CN112813185A

CN112813185A - 一种用于鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型的引物组合物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN112813185A
Application number: CN202110195043.XA
Authority: CN
Inventors: 李白; 张世玺; 王蕾; 姚坚; 种高军
Original assignee: JIAXING ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: JIAXING ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2021-02-20
Filing date: 2021-02-20
Publication date: 2021-05-18

Abstract

本发明公开了一种用于鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型的引物组合物、试剂盒及方法。引物组合物包括一对外引物lox3‑o‑F、lox3‑o‑R和一对内引物lox3‑i‑F、lox3‑i‑R。本发明引物组合能够快速、有效、经济地鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型，使用一次普通PCR和琼脂糖凝胶电泳的方法对lox3进行基因分型，实现水稻耐储藏性状的分子标记辅助育种。由于本发明的基因标记位于lox3编码区内部，与其它标记方法相比检测更准确，4引物的设计通过一次普通PCR即可完成反应，且带型差异较大，可使用廉价的琼脂糖凝胶电泳分辨带型。

Description

一种用于鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型的引物组合物、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型的引物组合物、试剂盒及方法。

背景技术

水稻是我国主要的粮食作物之一，现在对水稻生产的要求从追求产量向优质食用、加工专用、风味特用和耐储备用等多样化目标发展，尤其在稻米流通领域，迫切需要耐储特性优良的水稻品种，以满足目前的稻米消费和水稻生产需求。稻米消费方面，部分稻米品种刚收获时加工的大米食味上乘，但秋收储藏过春节后，稻米品质即明显下降，至来年下半年则外观、食味均显著劣变，严重影响了大米的商品性。水稻生产方面，在水稻种子生产保存过程中，由于部分品种稻谷陈化速度快，其生活力下降，导致发芽率降低，给储备和生产带来了较大影响。有研究表明，稻米储藏期间脂质的氧化是导致其品质下降的主要原因之一，其中脂肪氧化酶(LOX)是脂质降解的关键酶。因此，生产中利用各种方法试图抑制或消除水稻中的脂肪酶活性，虽然取得了一定的成效，但是这些方法涉及不同的加工及储藏手段，如低温储藏、气调储藏和微波辐照等，都需要能源及物质材料的消耗，而且还有可能引起种子蛋白变性。所以，培育耐储藏水稻品种是提高稻谷耐储藏特性的一条有效、经济的途径。

脂肪氧化酶LOX分布在水稻米糠和种胚中，在成熟的种胚中存在3种LOX同工酶，其中LOX-3在胚成熟过程中大量表达，占未萌发水稻种子LOX总活性的80％～90％，该酶的缺失可以延缓稻谷的陈化变质。科学家采用脂肪氧化酶LOX-3缺失体爪哇型的泰国陆稻品种Dawn Dam与LOX-3活性正常的水稻品种越光杂交，发现lox3基因的缺失是受单隐性基因控制，lox3基因的缺失并不影响水稻的生长发育。色谱分析显示，经35℃处理后的lox3基因缺失突变体和普通品种，前者的己醛、戊醛和戊醇仅为后者的1/3～1/5，而这些挥发性物质被认为是米质劣变后的标志性产物，因此认为lox3基因的缺失可延缓氧化酸败，对维持稻米储藏的原有品质有重要作用。贮藏试验证明lox3基因的缺失可以有效地防止稻米陈化，提高耐贮性。因此，可以通过筛选LOX-3活性较低或失活的水稻品系，进而培育和生产具有耐储藏特性的稻谷。

水稻突变型(MT)lox3基因与野生型(WT)lox3基因相比，基因编码的mRNA再编码区第1497个核苷酸发生了G到A的置换突变，导致了翻译提前终止。lox3基因型检测方法目前有SSR连锁标记、RAPD标记、dCAPS标记及基因测序等，但是这些方法中存在检测精度相对不高，稳定性较低，操作繁琐耗时，费用较高等缺点。而植物分子育种工作中需要快速、准确、廉价地检测大量样品的多个基因，因此有必要开发水稻lox3基因更高效、经济的分子标记检测方法，以达到提升检测准确度和速度，并降低检测成本，使水稻分子育种中lox3基因检测项目具有可行性。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种用于鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型的引物组合物、试剂盒及方法。

lox3基因在mRNA编码区第1497个核苷酸发生了突变，导致相应氨基酸的改变，从而导致脂肪氧化酶LOX-3功能缺失。本发明针对G/A置换突变，设计出一种引物组合，其中外引物lox3-o-F、lox3-o-R分别位于突变位点的两侧，内引物lox3-i-F、lox3-i-R在突变位点上。利用该引物组合对水稻品种的基因组DNA进行PCR扩增，通过扩增产物带型即可区lox3基因是野生型(WT)、突变缺失型和杂合型。

本发明首先提供了一种用于鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型的引物组合物，包括一对外引物和一对内引物，

外引物包括：

lox3-o-F：5’-CGCTGGACAGCAACCGGCT-3’，

lox3-o-R：5’-CGCGATCACGAACGGCTCCA-3’；

内引物包括：

lox3-i-F：5’-ACCGGCGTCGAGGCCCGA-3’，

lox3-i-R：5’-TGGCGAGCTGCCACCCC-3’。

本发明又提供了一种用于鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型的试剂盒，包括所述的引物组合物。所述的试剂盒，还包括PCR扩增所用的DNA聚合酶、dNTP及缓冲液。

本发明又提供了所述引物组合物或所述试剂盒在鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型中的应用。

本发明又提供了所述引物组合物或所述试剂盒在筛选耐储藏水稻品种中的应用。

本发明还提供了一种用于鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测水稻样品的基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，利用所述的引物组合物进行PCR扩增；

(3)检测PCR扩增结果，若检测结果只在425bp和204bp处有特异性条带，则待检测水稻样品含有纯合突变型lox3基因；

若检测结果只在425bp和255bp处有特异性条带，则待检测水稻样品含有纯合野生型lox3基因；

若检测结果在422bp、255bp、204bp处均有特异性条带，则待检测水稻样品含有杂合型lox3基因。

PCR扩增的体系为：

PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。

由于本发明在设计时，产生的特异性片段的大小至少为204bp，且不同片段差异大于50bp，因此，可采用普通琼脂糖凝胶电泳分析即可分辨PCR产物，琼脂糖的浓度可以为2％。

本发明引物组合能够快速、有效、经济地鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型，使用一次普通PCR和琼脂糖凝胶电泳的方法对lox3进行基因分型，实现水稻耐储藏性状的分子标记辅助育种。由于本发明的基因标记位于lox3编码区内部，与其它标记方法相比检测更准确，4引物的设计通过一次普通PCR即可完成反应，且带型差异较大，可使用廉价的琼脂糖凝胶电泳分辨带型。

本发明引物组合能够有效鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型，使用一次普通PCR和琼脂糖凝胶电泳的方法对lox3进行基因分型，较其他检测方法相比，检测操作更简便、准确，成本更低。

附图说明

图1为水稻野生型(WT)lox3基因片段与突变型(MT)lox3基因片段的序列比对图，及分子标记引物设计示意图，其中等位基因变异位点以“矩形框”标识，引物错配碱基以“灰色背景”标识。

图2为利用本发明引物对鉴别16个水稻品种的电泳结果图(水稻品种编号见表1)。

图3为利用本发明引物组合鉴别野生型lox3与突变型lox3品种及其杂交后代F₁、F₂群体共24个单株的电泳结果图(1：突变型lox3；2：野生型lox3；3～5：杂交F₁单株；6～24：19株Daw Dam/TF538杂交F₂单株)。

图4为实施例3中使用引物组合A的鉴定结果图。

图5为实施例3中使用引物组合B的鉴定结果图。

具体实施方式

实施例1

通过对水稻野生型lox3基因(EU146294.1)和突变型lox3基因(AB571658.1)的编码区DNA序列比对发现，突变型lox3基因在编码区第1497核苷酸的位置存在一个“G→A”的SNP突变，导致翻译提前终止，脂肪氧化酶LOX-3不能正常合成，这降低了种子脂肪酸的氧化分解，提高了种子耐储藏性。

为验证水稻野生型lox3基因和突变型lox3基因的SNP突变，选取15个野生型lox3基因的水稻品种与突变型lox3基因的水稻品种Daw Dam(表1)，设计引物lox3ga-F1和lox3ga-R1(引物序列见表2)，通过PCR将lox3基因的SNP位点(AB571658.1：g.4144G＞A)进行扩增并测序。

表1 lox3基因型检测结果

注：(+)表示纯合lox3突变型基因；(-)表示纯合lox3野生型基因。

表2引物序列

引物名称	引物序列(5’-3’)
		lox3ga-F1	ATCGAGCTGAGCGAGCCTATGA
lox3ga-R1	TTCTTCCCACTGATGCCTTACAAAA
		lox3-o-F	CGCTGGACAGCAACCGGCT
lox3-o-R	CGCGATCACGAACGGCTCCA
		lox3-i-F	ACCGGCGTCGAGGCCCGA
lox3-i-R	TGGCGAGCTGCCACCCC

15个水稻品种为：IR64、嘉育938、中早39、玉针香、黄华占、中嘉早17、特青、9311、秀水134、淮稻5号、苏秀867、嘉花1号、浙粳88、嘉58、嘉禾218。

PCR扩增反应体系为：

反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。

通过PCR扩增获得552bp的片段，将扩增片段测序后进行序列比对，发现15个水稻品种中lox3基因在序列上完全一致，与Daw Dam水稻品种lox3基因仅存在上述“G→A”突变的差异。

如图1所示，本发明利用野生型lox3基因与突变型lox3基因在编码区第1497核苷酸的位置存在的“G→A”突变，设计开发了能够鉴别水稻耐储藏相关基因lox3基因型的引物组合，图1引物序列中带“灰色背景”的碱基为引入的错配碱基，加“矩形框”的碱基为要检测的SNP位点。该引物组合对水稻lox3基因进行扩增，能扩增出425bp的条带，此带可用于PCR扩增与否的监测，此外，野生型lox3基因能扩增出204bp的条带；突变型lox3基因能扩增出255bp的条带；杂合型能扩增出204bp和255bp的条带。

实施例2

选取15个野生型lox3基因的水稻品种，突变型lox3基因的水稻品种Daw Dam，及Daw Dam/TF538杂交的后代世代F₁、F₂群体，对本发明的引物组合Lox3-4P进行验证。15个野生型lox3基因的水稻品种为：IR64、嘉育938、中早39、玉针香、黄华占、中嘉早17、特青、9311、秀水134、淮稻5号、苏秀867、嘉花1号、浙粳88、嘉58、嘉禾218。后代世代F₁、F₂群体为：Daw Dam/TF538杂交的后代世代F1、F2群体，TF538为含有野生型lox3基因的育种中间材料。

利用CTAB法提取上述水稻品系叶片的基因组DNA作为PCR扩增模板，2×PCR反应预混液为Novoprotein公司。

PCR扩增反应体系为：

使用3％琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行检测，鉴定：

若检测结果只在425bp和204bp处有特异性条带，则待检测水稻样品含有纯合突变型lox3基因，标记为“+”；

若检测结果只在425bp和255bp处有特异性条带，则待检测水稻样品含有纯合野生型lox3基因，标记为“-”；

若检测结果在422bp、255bp、204bp处均有特异性条带，则待检测水稻样品含有野生突变杂合型lox3基因，标记为“±”。

电泳检测结果见图2和表1。从图2可以看出，利用设计的引物组合Lox3-4P分别对16个水稻品种的lox3基因进行检测，扩增结果表明，15个野生型水稻品种均扩增出425bp和255bp的片段，表现为纯合野生型lox3基因；Daw Dam品种扩增出425bp和204bp的片段，表现为纯合突变型lox3基因。

Lox3-4P基因标记对Daw Dam/TF538的后代F₁、F₂群体进行PCR检测，所有样品均能有效扩增。其中样品1为Daw Dam，lox3基因型“+”，2为TF538，lox3基因型“-”；样品3～5为杂交F₁，lox3基因型均为“±”；样品6～24为F₂，lox3基因型“+”单株有8株，基因型“-”单株有4株，基因型“±”单株有7株(图3)。

通过对16个水稻品种，野生型lox3与突变型lox3品种及其杂交后代F₁、F₂群体共24个单株的lox3基因型检测，表明本研究获得的引物组合Lox3-4P，可以快速、准确地鉴定水稻耐储藏基因的基因型，适用于lox3基因的分子标记辅助育种。

实施例3

利用其它引物组合检测水稻lox3基因型

lox3基因片段SNP位点附近富含GC碱基，引物组合设计需平衡考虑各引物Tm值、长度，及内引物错配碱基位置种类及其GC含量，期间还需不断调试引物组合与反应条件。下面是2个引物组合设计中的对比例。

引物组合A：

lox3-o-F1，CGACCAGGACGCTCTTCTTC；

lox3-o-R1，ATCACGAACGGCTCCATCAC；

lox3-i-F1，CGGCGTCGAGGCCCGA；

lox3-i-R1，GGCGAGCTGCCACGCC。

反应条件同实施例2，其中退火温度为53～70℃，图4中泳道1～6反应退火温度是53～70℃递增，泳道7～12，泳道13～18，泳道19～24同泳道1～6。泳道1～12反应体系未加10％DMSO，泳道13～24加10％DMSO。泳道1～6，泳道13～18为阳性对照，拟扩增“+”片段长度198bp；泳道7～12，泳道19～24为阴性对照，拟扩增“-”片段长度158bp；外引物扩增片段长度为325bp。

结果如图4，虽然10％DMSO提高了扩增的特异性，53～70℃退火温度范围也较大，外引物片段和阳性片段也得到扩增，但阴性片段未能有效扩增，且阳性片段扩增特异性差，该引物组合不适用于水稻lox3基因型的检测。

引物组合B：

lox3-o-F2，GCGCTGGACAGCAACCGGCT；

lox3-o-R2，CGCGATCACGAACGGCTCCA；

lox3-i-F2，ACCGGCGTCGAGGCCCGA；

lox3-i-R2，TGGCGAGCTGCCATCCC；

lox3-i-R3，TGGCGAGCTGCCATGCC；

lox3-i-R4，TGGCGAGCTGCCATTCC。

反应条件同实施例2，图5中泳道1～3引物组合为lox3-o-F2、lox3-o-R2、lox3-i-F2和lox3-i-R2，泳道4～6引物组合为lox3-o-F2、lox3-o-R2、lox3-i-F2和lox3-i-R3，泳道7～9引物组合为lox3-o-F2、lox3-o-R2、lox3-i-F2和lox3-i-R4。泳道1、4、7为阳性对照，拟扩增“+”片段长度204bp；泳道2、5、8为阴性对照，拟扩增“-”片段长度255bp；泳道3、6、9为杂合对照，拟扩增“±”片段长度255bp和204bp；外引物片段为425bp。

结果如图5，虽然外引物片段、阳性片段得到有效扩增，阳性片段扩增特异性较好，但阴性片段扩增特异性差，4种引物组合对lox3基因型阳性、阴性和杂合的对照检测中，2种引物组合的阴性片段无差别扩增，2种引物组合的阴性片段无差别不扩增，该4种引物组合均不适用于水稻lox3基因型的检测。

序列表

<110> 嘉兴市农业科学研究院

<120> 一种用于鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型的引物组合物、试剂盒及方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcgagctga gcgagcctat ga 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcttcccac tgatgcctta caaaa 25

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgctggacag caaccggct 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcgatcacg aacggctcca 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accggcgtcg aggcccga 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggcgagctg ccacccc 17

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgaccaggac gctcttcttc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atcacgaacg gctccatcac 20

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggcgtcgag gcccga 16

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggcgagctgc cacgcc 16

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcgctggaca gcaaccggct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgcgatcacg aacggctcca 20

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

accggcgtcg aggcccga 18

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tggcgagctg ccatccc 17

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tggcgagctg ccatgcc 17

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tggcgagctg ccattcc 17

Claims

1.一种用于鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型的引物组合物，其特征在于，包括一对外引物和一对内引物，

外引物包括：

lox3-o-F：5’-CGCTGGACAGCAACCGGCT-3’，

lox3-o-R：5’-CGCGATCACGAACGGCTCCA-3’；

内引物包括：

lox3-i-F：5’-ACCGGCGTCGAGGCCCGA-3’，

lox3-i-R：5’-TGGCGAGCTGCCACCCC-3’。

2.一种用于鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合物。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增所用的DNA聚合酶、dNTP及缓冲液。

4.权利要求1所述引物组合物或权利要求3所述试剂盒在鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型中的应用。

5.权利要求1所述引物组合物或权利要求3所述试剂盒在筛选耐储藏水稻品种中的应用。

6.一种用于鉴别水稻耐储藏基因lox3基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检测水稻样品的基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组合物进行PCR扩增；

若检测结果在425bp、255bp、204bp处均有特异性条带，则待检测水稻样品含有杂合型lox3基因。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR扩增的体系为：

补ddH₂O至20μL。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR扩增条件为：

94℃预变性5min；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。