CN112048568B - 玉米苗期耐渍主效QTL qWT7.02的获得及其分子标记引物的开发及应用 - Google Patents

玉米苗期耐渍主效QTL qWT7.02的获得及其分子标记引物的开发及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了玉米苗期耐渍主效QTL qWT7.02的获得及其分子标记引物的开发及应用。本发明提供了控制玉米苗期渍水存活率的主效QTL qWT7.02，其包含两个主效位点，分别将其命名为qWT7.02a和qWT7.02b，其中与qWT7.02a紧密连锁的分子标记引物为:Indel‑29F：TCTTAACACCCAGCATCACG和Indel‑29R:CGCACTTGGTTCTCGTTCTT；与qWT7.02b紧密连锁的分子标记引物为：Indel‑46F：AGAAGCCATCAGGACTGCATAIndel‑46R：TCTGCCTCTTCCTCCATTGT。两个位点均为控制耐渍表型变异的主效QTL位点，解释的表型贡献率分别为23%和25.8%，与之紧密连锁的分子标记Indel‑29,Indel‑46可用于玉米苗期耐渍性状分子标记辅助选择育种。

Description

玉米苗期耐渍主效QTL qWT7.02的获得及其分子标记引物的 开发及应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及玉米苗期耐渍主效QTL qWT7.02的获得及其分子标记引物的开发及应用。
背景技术
玉米是一种对涝渍胁迫敏感的旱地作物，中国南方玉米带在正常的栽培季节中，苗期易遭低温春雨，花期常遇持久梅雨，在排灌系统不良及地下水位高的土壤环境中，玉米根系长期处于低氧状态，渍害已严重制约了南方玉米稳产、高产和种植面积的扩大；在中国玉米主产区山东及河北两地，2012-2018年渍害胁迫导致大面积的玉米减产35％左右。由于涝渍条件下根系中氧气的可用性对植物的生存至关重要，因此植物进化出了一系列适应特性，确保气体交换，同时避免氧气损失(Colmer and Voesenek 2009)。玉米中已知的耐渍QTL主要与适应性、形态和生物量相关性状相关，包括14个与根通气组织的形成相关的QTL，分布在除第4和第6之外的其他染色体上，利用玉米深根自交系B73和浅根系大刍草，将控制第二结根的QTL定位在第4、第7和第10染色体上，控制第三结根夹角的QTL定位在第2、第4和第7 染色体上(Mano and Omori 2008；Mano et al.,2007,2008,2012)，2个与不定根形成相关的QTL定位在第4和第8染色体上(Mano et al et al.,2005)，1个与径向氧损失屏障的形成相关的QTL定位在第3染色体上(Watanabe et al.,2017)。玉米对涝渍的不同耐受性直接影响根、茎的生长和叶片的衰老。渍水胁迫下，已鉴定18个QTL影响根长、24个QTL和苗高相关(Os man et al.,2013；Qiu et al.,2007)，2个QTL和涝渍叶损伤(LI)相关(Mano etal.,2006； Mano and Omori 2013)，这些变化最终会影响与生物量相关的性状。许多与生物量性状相关的QTL也在玉米渍水胁迫中得到了鉴定和定位，包括6个根鲜重相关QTL、14个根干重相关QTL、3个地上部分鲜重相关QTL、15个地上部分干重相关QTL和11个总干重相关QTL (Mano et al.,2006；Omori and Mano 2007；Osman et al.,2013；Qiu et al.,2007)。此外，在大田淹水环境下，超过14个与产量性状相关的QTL被鉴定，涉及根系倒伏、气生根生成和茎倒伏(Zaidi et al.,2015)。近年来，余等利用全基因组关联分析，结合368个玉米自交系正常生长和淹水胁迫下的表型相对值，在玉米基因组上鉴定16个位点和耐渍性相关联(Yu et a l.,2018)，通过正向遗传方法克隆了叶损伤表型相关的候选基因GRMZM2G110141，其优良的单倍型可直接应用于育种实践(Yu et al.,2018)，同时基于反向遗传学鉴定到了玉米第一个影响渍水存活率变异的乙烯响应因子ZmEREB180(Yu et al.,2019)。
随着全球气候的变化，渍害在世界范围内呈现蔓延的趋势，而且逐渐成为影响作物生产最重要的逆境胁迫因子。尽管在玉米基因组中发现了100多个耐涝相关的QTL，然而，由于涝渍胁迫性状的复杂程度高、玉米种质资源狭窄且基因组比较复杂，鉴定耐涝性的遗传构成具有挑战性，迄今为止还没有通过图位克隆技术克隆到基因，我们对玉米耐渍性形成的遗传基础以及玉米渍水抗性改良过程中所选择的位点信息知之甚少。发掘和有效利用耐渍基因、探讨玉米耐渍性分子机理、创制耐渍性玉米新种质、培育耐渍性新品种是减少玉米损失，提高单位面积产量，扩大玉米种植面积的最为经济有效的途径(Zaidi et al.,2004，2010)。存活率是玉米涝渍胁迫忍受性的最直观表现，但是这种适应渍水胁迫的位点信息及调控机制，在玉米中还不是很清楚，基于此，本研究以玉米耐渍种质竹山白马牙及渍水敏感型自交系B73 为研究对象，构建回交导入系群体，基于正向遗传学定位并验证控制玉米苗期渍水存活率主效QTL qWT7.02，进一步地通过候选区段关联分析，鉴定优良等位变异，开发特异性功能标记并用于创制育种中间材料，为开展玉米耐渍分子育种提供优良等位基因资源。
发明内容
本发明的目的在于提供了一个控制玉米苗期渍水存活率的主效QTL qWT7.02，其包含两个主效位点，分别将其命名为qWT7.02a和qWT7.02b，其中与qWT7.02a紧密连锁的分子标记引物为:Indel-29F：TCTTAACACCCAGCATCACG和Indel-29R:CGCACTTGGTTCTCGT TCTT；与qWT7.02b紧密连锁的分子标记引物为：Indel-46F：AGAAGCCATCAGGACTGCA TAIndel-46R：TCTGCCTCTTCCTCCATTGT。
本发明的另一个目的在于提供了与qWT7.02a紧密连锁的分子标记引物在玉米耐渍形状育种中的应用。
本发明还有一个目的在于提供了与qWT7.02a紧密连锁的分子标记引物和与qWT7.02b紧密连锁的分子标记引物联合使用，在玉米耐渍形状育种中的应用。
为了达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
控制玉米苗期渍水存活率的主效QTL qWT7.02中的两个主效位点qWT7.02a和qWT7.02b的获得：
1)本发明首先通过BSA测序初定位及BC2F1回交导入系重定位验证，在玉米第七染色体7.0 2bin的位置检测到控苗期渍水存活率的QTL qWT7.02，它包含两个主效位点，分别将其命名为qWT7.02a和qWT7.02b，总长度分别为3.16Mb(chr7：15840000-1900000)和1Mb(chr7： 81940000-82980000)。
2)通过连续几代回交，构建了BC4F1导入系群体，开发了目标区段内的12个分子标记，对其进行重定位验证。
3)申请人通过BSA测序和较大群体重定位验证的方法，确定了qWT7.02a和qWT7.02b的区间，开发了与之紧密连锁的分子标记。其中与qWT7.02a紧密连锁的分子标记引物为:
Indel-29F：TCTTAACACCCAGCATCACG
Indel-29R:CGCACTTGGTTCTCGTTCTT
qWT7.02b紧密连锁的分子标记引物为：
Indel-46F：AGAAGCCATCAGGACTGCATA
Indel-46R：TCTGCCTCTTCCTCCATTGT。
4)申请人通过207份玉米自交系的苗期渍水存活率表型，基于候选区段关联分析方法，鉴定到了qWT7.02a调控渍水存活率的优良单倍型，该优良单倍型在自然群体中可提高7.43％渍水存活率，在育种实践中也受到了强烈的选择。该优良单倍型为玉米耐渍品系创制提供了基因资源。
本发明的保护内容还包括：与qWT7.02a紧密连锁的分子标记引物在玉米耐渍形状育种中的应用；
与qWT7.02a紧密连锁的分子标记引物和与qWT7.02b紧密连锁的分子标记引物在玉米耐渍形状育种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明对一个新的控制玉米苗期渍水存活率主效QTL进行了精细定位，将该主效QTL 定位于7号染色体长臂，包含两个主效的QTL位点，总长度分别为3.16Mb(chr7：15840000- 1900000)和1Mb(chr7：81940000-82980000)，两个位点均为控制耐渍表型变异的主效QT L位点，解释的表型贡献率分别为23％和25.8％，与之紧密连锁的分子标记Indel-29,Indel-46 可用于分子标记辅助选择育种。
附图说明
图1为B73和BMY幼苗对渍水胁迫响应的生长特征示意图；
其中：A为苗高、B为地上部分鲜重、C为地上部分干重、D为根长、E为根鲜重、F 为根干重及G为第一片叶叶绿素含量，渍水三周后两亲本材料比较分析；H不同淹水时期，两材料苗高差值，散点代表数据分布，柱状图代表平均值，误差线代表SD；T-test用于成对比较的显著性检验。
图2为B73和BMY在对照和渍水处理下的根系和生理特性分析示意图；
在渍水处理6天后，分别取对照和处理条件下的幼苗根系，统计不定根数目和抗氧化物 MDA的含量：A为渍水胁迫6天不定根生成对比图；B为不定根数目；C为MDA含量差异比较分析；每一个柱子均代表均值±标准差；P值表示成对比较方差分析的显著性，圆点代表各个重复值，红色箭头指示BMY淹水胁迫下的不定根生成情况。
图3为淹水28d时家系间存活率分布及比较分析示意图；
其中：A为B73(左)和BMY(右)田间渍水生长状态；B B73，BMY渍水28天存活率比较分析，散点代表数据分布，柱状图代表平均值，误差线代表SD；T-test用于成对比较的显著性检验；C为BC2F1家系渍水28d存活率分布，柱状图代表家系数目；D为渍水敏感性家系和渍水抗性家系间存活率比较分析，散点代表每个家系存活率平均值，误差线代表SD；T-test用于成对比较的显著性检验。
图4为qWT7.02a和qWT7.02b遗传效应评价示意图；
散点代表家系存活率分布，柱状图代表平均值，误差线代表SD。多重比较用于各组合间差异分析，差异水平在0.05水平上视为显著。
图5为qWT7.02a位点关联分析、优良单倍型效应及频率分布分析示意图；
其中：A为qWT7.02a位点1168个最小等位基因频率大于0.05的多态性变异位点与渍水存活率表型在207份不同自交系中的关联分析，每一圆点代表一个多态性位点；B为51个Hap1自交系和131个Hap2自交系渍水存活率比较分析，每个方框代表中位数和四分位范围并扩展至最大值和最小值，红色圆点表示每一个自交系的渍水存活率表型，差异的显著性由单因素方差分析估计；C为Hap1和Hap2两种单倍型在不同自交系中的分布，红色和白色的数字分别代表Hap1和Hap2单倍型的数目。
图6为qWT7.02a/qWT7.02b功能标记开发利用
其中：A左：qWT7.02a/qWT7.02b类型家系渍水抗性强，右：qwt7.02a/qwt7.02b类型家系渍水抗性差；B根据功能标记检测，渍水抗性强的家系至少包含一个QTL位点，即qWT7.02a或qWT7.02b位点。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均已公开。
实施例1：
玉米苗期耐渍主效QTL qWT7.02的获得：
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1亲本材料
耐渍玉米地方种质“白马牙”(“第三次全国农作物种质资源调查与收集行动”普查编号： P420323011；收集地：竹山县深河乡麻线村5组)，该材料具有较强的渍水耐受性，经连续自交纯合，命名为BMY。
敏感型自交系材料B73。
1.1.2 QTL定位材料
利用耐渍材料BMY作为供体亲本，渍水敏感型自交系B73作为受体亲本，构建回交导入系群体。
1.1.3关联分析及优异单倍型频率分布分析材料
本发明的实验材料包括全球收集的470份玉米自交系材料，自交系根据适应性划分，包括热带亚热带材料243份，温带材料236份，分别来自于中国，美国，墨西哥及拉美国家。
1.2实验方法
1.2.1耐渍主效QTL初定位
QTL定位群体从BC1代开始，单株取样提取DNA，利用BC2F1家系的存活率数据，评价BC1的耐渍性差异。587个B73 x BMY:BC2F1家系，按穗行种植于湖北省农科院南湖实验基地，每个家系种植12株，7叶期开始淹水处理，一周后根据叶黄和苗高，生长势判断耐渍性(R代表耐渍，S代表敏感)，连续观察4周，并统计每行存活率。删除低洼带数据，共计5 26个穗行，用于存活率频率分布比较分析，基于BSA测序(极端表型集团分离分析，渍水耐性和敏感性两个池各50个单株)，BSA混池后提取各样本的基因组DNA，质检合格后依据 Illumina文库构建Protocol进行Paired-end(PE)文库构建，每个样本DNA建一个PE文库，即将基因DNA随机打断至300-500bp的片段，连接测序接头。在测序芯片上制备DNA簇 (DNA cluster)，最后在Illumina HiSeq测序仪上进行PE150测序。对于下机的原始数据，进行数据质控，得到高质量的clean data，然后将clean data比对到参考基因组上，进行变异检测，使用的参考基因组为AGPv4，下载自http://plants.ensembl.org/Zea_mays/Info/Index，使用BWA软件将PE reads与参考基因组序列进行比对，得到AM格式的比对结果，使用软件samtools将SAM格式的文件转换成BAM格式，接着使用Picard工具中的SortSam对 BAM文件中的reads进行排序，去除PCR重复，得到最终可以用于variant calling的BAM 文件。最后，使用GATK的Haplotype Caller模块进行变异检测，包括SNP和InDel。候选区间是基于SNP-index值确定的，SNP-index值等于亲本型等位基因的测序深度除以总深度。为了排除不可靠标记的影响，两个池测序深度均大于48x；两个池的SNP-index值不能同时大于0.8或者同时小于0.2。根据筛选后的SNP-index值，以滑动窗口计算(SNP-index)的平均值(2Mb窗口大小，20Kb步长)，进行耐渍基因的初定位获得初定位区间，并在目标区段内进行分子标记的开发。BC1F1连续与B73回交4代，并自交4代，获得不少于300个家系的回交导入系群体，结合BSA测序数据，在目标区段内进行多态性标记开发，开发分子标记用于目标QTL标记加密，结合染色体置换作图进一步缩小QTL定位区间，开发可用于耐渍优良等位基因鉴定的功能标记。
1.2.2目标区段分子标记开发
根据B73基因组，结合BSA测序提供的差异位点信息，设计特异引物，扩增B7 3和BMY基因组DNA，寻找二者差异在4个碱基以上的插入缺失多态性位点(InDe l)，并对其设计特异引物扩增，作为检测此位点的分子标记。对于仅存在SNP的片段，直接通过重组单株目标区段的PCR测序，通过序列分析来确定基因型。共计开发了1 2个新的标记，包含9个InDel标记和3个SSR标记。
1.2.3、基因型分析
采用CTAB(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法进行玉米小量DNA抽提(Saghai-Maroof et al 1984)。
基因型鉴定应用的是PCR，其反应体系为：浓度约为20ng的模板DNA 2μl，正义和反义引物各1μl，2×PCR Mix 7.5μl，3.5μl的ddH2O。PCR反应程序：第一步：95℃5min，第二步：95℃40s，第三步：58℃40s，第四步：2-4循环32次，第五步：72℃5min。
单株基因型检测采用毛细管电泳。
1.2.4候选基因关联分析
候选区段关联分析采用TASSEL3.0(Bradbury et al.,2007)抽提SNP和InDel，选取等位基因频率大于0.05的位点用作后续的关联分析。最佳线性无偏估计预测，计算多态性位点间的L D值(Shin et al.,2006)。结合自交系的群体结构(Q)和系谱关系(K)，采用TASSEL3.0中的 MLM Q+K模型(Bradbury et al.,2007,Yu et al.,2006)，使用207个自交系的qWT7.02区间基因型，结合2次试验的自交系淹水存活率的平均值值，开展候选基因关联分析。
1.2.5指标测定
淹水处理6天后，分别取对照和处理样本的根系，准确称量后在液氮中研磨成粉末，按重量(g)：体积(ml)＝1:4的比例，加入4倍体积的生理淹水，制成20％的匀浆液，匀浆离心10分钟(2500×g，4℃)，取上清液待测。MDA的活性测定根据相应的试剂盒说明进行(南京建成生物工程研究所，南京，中国)，每项分析进行3次生物学重复。利用CBB(Coomass ieBrilliant Blue)法(Bradford 1976)测定蛋白浓度，最终的测量值用蛋白浓度标准化处理。MDA含量测定是通过硫代巴比妥酸(TBA，Thibabituric Acid)法进行，MDA与TBA 反应形成红色产物，在532nm处比色测定。
2、结果与分析
2.1淹水胁迫下两亲本材料表型差异分析
淹水处理后三周，BMY在苗高、根长、地上部分鲜重/干重、根干重/鲜重及叶绿素含量上显著高于B73(图1中A-G)，且随着淹水处理的时间延长，二者的生长极差越来越大 (图1中H)，BMY渍水抗性显著高于B73，说明二者是耐渍遗传学研究的理想材料。
2.2BMY在根系形态和生理特性上适应淹水胁迫
本申请的结果证实，耐渍性较强的材料在淹水后能快速生成不定根(图2中A)。在正常生长的条件下，BMY不定根数比B73平均多2.9个(p＝5.89E-09)，渍水胁迫6 天，BMY和B73不定根数目均有所增加，但BMY增幅较大，BMY不定根数比B73 平均多5.8个(p＝2.11E-17)(图2中B)。在正常生长的条件，B73和BMY根系中M DA含量无显著差异(p＝0.71)，淹水胁迫6天后，B73根系中MDA含量迅速积累，二者的差异达到了显著水平(图2中C)，这些结果表明BMY在渍水条件下能维持完整的不定根系统和活性氧清除的能力，增加了渍水抗性。
2.3淹水胁迫下两亲本材料及BC2F1家系渍水存活率比较
田间淹水处理30天后，结合生长势和渍水存活率进行表型鉴定，结果表明：BMY的存活率为86％，B73的存活率仅为8.25％(图3中A,B)，说明BMY相对于B73渍水耐受性较强(p＝2.45E-08)。BC2F1的平均存活率为37.6％，标准误差为1.28％，穗行间最高存活率为100％，最低为0。在526份BC2F1家系中，284个家系存活率小于39％，242个家系存活率大于39％，(图3中C)。根据田间生长势和叶黄程度，共计判定270个家系为渍水抗性，256个家系为渍水敏感性，卡方检验符合1:1的分离比(p＝0.545)，说明该耐渍性有主效QTL控制，渍水抗性家系的平均存活率为59.8％，渍水敏感家系的平均存活率14.2％ (p＝7.3E-114)(图3中C、D)。综上，排除小区间的地势不平衡造成的影响，存活率和生长势结合起来可有效评价家系间的耐渍性，为耐渍性QTL定位奠定了基础。
2.4耐渍主效QTL初定位及遗传效应评价
结合BSA测序数据，取SNP所有位点拟合值的99.5％作为分析的关联阈值(LOD＝0.218)。根据关联阈值判定，将耐渍主效QTL锚定在玉米第七染色体7.02bin，总长度分别为3.16Mb(chr7：15840000-1900000)和1Mb(chr7：81940000-82980000)的区间。两个 QTL位点相隔62.9Mb，分别命名qWT7.02a和qWT7.02b，且第二个区间仅包含两个候选基因。结合BSA测序提供的差异位点信息，共计开发了12个新的标记，包含9个InDel标记和3个SSR标记，分别为Indel-1、indel-4、indel-5、indel-27、indel-29、indel-32、indel-4 6、indel-54和indel-72；三个SSR标记，分别为umc1036、umc1983、umc1978。分别利用上述标记鉴定400份BC2F1群体基因型，结合存活率表型进行重定位验证，结果发现，i ndel-27、indel-29、indel-32与qWT7.02a紧密连锁，ndel-46、indel-54和indel-72与qWT 7.02b紧密连锁，两个位点均为控制耐渍表型变异的主效QTL位点，解释的表型贡献率分别为23％和25.8％(表1)。BC2F1家系中，根据两个耐渍QTL位点存在情况，可以分为四种类型，qwt7.02a/qwt7.02b、qWT7.02a/qwt7.02b、qwt7.02a/qWT7.02b和qWT7.02a/qWT7.02b。其中qwt7.02a/qwt7.02b家系平均存活率为(20.1±17.8)％，均低于其他三种类型，包含两个 QTL位点qWT7.02a/qWT7.02b的家系平均存活率为(54.9±22.8)％，显著高于其他三种类型，qWT7.02a/qwt7.02b、qwt7.02a/qWT7.02b渍水存活率分别为(37.8±18.2)％和(42.9 ±20.1)％，二者之间没有显著性差异(图4)，表明qWT7.02a和qWT7.02b均能单独调控玉米苗期渍水存活率，且二者的效应是可以累加的。结合两位点开发的功能标记可用于BC4F 1家系的分子标记辅助选择，为创制耐渍性玉米新种质、培育耐渍性新品种提供了中间材料(图5)。
其中与qWT7.02a紧密连锁的分子标记如下，在BMY中的扩增为单条带，大小为248bp，在B 73中的扩增为单条带，大小为198bp；
Indel-29F：TCTTAACACCCAGCATCACG
Indel-29R:CGCACTTGGTTCTCGTTCTT；
qWT7.02b紧密连锁的分子标记引物如下，在BMY中的扩增为单条带，大小为110bp，在B73 中的扩增为单条带，大小为136bp；
Indel-46F：AGAAGCCATCAGGACTGCATA
Indel-46R：TCTGCCTCTTCCTCCATTGT。
表1主效QTL重定位验证
BB代表B73基因型，BM代表杂合基因型，T-test双因素等方差分析用于显著性检验。
2.5 qWT7.02a候选区域关联分析及优异单倍型频率分布分析
在207个不同自交系材料中，利用严建兵教授课题组公开发表的527分玉米自交系1.25M 重测序数据，采用TASSEL3.0(Bradbury et al.,2007)抽提SNP和InDel，选取等位基因频率大于0.05的位点用作后续的关联分析。结合自交系的群体结构(Q)和系谱关系(K)，采用TA SSEL3.0中的MLM Q+K模型(Bradbury et al.,2007,Yu et al.,2006)，使用207个自交系的q WT7.02区段内的基因型，结合3次试验的自交系渍水存活率表型BLUP值，开展候选区段关联分析。结果表明，在207份自交系材料中共发现1618个MAF≥0.05的多态性位点，其中有 12个SNP位点与存活率的自然变异显著关联，其中qWT7.02重要候选基因zm5UN调控区域的变异SNP 17291300(T/G)在P＝7.38E-05上显著关联，且所有的显著型位点都落在qWT7.02a 重要候选基因上(图5中A，表2)。
在207个自交系材料中，按照SNP 17291300(T/G)划分成两种单倍型，分别命名为Hap1和 Hap2，分成两组成对比较渍水两周后存活率在两种单倍型之间的差异。其中有51个自交系材料为SNP 17291300(G/G)或Hap1等位基因型，131个材料为SNP 17291300(T/T)或Hap2等位基因型，25个自交系材料在该位点表现为基因型数据缺失，相对于Hap1单倍型，Hap2单倍型自交系材料的渍水存活率平均增加7.43％(p＝0.0009，图5中B)，因此Hap2为qWT7.02a优良单倍型。进一步分析527份玉米自交系材料中，Hap1/Hap2两种单倍型的分布规律，结果发现来源于墨西哥玉米小麦改良中心的213份材料中，118份材料含有Hap2，频率为55.3％，和热带材料中所占的比例54.7％基本一致，而来源于中国的208份玉米自交系材料中，193个系包含Hap2单倍型，占比92.75％(图5中C)，表明CIMMYT(世界小麦玉米改良中心)材料，保留玉米多样性，遗传变异丰富，包含各种等位基因型。中国玉米依靠美国自交系的遗传改良，在育种过程中，间接的选择了qWT7.02a优良单倍型Hap2，从另一方面也反映了qWT7.02a在育种过程中的价值。
表2 qWT7.02a区间多态性位点与渍水存活率在207个不同自交系中的关联分析
aqWT7.02a区间多态性位点物理位置(V2)。b多态性位点引起的氨基酸变异。c自然群体中检测到的等位变异。
实施例2：
玉米苗期耐渍主效QTL qWT7.02分子标记引物的应用：
在BMY作为供体亲本，渍水敏感型自交系B73作为受体亲本，434份BC4F1家系中，开花期渍水一周，随机选取存活率为零的20份家系，及存活率不低于50％的20份家系，每个家系8株混样，提取DNA，分别利用qWT7.02a/qWT7.02b两位点紧密连锁的分子标记 Indel-29和Indel-46进行基因型鉴定，结果表明存活率为零的20份家系中，在两位点均和渍水敏感型亲本B73基因型一致，而存活率大于50％的家系，在两位点至少存在一个位点为杂合状态，即存活率较大的家系中至少包含qWT7.02a或qWT7.02b其中一个，或者两个位点都包含(表3)，这些结果证实两位点开发的功能标记可用于BC4F1家系的分子标记辅助选择，为创制耐渍性玉米新种质、培育耐渍性新品种提供了中间材料(图6)。在本发明中，轮回亲本B73为渍水敏感型材料，渍水存活率为零，根据回交群体遗传特点，存活率大≥50％即认为绝对存在耐渍抗性位点。
表3标记Indel-29和Indel-46可用于耐渍性鉴定评价
/>
表中1代表敏感型亲本B73基因型，3代表杂合基因型。
序列表
<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所
<120> 玉米苗期耐渍主效QTL qWT7.02的获得及其分子标记引物的开发及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcttaacacc cagcatcacg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcacttggt tctcgttctt 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agaagccatc aggactgcat a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctgcctctt cctccattgt 20

Claims (4)

1.一种与玉米苗期耐渍性状紧密连锁的分子标记的引物:Indel-29F：TCTTAACACCCAGCATCACG和Indel-29R: CGCACTTGGTTCTCGTTCTT。
2.一种与玉米苗期耐渍性状紧密连锁的分子标记的引物组合，包括：Indel-29F：TCTTAACACCCAGCATCACG、Indel-29R: CGCACTTGGTTCTCGTTCTT和Indel-46F：AGAAGCCATCAGGACTGCATA、Indel-46R：TCTGCCTCTTCCTCCATTGT。
3.权利要求1所述的引物在玉米苗期耐渍性状育种中的应用。
4.权利要求2所述的引物组合在玉米苗期耐渍性状育种中的应用。
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