CN111926102A

CN111926102A - 一种水稻光温敏雄性不育基因pms3的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN111926102A
Application number: CN202010864426.7A
Authority: CN
Inventors: 李佳林; 李燕群; 唐杰; 曾翔; 吴永忠
Original assignee: Hainan Bolian Rice Gene Technology Co ltd
Current assignee: Hainan Bolian Rice Gene Technology Co ltd
Priority date: 2020-08-25
Filing date: 2020-08-25
Publication date: 2020-11-13

Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种水稻光温敏雄性不育基因pms3的分子标记及其应用。所述分子标记由如SEQ ID NO.1‑3所示的引物扩增得到。利用该分子标记，只需通过简单的PCR和PAGE凝胶电泳检测即可完成对pms3的基因分型，预测水稻光温敏雄性不育性。本发明具有对DNA质量要求低、基因分型更准确、成本更低廉、检测通量更高等优势，更适合普通育种单位在水稻大规模分子标记辅助育种中进行运用。

Description

一种水稻光温敏雄性不育基因pms3的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体地说，涉及一种水稻光温敏雄性不育基因pms3的分子标记及其应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界多数人口以稻米作为日常主食。基于不育系、保持系和恢复系的水稻“三系”配套成功及三系杂交稻的成功推广，使水稻产量实现了巨大飞跃。但是，随着时间的推移，三系不育细胞质过于单一和种质资源利用率低的弊端不断显现，阻碍了三系杂交稻的进一步推广和利用。1973年，石明松在湖北沔阳县的(今湖北省仙桃市)沙湖原种场种植的晚粳品种农垦58的大田中发现光周期敏感的核雄性不育突变体，后命名为农垦58S(石明松.对光照长度敏感的隐性雄性不育水稻的发现及初步研究.中国农业科学，1985，2：44-48)，至此开启了“两系”杂交水稻育种的序幕。

过去，由于研究条件有限，人们只能通过自身经验结合外观表型将两系不育基因源保留下来，选择盲目性很大。随着科学技术的发展，一大批两系不育基因得以克隆，如pms3或p/tms12-1和tms5(国家水稻数据中心http://www.ricedata.cn/index.htm)，为进一步的育种工作打下了坚实基础。

pms3或p/tms12-1位于第12染色体，是控制粳稻农垦58S光敏型雄性不育和控制籼稻培矮64S温敏雄性不育的隐性核基因，克隆证实它们位于同一个位点，是一个非编码RNA。华中农业大学张启发课题组研究认为pms3基因的突变导致了农垦58变为光敏核雄性不育系农垦58S，后续研究也证实pms3转录本上确实存在SNP变异，农垦58中碱基G变成了农垦58S中的碱基C。该突变引起了pms3编码的长1236bp的long noncoding RNALDMAR的RNA二级结构发生了改变，并造成其启动子区域DNA甲基化中CG甲基化程度的升高，抑制了基因在长日照下幼穗中的表达量，导致雄性不育。此后进一步深入研究发现是由LDMAR启动子区长度为21nt的小RNAPsi-LDMAR介导了该区间的DNA甲基化，属于典型的RNA介导的DNA甲基化(Ding J H,Lu Q,Ouyang Y D,et al.A long noncoding RNA regulates photoperiod-sensitive male sterility,an essential component of hybrid rice.Proceedings ofthe National Academy of Sciences,2012,109:2654-2659；Ding J H,Shen J Q,Mao HL,et al.RNA-directed DNA methylation is involved in regulating photoperiod-sensitive male sterility in rice.Molecular Plant,2012,5:1210-1216；Mei M H,Chen L,Zhang Z H,et al.pms3 is the locus causing the original photoperiod-sensitive male sterility mutation of‘Nongken 58S’.Science in China Series C-Life Science,1999,42:316-322)。华南农业大学庄楚雄课题组进一步指出，在培矮64S中鉴定到的p/tms12-1位点上的同一个碱基突变造成了光温敏雄性不育，该碱基突变恰好位于21nt的小RNA osa-smR5864m的第11位上，osa-smR5864m和野生型osa-smR5864w都在幼穗中优先表达，但两者之间的表达差异并不受光照长度和温度的影响，推测其作用的发挥并不是通过小RNA的表达量来体现，可能是通过对小RNA结合的下游靶基因进行调控：osa-smR5864w会抑制其下游靶基因的表达，而osa-smR5864m则不存在这种抑制作用，使得光温敏雄性不育表型的出现。因此p/tms12-1单碱基的突变导致osa-smR5864m丧失功能，使其在粳稻和籼稻背景中分别表现出光敏雄性不育和温敏雄性不育(Zhou H,Liu Q J,Li J,etal.Photoperiod-and thermo-sensitive genic male sterility in rice are causedby a point mutation in a novel noncoding RNA that produces a small RNA.CellResearsh,2012,22:649-660)。

根据野生型和突变型pms3的功能SNP，人们相继开发了对应的CAPS标记(张华丽，陈晓阳，黄建中等.中国两系杂交水稻光温敏核不育基因的鉴定与演化分析.中国农业科学,2015,48(1):1-9)、dCAPS标记(祁永斌，王建军，王林友等.水稻光温敏雄性不育pms3和p/tms12-1基因的分子检测方法及其分子标记.2017,CN106282338A)、四引物分子标记(李军，李白，高荣村.利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术检测水稻光温敏核不育基因p/tms12-1.中国水稻科学,2014,28(4):442-446；邓国富，高利军，周萌等.水稻不育基因pms3的特异性功能标记及其应用.2015,专利号：CN104531693A)和基于KASP技术的SNP分子标记(彭佩，贺治洲，张先文等.用于检测水稻不育基因pms3的SNP分子标记.2018，专利号：CN108048598A)。

使用以上标记都能鉴定pms3不同基因型，但也存在一定问题。如：使用四条引物进行PCR并使用琼脂糖胶进行电泳检测，这提高了检测成本，对DNA质量要求比较高，同时增加了PCR假阳性出现的概率，在检测通量上也受到限制；而使用CAPS或dCAPS标记，在进行常规PCR后还需要进行酶切反应，操作过程相对繁琐、实验成本上也相对较高，在检测通量上同样受到限制且DNA质量要求也比较高。对于KASP标记而言，其本身存在检测平台不易建立、仪器及试剂耗材昂贵、引物需要特别设计、成本比较高等不足。

开发一种对DNA质量要求更低、成本更低、检测准确性和通量更高的分子标记用于pms3基因分型，将极大促进pms3基因在水稻光温敏核雄性不育新种质资源培育中的应用、加快两系育种进展。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明基于pms3转录本上的SNP变异，经大量设计、摸索、筛选和验证得到了水稻光温敏雄性不育基因pms3的三引物分子标记及其特异性引物组合，并根据上述发现提供了一种水稻光温敏雄性不育基因pms3的分子标记及其应用。

具体而言，第一方面，本发明提供了一种水稻光温敏雄性不育基因pms3的分子标记，其由如SEQ ID NO.1-3所示的引物扩增得到。

本发明进一步提供检测水稻光温敏雄性不育基因pms3的引物组合，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。

其中，SEQ ID NO.1所示的正向引物pms3-F1:AGCAAAGAAGTGCATTGTGTGTG，SEQ IDNO.2所示的正向引物pms3-F2:ATGGTGAATCAAAGAAGTGCATTGTTAGTC，和SEQ ID NO.3所示的反向引物pms3-R:GGCGGCTCCGTTATAGATAGAC。

本发明上述引物组合是针对pms3基因野生型和光温敏雄性不育表型之间存在的功能SNP设计、筛选后获得。pms3-F1和pms3-F2的引物结合位置相同，但3’末端碱基分别为G和C，只能分别与突变型和野生型SNP配对。此外，pms3-F2的5’端增加了特异序列ATGGTGA用以引入扩增片段长度多态性，pms3-F1的3’端第5个碱基引入了T→G的突变，pms3-F2的5’端第9个碱基和3’端第4个碱基引入了G→T和T→A的突变用以扩大pms3-F1和pms3-F2对目标序列识别能力的差异及避免引物间产生引物二聚体。pms3-R可以分别与pms3-F1和pms3-F2配对扩增出116bp和123bp的PCR产物。

第二方面，本发明提供所述的引物组合在制备检测水稻光温敏雄性不育基因pms3的试剂盒中的应用。

本发明进一步提供一种用于检测水稻光温敏雄性不育基因pms3的试剂盒，含有所述的引物组合。

作为优选，所述试剂盒在工作时的反应程序如下：94℃，4-5min；94℃，20-30s，54-56℃，20-30s，72℃，20-30s，共35个循环；72℃，5-10min，16℃，1min。

所述试剂盒在工作时的10μL反应体系如下：2×PCR反应mix5μL，pms3-F1 0.75μL，pms3-F2 0.5μL，pms3-R 0.5μL，10％DMSO0.5μL，待测样品的基因组DNA1-1.5μL，补ddH₂O至10μL；

其中，所述pms3-F1为序列如SEQ ID NO.1所示的引物，所述pms3-F2为序列如SEQID NO.2所示的引物，所述pms3-R为序列如SEQ ID NO.3所示的引物；所述pms3-F1、pms3-F2和pms3-R的浓度均为10μM。

第三方面，本发明提供所述的分子标记或所述的引物组合或试剂盒在检测水稻光温敏雄性不育基因pms3中的应用。

进一步的，本发明还提供一种检测水稻光温敏雄性不育基因pms3的方法，以待测样品的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-3所示的引物进行PCR扩增，根据扩增产物大小判断水稻光温敏雄性不育基因pms3的基因型。

作为优选，若扩增产物只出现116bp条带，则表明待测样品的基因型为突变型，待测样品为含有隐性纯合pms3基因的粳型光敏雄性不育系或籼型温敏雄性不育系；若只出现123bp条带，则表明待测样品的基因型为野生型，待测样品为含有显性纯合PMS3基因的种质资源；若同时出现116bp和123bp条带，则表明待测样品的基因型为杂合型，待测样品为含有PMS3/pms3基因型的的种质资源。

116bp条带的参考序列如SEQ ID NO.4所示，123bp条带的参考序列如SEQ ID NO.5所示。本领域技术人员应当理解，由于水稻品种的差异，设计引物时预测的PCR产物序列只能作为参考序列，而从不同品种中扩增出来的产物的序列可能和参考序列完全一致，也可能与参考序列有部分碱基差异，但这种差异通常不会影响标记的使用。

作为优选，所述PCR的反应程序如下：94℃，4-5min；94℃，20-30s，54-56℃，20-30s，72℃，20-30s，共35个循环；72℃，5-10min，16℃，1min。

作为优选，所述PCR的10μL反应体系如下：2×PCR反应mix5μL，pms3-F1 0.75μL，pms3-F2 0.5μL，pms3-R 0.5μL，10％DMSO0.5μL，待测样品的基因组DNA1-1.5μL，补ddH₂O至10μL；

以上PCR反应体系中模板DNA可采用常规方法提取得到。特别地，相比于现有技术的检测方法，本发明提供的检测引物和检测方法可实现以简易法提取得到的DNA为模板进行高效扩增和检测。

优选地，所述水稻基因组DNA模板采用简易法提取得到。

简易法提取水稻基因组DNA的方法可采用如下方法：

(1)取1cm左右的水稻叶片放入多孔PCR板中；

(2)加入70μL缓冲液A(20％Tween20:800μL，5mol/L NaOH：160μL，ddH₂O 7.04mL，用硅胶盖封口，立刻将PCR板放入PCR仪中，95℃，保持10min；

(3)取出PCR板，迅速加入等体积缓冲液B(1mol/L Tris-HCl(pH8.0)：1mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)：40μL，ddH₂O 8.96mL)得到的提取液可直接用于作为模板DNA。

在本发明的一个优选实例中，所述的2×PCR反应mix可以为Biomiga的2×BenchTop^TM Taq master mix。

在本发明的一个实施例中，是通过将PCR扩增产物进行PAGE胶电泳对其大小进行判断，PAGE胶电泳条件为：6％PAGE胶，U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，电泳1h。

本发明进一步提供所述的分子标记或所述的引物组合或试剂盒或所述的方法在鉴定或筛选光温敏雄性不育水稻中的应用。

本发明进一步提供所述的分子标记或所述的引物组合或试剂盒或所述的方法在水稻育种、水稻种质资源改良及分子标记辅助选择中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明基于水稻光温敏雄性不育基因pms3在野生型和光温敏雄性不育表型之间存在的功能SNP，设计开发了一种扩增片段短，特异性强的三引物分子标记。利用该分子标记，只需通过简单的PCR和PAGE凝胶电泳检测即可完成对pms3的基因分型，预测水稻光温敏雄性不育性。本发明具有对DNA质量要求低、基因分型更准确、成本更低廉、检测通量更高等优势，更适合普通育种单位在水稻大规模分子标记辅助育种中进行运用。

附图说明

图1是本发明分子标记的引物设计示意图。

图2是用本发明分子标记检测18个水稻品种/品系的PAGE胶电泳图。泳道1-18分别为7001S(含隐性pms3基因)、双8S(含隐性pms3基因)、元丰9918S、GP08S、GP23S、GP16S、GP15S、9918S、919S、149S、023S、双11S、33S、C815S、Y58S、泷S、聚7S、龙S。PCR产物大小标记在胶图右侧。

图3是用本发明分子标记检测2245(为9311突变体)/双8S的F3代16个单株的PAGE胶电泳图。泳道1-16为不同的F3代单株，泳道17为双8S。PCR产物大小标记在胶图右侧。

图4是2245(为9311突变体)/双8S的F3代中纯合pms3基因型和纯合PMS3基因型单株、7001S、双8S、D38S、聚7S测序序列与日本晴、9311参考序列比对结果。箭头所指处为功能碱基突变位点。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例1水稻pms3基因分子标记的引物设计及扩增片段分析

1、引物设计

通过对水稻光温敏雄性不育基因pms3在正常可育和两系品种中等位基因的序列比对，分析得到了pms3基因野生型和光温敏雄性不育表型之间C→G的功能SNP。根据该SNP位点上下游的序列设计引物组合：

pms3-F1:AGCAAAGAAGTGCATTGTGTGTG(SEQ ID NO.1)，

pms3-F2:ATGGTGAATCAAAGAAGTGCATTGTTAGTC(SEQ ID NO.2)，和

pms3-R:GGCGGCTCCGTTATAGATAGAC(SEQ ID NO.3)。

引物设计示意图见图1，其中，pms3-F1和pms3-F2的引物结合位置相同，但3’末端碱基分别为G和C，只能分别与突变型和野生型SNP配对。此外，pms3-F2的5’端增加了特异序列ATGGTGA用以引入扩增片段长度多态性，pms3-F1的3’端第5个碱基引入了T→G的突变，pms3-F2的5’端第9个碱基和3’端第4个碱基引入了G→T和T→A的突变用以扩大pms3-F1和pms3-F2对目标序列识别能力的差异及避免引物间产生引物二聚体。SNP位点用方框标出，引入的碱基突变用下划线标出。

2、扩增片段分析

用上述引物组合对水稻光温敏雄性不育基因pms3进行扩增，突变型材料将只能扩出一条116bp条带，野生型的材料则只能扩出一条123bp条带。116bp和123bp条带的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

实施例2用本发明分子标记鉴定水稻品种/品系的pms3基因型

1、实验材料

7001S(含隐性pms3基因)、双8S(含隐性pms3基因)、元丰9918S、GP08S、GP23S、GP16S、GP15S、9918S、919S、149S、023S、双11S、33S、C815S、Y58S、泷S、聚7S、龙S。

2、水稻基因组DNA的提取

在苗期提取叶片基因组DNA，DNA提取参考赵国珍等(赵国珍,贾育林,严宗卜等.一种高效便捷的水稻DNA提取法及其应用.中国水稻科学,2012,26(4)：495-499)建立方法稍加改进，具体方法如下：

DNA提取使用的化学试剂：

缓冲液A(现配现用)：20％Tween20:800μL，5mol/L NaOH：160μL，ddH₂O 7.04mL。

缓冲液B：1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)：1mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)：40μL，ddH₂O8.96mL。

DNA提取步骤：

(1)取新鲜水稻叶片或老叶片约1cm左右放入200μL 96孔PCR板中；

(2)每孔加入70μL缓冲液A，用96孔硅胶盖封口，立刻将平板放入PCR仪中，95℃，保持10min；

(3)取出平板，迅速加入等体积缓冲液B得到提取液，该提取液即可直接作为模板DNA进行PCR检测；

(4)若要存留一段时间进行PCR检测，可将剩下的提取液封口保存于-20℃备用，但不宜反复冻融。

3、PCR扩增

利用实施例1筛选得到的特异性引物组合(pms3-F1，pms3-F2，pms3-R)对本实施例所述18个水稻品种/品系的DNA进行PCR扩增，PCR的反应体系为：Biomiga的2×Bench Top^TMTaq master mix 5μL，10μM的pms3-F1为0.75μL、pms3-F2和pms3-R各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，简易法提模板DNA约1.5μL，补ddH₂O至10μL；

PCR反应条件为：94℃，4min；94℃，30s，54℃，30s，72℃，20s，共35个循环；72℃，5min，16℃，1min。

4、PCR产物检测

扩增产物经6％PAGE胶电泳检测，电泳条件为：U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，电泳1h。电泳完成后用0.1％AgNO₃染色，观片灯上观察拍照。

5、结果与分析

用本发明实施例1的分子标记的引物组合扩增这18个水稻品种/品系，结果见图2，在图2中，泳道1-18分别为7001S(含隐性pms3基因)、双8S(含隐性pms3基因)、元丰9918S、GP08S、GP23S、GP16S、GP15S、9918S、919S、149S、023S、双11S、33S、C815S、Y58S、泷S、聚7S、龙S。PCR产物大小标记在胶图右侧。

根据该结果，只有7001S和双8S扩增出了一条116bp的带，为纯合突变基因型，而所有其它品种/品系都只扩增出了一条123bp的带，为纯合野生基因型。这些结果表明突变型pms3在现有水稻栽培品种中分布稀少，只存在于少数特异的种质资源中，说明两系法育种中pms3基因还有很大利用潜力可挖掘。此外，野生型和突变型pms3电泳带型和测序后功能SNP碱基类型的一一对应关系验证了本发明分子标记在鉴定pms3基因型时的准确性和可靠性(见图4)。

实施例3本发明分子标记的应用

1、水稻材料2245(9311突变体)/双8S的F3代16个单株。

2、水稻基因组DNA的提取在苗期提取叶片基因组DNA，具体方法同实施例2。

3、PCR扩增和产物判断标准参见实施例2。

4、结果与分析

用本发明实施例1的分子标记(特异性引物组合pms3-F1，pms3-F2，pms3-R通过PCR扩增得到)在苗期检测2245(9311突变体)/双8S的F3代16个单株中pms3的基因型，发现全部8个单株同时扩增出了116bp和123bp条带，3个单株只扩增出了116bp条带，5个单株扩增出了123bp条带，结果见图3，图3中，泳道1-16为为不同的F3代单株，泳道17为双8S。PCR产物大小标记在胶图右侧。

对F3群体中筛选到的纯合pms3基因型和PMS3基因型单株、7001S、双8S、D38S、聚7S进行测序并与参考序列进行序列比对，发现纯合pms3基因型单株序列与7001S和双8S序列在功能SNP处完全一致，纯合PMS3基因型单株序列与D38S、聚7S及野生型参考序列(日本晴和9311)在功能SNP处完全一致，结果见图4，图4中，箭头所指处为功能碱基突变位点。说明本发明分子标记确实能在杂交后代中有效区分pms3的基因型，且结果真实准确，利用该分子标记在大规模育种实践中能较为准确地对光温敏雄性不育基因pms3进行辅助选择。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 一种水稻光温敏雄性不育基因pms3的分子标记及其应用

<130> KHP201114963.7

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcaaagaag tgcattgtgt gtg 23

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtgaatc aaagaagtgc attgttagtc 30

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcggctccg ttatagatag ac 22

<210> 4

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcatagaag tgcattgtgt gtgtaccatc catcaagagt aaaattttta tcaacacgca 60

gttcagatac tctagatgca gtataacttc tcgggtctat ctataacgga gccgcc 116

<210> 5

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggtgaatc aaagaagtgc attgttagtc taccatccat caagagtaaa atttttatca 60

acacgcagtt cagatactct agatgcagta taacttctcg ggtctatcta taacggagcc 120

gcc 123

Claims

1.一种水稻光温敏雄性不育基因pms3的分子标记，其特征在于，由如SEQ ID NO.1-3所示的引物扩增得到。

2.检测水稻光温敏雄性不育基因pms3的引物组合，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQID NO.1-3所示的引物。

3.一种用于检测水稻光温敏雄性不育基因pms3的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的引物组合。

4.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在检测水稻光温敏雄性不育基因pms3中的应用。

5.一种检测水稻光温敏雄性不育基因pms3的方法，其特征在于，以待测样品的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-3所示的引物进行PCR扩增，根据扩增产物大小判断水稻光温敏雄性不育基因pms3的基因型。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，若扩增产物只出现116bp条带，则表明待测样品的pms3基因为突变型；若只出现123bp条带，则表明待测样品的pms3基因为野生型；若同时出现116bp和123bp条带，则表明待测样品的pms3基因为杂合型。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应程序如下：94℃，4-5min；94℃，20-30s，54-56℃，20-30s，72℃，20-30s，共35个循环；72℃，5-10min，16℃，1min。

8.根据权利要求5～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR的10μL反应体系如下：2×PCR反应mix 5μL，pms3-F1 0.75μL，pms3-F2 0.5μL，pms3-R 0.5μL，10％DMSO 0.5μL，待测样品的基因组DNA1-1.5μL，补ddH₂O至10μL；

其中，所述pms3-F1为序列如SEQ ID NO.1所示的引物，所述pms3-F2为序列如SEQ IDNO.2所示的引物，所述pms3-R为序列如SEQ ID NO.3所示的引物；所述pms3-F1、pms3-F2和pms3-R的浓度均为10μM。

9.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒或权利要求5～8中任一项所述的方法在鉴定或筛选光温敏雄性不育水稻中的应用。

10.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒或权利要求5～8中任一项所述的方法在水稻育种、水稻种质资源改良及分子标记辅助选择中的应用。