CN112210616B - 一种与水稻籽粒长度性状相关的InDel分子标记引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物分子遗传育种学领域，提供了与水稻籽粒长度性状相关的InDel标记引物及其应用。该标记正反向引物序列分别为5'‑CGGAGGTGATGGCAGGAG‑3'和5'‑GTACTGCGTGTTGGAGCACC‑3'，利用上述引物对水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行电泳检测，发现扩增条带大小为131bp的水稻品种的籽粒长度明显大于条带大小为125bp的水稻品种。本发明对于筛选和培育高产量水稻新品种具有重要应用价值。

Description

一种与水稻籽粒长度性状相关的InDel分子标记引物及其 应用

技术领域

本发明属于农作物分子遗传育种学领域，具体提供了与水稻籽粒长度相关的分子标记引物及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)作为中国粮食作物之首，其稳定的产量是保证国家粮食安全的重要保障之一。随着城市化进程、水资源限制、种植结构调整等方面带来的影响，我国的水稻实际种植面积已有下降趋势。因此，为了满足日益增长的人口对粮食的需求，提高水稻单位产量具有重要意义。

水稻的单株产量由每株穗数、每穗粒数和粒重等因素共同决定，水稻的粒重由其籽粒大小和灌浆程度决定。在灌浆程度理想的情况下，水稻粒重可以直观的描述为水稻的籽粒大小。水稻籽粒的大小从外观上又可以细分为籽粒长度、籽粒宽度和籽粒厚度等组分，是典型的数量性状，同时又有着较高的遗传力。水稻籽粒的长宽厚直接关系到水稻的粒重，还决定着水稻的长宽比等外观品质。

通过正向遗传学方法，研究人员已经克隆了多个主效的粒重基因(Zuo and Li,2014)。Li等(2004)利用热带粳稻品种Jefferson作为轮回亲本，与普通野生稻回交，将控制粒重的位点gw3.1定位在第3条染色体短臂上一个93.8kb的区间内(Li et al.,2004)。Fan等(2006)等利用明恢63作为轮回亲本与川7杂交、回交，将控制粒重的基因GS3定位在第3染色体，并筛选到了候选基因(Fan et al.,2006)。这些不同群体定位到的控制粒长的位点，最终被证明都是GS3(Fan et al.,2006)。Song等(2007)用亲本WY3和丰矮占构建近等基因系，在第2染色体成功克隆了控制粒宽、粒重的基因GW2，并阐明GW2控制粒宽的分子机理(Song et al.,2007)。利用MAS手段将大粒品种WY3的GW2基因导入到小粒品种FAZ1中后，产生以FAZ1为背景的近等基因系NIL^GW2。相比FAZ1，NIL^GW2的粒宽增加了26.2％、粒厚增加10.5％、粒长增加6.6％、千粒重提高了49.8％，且基本不影响稻米的蒸煮品质(Song etal.,2007)。功能型GW2基因的作用效应表现出较好的应用前景。GW2作为一种E3泛素连接酶参与泛素介导的蛋白降解途径，对颖壳的细胞分裂起负调控作用；GW2突变使其丢失负调功能，加快颖壳的细胞分裂，导致颖壳变宽。Wang等(2015)发现GL7的拷贝数变异影响了GL7基因的表达，同时下调了其附近负调节子的表达，从而调控水稻粒长(Wang et al.,2015b)。通过全基因组关联分析，Si等(2016)鉴定和克隆了一个调控籽粒大小的基因GLW7，编码转录因子OsSPL13；进一步研究发现该基因的表达水平与籽粒大小有关(Si et al.,2016)。Wang等(2015)发现OsSPL16(GW8)-GW7调控模块对籽粒大小和产量的调控，而且OsSPL16可以直接作用于GW7的启动子并抑制其表达(Wang et al.,2015a)。Duan等(2017)通过基因组关联分析鉴定了一个控制籽粒大小的基因GSE5，发现该基因编码一个具有IQ功能域的质膜相关蛋白，该基因的缺失导致了水稻籽粒增大、粒重增加(Duan et al.,2017)。

寻找与水稻籽粒长度相关的基因(标记)，对育种具有重要意义。传统的常规杂交育种依赖于人工目测表型选择，不仅要求研究人员具有丰富的经验而且育种年限长达数年甚至十几年的时间。近年来，以分子标记、转基因技术、CRISPR技术等为代表的分子设计育种技术为植物育种的发展开辟了新方向。研究者们在作物育种实践中，往往借助分子标记技术有效地将某一作物的优良基因导入到另一作物体内，也可以追踪目标基因在植物体内的表达，还可以将多个优良性状的基因聚合在一个作物品种内，对缩短育种周期、提高育种效率具有重要作用。

InDel(insertion-deletion)标记是基于核苷酸插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记，其分布密度大、准确性高、稳定性好。目前，InDel标记已广泛应用于水稻遗传分析、分子辅助育种等领域。随着位于功能基因上InDel标记的开发，可将这些标记应用于水稻重要性状的功能基因的筛选，有利于优良基因的进一步开发和利用。

发明内容

本发明的目的是提供一种与水稻籽粒长度性状相关的InDel分子标记引物对，名称为TF01，以及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种用于检测与水稻籽粒长度性状相关的InDel分子标记的引物对TF01，所述引物对具有下述1)～3)任一项所述的核苷酸序列之一：

1)所述引物对TF01中上游引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述引物对TF01中下游引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

TF01-F：5'-CGGAGGTGATGGCAGGAG-3'(SEQ ID NO.1)

TF01-R：5'-GTACTGCGTGTTGGAGCACC-3'(SEQ ID NO.2)

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且能扩增出水稻长粒相关基因的序列。

本发明第二个目的是提供前述用于检测InDel分子标记的引物对TF01在制备用于检测或辅助检测水稻长粒相关基因的试剂盒或PCR试剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种用于检测水稻长粒相关基因的试剂盒或PCR试剂，所述试剂盒或PCR试剂包括前述的引物对TF01。

进一步的，所述的用于检测水稻长粒相关基因的试剂盒或PCR试剂，所述试剂盒或PCR试剂还包含有PCR技术常用的试剂。

本发明的第四个目的是提供一种DNA片段，所述DNA片段为以水稻基因组DNA为模板，采用前述引物对TF01扩增得到。

前述的引物对TF01、前述的试剂盒或PCR试剂、前述DNA片段在检测水稻粒长相关基因和/或在水稻分子标记辅助育种中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种检测水稻粒长相关基因或水稻分子标记辅助育种方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待测水稻样品基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用前述引物对TF01进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。

(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行浓度为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如果该待测水稻样品扩增出大小为131bp的条带，则该待测水稻为长粒形水稻品系或候选的长粒形水稻品系。

进一步的，步骤(2)所述PCR扩增的反应体系为：2×PowerTaq PCR master MIX5.0μl，10pmol/μl的前述引物对1μl，300-500ng/μl的水稻基因组模板DNA 1μl，加灭菌后的超纯水至10μl。

进一步的，步骤(2)所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸15s，循环30次；最后72℃延伸10min；扩增产物在4℃下保存。

本发明的第六个目的是提供前述的方法在提高长粒形水稻品种育种进程中的应用。

本发明所述的长粒具体指某水稻品种粒长在9mm以上。

本发明技术方案所实现的有益效果为：

(1)通过筛选获得与水稻籽粒长度性状相关的分子标记，为分子标记辅助育种奠定了基础。以待测水稻基因组为模板，利用本发明的引物对进行扩增，若所得扩增产物大小为131bp，则判定所述待测水稻为长粒形水稻品系或候选的长粒形水稻品系(在10个水稻品系中的选择效率为80％)。

(2)本发明的InDel分子标记准确性高、稳定性好。由于这个标记与水稻籽粒长度相关，因此，在水稻苗期就可以用上述的分子标记方法预测植株的籽粒表型，淘汰其它植株，不仅节约生产成本、控制了育种群体规模，而且方便在水稻抽穗前安排育种工作。

(3)本发明提供的分子标记可广泛应用于分子辅助育种中水稻籽粒长度基因的分子检测(标记引物位于水稻参考基因组第6号染色体8848511bp–8848635bp之间)，实现基因的产业化分子育种。

附图说明

图1为InDel分子标记TF01对20份材料进行基因型检测的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

其中：M：分子量Marker；L：长粒形水稻；S：短粒形水稻；1-10：短粒形水稻带型；11-20：长粒形水稻带型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 InDel分子标记TF01在鉴定水稻籽粒长度上的应用

(一)引物TF01的制备

人工合成下述表1所示的引物序列。

表1

(二)InDel分子标记TF01在鉴定水稻籽粒长度中的应用

将供试植株苗期单株挂牌取样后，提取其基因组并以其为模板，用引物对TF01进行扩增，得到产物后进行浓度为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶检测，根据检测结果按照如下方法确定待测单株的基因型：若该待测水稻的扩增产物中有大小为131bp的条带，则该待测水稻为候选长粒形水稻品系。

扩增过程如下所述：

扩增反应体系共10μl，详见表2。

表2 PCR扩增反应体系

PCR扩增程序如下：

步骤一：95℃预变性5min；

步骤二：95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸15s，循环30次；

步骤三：72℃延伸10min

步骤四：扩增产物在4℃下保存。

(三)InDel分子标记TF01筛选长粒水稻品系的结果

如表3所示，为了鉴定TF01与水稻籽粒长度的相关性，一共选取20份供试水稻，采用(二)中的方法进行PCR扩增，得到产物后进行浓度为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(图1)。这些水稻品系来自世界各地，其中包括我国著名栽培种南粳46、南粳9108、武运粳30和9311等。

表3

具体样品和检测结果如表3所示，利用引物对TF01，一共10个扩增长度为125bp的水稻中，仅有1个籽粒长度大于9mm，扩增长度为131bp的水稻中，有8个籽粒长度大于9mm。该结果说明，125带型选择长粒水稻的效率仅为10％，而131带型选择长粒水稻的效率高达80％，131带型与长粒水稻紧密相关。

进一步地，针对TF01扩增出来的带型与水稻籽粒长度的相关性进行统计分析，结果如表4所示。

表4：TF01的带型与水稻籽粒长度的相关性

表4中，7.54mm为含有125带型品种的籽粒长度平均值，9.09mm为含有131带型品种的籽粒长度平均值。分析结果显示，扩增长度为131bp的带型和水稻长粒存在极显著相关(t测验，P<0.05)。可确定，在选育品种时，引物TF01可以作为分子辅助选择的标记。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种与水稻籽粒长度性状相关的InDel分子标记引物及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggaggtgat ggcaggag 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtactgcgtg ttggagcacc 20

Claims (6)

1.一种用于检测InDel分子标记的引物对TF01在制备用于检测或辅助检测水稻长粒的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物对具有下述核苷酸序列：

所述引物对TF01中上游引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述引物对TF01中下游引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

2.权利要求1中所述的引物对TF01在检测水稻粒长中的应用。

3.一种检测水稻粒长的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待测水稻样品基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用权利要求1中所述引物对TF01进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行浓度为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如果该待测水稻样品扩增出大小为131bp的条带，则该待测水稻为长粒形水稻品系或候选的长粒形水稻品系，所述长粒形水稻为粒长在9mm以上。

4.根据权利要求3所述的检测水稻粒长相关基因的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的反应体系为：2×PowerTaq PCR master MIX 5.0μl，10pmol/μl的权利要求1所述引物对1μl，300-500ng/μl的水稻基因组模板DNA 1μl，加灭菌后的超纯水至10μl。

5.根据权利要求3所述的检测水稻粒长的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸15s，循环30次；最后72℃延伸10min；扩增产物在4℃下保存。

6.权利要求3～5任一项所述的方法在提高长粒形水稻品种育种进程中的应用，其特征在于，所述的长粒形水稻为粒长在9mm以上。

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