆3A、3B、3D三条染色体上TaRLK序列，测序后比较发现，TaRLK-A全长1422bp，编码473个氨基酸；TaRLK-B全长1143bp，编码380个氨基酸；TaRLK-D全长1434bp，编码478个氨基酸。与1139-1142bp(TGGA)的TaRLK-D和1224-1227bp(TGGA)的TaRLK-A相比，TaRLK-B的1130-1132bp(TGA)同源等位基因缺一个‘G’碱基，导致TaRLK-B在1141-1143bp提前终止(图1)。

实施例2、SNP分子标记引物的设计

对望水白和Alondra's中TaRLK-B序列比较发现，还存在其他几个SNP(图2)。根据望水白和Alondra's在TaRLK-B中233bp位置上SNP设计Teta-primer ARMS-PCR引物(图3)，

所设计的四引物组合序列信息如下：

outer primer 1:TGGACTCCATTGTCATTGGCAGGAGCAA(SEQ ID NO.1)；

outer primer2:TCCTCCTCCTCCATCTCATGATGCCACTG(SEQ ID NO.2)；

inner primer 1:GCACCCCCACCGAAGGTAACACCGAC(SEQ ID NO.3)；

inner primer 2:ATAGGTGCAGGCAGATCACTTGGGGGCA(SEQ ID NO.4).

实施例2、SNP分子标记方法的实现

利用以上四引物组合在望水白和Alondra’s中进行PCR扩增检测。结果显示，在双亲扩增出多态条带，其中在望水白中扩增178bp的特异扩增条带，Alondra’s中扩增212bp的特异扩增条带(图4)。可以作为SNP分子标记。

PCR试剂组成为：含20-100ng DNA的1.0μL DNA模板，1.0μL10×PCR buffer，0.8μLMgCl₂，0.8μLdNTP，四引物各0.2μL，0.15μL Taq DNA polymerase，5.85μL dd H₂O。

PCR程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火50秒，72℃延伸1分10秒，28个循环；72℃延伸10分钟；10℃保存，PCR产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比为39:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法进行染色。

实施例3、SNP分子标记引物在重组自交系(RIL)群体、22个自然群体中的应用

进一步利用该标记在其它20个小麦基因型中扩增，发现在苏麦3号、早小麦、早火烧头、绵阳11、中国春共5个材料中扩增出与望水白相同带型，在白壳茧子头、铜柱头、茧子头、火烧头、红壳茧子头、红头麦、和尚麦、烟农19、济麦22、宁麦6号、台湾小麦、扬麦158、绵阳8545这14个材料扩增出与Alondra's相同带型，在仗水红中能够同时扩增两个基因型(图5)。该基因标记在抗、感品种中具有明显的相关性。该SNP引物组合和HRC标记的扩增结果完全一致(图5)。因此该标记不仅可以特异鉴定TaRLK-B，可特异追踪位于3BS上的抗赤霉病基因Fhb1。该标记在望水白/Alondra's的117个RIL群体中扩增，将群体分为两种基因型，分别为W型(望水白)57株，A型(Alondra's)58株，两种类型之间病小穗率有极显著差异(图6)，表明该标记与抗病性紧密连锁。

序列表

<110> 南京农业大学

江苏瑞华农业科技有限公司

江苏里下河地区农业科学研究所

<120> 一个抗赤霉病相关基因TaRLK-B的SNP标记引物及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggactccat tgtcattggc aggagcaa 28

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctcctcct ccatctcatg atgccactg 29

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcacccccac cgaaggtaac accgac 26

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ataggtgcag gcagatcact tgggggca 28

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggctgtgg tgagtgcctc tt 22

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcacctgggg cctgatac 18

Claims

1.用于追踪抗小麦赤霉病Fhb1的抗病候选基因TaRLK-B的SNP标记的引物组合，其特征在于所述的引物组合由SEQ ID NO.1-4所示序列组成。

2.权利要求1所述的引物组合在抗小麦赤霉病分子辅助选择育种中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的引物组合在抗小麦赤霉病品种望水白基因组DNA中PCR扩增出178bp的特征条带，在感小麦赤霉病品种Alondr’s基因组DNA中扩增出212bp的特征条带。

4.权利要求1所述的引物组合在特异鉴定小麦TaRLK-B基因和/或特异追踪位于小麦3BS染色体上的抗赤霉病基因Fhb1中的应用。

5.用于追踪抗小麦赤霉病Fhb1的抗病候选基因TaRLK-B的SNP标记在抗小麦赤霉病分子辅助选择育种中的应用；所述的SNP标记的引物组合如SEQ ID NO.1-4所示；利用该引物组合在抗小麦赤霉病品种望水白基因组DNA中PCR扩增出178bp的特征条带，在感小麦赤霉病品种Alondr’s基因组DNA中扩增出212bp的特征条带。

6.用于追踪抗小麦赤霉病Fhb1的抗病候选基因TaRLK-B的SNP标记在特异鉴定小麦TaRLK-B和/或特异追踪位于小麦3BS染色体上的抗赤霉病基因Fhb1中的应用；所述的SNP标记的引物组合如SEQ ID NO.1-4所示；利用该引物组合在抗小麦赤霉病品种望水白基因组DNA中PCR扩增出178bp的特征条带，在感小麦赤霉病品种Alondr’s基因组DNA中扩增出212bp的特征条带。

7.特异追踪小麦抗赤霉病基因TaRLK-B的分子标记方法，其特征在于利用权利要求1所述的SNP标记的引物组合PCR扩增小麦基因组DNA，能够扩增出178bp的特征条带的小麦为携带小麦抗赤霉病基因TaRLK-B的小麦；扩增出212bp的特征条带的小麦为未携带小麦抗赤霉病基因TaRLK-B的小麦。