CN108411028A - 水稻耐盐基因skc1基因内特异snp共显性分子标记引物及应用 - Google Patents
水稻耐盐基因skc1基因内特异snp共显性分子标记引物及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了水稻耐盐基因SKC1基因内特异共显性SNP分子标记引物及应用。申请人通过将不同等位基因测序及序列比对鉴定到一个SKC1基因内特异性SNP位点并开发了一套鉴定该SNP的分子标记引物，分别为1039IF:GCGGCGGCGAGGGCTGCG;1451R:AATGTCCCAGGCCAGAGTA。利用该引物对水稻DNA进行PCR扩增，可快速判断待测水稻SKC1的基因型。方法简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源SKC1基因型鉴定。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，具体涉及水稻耐盐基因SKC1基因内特异共显性SNP分子标记引物及应用，本发明提供的分子标记引物适于在水稻育种中对SKC1基因型的大量筛选以及从水稻种质资源中筛选新的SKC1基因型耐盐亲本。
技术背景
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，世界上有一半以上的人口以稻米为主食。水稻生长过程中可能会遇到多种逆境，影响到其产量以及品质，包括寒冷、高盐、干旱、病虫害等逆境都会对水稻生长造成严重的影响，因此研究提高抗逆性是水稻高产稳产的重要途径与手段。中国有着约2000万公顷的盐碱土地，这些盐碱化土地严重阻碍了我国的农业生产以及粮食供应。因此，水稻耐盐性的深入研究以及水稻耐盐品种的培育，对于扩大水稻种植区域、提高盐碱区域水稻种植产量和保证盐碱稻区粮食安全生产有着十分重要的意义。
SKC1是第一个被图位克隆的水稻耐盐基因(Ren ZH et al.A rice quantitativetrait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter.Nature Genetics,2005,37,1141-1146)，它的供体亲本来源于高度耐盐籼稻品种Nona Bokra，对在盐胁迫下，它通过维持水稻地上部K+，调节K+的动态平衡来提高水稻的耐盐性。SKC1对表型变异的贡献率达到40.1％，位于水稻1号染色体，是一个水稻耐盐的主效QTL。将SKC1导入到水稻优良骨干品种中，培育耐盐性好的新品种，具有较好的应用前景。
分子标记是一种快速、简便、成本低廉并可在水稻生长早期进行无损检测的一种技术，但目前还没有对SKC1基因内特异性共显性分子标记报导。本研究通过对耐盐性不同的品种的SKC1等位基因进行了PCR扩增、等位基因重测序，最终在SKC1基因ATG启动子后+994bp处获得一个特异性SNP位点，SKC1耐盐等位基因型为G碱基，其余基因型均为C碱基，针对该SNP位点设计引物，可以在水稻生长早期进行非破坏性检测，具有简单、准确、成本低等一系列优点，适于在育种中对群体大量筛选以及对于水稻种质资源中SKC1等位基因型鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供了水稻耐盐基因SKC1基因内特异性SNP分子标记引物，为：1039IF:GCGGCGGCGAGGGCTGCG；1451R:AATGTCCCAGGCCAGAGTA。引物特异性好，扩增效率高，可用于水稻耐盐基因SKC1的基因型鉴定。
本发明的另一个目的是提供了水稻耐盐基因SKC1特异性SNP分子标记引物的应用，利用该引物可以有效的对耐盐基因SKC1进行基因型选择，既可以用于水稻资源的筛选鉴定，又可以用于水稻耐盐基因SKC1的分子育种。
为了实现上述目的，本发明采取了以下技术措施：
本发明技术方案采取以下思路：SKC1位于水稻第1号染色体的短臂，cDNA全长2160bp，包含有3个外显子，编码一个由554氨基酸组成的蛋白产物，产物含有跨膜结构域。本研究通过对耐盐性不同的品种的SKC1等位基因进行了PCR扩增、等位基因重测序，最终在SKC1基因ATG启动子后+994bp处获得一个特异性SNP位点，SKC1耐盐等位基因型为G碱基，skc1感盐基因型为C碱基；因此，通过设计特异性引物对该SNP位点特异性扩增即可实现SKC1等位基因的鉴定。
针对上述位点，申请人设计的引物为：1039IF:GCGGCGGCGAGGGCTGCG；1451R:AATGTCCCAGGCCAGAGTA。
水稻耐盐基因SKC1基因内特异性SNP共显性分子标记引物的应用，包括利用本发明提供的引物用于水稻资源的筛选鉴定，或者用于水稻耐盐基因SKC1的分子育种，或是制备成耐盐基因SKC1的检测试剂盒；
以上所述的应用中，优选的，应用过程包括：
利用1039IF:GCGGCGGCGAGGGCTGCG；1451R:AATGTCCCAGGCCAGAGTA，对水稻DNA进行PCR扩增；纯合SCK1基因型扩增出430bp条带，其余等位基因类型扩增条带为320bp条带，杂合型的扩增条带为430bp和320bp条带。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.申请人设计引物对SKC1来源材料的SKC1编码区的等位基因进行了PCR扩增、等位基因重测序，最终在SKC1基因ATG启动子后+994bp处获得一个SKC1特异性SNP位点，SKC1等位基因型为G碱基，skc1基因型均为C碱基。
2.对单个SNP位点检测常用的方法有测序、荧光定量PCR方法，仪器设备较贵，检测成本较高，PCR-CTPP方法需要在SNP位点设计两对引物，本发明利用目标基因内SNP位点及下游特异序列开发出只需要一对引物即可进行SNP分型的特异性共显性分子标记，方法更简便，成本更低。
3.利用该引物进行SKC1分子标记辅助选择(MAS)回交改良，可以在水稻生长早期进行非破坏性检测，具有简单、准确、成本低等一系列优点，适于在育种中对群体大量筛选以及对于水稻种质资源中SKC1等位基因型鉴定。
附图说明
图1为利用PCR-CTPP方法对水稻SKC1基因内特异性SNP位点扩增示意图。
图2为PCR-CTPP的两对引物分开对不同SKC1基因型DNA模板PCR扩增的电泳图
M：DL2000DNA marker；泳道1、5、9的模板为明恢63；泳道2、6、10的模板为广陆矮4号；泳道3、7、11的模板为成农水晶；泳道4、8、12的模板为9311；泳道1～4引物组合为：811F+1039IR；泳道5～8的引物组合为811F+1451R；泳道9～12的引物组合为：1039IF+1451R。
图3为SKC1特异性分子标记对目标SNP位点分离的核心种质检测
M：DL2000DNA marker；泳道1和2是作为对照组的明恢63和广陆矮4号；泳道3～24的部分材料是：朝阳一号B、L301B、青四矮16B、献改B、江农早1号、京虎B、黎明B、包协-7B、珍汕97B、88B、包二幅、中楼一号1、兴国、雷火占、台中65号、台中在来1号、麻麻谷、梅花糯、水原300粒、叶里藏花、卫国、六十早。
具体实施方式
本实施例中未特别说明的实验方法即为分子生物学常规方法。本研究所用Taq酶及dNTP产自北京全式金生物技术有限公司，其余均为常规生化试剂。
实施例1：
SKC1基因内特异SNP共显性分子标记的获得：
申请人通过对耐盐性不同的品种(例如明恢63、日本晴及广陆矮4号等)的SKC1等位基因进行了PCR扩增、等位基因重测序在SKC1基因ATG启动子后+994bp处获得一个特异性SNP位点，SKC1耐盐等位基因型为G碱基，skc1感盐基因型为C碱基；针对该SNP设计引物，为利用1039IF:GCGGCGGCGAGGGCTGCG；1451R:AATGTCCCAGGCCAGAGTA。
引物设计过程如下(图1，表1)：
在设计C型等位基因鉴定引物时，最开始是根据PCR-CTPP(polymerase chainreaction with confronting two-pair primers)方法原理，首先在该SNP位点上游设计了正向引物811F，以该SNP位点C的互补碱基G作为3’端在该位点设计反向引物1039IR(表1)，理论上1039IR的3’端的G碱基与C型等位基因材料正常结合扩增而与G型材料形成G/G错配无法扩增，但实验结果表明该错配并不能完全区分两种基因型，在G型材料中也有较微弱的扩增，因此为增强该引物特异性在1039IR的倒数第三位引入了一个错配碱基C/C增强其特异性，结果表明该引物只有与C型等位基因材料扩增时有一条234bp条带，与G型材料没有条带扩增；在设计G型等位基因鉴定引物时，该SNP位点的G碱基作为3’端在该位点设计正向引物1039IF(表1)，以该SNP位点下游设计反向引物1451R，同理为增强该引物特异性在PR的倒数第三位引入了一个错配碱基G/T增强其特异性，发现1039IF/1451R引物对，在G等位基因材料扩增时有430bp的目的带型，在C型等位基因材料扩增时出现了稳定的320bp的条带(图2)；对这430bp和320bp的条带进行分离测序后发现，在目标SNP G/C的下游110bp有一段序列与引物1039IF有一定错配的序列(3’端连续7个碱基可以匹配)，基因型为C的时候目标位点不能扩增能够结合该区域扩增出320bp条带，基因型为G的时候目标序列能够匹配能够结合扩增出320bp条带；SKC1基因型为G/C杂合时有430bp和320bp两个条带。因此1039IF/1451R引物对可以作为一个特异的SNP共显性分子标记来对SKC1进行基因型鉴定。
表1引物序列
实施例2：
水稻耐盐基因SKC1基因内特异性SNP共显性分子标记引物的应用，应用方法包括：
1)按照本领域的常规方式提取待测水稻基因的DNA；
2)PCR：
PCR反应体系为15μL，含1.5μL 10×Buffer，1.0μL dNTPs(10mmol/L)，引物1039IF和1451R为0.2μL；Taq酶0.2μL(5U/μL)，2.0μL模板DNA(50ng/μL)，其余用ddH2O补齐；
1039IF:GCGGCGGCGAGGGCTGCG；1451R:AATGTCCCAGGCCAGAGTA；
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸5min，扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。
3)判定：
纯合SCK1基因型扩增出430bp条带，为纯合耐盐基因植株，其余等位基因类型扩增条带为320bp条带，杂合型的扩增条带为430bp和320bp条带。
实施例3：
水稻耐盐基因SKC1特异性分子标记引物的应用，包括以下步骤：
1)生物材料
亲本对照为明恢63(SKC1，GG基因型)、广陆矮4号(skc1，CC基因型))，检测材料为160份中国栽培稻微核心种质。中国栽培稻微核心种质是在6万多份中国稻种资源中筛选出来的最具代表性的品种0.3％的品种保存了全部品种超过70％的标记多态性和表型多态性。CTAB方法提取上述材料的DNA。
2)按照实施例2的方法对DNA进行PCR扩增，并进行结果分析
160个品种中，出现与耐盐对照SKC1一样的条带有73个(GG基因型)，占总数的45.6％(部分结果见图3)，说明SKC1基因在国内水稻种质中分布频率较高，但是不注重选择也容易丢失。在三叶期以含有0.5％浓度NaCl的营养液进行耐盐处理15天，考察耐盐指数，考察方法参考国际水稻研究所(IRRI)提出的鉴定标准，评分标准如下：
盐害症状目测法分级标准与平均死叶百分比分级标准
死叶率(％)＝(供试值株总死叶率/供试值株总叶片数)×100％
结果表明，73个GG型品种的平均耐盐指数是5.2，87个CC型品种的平均耐盐指数6.8(耐盐性1级最高，9级最低)，两种基因型表型的差异达到显著水平(p<0.01)，这个位点可以解释耐盐性34.8％的变异。说明水稻耐盐性是一个复杂的多基因控制的性状，SKC1是其中的一个主效基因。SKC1特异分子标记的开发将为我国水稻品种的耐盐抗性改良提供便利，本发明提供的引物，可用于有效的对耐盐基因SKC1进行基因型选择，既可以用于水稻耐盐种质资源的鉴定筛选，又可以用于水稻耐盐基因SKC1的分子育种。
实施例4：
水稻耐盐基因SKC1特异性分子标记引物的应用，包括以下步骤：
本实施例是利用F2群体对水稻耐盐基因SKC1特异性分子标记引物的效果验证
1)生物材料
P1、P2为目标SNP位点分别为C和G碱基的亲本明恢63(SKC1)、广陆矮4号(skc1)，明恢63(SKC1)、广陆矮4号(skc1)杂交构建的F2群体。
2)PCR
PCR体系同实施例2。
3)结果分析
P1、P2分别为亲本明恢63(SKC1，SNP位点为GG)、广陆矮4号(skc1，SNP位点为CC)，利用亲本明恢63(SKC1)、广陆矮4号(skc1)杂交构建了F2群体，通过对180个F2单株基因型检测表明，3种不同基因型的分离比为42CC：88CG：50GG，经卡方检验符合1:2:1的孟德尔单基因分离比(χ2＝0.80<χ2 0.05＝5.99)，因此该标记为共显性标记，可以将两种不同的纯合子以及杂合子区分开，检测位点同时表现为单基因分离。
序列表
<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所
<120> 水稻耐盐基因SKC1基因内特异SNP共显性分子标记引物及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggcggcga gggctgcg 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatgtcccag gccagagta 19
Claims (4)
1.水稻耐盐基因SKC1基因内特异共显性SNP分子标记引物，为:1039IF:GCGGCGGCGAGGGCTGCG和1451R: AATGTCCCAGGCCAGAGTA。
2.一种对水稻耐盐基因SKC1的鉴定方法，包括：利用1039IF: GCGGCGGCGAGGGCTGCG;1451R: AATGTCCCAGGCCAGAGTA，对水稻DNA进行PCR扩增；纯合SCK1基因型扩增出430bp条带，其余等位基因类型扩增条带为320bp条带，杂合型的扩增条带为430bp和320bp条带。
3.权利要求1所述的引物在水稻耐盐基因分子育种中的应用。
4.权利要求1所述的引物在水稻资源的筛选鉴定中的应用。
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