CN116694811B - 一种与小麦苗期种子根数目qtl紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与小麦苗期种子根数目QTL紧密连锁的分子标记及其应用，包括：提取待测小麦幼嫩叶片的DNA；以上述DNA为模板，采用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3构成的引物对进行PCR扩增；所得扩增产物在10.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离；检测电泳条带是否包含198bp的扩增产物，由此鉴定或辅助鉴定小麦苗期的种子根数目。基于本发明开发的新靶点和新的技术思路，能够用来检测小麦品种/系中是否含有增加种子根数目的QTL位点，以及用于小麦优良根系构型的育种和选育。

Description

一种与小麦苗期种子根数目QTL紧密连锁的分子标记及其 应用

技术领域

本发明涉及分子生物和基因工程技术领域，尤其是一种与小麦苗期种子根数目QTL紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术

小麦（Triticum aestivum L.）世界上最重要的三大粮食作物之一，其产量和品质直接关系到国家粮食安全和人民生活水平。根系是小麦生长发育的基础，也是吸收矿质元素和水分的重要器官，其形态数量性状、活力与地上部生长发育及产量有密切关系，小麦能否获得高产很大程度取决于根系生长发育情况。而种子根的数量决定了植物根系在土壤中的分布范围和密度以及根系吸收水分的能力，因此加强小麦种子根数目的分子遗传基础研究，将有助于育种家培育出高产、抗旱、养分高效利用的小麦新品种。

小麦苗期种子根形态特征对生殖生长期植株的根系统功能有重要影响，其中苗期种子根数目显著影响小麦籽粒大小，与籽粒产量之间存在着密切的相关性，并且明显增强根系吸收水分的能力，在提高小麦抗旱过程中发挥着重要作用。小麦种子根数目是由多基因控制的数量性状，因此，挖掘小麦种子根数目的QTL位点，为小麦根系构型分子育种、抗旱和增产提供了基因资源和技术支撑。

目前，利用不同遗传背景的作图群体，借助分子数量遗传学方法，在小麦不同染色体上报道了一些控制种子根数的QTL，但是定位到的种子根数QTL置信区间较大，以及受环境、遗传背景等因素的影响，导致种子根数目QTL难以用于分子标记辅助育种。因此，开发与种子根数目主效QTL紧密连锁的分子标记，发掘控制种子根数目的优良等位基因，有助于小麦根系分子育种，进而促进小麦高产、抗旱育种。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种与小麦苗期种子根数目QTL紧密连锁的分子标记及其应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

用于鉴定或辅助鉴定小麦苗期种子根数目的试剂盒，该试剂盒通过检测与小麦苗期种子根数目主效QTL紧密连锁的分子标记，进行小麦苗期种子根数目的鉴定或辅助鉴定；所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

作为本发明的一种优选技术方案，该试剂盒至少包含与SEQ ID NO.1所示分子标记对应的扩增引物对；所述引物对包括SEQ ID NO：2所示的上游引物，以及SEQ ID NO：3所示的下游引物。

上述试剂盒的用途，用于鉴定或辅助鉴定被测小麦基因组中是否包含与苗期种子根数目主效QTL紧密连锁的分子标记。

作为本发明的一种优选技术方案，采用所述试剂盒对小麦组织DNA进行扩增，扩增产物包含分子量为198bp的扩增产物，即表明被测小麦包含与苗期种子根数目主效QTL紧密连锁的分子标记。

作为本发明的一种优选技术方案，所述小麦组织为小麦的幼嫩叶片。

上述试剂盒的用途，用于小麦的分子标记辅助育种。

作为本发明的一种优选技术方案，在小麦育种早期通过分子标记辅助育种区分和/或筛选待测小麦的苗期种子根数目表型。

上述试剂盒的用途，用于选育具有特定种子根数目基因型的小麦种质资源库。

用于鉴定或辅助鉴定小麦苗期种子根数目的引物对，该引物对包括SEQ ID NO：2所示的上游引物，以及SEQ ID NO：3所示的下游引物。

鉴定或辅助鉴定小麦苗期种子根数目的方法，该方法包括如下步骤：

A、提取待测小麦幼嫩叶片的DNA；

B、以上述DNA为模板，采用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3构成的引物对进行PCR扩增；

C、所得扩增产物在10.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离；

D、检测电泳条带是否包含198bp的扩增产物，由此鉴定或辅助鉴定小麦苗期的种子根数目。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，采用CTAB法提取待测小麦幼嫩叶片的DNA。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，PCR扩增的体系为10μL，包括：1μL SEQID NO:2所示的上游引物，浓度2μmol/L；1μL SEQ ID NO:3所示的下游引物，浓度2μmol/L；1.5μL浓度为100ng/μL的DNA模板；5μL 2×3G Taq Master Mix；1.5μL ddH₂O。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，PCR扩增程序如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中，电泳缓冲液为1×TBE，190V恒压3h。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤D中，扩增产物包含分子量为198bp的扩增产物，与扩增产物不包含分子量为228bp的扩增产物相比，前者具有相对较多的苗期种子根数目。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明成功开发了一种与小麦苗期种子根数目基因座紧密连锁的分子标记，并进一步开发了其科研应用价值和农业生产应用前景。基于本发明开发的新靶点和新的技术思路，能够用来检测小麦品种/系中是否含有增加种子根数目的QTL位点，以及用于小麦优良根系构型的育种和选育。

附图说明

图1为分子标记QAU2D-230检测亲本TAA10和XX329及其衍生的部分RIL家系的结果示意图；图中，M为2000bp DNA Ladder，T为普通小麦TAA10的扩增带型，X为人工合成六倍体小麦XX329的扩增带型。

图2为QTL-QRn2D定位分析的结果示意图。

图3为182个RIL家系基于QAU2D-230的苗期种子根数目的单标记分析结果示意图；图中AA表示来自TAA10的苗期种子根数目减少等位基因，BB表示来自XX329的苗期种子根数目增加等位基因，***表示差异显著水平（P＜0.001）。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。应当理解，当在本申请说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。还应当理解，在本申请说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。如在本申请说明书和所附权利要求书中所使用的那样，术语“如果”可以依据上下文被解释为“当...时”或“一旦”或“响应于确定”或“响应于检测到”。类似地，短语“如果确定”或“如果检测到[所描述条件或事件]”可以依据上下文被解释为意指“一旦确定”或“响应于确定”或“一旦检测到[所描述条件或事件]”或“响应于检测到[所描述条件或事件]”。另外，在本申请说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。

实施例1、分子标记的开发

1、供试材料的获取。以普通小麦TAA10和人工合成六倍体小麦XX329为亲本构建重组自交系，通过F₁逐代自交形成含有182个家系的F₈代RIL群体；用自交衍生的F₈代RIL家系包含182个家系为供试材料。

2、进行QTL定位分析和检测。将RIL群体182个家系在水培条件下通气培养，考察其发芽后第6天的苗期种子根数目，其中每个株系均设置3个生物学重复，每个生物学重复至少20株幼苗。同时结合182个RIL家系基因型数据，构建高密度遗传连锁图谱，采用WinQTLCart进行加性QTL定位分析，以LOD ≥ 2.5为标准。QTL分析结果如图2所示，在小麦2D染色体上检测到了一个控制苗期种子根数目的主效QTL（QRn-2D），LOD值为5.44，所定位种子根数目QTL能够解释表型变异的11.57%，其中来自XX329的等位基因增加种子根数目0.1条。

3、在QRn2D区段LOD预测峰值附近设计开发了一个在亲本间有多态性的InDel分子标记QAU2D-230，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

分子标记QAU2D-230的上游引物的序列为：GCAGGGCCGGACTAGCTA（SEQ ID NO:2）。

分子标记QAU2D-230的下游引物的序列为：CTAACTTCGTGTCATGGCAA（SEQ ID NO:3）。

4、采用CTAB法提取亲本及182个家系RIL群体幼嫩叶片的DNA。

5、以上述DNA为模板，以所述分子标记为引物进行PCR扩增，PCR扩增的体系为10μL，包括：1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:2所示的上游引物；1μL浓度为2μmol/L的SEQ IDNO:3所示的下游引物；1.5μL浓度为100ng/μL以上的DNA模板；5μL 2×3G Taq Master Mix；1.5μLddH₂O。所述PCR扩增程序如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。所得扩增产物在10.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳缓冲液为1×TBE，190V恒压3h。

6、基于单标记QAU2D-230的小麦苗期种子根数目差异显著性分析

采用QAU2D-230对前述182个RIL家系进行基因型分型的结果，对不同基因型苗期种子根数目进行差异显著性分析，结果如图3所示。

结果表明，与TAA10的等位基因可减少种子根数目的效应相比，来自XX329等位基因增加种子根数目。这说明SEQ ID NO:2所示的上游引物和SEQ ID NO:3所示的下游引物在小麦品种XX329的DNA中获得的分子量为198bp的扩增产物，即为与小麦苗期种子根数目QTL紧密连锁的分子标记（即分子标记QAU2D-230）。

实施例2、应用示例

基于前面的试验和分析可知，本发明开发的新靶点和新技术思路具有良好的科研应用价值和农业生产应用前景。举例如下。

本发明开发的新技术可以应用在分子标记辅助育种中，以鉴定或辅助鉴定小麦苗期种子根数目中。

本发明开发的新技术还可以应用在选育具有种子根数目基因型的小麦种质资源中。

另外，由SEQ ID NO:2所示的上游引物和SEQ ID NO:3所示的下游引物组成的引物对，可以应用在鉴定或辅助鉴定小麦苗期种子根数目性状中，还可以应用在获取与小麦苗期种子根数目相关的分子标记中。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。

综上各实施例可见，本发明涉及与小麦苗期种子根数目QRn-2D位点紧密连锁的分子标记及其应用。本发明的分子标记为QAU2D-230，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；分子标记QAU2D-230的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；本发明还公开了基于上述技术体系的辅助鉴定小麦苗期种子根数目性状的方法，分子标记QAU2D-230可用于检测小麦品种（系）中是否含有增加苗期种子根数目的QTL位点，在小麦幼苗期就能够快速筛选出目标株系，对小麦根系构型育种具有重大应用。

上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.用于辅助鉴定增加小麦苗期种子根数目的试剂盒，其特征在于：该试剂盒通过检测与增加小麦苗期种子根数目主效QTL紧密连锁的分子标记，进行小麦苗期种子根数目的辅助鉴定；所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述小麦为普通小麦TAA10 、人工合成六倍体小麦XX329及其杂交后代；该试剂盒至少包含与SEQ ID NO.1所示分子标记对应的扩增引物对；所述引物对包括SEQ ID NO：2所示的上游引物，以及SEQ ID NO：3所示的下游引物。

2.权利要求1所述试剂盒的用途，其特征在于：用于辅助鉴定被测小麦基因组中是否包含与增加苗期种子根数目主效QTL紧密连锁的分子标记；所述分子标记的核苷酸序列如SEQID NO：1所示；所述小麦为普通小麦TAA10 、人工合成六倍体小麦XX329及其杂交后代。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：采用所述试剂盒对小麦组织DNA进行扩增，扩增产物包含分子量为198bp的扩增产物，即表明被测小麦包含与增加苗期种子根数目主效QTL紧密连锁的分子标记；所述小麦组织为小麦的幼嫩叶片。

4.权利要求1所述试剂盒的用途，其特征在于：在小麦育种早期通过分子标记辅助育种区分和/或筛选待测小麦的苗期种子根数目表型。