CN111763764B - 用于检测甜瓜疫病抗性的caps标记及其应用 - Google Patents
用于检测甜瓜疫病抗性的caps标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种与甜瓜抗疫病基因紧密连锁的CAPS标记,其特征在于,所述CAPS标记的多态性位点位于甜瓜基因组3.5.1版本12号染色体22,902,391的位置,为G/C多态性;本发明还提供了上述分子标记在甜瓜育种、品种鉴定以及制备相应试剂盒中的应用。
Description
技术领域
本申请属于农业分子生物学检测技术领域,具体地,本申请提供了一种与甜瓜抗疫病基因紧密连锁的CAPS标记及其相应引物,检测方法和应用。
背景技术
甜瓜是葫芦科黄瓜属(Cucumis melo L.)作物,在我国是一种重要的园艺作物。据联合国粮农组织统计,我国的甜瓜栽培面积和产量均位居世界首位,对提高农民收入、推动农业供给侧结构改革发挥了重要作用。
疫病是由疫霉菌侵染引起的具有毁灭性的土传病害,可以通过雨水、土壤、空气传播,高温高湿的环境可促进疫病的发生和流行。疫霉菌可侵染甜瓜植株的根、茎、叶、果实等各个组织和器官,发病周期短,传播速度快,对产业构成严重威胁。化学防治是最常用的防治方法,但由于疫霉菌可以以厚垣孢子的形式在土壤中存活数年,对外界环境的耐受性较强。嫁接可以有效防治疫病的危害,但容易降低果品品质,选育抗疫病品种是有效控制甜瓜疫病最安全、经济、环保的途径。因此,开发甜瓜抗疫病基因连锁标记,将有利于高效改良甜瓜的疫病抗性,为抗病分子育种提供技术支撑。但目前还未有抗疫病基因被定位或克隆,也没有与抗病基因紧密连锁的分子标记被报道(目前报道的甜瓜分子标记基本集中于农艺性状、抗白粉病等方面)。
发明内容
发明人以甜瓜抗疫病材料ZQK9作为父本,高感材料E31作为母本,两亲本杂交获得F1群体,然后F1代自交获得F2群体,回交获得BC1P1和BC1P2群体。利用在田间感病甜瓜植株中分离的疫霉菌菌株,采用灌根接种法对两个亲本及各个单株进行抗病性鉴定,从而进行遗传分析。结果表明,甜瓜抗病材料ZQK9对疫病的抗性符合单显性基因的遗传模式,其抗性可能由一个显性基因控制。采用全基因组重测序(Whole Genome Resequencing,WGR)和混合分组分析法(Bulked Segregation Analysis,BSA法)相结合的方法,通过生物信息学分析,检测亲本间的SNP差异位点,计算混池间这些差异位点的频率,确定目标基因所处染色体区段。利用甜瓜全基因重测序信息,对初步定位基因区间进行基因组序列比对,获取与甜瓜材料表型性状完全符合的候选SNP位点;并将结合遗传分离群体验证分析及自然群体验证分析,迅速获取与目的性状紧密连锁的标记,可应用于抗疫病分子辅助育种,为甜瓜抗病分子育种提供技术支撑,同时大大缩短了传统基因定位的时间。
一方面,本发明提供了一种与甜瓜抗疫病基因紧密连锁的CAPS标记,其特征在于所述CAPS标记的多态性位点位于甜瓜基因组3.5.1版本12号染色体22,902,391的位置,为G/C多态性。
进一步地,所述CAPS标记以以下引物扩增获得:
上游引物序列:5’-TATGTAACTGCTATCTCCCTAA-3’(SEQ ID NO.1);
下游引物序列:5’-GGTTACTGGAGCTTTGGCTC-3’(SEQ ID NO.2)。
进一步地,所述CAPS标记以Fau I酶切判断多态性。
另一方面,本申请提供了上述CAPS标记在甜瓜育种中的应用。
另一方面,本申请提供了上述CAPS标记在甜瓜品种鉴定中的应用。
进一步地,应用包括:
使用以下引物扩增:
上游引物序列:5’-TATGTAACTGCTATCTCCCTAA-3’(SEQ ID NO.1);
下游引物序列:5’-GGTTACTGGAGCTTTGGCTC-3’(SEQ ID NO.2);
将扩增产物以Fau I酶切判断多态性,酶切后形成一条220bp的条带和一条55bp的条带的为抗病材料,仅有275bp条带的为感病材料。
进一步地,PCR扩增体系为10μl,包括1μl DNA工作液,1μl 10×Buffer缓冲液,0.4μl dNTPs,0.2μl DNA聚合酶,正、反向引物各0.2μl,用7μl ddH2O将总体积补齐至10μl;扩增程序为:94℃预变性4min;94℃变性30s,55℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸8min;
酶切体系为:0.5μl限制性内切酶Fau I,1μl 10×CutSmart Buffer缓冲液,4μlPCR产物,4.5μl ddH2O将总体积补齐至10μl,55℃酶切4h,65℃灭活20min。
酶切后将扩增产物用7%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸银染色后观察。
另一方面,本申请提供了一种甜瓜育种/品种鉴定用试剂盒,包括以下引物:
上游引物序列:5’-TATGTAACTGCTATCTCCCTAA-3’(SEQ ID NO.1)
下游引物序列:5’-GGTTACTGGAGCTTTGGCTC-3’(SEQ ID NO.2);
以及Fau I酶。
进一步地,试剂盒还包含PCR和酶切用试剂。
本申请中所述的甜瓜疫病是指辣椒疫霉菌引起的,以叶、茎、果实处暗绿色、青白色、黄褐色斑点为特征的甜瓜病害。
本申请中的PCR试剂和酶切试剂本领域技术人员可以根据分子生物学常识常规选用,包括但不限于聚合酶、dNTP、镁离子、缓冲液等,本领域技术人员可以单独购买/制造试剂或者购买市售的试剂包或试剂组合。
附图说明
图1:CAPS标记在双亲、F1、抗感池以及F2群体中随机挑选的抗病和感病单株中的扩增结果。图中,1:抗病亲本ZQK9基因型;2:感病亲本E31基因型;3:F1基因型;4:抗病混池基因型;5:感病混池基因型;6-15:F2群体中10株抗病单株;16-25:F2群体中10株感病单株。
具体实施方式
实施例1:本实施例为甜瓜抗疫病基因连锁的SNP位点及标记及其获得方法。
1.供试甜瓜材料:本发明以本实验室选育的感病品种E31作为母本(P1),以抗病品种ZQK9作为父本(P2),利用两个亲本配制得到F1、BC1P1、BC1P2和F2群体。
供试菌株:本实验所用菌株是由从海南田间发病甜瓜植株上分离得到的,经鉴定为辣椒疫霉菌。
2.分析方法及结果
(1)苗期抗病性分析:抗病性鉴定采用灌根接种法,待幼苗长至两叶一心期时,在距幼苗根部约1cm处,扎一1cm深的孔,将1ml浓度为106个/m1的饱子悬浮液注入孔内,接种温度为25℃,接种后保持湿润状态,10天后分0-5级进行病情调查。其分级标准采用灌根接种法进行接菌,接菌10d后对植株的抗病情况进行调查并分为0-5级,分级标准如下:
0级:无症状;
1级:幼苗茎基部出现水渍状褐色病斑,轻微缢缩,植株不倒伏,不萎蔫;
2级:幼苗茎基部缢缩,褐色病斑未超过子叶,植株倒伏,子叶不萎蔫,真叶不萎蔫;
3级:幼苗茎部褐色病斑超过子叶,子叶萎蔫,真叶不萎蔫;
4级:幼苗茎部褐色病斑蔓延至全株,子叶干枯,真叶萎蔫,生长点不萎蔫;
5级:植株枯萎死亡。
病情指数(Disease index,DI)计算方法如下:
公式中:DI表示病情指数;s表示各级病情指数的代表数值;n表示各发病级别的植株数;N表示调查的植株总数;S表示最高病情级别的代表数值。
根据病情指数划分抗性水平:
免疫(I):病情指数为0;
高抗(HR):病情指数为0<DI≤10;
抗病(R):病情指数10<DI≤30;
中抗(MR):病情指数30<DI≤50;
感病(S):病情指数50<DI≤70;
高感(HS):病情指数70<DI≤100
根据该标准,我们将单株症状为0-1级的定为抗病,2-5级定为感病。对各世代群体用卡方检验进行分离比适合度测验,确定品种抗性的遗传模式。
(2)DNA提取和抗感池构建:甜瓜基因组的提取采用CTAB法。采用WGR+BSA相结合的方法进行初定位,具体方法是在F2分离群体中随机选取15株极端抗病植株和15株极端感病植株,分别提取DNA,然后将15株抗病植株的DNA等量混合构建成抗病池,将15株感病植株的DNA等量混合构建成感病池。对两个亲本DNA混池和两个F2群体极端混池进行全基因组重测序,参考基因组为甜瓜DHL92基因组3.5.1版本(http://cucurbitgenomics.org)。通过分析亲本间SNP差异位点与抗感表型的相关性确定抗病基因候选区域,即基因的初定位区间为12号染色体22,061,826—25,008,958bp。
(3)利用已公布的甜瓜基因组重测序数据(https://doi.org/10.1038/s41588-019-0522-8),对10份甜瓜重测序材料(表1)在初步定位基因区间内进行基因组序列比对,获取与其表型性状完全符合的候选SNP位点,该位点位于基因组3.5.1版本12号染色体22,902,391的位置,在抗病材料里该碱基位点是G,在感病材料中是C。
表1用于开发SNP标记的甜瓜重测序材料
材料名称 | 抗性 | 位点基因型 |
PI 143217 | 高抗 | AGTTGCGGCGGGTGTAATA |
PI 140774 | 高抗 | AGTTGCGGCGGGTGTAATA |
PI 140627 | 高抗 | AGTTGCGGCGGGTGTAATA |
PI 140766 | 高抗 | AGTTGCGGCGGGTGTAATA |
PI 164395 | 高抗 | AGTTGCGGCGGGTGTAATA |
PI 165515 | 高感 | AGTTGCGGCGGCTGTAATA |
PI 143244 | 高感 | AGTTGCGGCGGCTGTAATA |
PI 136228 | 高感 | AGTTGCGGCGGCTGTAATA |
PI 614395 | 高感 | AGTTGCGGCGGCTGTAATA |
PI 164466 | 高感 | AGTTGCGGCGGCTGTAATA |
利用在线软件dCAPS Finder 2.0分析该SNP位点所处基因组序列,发现该位点符合限制性内切酶Fau I的酶切位点序列,将上述SNP位点设计成了CAPS标记。引物序列为
上游引物序列:5’-TATGTAACTGCTATCTCCCTAA-3’
下游引物序列:5’-GGTTACTGGAGCTTTGGCTC-3’
所述CAPS引物进行PCR扩增体积为10μl,包括1μl DNA工作液,1μl 10×Buffer缓冲液,1μl dNTPs,0.2μl DNA聚合酶,正、反向引物各0.2μl,用7μl ddH2O将总体积补齐至10μl。
扩增程序为:94℃预变性4min;94℃变性30s,55℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸8min。
酶切体系为:0.5μl限制性内切酶Fau I,1μl 10×CutSmart Buffer缓冲液,4μlPCR产物,4.5μl ddH2O将总体积补齐至10μl,55℃酶切4h,65℃灭活20min。酶切后将扩增产物用7%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸银染色后观察(图1),CAPS标记PCR扩增后得到一条275bp的条带,抗病材料酶切后形成一条220bp的条带和一条55bp的条带,感病材料的条带为275bp。
实施例2:F2群体及自然群体材料基因型验证
实施方案:
1.实验材料
供试甜瓜材料:抗病亲本ZQK9,感病亲本E31,包含497个单株的F2群体,以及由40个甜瓜材料构成的自然群体材料。
2.实验方法
采用灌根接种法鉴定所有实验材料的表型,采用CTAB法提取所有单株的DNA,利用CAPS标记进行PCR扩增后,用限制性内切酶Fau I酶切,用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(图1)。利用CAPS标记分析F2群体的基因型,并结合F2单株田间的抗病性鉴定结果,利用JoinMap4.0软件进行连锁遗传分析。
3.实验结果
利用该CAPS标记对F2群体的497个单株的基因型进行扩增后,统计后用JoinMap4.0软件进行分析,结果显示该标记与抗病基因共分离。34个甜瓜自然群体材料的表型与基因型完全对应(表2)。
表2 40个甜瓜自然群体材料的表型和CAPS标记检测结果
序列表
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 用于检测甜瓜疫病抗性的CAPS标记及其应用
<130> aaaaa
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
tatgtaactg ctatctccct aa 22
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ggttactgga gctttggctc 20
Claims (5)
1.检测与甜瓜抗疫病基因紧密连锁的CAPS标记的试剂在甜瓜抗疫病育种中的应用,所述CAPS标记位于甜瓜基因组3.5.1版本12号染色体第22,902,391bp的位置,表现为G/C多态性,所述CAPS标记以以下引物扩增获得:
上游引物序列:5’-TATGTAACTGCTATCTCCCTAA-3’;
下游引物序列:5’-GGTTACTGGAGCTTTGGCTC-3’;
将扩增产物以Fau I酶切判断多态性,酶切后形成一条220bp的条带和一条55bp的条带的为抗病材料,仅有275bp条带的为感病材料;
所述疫病指辣椒疫霉菌引起的,以叶、茎、果实处暗绿色、或黄褐色斑点为特征的甜瓜病害。
2.检测与甜瓜抗疫病基因紧密连锁的CAPS标记的试剂在与甜瓜抗疫病性状相关的甜瓜品种鉴定中的应用,所述CAPS标记以以下引物扩增获得:
上游引物序列:5’-TATGTAACTGCTATCTCCCTAA-3’;
下游引物序列:5’-GGTTACTGGAGCTTTGGCTC-3’;
将扩增产物以Fau I酶切判断多态性,酶切后形成一条220bp的条带和一条55bp的条带的为抗病材料,仅有275bp条带的为感病材料;
所述疫病指辣椒疫霉菌引起的,以叶、茎、果实处暗绿色、或黄褐色斑点为特征的甜瓜病害。
3. 根据权利要求1或2任一项所述的应用,其中PCR扩增体系为10μl,包括1μl DNA工作液,1μl 10×Buffer缓冲液,0.4μl dNTPs,0.2μl DNA聚合酶,上、下游引物各0.2μl,用7μlddH2O将总体积补齐至10μl;
扩增程序为:94℃预变性4min;94℃变性30s,55℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸8min;
酶切体系为:0.5μl限制性内切酶Fau I,1μl 10×CutSmart Buffer缓冲液,4μl PCR产物,4.5μl ddH2O将总体积补齐至10μl,55℃酶切4h,65℃灭活20min;
酶切后将酶切产物用7%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸银染色后观察。
4.一种甜瓜育种/品种鉴定用试剂盒,包括权利要求1所述的引物,
以及Fau I酶;
所述甜瓜育种为采用权利要求1所述的CAPS标记进行的甜瓜抗疫病育种;
所述品种鉴定为采用权利要求1所述的CAPS标记进行的与甜瓜抗疫病性状相关的甜瓜品种鉴定;所述疫病指辣椒疫霉菌引起的,以叶、茎、果实处暗绿色、或黄褐色斑点为特征的甜瓜病害。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其还包含PCR和酶切试剂。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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