CN114107537A - 与小麦苗期侧根数目主效qtl紧密连锁的分子标记、其检测引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与小麦苗期侧根数目主效QTL紧密连锁的分子标记、其检测引物及其应用。所述分子标记的核苷酸为序列表中SEQ ID NO：1所示的序列；所述检测引物的核苷酸为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的序列。本发明还包括一种辅助鉴定小麦苗期侧根数目性状的方法，根据所述分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测小麦基因组DNA为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记。本发明能够用来检测小麦品种（系）中是否含有增加侧根数目的QTL位点，能够用于小麦优良根系构型的育种选育。

Description

与小麦苗期侧根数目主效QTL紧密连锁的分子标记、其检测引 物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种与小麦苗期侧根数目主效QTL紧密连锁的分子标记、其检测引物及其在作物选种培育中的应用。

背景技术

小麦是一种重要的谷类作物和主要的食物来源，在我国粮食安全中发挥重要的作用。根系作为小麦吸收水分和营养的重要器官，对地上部生长发育和产量形成具有重要作用。小麦根系属于须根系，是小麦所有初生根、次生根及其各次分枝上产生的侧根与根毛的总称。与大多数农艺性状一样，根系相关性状是典型的数量性状，受多基因调控，基因的分离和鉴定面临巨大挑战，限制了小麦分子标记的开发和分子育种应用。因此，解析根系相关性状的分子遗传学基础，挖掘侧根数目优异等位基因并利用于育种，将有助于培育根系活力强的小麦高产新品种，保障我国粮食安全和农业可持续发展。

目前，国内外学者已利用多个遗传背景及不同环境条件对小麦侧根数QTL进行了定位分析研究。由于这些小麦侧根数QTL区间较大，其连锁标记距离目标基因较远，导致侧根数目分子标记不能有效用于分子辅助育种。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种与小麦苗期侧根数目主效QTL紧密连锁的分子标记、其检测引物及其应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种分子标记，所述分子标记与小麦苗期侧根数目主效QTL紧密连锁，所述分子标记包含SEQ ID NO：1所示的序列。

作为本发明的一种优选技术方案，所述分子标记的核苷酸为SEQ ID NO：1所示的序列。

一种分子标记，所述分子标记以苗期的小麦基因组DNA为模板，以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的人工核苷酸序列为引物对经PCR扩增得到。

作为本发明的一种优选技术方案，所述小麦为TAA10小麦品种。

一种包含所述的分子标记的载体。

一种包含所述的分子标记或者包含所述载体的重组细胞。

一种引物对，所述引物对用于扩增与小麦苗期侧根数目主效QTL紧密连锁的分子标记。

作为本发明的一种优选技术方案，所述引物对的引物1的核苷酸为SEQ ID NO：2所示序列，引物2的核苷酸为SEQ ID NO：3所示序列。

一种检测试剂盒，包含所述引物对当中的一条或两条。

一种辅助鉴定小麦苗期侧根数目性状的方法，包括以下步骤：根据权利要求1所述分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测小麦基因组DNA为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记；所述引物对采用权利要求7所述的引物对。

制备上述引物对的方法，包括将上述的两条单链DNA分别单独包装的步骤。

用于鉴定或辅助鉴定小麦苗期侧根数目性状的产品，所述产品含有上述的引物对。

用于鉴定或辅助鉴定小麦苗期侧根数目性状的方法，包括以下步骤：

步骤1：提取待测小麦的基因组DNA；

步骤2：以待测小麦的基因组DNA为模板，用上述的引物对进行PCR扩增；

步骤3：将待测小麦的PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳结果确定待测小麦苗期侧根数目性状：如果出现了分子量大小为240bp的扩增片段，预测该小麦品种或品系具有增加小麦苗期侧根数目的QTL位点，否则，该小麦品种或品系不具有增加小麦苗期侧根数目的QTL位点。

作为本发明的一种优选技术方案，在步骤2中，PCR扩增反应体系为10uL,包括：(1)1uL浓度为2umol/L的SEQ ID NO：2所示的上游引物；(2)1uL浓度为2umol/L的SEQ ID NO：3所示的下游引物；(3)1.5uL浓度为50ng/ul的DNA模板；(4)5uL 2*Taq PCR StarMix；(5)1.5uL ddH₂O补足反应体系。

作为本发明的一种优选技术方案，在步骤2中，PCR扩增程序如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸5min，12℃保存；

作为本发明的一种优选技术方案，在步骤3中，凝胶选用的是8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，每100mL凝胶溶液中含有7.8g丙烯酰胺和0.2g甲叉丙烯酰胺。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明提供了一种与小麦苗期侧根数目主效QTL紧密连锁的分子标记，能够用来来检测小麦品种(系)中是否含有增加侧根数目的QTL位点。本发明提供的与小麦苗期侧根数目主效QTL紧密连锁的分子标记及其引物对(SEQ ID NO:2和SEQ ID:3)，能够用于小麦优良根系构型的育种选育。具体来看，本发明至少包括如下技术优势：(1)本发明所提供的引物对，由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的两条单链DNA组成，该引物对具有扩增稳定、检测快捷高效等优点，可以促进小麦苗期侧根数目主效QTL QLrn5D在优良根系构型分子育种中的应用；(2)本发明提供的分子标记QAU5D-20与QLrn5D紧密连锁，其能够促进该位点在推广品种中转移应用，也有利于该位点与其它产量相关位点的聚合育种；(3)本发明提供的分子标记QAU5D-20为Indel标记，具有共显性，其引物对具有扩增稳定、检测快捷高效等优点，通过使用分子标记QAU5D-20，可以快速确定小麦资源中是否存在QLrn5D，并预测小麦苗期侧根数目特性，进而有效筛选含有QLrn5D位点的小麦品种(系)并用于小麦品种根系构型的改良；(4)通过应用与QLrn5D紧密连锁的分子标记QAU5D-20，可以大大减少表型鉴定的工作，并且在小麦苗期加以利用，从而淘汰非目标植株，既节约育种成本，又可以提高育种效率。

附图说明

图1是本发明提供的分子标记QAU5D-20在部分RIL家系中的扩增带型，M为2000bpDNA Ladder，A为小麦品种TAA10的扩增带型，B为小麦品种XX329的扩增带型。

图2是利用Join Map4.0和WinQTLCart进行QTL-QLrn5D定位分析的结果图。

图3是182个RIL家系基因QAU5D-20的苗期侧根数目的单标记分析结果图，AA表示来自TAA10的苗期侧根数目增加等位基因，BB表示来自XX329的苗期侧根数目减少等位基因，***表示差异显著(P＜0.001)。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。

在以下实施例的描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定系统结构、技术之类的具体细节，以便透彻理解本申请实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本申请。

应当理解，当在本申请说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素和/或其集合的存在或添加。

还应当理解，在本申请说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。

如在本申请说明书和所附权利要求书中所使用的那样，术语“如果”可以依据上下文被解释为“当...时”或“一旦”或“响应于确定”或“响应于检测到”。类似地，短语“如果确定”或“如果检测到[所描述条件或事件]”可以依据上下文被解释为意指“一旦确定”或“响应于确定”或“一旦检测到[所描述条件或事件]”或“响应于检测到[所描述条件或事件]”。

另外，在本申请说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。

实施例1、与小麦苗期侧根数目主效QTL紧密连锁的分子标记

以普通小麦TAA10和人工合成六倍体小麦XX329为亲本衍生的包含182个RIL家系为供试材料，利用QTL定位分析，将侧根数目主效QTL(QLrn5D)定位于5D染色体上，利用TAA10和XX329重测序数据，在QLrn5D区段LOD预测峰值附近设计开发了一个在亲本间有多态性的InDel分子标记QAU5D-20。该分子标记QAU5D-20的上游引物的序列为：TTGATAAAAAGCCCCCTTCC(SEQ ID NO:2)，下游引物的序列为：GCTAATTAGACCCGGCAACA(SEQID NO:3)。

以小麦品种TAA10的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:2所示的上游引物和SEQ IDNO:3所示的下游引物进行PCR扩增。

PCR扩增反应体系为10uL,包括：

(1)1uL浓度为2umol/L的SEQ ID NO：2所示的上游引物；

(2)1uL浓度为2umol/L的SEQ ID NO：3所示的下游引物；

(3)1.5uL浓度为50ng/ul的DNA模板；

(4)5uL 2*Taq PCR StarMix；

(5)1.5uL ddH₂O补足反应体系；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s,35个循环；72℃延伸5min，12℃保存；

PCR仪的型号：S100^TMThermal Cycler。

所得扩增产物在8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶(每100mL凝胶溶液中含有7.8g丙烯酰胺和0.2g甲叉丙烯酰胺)上进行电泳分离，最终扩增产物的分子量为240bp(如SEQ IDNO：1所示)。

实施例2、分子标记QAU5D-20的获取

分子标记QAU5D-20的获取方法具体包括以下步骤：

步骤1：形成182个家系的F8代RIL群体

以TAA10和XX329为亲本进行杂交得到杂种F₁，杂种F₁自交产生F2，

F₂逐代自交形成含有182个家系的F8代RIL群体；

步骤2：用CTAB法提取小麦RIL群体叶片DNA，具体的方法和程序如下：

(1)取小麦植株幼嫩叶片0.2g，置于1.5ml Eppendorf管中，加入液氮，研成细粉。

(2)在离心管中加入65℃预热的1×CTAB提取缓冲液600μl，轻轻振荡混匀。

(3)在65℃水浴锅中温浴60min且每10min小心摇动离心管一次。

(4)60min后取出离心管，在通风橱中加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)并小心充分摇动离心管1min，然后静置至有机相由无色→绿色→深绿色。

(5)室温下，10000rpm离心10min，然后吸上清500μl至新的离心管中。

(6)在上清中加入等体积预冷的异丙醇(-20℃)，小心混匀后于-20℃放置20min。

(7)室温下，10000rpm离心10min，小心倒掉上清后加入75％乙醇600μl进行漂洗，轻微摇动离心管，使DNA悬浮起来。

(8)室温下，8000rpm离心2min，然后小心倒掉上清并放置常温干燥。

(9)待DNA晾干后，加入适量的灭菌ddH₂O，充分溶解DNA。

(10)用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，存在-20℃冰箱中备用。

用SEQ ID NO:2所示的上游引物和SEQ ID NO:3所示的下游引物对上述提取的所有DNA进行PCR扩增。

PCR扩增反应体系为10uL,包括：

(1)1uL浓度为2umol/L的SEQ ID NO：2所示的上游引物；

(2)1uL浓度为2umol/L的SEQ ID NO：3所示的下游引物；

(3)1.5uL浓度为50ng/ul的DNA模板；

(4)5uL 2*Taq PCR StarMix；

(5)1.5uL ddH₂O补足反应体系；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸5min，12℃保存；

PCR仪的型号：S100^TMThermal Cycler。

所得扩增产物在8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳缓冲液为1*TBE，180V恒压3h。

硝酸银染色步骤：电泳完毕后，剥离胶块在染色液中染色15min，用去离子水冲洗3次，之后转入显影液中显影至扩增条带清晰可见，用水清洗2次。

将显影后的胶块放至观片灯上，记录带型，拍照得到凝胶图片，如图1所示。

带型读取结果：TAA10扩增产物大小为240bp，XX329扩增产物大小为219bp，RIL共182个群体中带型与TAA10相同的有83个，带型与xx329相同的有91个。

步骤3：构建小麦分子标记遗传连锁图谱

利用JoinMap 4.0作图软件，将获得的RIL群体基因型资料构建具有44个标记位点的小麦分子标记遗传连锁图谱。

步骤4：考察RIL群体中182个株系的侧根数目

将RIL群体182个家系在水培条件下通气培养，考察其发芽后第8天的苗期侧根数目。每个株系均设置3个生物学重复，每个生物学重复至少8株幼苗。

苗期侧根数目测定方法：用根系扫描仪进行统一测根，对小麦苗的初生主根扫描纪录，扫描后用Adobe Photoshop软件进行小麦苗期侧根数目的统计，记录。

步骤5：进行加性QTL定位分析

利用上述182个RIL高密度遗传连锁图谱以及基因型和表型值，采用WinQTLCart进行加性QTL定位分析，分析结果如表1、图2。

表1苗期侧根数目主效QTL(QLrn5D)的定位结果

QTL分析结果表明：区间定位在5D染色体的最近标记QAU5D-20，LOD值为3.98，所定位侧根数目QTL能够解释表型变异的8.4％，其中来自TAA10的等位基因增加侧根数目1.36条。

步骤6：基于单标记QAU5D-20的苗期侧根数目差异显著性分析

采用QAU5D-20对前述182个RIL家系进行基因型分型的结果，对不同基因型苗期侧根数目进行差异显著性分析，结果如图3所示。

结果表明，与来自XX329等位基因减少侧根数目的效应相比，来自TAA10的等位基因可增加苗期侧根数目。这说明SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物在小麦品种TAA10的DNA中获得的分子量为240bp的扩增产物，即为与小麦苗期侧根数目QTL紧密连锁的分子标记(即分子标记QAU5D-20)。

实施例3、分子标记QAU5D-20的应用

基于前面的试验和分析可知：(1)由SEQ ID NO:2所示的上游引物和SEQ ID NO:3所示的下游引物组成的引物对，可以应用在鉴定或辅助鉴定小麦苗期侧根数目性状中，还可以应用在获取与小麦苗期侧根数目相关的分子标记中；(2)分子标记QAU5D-20，可以应用在鉴定或辅助鉴定小麦苗期侧根数目中，还可以应用在选育具有侧根数目基因型的小麦中。

综上，本发明提供的引物对以及分子标记QAU5D-20，可大大加快小麦苗期侧根数目分子标记辅助选育进程，对小麦根系遗传改良和培育高产、优质小麦品种具有重要应用价值。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。

以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 与小麦苗期侧根数目主效QTL紧密连锁的分子标记、其检测引物及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 240

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 1

ttgataaaaa gcccccttcc ccaaacccaa acttcatttc gttaaaacga aaagtaacgg 60

tatcaaactg caggcatcat ctcttttttc cttagtattt ttcccttggt gacattgatg 120

aggtggccat atcgacggtg tgttggaaca aggtctctct cgtctcttct tacctcgatg 180

acatccgatc tggcaccaac agaaggtctg tgtgagtttg tgttgccggg tctaattagc 240

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ttgataaaaa gcccccttcc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gctaattaga cccggcaaca 20

Claims (10)

1.一种分子标记，其特征在于：所述分子标记与小麦苗期侧根数目主效QTL紧密连锁，所述分子标记包含SEQ ID NO：1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于：所述分子标记的核苷酸为SEQ ID NO：1所示的序列。

3.一种分子标记，其特征在于： 所述分子标记以苗期的小麦基因组 DNA 为模板，以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的人工核苷酸序列为引物对经 PCR 扩增得到。

4.根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于：所述小麦为TAA10小麦品种。

5.一种包含权利要求 1-4 任一项所述的分子标记的载体。

6.一种包含权利要求 1-4 任一项所述的分子标记后者包含权利要求5所述载体的重组细胞。

7.一种引物对，其特征在于：所述引物对用于扩增与小麦苗期侧根数目主效QTL紧密连锁的分子标记。

8.根据权利要求7所述的引物对，其特征在于：所述引物对的引物1的核苷酸为SEQ IDNO：2所示序列，引物2的核苷酸为SEQ ID NO：3所示序列。

9.一种检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求8所述引物对当中的一条或两条。

10.一种辅助鉴定小麦苗期侧根数目性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：根据权利要求 1所述分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测小麦基因组 DNA 为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记；所述引物对采用权利要求7所述的引物对。

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