CN113388617B - 西瓜强健根系性状的kasp分子标记及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种调控主根长度相关基因ClACS7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述。本发明还同时提供了鉴定西瓜中强主根相关基因ClACS7的分子标记MRL。该分子标记MRL能用于鉴定西瓜强根株系或其后代辅助选择育种。

Description

西瓜强健根系性状的KASP分子标记及其用途
技术领域
本发明属于蔬菜农艺性状分子标记开发和分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种适用于西瓜强 健根系性状快速筛选和分子标记辅助育种，提供涉及一种新型且简便的分子标记及辅助选择方法。
背景技术
根系是植物从自然界获取水分和营养元素的主要器官，也是植物应对土壤逆境的第一道防线[1-3]。根系 构型是根系在土壤中的空间构型，用来描述根系的形状和结构。由于土壤资源(水、营养元素等)在土壤 中的分布是异质性的，根系的空间布局从根本上决定植物获取土壤资源的能力。强健的根系结构(主根更 长，侧根更多)可以显著提高植物在亚适宜条件下的水分和养分的吸收及利用效率，从而提升作物的存活率 和生产性能。遗传研究发现了多个根系结构相关数量性状位点(QTL)与作物产量、水分和养分利用效率 等重要性状的QTL重叠，表明根系结构对这些生产力相关性状发挥重要作用[4-6]。此外，根系也在植物抵 御土壤逆境的负面影响中发挥重要作用。西瓜中有研究发现：具有分支根系和丰富的次生须根的西瓜基因 型在缓解黄萎病、镰刀菌和根结线虫等病虫害的影响方面具有优势，即强健而有弹性的根系可以保护西瓜 作物抵御根病原体侵害[7]。植物的根系结构建成是由根源基形成、根萌发、伸长等多个发育过程形成的， 这些发育过程很大程度上受体内植物激素与外部水分、养分、重力等环境因素的调控和影响[8]。在调控根 系发育的众多植物激素中，生长素是最关键的一个因素。早在胚胎发生时，生长素的分布模式就决定了胚 根的发育位置；在根系发育后期中，生长素在分生组织内和周围细胞的分布模式影响着根原基的形成、根 损伤后的再生、须根发生和侧根的间距。同时，生长素也是植物根系向地性反应的信号物质[9,10]。此外， 细胞分裂素与独脚金内脂等激素也被发现通过与生长素互作来调控根系发育。另一方面，最新的研究发现 乙烯在植物根系感受土壤质地时发挥重要作用：由于夯实土壤较疏松土壤具有更少的空隙和更低的气体扩 散效率，促使植物根系产生的乙烯在夯实土质中大量积累，从而抑制了该区域的根系生长，而疏松土壤里 乙烯快速逃逸导致根系可以良好地生长，表明乙烯是植物根系赖以感受并适应不同土壤质地环境的重要工 具[11]。目前，根系发育的机理研究主要是通过QTL定位分析。比如在水稻中就发现了较多与根生物量、 根长、根数、根生长角度等性状相关的多个中-微效QTL[12-21]；此外，多个关于根系结构响应氮浓度[22，23]、 低磷胁迫[24-26]、铝离子和砷酸盐胁迫[27，28]等环境因素的QTL也已被发现。然而，根系发育的高适应性和 可塑性使得关于根系结构变异的遗传研究变得复杂，导致这些QTL对根系表型的贡献率并不高(30％左 右)，这也是难以精细定位主效根系调控基因的一个重要原因。
当前，我国农业可持续发展的资源环境瓶颈尚未突破，资源与环境承载能力日益脆弱，生态安全面 临严重威胁。揭示根系结构遗传变异的程度和机理，为资源高效利用型作物育种提供理论支持，对于提高 作物的水分和养分利用效率，以及在非生物逆境(干旱、水渍、盐碱化等)下的生存与生产能力具有重要 意义。
西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai]栽培地域广阔，经济效益显著，是世界上重要的经济 作物；其口感甜美，营养丰富，是满足新时期人民美好生活需要的重要时令水果之一。我国是世界西瓜生 产与消费第一大国，2019年西瓜栽培面积达186万公顷，占世界总面积的53％、产量约6068万吨，超 过世界总产量的60％(FAOSTAT,http://www.fao.org/faostat/en/)。西瓜是较为耐旱的陆生作物，但是其全生 育期的需水量巨大。较为强健的根系结构使得西瓜成为根系结构研究的理想物种。近期有研究表明，相比于西瓜属其它种、亚种或变种，栽培西瓜亚种根系最弱；而饲用西瓜(Citrullus amarus)亚种西瓜具有最 为强健的根系结构，表明栽培西瓜(Citrullus lanatus)可能在长期驯化过程中丢失了部分强健根系结构相 关等位基因[29]。
上文中涉及的参考文献如下：
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6.Johnson,W.C.et al.(2000)Lettuce,a shallow-rooted crop,and Lactucaserriola,its wild progenitor, differ at QTL determining root architecture anddeep soil water exploitation.Theor.Appl.Genet.101,1066–1073 (Johnson等2000。浅根作物莴苣与其野生祖系莴苣在决定根系结构和深层土壤水分利用的QTL上存在差 异。理论和应用遗传学。101，1066-1073)；
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8.Ogura,T.et al.(2019)Root System Depth in Arabidopsis Is Shaped byEXOCYST70A3 via the Dynamic Modulation of Auxin Transport.Cell 178,400-412(Ogura等2019。拟南芥的根系深度是由 EXOCYST70A3通过生长素运输的动态调节形成的。细胞。178，400-412)；
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10.Dorlodot,S.D.et al.(2007).Root system architecture:opportunitiesand constraints for genetic improvement of crops.Trends.in Plant Sci.12(10),474-481(Dorlodot等2007。根系结构:作物遗传改良的机 遇和制约因素。植物科学趋势。12(10)，474-481)；
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19.Zheng,B.S.et al.(2006)QTLs and candidate genes for rice rootgrowth under flooding and upland conditions.Journal of Genetics and Genomics，33，141–151(Zheng等2006.水淹和旱作条件下水稻根生长 的QTL和候选基因。遗传学和基因组学杂志。33，141-151)；
20.Uga,Y.et al.(2010)Fine mapping of Sta1,a quantitative trait locusdetermining stele transversal area, on rice chromosome 9.Mol.Breed.26,533–538(Uga等2010。水稻9号染色体中柱横截面积定量性状位点 Sta1的精细定位。分子育种。26，533-538)；
21.Uga,Y.et al.(2011)A major QTL involved in deep rooting of riceunder upland field conditions.J.Exp. Bot.62,2485–2494(Uga等2011。旱田条件下水稻深生根的一个主要QTL。实验植物学杂志。62， 2485-2494)；
22.Rauh,B.L.et al.(2002)Quantitative trait loci analysis of growthresponse to varying nitrogen sources in Arabidopsisthaliana.Theor.Appl.Genet.104,743–750(Rauh等2002。拟南芥对不同氮源生长响应的数量性 状位点分析。理论和应用遗传学。104，743-750)；
23.Obara,M.et al.(2010)Fine-mapping of qRL6.1,a major QTL for rootlength of rice seedlings grown under a wide range of NH4+concentrations inhydroponic conditions.Theor.Appl.Genet.121,535–547(Obara 等2010。对水培条件下大范围NH4+浓度下水稻幼苗根长主要QTL qRL6.1的精细定位。理论和应用遗传 学。121，535-547)；
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25.Ochoa,I.E.et al.(2006)QTL analysis of adventitious root formationin common bean under contrasting phosphorus availability.Crop Sci.46,1609–1621(Ochoa等2006。低磷有效性下普通菜豆不定根形成的QTL 分析。作物科学。46，1609-1621)；
26.Reymond,M.et al.(2006)Identification of QTL controlling rootgrowth response to phosphate starvation in Arabidopsis thaliana.Plant CellEnviron.29,115–125(Raymond等2006。控制拟南芥根系对磷 酸盐饥饿反应的QTL的鉴定。植物细胞环境。29，115-125)；
27.Magalhaes,J.V.et al.(2004)Comparative mapping of a major aluminumtolerance gene in sorghum and other species in the Poaceae.Genetics 167,1905–1914(Magalhaes等2004。高粱和禾本科植物主要耐铝基因 的比较定位。遗传。167，1905-1914)；
28.Dasgupta,T.et al.(2004)An arsenate tolerance gene on chromosome6of rice.New Phytol.163,45–49 (Dasgupta等2004。水稻第6染色体上的一个砷酸盐耐受基因。新植物学家。163，45-49)；
29.Katuuramu,D.N.et al.(2020)Phenotypic Diversity for Root Traits andIdentification of Superior Germplasm for Root Breeding inWatermelon.HortScience 55(8),1272–1279(Katuuramu等2020。西瓜根系性 状表型多样性及其优良种质鉴定。园艺科学。55(8)，1272-1279)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一个西瓜亚种间中的调控主根长度相关基因ClACS7，提供一种与强健 主根SNP关联的KASP分子标记及其开发方法和用途；本发明所获得的分子标记MRL(Main Root length) 为西瓜强主根基因的基因标记，能用于强主根西瓜的辅助选择育种。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种饲用西瓜中强主根相关基因ClACS7，即，调控主根长度相 关基因ClACS7：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。
本发明还同时提供了上述饲用西瓜中强主根相关基因ClACS7编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列 如SEQ ID NO：2所述。
本发明还同时提供了鉴定西瓜中强主根相关基因ClACS7的分子标记MRL(与西瓜主根长度有关的分子 标记MRL)，以西瓜为物种，分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5’-3’
ZJU003型正向引物(F-HEX)：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACGAACCGGGCGAAATATTC
ZJU087型正向引物(F-FAM)：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACGAACCGGGCGAAATATTG
反向引物(R)：GGTGAAATTGAGATTTGGAAGCGG。
本发明还同时提供了上述分子标记MRL的用途：用于鉴定西瓜强根株系或其后代辅助选择育种。
本发明还同时提供了利用如上述分子标记MRL鉴定西瓜主根长度相关基因ClACS7的方法，包括以下 步骤：
(1)提取待测西瓜品种基因组DNA；
(2)利用分子标记MRL对西瓜基因组DNA进行PCR扩增；
(3)根据PCR产物荧光信号的差异，利用软件(例如Kraken软件)，进而鉴别出每个待测西瓜的基 因型，即，鉴定出属于纯合GG型基因型(强根系生长型)，纯合CC型基因型(弱根系生长型)、杂合CG 基因型。
作为本发明的鉴定西瓜中主根长度相关基因ClACS7的方法的改进：步骤2)中，
PCR反应体系为：20～50ng/μl西瓜基因组DNA 5.0μl，KASP Master Mix(LGC)5.0μl，KASP Assay Mix (F-HEX：F-FAM：R＝2:2:5的摩尔浓度比)0.14μl，共10.14μl；
PCR程序为：94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性)；61℃(-0.6℃/循环)退火60s，10个 循环；再94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环。
本发明还提供了西瓜强健主根相关ClACS7基因的克隆方法，包括以下步骤：
1)、以栽培西瓜与饲用西瓜为亲本进行杂交和自交，从而获得作为后代的强/弱主根分离的单株；
2)、用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonnium Bromide)法提取西瓜亲本幼 苗及杂交后代F2群体幼苗基因组DNA；
3)、采用BSA(分离群体分析，Bulked Segregant analysis)构建强主根/弱主根基因池，基于Illumina 高通量测序平台对不同基因池进行基因组覆盖度50倍重测序；
4)、采用关联分析鉴定与主根长度相关的基因；
5)、克隆到一个与西瓜强健主根调控基因ClACS7。
采用KASP标记MRL进行西瓜主根长度性状预测的方法具体是：
(1)MRL标记在不同西瓜基因型自然群体材料的DNA多态性分析：
根据MRL基因的核苷酸序列，设计开发分子标记MRL，用于检测不同主根长度西瓜基因型的多态性。 备注说明：引物(分子标记)可委托上海桑尼生物科技有限公司合成，在ABI Veriti96 PCR仪上进行PCR扩 增，并利用ABI公司Stepone荧光定量PCR仪检测荧光信号并分析基因分型。
PCR反应体系为：20～50ng/μl西瓜基因组DNA 5.0μl，KASP Master Mix5.0μl，KASP Assay Mix (F-HEX：F-FAM：R＝2:2:5，这3者的摩尔浓度分别为2.2ng/l、2.2ng/l、5.5ng/l)0.14μl，共10.14μl。
具体程序为：94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性)—61℃～55℃，1分钟(复性&延伸：以 touch down程序扩增10个循环，每循环降低0.6℃)；94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个 循环。扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩 增，每3个循环查看分型情况，直至分型完全，从Kraken软件中导出实验结果。
按照本发明的设定，扩增26个循环，即能实现分型完全。
基因分型结果显示：每一组引物对待测西瓜的分型效果均很好。其中，引物对DNA样品的分型效果图 如图1所示，图中每个圆点代表一份待测材料，其中红色圆点表示该位点是纯合基因型“CC”；蓝色圆点 表示该位点是纯合基因型“GG”；绿色圆点表示该位点是杂合基因型“CG”或“GC”；黑色标记表示NTC， 即为水对照。
本发明通过分析已发表西瓜GWAS数据，分析了MRL标记所在位点的单碱基多态性分布情况。发现在 来源于世界各地四百多份西瓜种质资源中，仅存在两种等位基因，即C和G类型。414份西瓜种质资源中只 有8份种质呈现纯合GG基因型，一份种质呈现杂合CG基因型；这9份包含G型等位基因的种质全部属于饲 用西瓜(Citrullus amarus)亚种(表1)；表明G型等位基因来源于饲用西瓜亚种内的进化事件。推测MRL 标记所在的ACS7基因可能是导致饲用西瓜根系强健的遗传基础之一。因此，本发明选取多个饲用西瓜种 质，根据MRL标记分为GG和CC类型进行表型-基因型关联分析，发现所有纯合GG基因型的饲用西瓜群体 的平均主根长度显著高于纯合CC基因的饲用西瓜群体(图2)，表明MRL分子标记与主根长度高度连锁。 上述发现说明了MRL分子标记的可靠性和可用性。
表1、MRL标记在414份西瓜种质中的分布情况
Figure BDA0003109902810000051
Figure BDA0003109902810000061
Figure BDA0003109902810000071
Figure BDA0003109902810000081
Figure BDA0003109902810000091
Figure BDA0003109902810000101
Figure BDA0003109902810000111
Figure BDA0003109902810000121
Figure BDA0003109902810000131
Figure BDA0003109902810000141
(2)利用MRL分子标记开展强健根系西瓜辅助选择育种：
强根系基因供体西瓜(例如ZJU087西瓜)与弱根系普通栽培西瓜(例如ZJU003西瓜)进行杂交，然 后通过回交、自交结合标记辅助选择，将强主根基因ClACS7导入到栽培西瓜中，选择分离群体中与强根系 基因供体西瓜基因型一致的单株用于育种改良，获得了若干份栽培西瓜背景的含有强主根基因ClACS7的材 料，通过主根长度检测，发现所有纯合GG基因型的西瓜F3后代群体的平均主根长度显著高于纯合CC基因 的西瓜F3后代群体，而杂合类型的群体的主根长度表现为中间类型。该结果再次验证了MRL分子标记与主 根长度的高度连锁，同时表明导入强根系基因供体西瓜(例如ZJU087)类型ClACS7等位基因的后代(即GG或GC基因型)的根系长度显著增加(图3)。
本发明的分子标记(MRL)的开发方法，包括以下步骤：
1)、用Plant DNAzol(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonniumBromide)法分别提取 栽培西瓜(ZJU003)和饲用西瓜(ZJU087)的基因组DNA；
2)、用天根公司的RNApre pure plant kit(TIANGEN，DP432)对上述材料进行RNA的提取，并反转 录成cDNA；
3)、采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法进行西瓜中主根长度调控基因ClACS7 基因标记的筛选；
4)、开发出一个KASP分子标记MRL。
本发明通过利用西瓜主根长度高度差异的西瓜种质构建F2遗传群体，针对主根长度指标进行精细定 位，发现西瓜一个乙烯合成相关(ACS7)基因的编码区在栽培西瓜和饲用西瓜间存在8个单碱基位点多 态性(SNP)，以及在该基因启动子区域存在多个插入缺失(InDel)。该基因序列的突变导致的根系乙烯含 量差异与西瓜主根长度密切相关。
本发明所获得的分子标记MRL标记，能用于西瓜强健主根株系的分子辅助育种。
本发明通过挖掘饲用西瓜等西瓜种质的强健根系的遗传基础并开发分子标记，可为资源高效利用型西 瓜分子设计育种提供重要的技术与材料基础。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1栽培西瓜和饲用西瓜杂交后代的MRL标记分型图；
蓝色圆点代表纯合CC型基因型；红色圆点代表纯合GG型基因型；绿色圆点代表杂合CG基因型； 黑色代表无样品的空白对照。分型结果图形分区界限明显，说明该kasp标记分型可靠。
图2是不同MRL基因型饲用西瓜的主根长度分布；
左侧柱代表所有纯合CC型基因型的饲用西瓜的主根长度；右侧柱代表所有纯合GG型基因型的饲用 西瓜的主根长度；
结果表明含有纯合GG标记的西瓜主根长度普遍高于含有CC标记的西瓜。
图3不同MRL标记基因型西瓜杂交F3群体的主根长度；
左侧柱代表所有纯合CC型基因型的西瓜F3群体材料的主根长度；右侧柱代表所有纯合GG型基因型 的西瓜F3群体材料的主根长度；中间柱代表所有杂合CG型基因型的F3群体材料的主根长度；
结果表明F3群体里MRL标记的基因分型与主根长度表型连锁，可以通过选择GG基因的杂交或回交 后代个体进行下一步育种。说明MRL标记可以辅助西瓜强根系育种。
图4为基因组序列与氨基酸序列对比，即，不同西瓜亚种的ACS基因组序列与氨基酸序列对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下案例中：
栽培西瓜(ZJU003)，为浙江大学选育的丽芳品种，其遗传背景基本同表1中的97103(WM1，西瓜 参考基因组材料)。尤其是本发明涉及的ClACS7基因的序列在ZJU003和97103之间完全一致(见图4)， 因此在本发明的应用过程中，ZJU003与97103效果一致。
饲用西瓜(ZJU087)，即，表2中的ZJU87(PI 485581)。
上述均为已知的西瓜品种。例如，丽芳，在《种植密度对丽芳西瓜营养代谢、生育及产量的影响》(浙 江农业科学2008年第2期)有告知。
实施例1、设计分子标记MRL
本发明的与西瓜主根长度有关的分子标记MRL，具体采用下述方法获得：
1)、比较栽培西瓜(ZJU003)和饲用西瓜(ZJU087)中主根长度调控基因ClACS7的基因组序列，鉴 定到栽培西瓜与饲用西瓜在ClACS7基因的编码区存在8个单碱基多态性(SNP)变异，如图4。8个单碱基 多态性(SNP)变异具体为第492(G/A)，第495(A/G)，第792(C/G)，第762(A/C)，第882(G/A)，第 1185(G/C)，第1206(G/A)，第1215(T/C)。
其中两个SNP为非同义突变，导致了编码的氨基酸改变。即，通过克隆测序检测出两亲本中ClACS7 基因序列内部存在差异。
2)、基于不同西瓜亚种中ClACS7基因的其中一个SNP变异(第792碱基位)，在SNP附近区域设计一组 引物(3条)；
3)、用CTAB法提取西瓜亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组DNA；
4)、采用PCR方法进行西瓜根系长度相关基因标记的筛选；
5)、开发出一个KASP标记MRL，经多态性检测，发现其与西瓜主根长度存在显著相关性，采用该标 记可以用来鉴定西瓜根系生长强弱。
KASP标记MRL为：
ZJU003型正向引物(F-HEX)：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACGAACCGGGCGAAATATTC
ZJU087型正向引物(F-FAM)：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACGAACCGGGCGAAATATTG
反向引物(R)：GGTGAAATTGAGATTTGGAAGCGG。
实施例2、用分子标记鉴定长主根型西瓜与短主根型西瓜的序列差异：
直接在ABI公司Stepone荧光定量PCR仪上进行PCR反应，所述PCR仪自带荧光分析软件，从而直 接获得分析结果，所得结果如图1，即，软件自动将检测样品按照不同的基因型分成纯合CC型基因型， 纯合GG型基因型和杂合CG基因型。
PCR反应体系为：20～50ng/μl西瓜基因组DNA 5.0μl，KASP Master Mix5.0μl，KASP Assay Mix (F-HEX：F-FAM：R＝2:2:5的摩尔浓度比)0.14μl，共10.14μl；
PCR程序为：94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性)；61℃(-0.6℃/循环)退火60s，10个 循环；再94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环。
当软件分析当出现同栽培西瓜ZJU003同样颜色的圆点时，表示圆点对应的材料基因型为CC；当出现 同饲用西瓜ZJU087同样颜色的圆点时，表示圆点对应材料的为GG；当出现位置居中(绿色)圆点时， 表示圆点对应材料的基因型是杂合型的。
备注说明：2个正向引物前分别设置各自的荧光接头(为不同颜色)，分别对应F-HEX和F-FAM，如 果检测的材料是纯合基因型，扩增的时候只会选其中对应的一个引物扩增(例如，纯合aa型只能与F-HEX 发生反应)，根据荧光的差异，分辨出所测材料是aa还是bb，如果检测的材料是杂合型的，扩增时2个 引物都会被用到，产生的荧光不同于纯合基因型的材料，从而实现区分杂合的基因型。
实验1、将表2所述的不同的西瓜种质按照实施例2所述方法进行检测，所得结果为见表2：
表2、使用分子标记MRL检测的193份西瓜种质资源所得结果
Figure BDA0003109902810000161
Figure BDA0003109902810000171
Figure BDA0003109902810000181
Figure BDA0003109902810000191
Figure BDA0003109902810000201
在表2中，结果为“GG”的西瓜中均能检测出含有SEQ ID NO：1所述的饲用西瓜核苷酸序列。而结果为“CC”的西瓜中均为栽培西瓜类型的核苷酸序列，即，结果为“CC”的 西瓜不能检测到SEQ ID NO：1所述序列。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导 出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 西瓜强健根系性状的KASP分子标记及其用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1343
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcgattg agattgagat tgagcaaaat ccaacggttg agctttccca aatcggaacg 60
tcggaaactc acggtgaaga ttcgccgtat ttcgccggct ggaaagcgta cgatgaagat 120
ccttataacg aaacaaccaa tccttctggt gttattcaaa tgggcttagc tgaaaatcaa 180
gtgtcctttg atttgttgga agagtattta gagcaaaatt gtgaagcaga agctaattgt 240
tctgggttta gagaaaatgc tttgtttcaa gattatcatg ggcttctctc ttttagaact 300
gcaatggctg gttttatgga agaaattaga ggtggaagag ccaaatttga cccaaataga 360
gttgttttaa ctgctggtgc cactgcagcc aatgagcttc ttactttcat tcttgcaaat 420
cctggtgatg ccctgctagt ccccactcct tactatcctg gatttgatag agatttgaga 480
tggagaacgg gagtgaaaat tgtaccaatt cattgtgata gttcaaacaa ttttcaaata 540
actccaaaag ctttggaaga ggcttataat acagcaatgg caatgaaaat caaagtaaga 600
ggagttttga ttacaaatcc atcaaatcca cttggggcaa cgatccaacg gtccacaatt 660
gaggagattt tagatttcgt tacacgcaaa aacatccacc tcgtatccga cgaaatctat 720
tccggttccg ttttctcctc ggccgagttt acaagcgtcg ccgaggtttt ggaatcccgc 780
ggctataaaa aggccgagcg agtccacatc gtgtatagtc tctccaaaga tctaggcctt 840
cccgggttta gaatcggcac gatttattca tacaacgata aagtcgtgac gacggctcgc 900
cgtatgtcta gctttacgct gatatcttca caaacgcagc ggtttttagc gtccatgttg 960
tcgaaccgga agtttacgga aaaatatatt aaaatgaacc gggaccggct caggaaacga 1020
tatgagatga ttattgaagg actacgaacc gctgggattc aatgtttgga agggaatgcc 1080
ggtttatttt gctggatgaa tttaagcccg ttattgaaaa ataaaaaact cactagagaa 1140
ggtgaaattg agatttggaa gcggattttg aaggaagtga aattcaatat ttcgcccggt 1200
tcgtcatgtc attgctctga acccggttgg ttcagggttt gttttgccaa catgagtgaa 1260
aaaactctgc acgttgctct ggaaagaata cattgcttca tggagaggat gaggaaggaa 1320
gatgaagtta tgaagttaat taa 1343
<210> 2
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Ile Glu Ile Glu Ile Glu Gln Asn Pro Thr Val Glu Leu Ser
1 5 10 15
Gln Ile Gly Thr Ser Glu Thr His Gly Glu Asp Ser Pro Tyr Phe Ala
20 25 30
Gly Trp Lys Ala Tyr Asp Glu Asp Pro Tyr Asn Glu Thr Thr Asn Pro
35 40 45
Ser Gly Val Ile Gln Met Gly Leu Ala Glu Asn Gln Val Ser Phe Asp
50 55 60
Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Glu Gln Asn Cys Glu Ala Glu Ala Asn Cys
65 70 75 80
Ser Gly Phe Arg Glu Asn Ala Leu Phe Gln Asp Tyr His Gly Leu Leu
85 90 95
Ser Phe Arg Thr Ala Met Ala Gly Phe Met Glu Glu Ile Arg Gly Gly
100 105 110
Arg Ala Lys Phe Asp Pro Asn Arg Val Val Leu Thr Ala Gly Ala Thr
115 120 125
Ala Ala Asn Glu Leu Leu Thr Phe Ile Leu Ala Asn Pro Gly Asp Ala
130 135 140
Leu Leu Val Pro Thr Pro Tyr Tyr Pro Gly Phe Asp Arg Asp Leu Arg
145 150 155 160
Trp Arg Thr Gly Val Lys Ile Val Pro Ile His Cys Asp Ser Ser Asn
165 170 175
Asn Phe Gln Ile Thr Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Tyr Asn Thr Ala
180 185 190
Met Ala Met Lys Ile Lys Val Arg Gly Val Leu Ile Thr Asn Pro Ser
195 200 205
Asn Pro Leu Gly Ala Thr Ile Gln Arg Ser Thr Ile Glu Glu Ile Leu
210 215 220
Asp Phe Val Thr Arg Lys Asn Ile His Leu Val Ser Asp Glu Ile Tyr
225 230 235 240
Ser Gly Ser Val Phe Ser Ser Ala Glu Phe Thr Ser Val Ala Glu Val
245 250 255
Leu Glu Ser Arg Gly Tyr Lys Lys Ala Glu Arg Val His Ile Val Tyr
260 265 270
Ser Leu Ser Lys Asp Leu Gly Leu Pro Gly Phe Arg Ile Gly Thr Ile
275 280 285
Tyr Ser Tyr Asn Asp Lys Val Val Thr Thr Ala Arg Arg Met Ser Ser
290 295 300
Phe Thr Leu Ile Ser Ser Gln Thr Gln Arg Phe Leu Ala Ser Met Leu
305 310 315 320
Ser Asn Arg Lys Phe Thr Glu Lys Tyr Ile Lys Met Asn Arg Asp Arg
325 330 335
Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Met Ile Ile Glu Gly Leu Arg Thr Ala Gly
340 345 350
Ile Gln Cys Leu Glu Gly Asn Ala Gly Leu Phe Cys Trp Met Asn Leu
355 360 365
Ser Pro Leu Leu Lys Asn Lys Lys Leu Thr Arg Glu Gly Glu Ile Glu
370 375 380
Ile Trp Lys Arg Ile Leu Lys Glu Val Lys Phe Asn Ile Ser Pro Gly
385 390 395 400
Ser Ser Cys His Cys Ser Glu Pro Gly Trp Phe Arg Val Cys Phe Ala
405 410 415
Asn Met Ser Glu Lys Thr Leu His Val Ala Leu Glu Arg Ile His Cys
420 425 430
Phe Met Glu Arg Met Arg Lys Glu Asp Glu Val Met Lys Leu Ile
435 440 445

Claims (2)

1.分子标记MRL的用途，其特征是：用于鉴定西瓜强根株系或其后代辅助选择育种；
所述分子标记MRL的扩增引物为：
F-HEX：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACGAACCGGGCGAAATATTC
F-FAM：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACGAACCGGGCGAAATATTG
反向引物R：GGTGAAATTGAGATTTGGAAGCGG；
其中的核苷酸序列为5’-3’。
2.一种鉴定西瓜主根长度的方法，其特征是：利用分子标记MRL，包括以下步骤：
（1）提取待测西瓜品种基因组 DNA；
（2）利用分子标记MRL对西瓜基因组 DNA 进行 PCR 扩增 ；
（3）根据PCR产物荧光信号的差异，利用软件，鉴别出每个待测西瓜的基因型；
所述分子标记MRL的扩增引物为：
F-HEX：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACGAACCGGGCGAAATATTC
F-FAM：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACGAACCGGGCGAAATATTG
反向引物R：GGTGAAATTGAGATTTGGAAGCGG；
其中的核苷酸序列为5’-3’。
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