CN116622899A - 与番茄抗颈腐根腐病基因Frl紧密连锁的Indel标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与番茄抗颈腐根腐病基因Frl紧密连锁的Indel标记及其应用。本发明分析了番茄自交系Heinz1706与ZM‑6的基因组序列，开发了与番茄颈腐根腐病抗性基因Frl紧密连锁的Indel标记，所述Indel标记扩增的与番茄感病基因Frl连锁的特征条带为89bp，与番茄抗病基因Frl连锁的特征条带为98bp。本发明利用36份不同遗传背景的番茄资源进行验证，结果表明Frl‑Indel验证的正确率为100％。利用本发明获得的Indel标记可以在番茄苗期快速、准确、高效的进行番茄颈腐根腐病抗性鉴定，降低人工接种鉴定和田间移栽工作量，提高育种效率、降低育种成本、加速育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及生物辅助育种技术领域，特别涉及一种与番茄抗颈腐根腐病基因Frl紧密连锁的Indel标记及其应用。
背景技术
番茄颈腐根腐病(Fusarium crown and root rot，FCRR)，俗称“死棵病”，是由尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici(Forl))引起的番茄土传性真菌病害。该病害在番茄幼苗期和成株期均可发生，设施栽培条件下发生尤为严重。近年来，随着番茄设施面积增大及种植年限增加，番茄颈腐根腐病已成为威胁我国设施番茄冬春生产的最重要的病害之一，病害发生时可造成番茄减产65％以上甚至绝收，严重影响了番茄的安全生产。番茄颈腐根腐病侵染周期相对较长，早期不易发现，目前还没有十分安全有效的物理和化学防治方法。相对来说，选育抗病品种是防治该病害最为经济有效的方法。采用分子标记辅助选择育种可有效地克服传统育种耗时长的缺陷，从而加速育种进程，然而番茄颈腐根腐病抗性基因挖掘及抗性机理相关研究的进展缓慢，严重限制了有效标记的开发及应用。
研究表明，番茄颈腐根腐病抗性来源于野生秘鲁番茄Solanum peruvianum，由显性单基因Frl控制，该基因已被定位到9号染色体上，并且被转育到栽培番茄中。近年来，国内外研究者对该基因进行了遗传定位和分子标记开发应用方面的研究。Staniaszek等将距离Frl基因约3cM的C2_At2g38025标记改造成了CAPS标记C2-25(Staniaszek M,SzczechuraW,Marczewski W.2014.Identification of a new molecular marker C2-25 linked tothe Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici resistance Frl gene intomato.Czech Journal of Genetics and Plant Breeding,50(4)：285-287)，该标记在检测过程需要使用限制性内切酶进行酶切，过程繁琐，且其鉴定的准确率不高。2015年，Mutlu等人利用抗病材料Fla.7781构建群体，筛选获得了一个SCAR标记SCAR-Frl(Mutlu N,Demirelli A,Ilbi H,Ikten C.2015.Development of co-dominant SCAR markerslinked to resistant gene against the Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici.Theoretical and Applied Genetics,128(9)：1791-1798)，但该标记在43份商品种番茄材料中验证其准确率不到45％。随后，Kim等筛选了两个与Frl连锁的CAPS分子标记PNU-T1212和PNU-D4，在F2群体中的准确率分别为93.2％和92.8％，但在60份商品种番茄中的准确率约为60％和90％(Kim B,Kim N,Kim J Y,Kim B S,Jung H J,Hwang I,NouaI S,Sim S C,Park Y.2016.Development of a high-resolution melting marker forselecting Fusarium crown and root rot resistance in tomato.Genome,59(3)：173-183)。2018年，Devran等通过基因组重测序和生物信息学分析将Frl基因定位在9号染色体4.2-5.1Mb范围内(Devran Z,Kahveci E,Hong Y,Studholme D J,M.2018.Identifyingmolecular markers suitable for Frl selection in tomato breeding.Theoreticaland Applied Genetics,131(10):2099-2105)，李传友等在该区间设计开发了一个PCR-based标记，其准确率未知(CN113943826A)。随后李传友等在该区间又设计开发了标记SNPFrl60，该标记的准确率较高，但其需要限制性内切酶SacI进行酶切，程序较为繁琐，且成本较高(CN116179734A)。因此，需要开发与抗性基因Frl紧密连锁且操作简单、成本较低的分子标记，从而更加高效的用于番茄抗颈腐根腐病辅助选择育种。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种与番茄抗颈腐根腐病基因Frl紧密连锁的Indel标记及其应用。本发明以感FCRR高代自交系Heinz1706(P1)与抗FCRR高代自交系ZM-6(P2)为亲本构建F1、F2及BC1P1群体，通过苗期人工接种鉴定，对番茄抗FCRR基因Frl进行了遗传规律分析。以F2群体为作图材料，利用亲本间多态性标记，实现Frl基因在染色体上的遗传定位(定位至番茄9号染色体91kb范围内)，并获得紧密连锁标记Frl-Indel。所述Indel标记扩增的与番茄感病基因Frl连锁的特征条带为89bp，与番茄抗病基因Frl连锁的特征条带为98bp。本发明利用36份不同遗传背景的番茄资源进行验证，结果表明Frl-Indel验证的正确率为100％，不仅为番茄抗颈腐根腐病基因的精细定位和克隆奠定基础，同时也为利用分子标记辅助选育抗颈腐根腐病的番茄新品种提供了理论依据。
本发明的技术方案是：一种与番茄抗颈腐根腐病基因Frl紧密连锁的Indel标记，其特征是，所述Indel标记的引物的核苷酸序列如下：
F：CTTTGTTGGTGACAAATTTG；
R：TGACCAAAACAAGTCCAGAG。
所述引物扩增的与番茄中感颈腐根腐病基因Frl连锁的特征条带为89bp(Seq IDNo.1)：CTTTGTTGGTGACAAATTTGAATTTGCTGCTAATTTTATGGGAATCTGGGTTGGAGTTTTTGAAGAAGCCTCTGGACTTGTTTTGGTCA。
所述引物扩增的与番茄中抗颈腐根腐病基因Frl连锁的特征条带为98bp(Seq IDNo.2)：CTTTGTTGGTGACAAATTTGGATTTGCTGATATTGCTGCTAATTTTATGGGAATTTGGGTTGGAGTTTTTGAAGAAGCCTCTGGACTTGTTTTGGTCA。
上述的Indel标记在鉴别感颈腐根腐病和抗颈腐根腐病的番茄材料中的应用。
上述的Indel标记在筛选对番茄颈腐根腐病抗感的番茄种质资源上的应用。
本发明筛选对番茄颈腐根腐病抗感的番茄种质资源的方法，具体步骤为：
(1)采用上述Indel标记的引物对待选番茄材料的基因组DNA分别进行PCR扩增；
(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；
(3)从检测结果中筛选出与抗番茄颈腐根腐病基因Frl连锁的Indel标记特征条带一致的材料。
PCR扩增反应的总体系为10μL，其中DNA模板(50ng·μL-1)2μL，引物正向和反向(10μmol·L-1)各0.25μL，2×M5 HiPer plus TaqHifi PCR Mix(聚合美公司产品)5μL，双蒸水2.5μL。
PCR扩增的程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。
PCR扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，180V恒功率电泳分离2h，最后银染显色，统计带型。
进一步的，步骤(3)引物扩增的与番茄中抗颈腐根腐病基因Frl连锁的特征条带为98bp；引物扩增的与番茄中感颈腐根腐病基因Frl连锁的特征条带为89bp。
本发明的技术效果是：
1、本发明以感FCRR高代自交系Heinz1706(P1)与抗FCRR高代自交系ZM-6(P2)为亲本构建F1、F2及BC1P1群体，通过苗期人工接种鉴定，对番茄抗FCRR基因Frl进行了遗传规律分析。以F2群体为作图材料，利用亲本间多态性标记，实现Frl基因在染色体上的遗传定位，定位至番茄9号染色体91kb范围内，通过对Frl基因的精确定位，提高了紧密连锁标记Frl-Indel的准确性；
2、本发明通过36份不同遗传背景的番茄资源进行验证，结果表明Frl-Indel验证的正确率为100％。本发明不仅为番茄抗颈腐根腐病基因的精细定位和克隆奠定基础，同时也为利用分子标记辅助选育抗颈腐根腐病的番茄新品种提供理论依据；
3、本发明获得的Indel标记可以在番茄苗期快速、准确、高效的进行番茄颈腐根腐病抗性鉴定，降低人工接种鉴定和田间移栽工作量，提高育种效率、降低育种成本、加速育种进程。
附图说明
图1为本发明实施例2中用Frl-Indel标记验证番茄亲本材料Heinz1706(P1)、ZM-6(P2)、F1以及F2群体随机单株的部分聚丙烯酰胺电泳检测结果；其中，P1：Heinz1706(感颈腐根腐病，S)；P2:ZM-6(抗颈腐根腐病，R)。
图2为本发明实施例2中用Frl-Indel标记验证36份不同遗传背景的番茄材料的聚丙烯酰胺电泳检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。
本研究所用试验材料为番茄高代自交系Heinz1706(母本P1，感病)和ZM-6(父本P2，抗病)，双亲杂交后获得F1，F1自交获得F2群体，F1与母本Heinz1706回交后获得BC1P1群体。
生物材料的来源：
番茄高代自交系Heinz1706(P1)：从美国番茄遗传资源中心(Tomato GeneticsResource Center)引进，加工类型番茄，有限生长类型，早熟，果实椭圆形，中等大小。该品种是国际番茄基因组计划的测序品种，在2012年的《Nature》第485期的第630页有记载。
番茄高代自交系ZM-6(P2)：由山东省农业科学院蔬菜研究所选育的番茄抗病自交系材料，无限生长型，抗颈腐根腐病(记载该自交系的文章：王梦蕊,刘淑梅,侯丽霞,等.番茄颈腐根腐病抗性鉴定技术的建立及抗性种质资源筛选[J].中国农业科学2022,55(4):707-718)。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
主要试剂：PCR实验使用北京聚合美公司的2×M5 HiPer plus TaqHifi PCR Mix；凝胶电泳使用康润公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至8％后使用。
实施例1：与番茄抗颈腐根腐病基因Frl紧密连锁的标记的获得
1、番茄颈腐根腐病抗性遗传规律分析
以感FCRR高代自交系Heinz1706(P1)与抗FCRR高代自交系ZM-6(P2)为亲本构建F1、F2及BC1P1群体，通过苗期人工接种鉴定，对番茄抗FCRR基因Frl进行了遗传规律分析。
2021年春在山东省农业科学院蔬菜研究所番茄课题组人工气候室对F1及368个F2单株和242个BC1P1单株进行番茄抗颈腐根腐病苗期接种鉴定。当番茄长至2～3片真叶时，小心拔起幼苗并用清水将根系冲洗干净，然后将整个根系在浓度为107个孢子/ml的接种悬浮液中浸泡15min，再移栽到苗钵中。接种后的控制温度18℃～22℃，正常栽培管理。4周后对其进行调查。
调查时，将病情划分为5个等级，分别为：0级，植株根系正常；1级，植株主根基部轻微褐变，侧根正常；2级，植株主根基部褐变，侧根轻微褐变，茎纵剖维管束褐变；3级，植株主根侧根明显褐变，侧根少量脱落，茎纵剖维管束明显褐变；4级，植株茎基部、根部严重褐变甚至腐烂，侧根脱落，茎纵剖维管束严重褐变。
根据调查结果使用Microsoft Excel 2010及SAS8.0软件进行数据统计分析，判断分离比。调查结果显示F1均表现抗病；F2群体共368株，其中270个单株表现为抗病，98个单株表现为感病，抗病植株数与感病植株数比例为2.76:1，符合孟德尔3:1分离比例(χ2 3:1＝0.52，P＝0.47)，242个BC1P1单株中，118个单株表现为抗病，124个单株表现为感病，抗病植株数与感病植株数比例为0.95:1，符合孟德尔1:1分离比例(χ2 1:1＝0.15，P＝0.70)，表明番茄抗颈腐根腐病基因Frl为一个显性单基因。
2、番茄抗颈腐根腐病基因遗传定位
取番茄植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本及F2群体各单株的基因组DNA。根据双亲重测序数据在9号染色体上开发分子标记并利用双亲筛选具有多态性的标记。利用筛选获得的多态性分子标记对F2单株DNA进行PCR扩增。
PCR扩增反应的总体系为10μL，其中DNA模板(50ng·μL-1)2μL，引物正向和反向(10μmol·L-1)各0.25μL，2×M5 HiPer plus TaqHifi PCR Mix(聚合美公司产品)5μL，双蒸水2.5μL。
PCR扩增的程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。
PCR扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，180V恒功率电泳分离2h，最后银染显色，统计带型。
共显性标记的统计方法：与母本(Heinz1706)一致的带型记为a，与父本(ZM-6)一致的带型记为b，杂合的带型记为h，未扩增出或模糊不清的记为u。利用筛选出的8对多态性标记对368株F2群体单株进行分析，结合表型鉴定结果利用Joinmap4.0构建连锁图，结果将Frl基因初步定位在9号染色体4.59-6.1Mb范围内。
3、Frl连锁群分子标记加密及重组单株分析
利用初定位双侧分子标记对扩大的F2单株进行基因分析，筛选重组单株；根据双亲重测序数据在定位区间开发高密度Indel标记，对重组单株进行加密标记分析，结合表型鉴定结果，逐步缩小定位区间，最终将Frl基因定位至番茄9号染色体91kb范围内。在该区间内获得一个与Frl基因紧密连锁的Indel标记，命名为Frl-Indel。
所述Indel标记的引物的核苷酸序列如下：
F：CTTTGTTGGTGACAAATTTG；
R：TGACCAAAACAAGTCCAGAG。
采用上述Indel标记的引物对待选番茄材料的基因组DNA分别进行PCR扩增；对扩增结果进行凝胶电泳检测；从检测结果中筛选出与抗番茄颈腐根腐病基因Frl连锁的Indel标记特征条带一致的材料，即所述引物扩增的与番茄中抗颈腐根腐病基因Frl连锁的特征条带为98bp(核苷酸序列如Seq ID No.2所示)；与番茄中感颈腐根腐病基因Frl连锁的特征条带为89bp(核苷酸序列如Seq ID No.1所示)。
实施例2.番茄抗颈腐根腐病基因Frl连锁标记的验证
用实施例1获得的与Frl基因连锁的Indel标记Frl-Indel对亲本、F1及368份F2材料以及36份不同遗传背景的番茄材料(表1)进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。验证采用实施例1的PCR扩增体系和检测方法。
表1番茄品种人工接种鉴定与分子标记检测结果
经和所选材料的室内接种鉴定结果相比，该Frl-Indel标记验证368份F2单株材料，结果显示，所有F2单株的带型反映的表型数据与室内人工接种鉴定结果一致，准确率为100％(部分PAGE胶电泳检测结果示于图1)。
另外，采用现有已知的36份不同遗传背景的番茄材料重复验证该Frl-Indel标记，结果发现，这36份材料的带型反映的表型数据与抗性调查结果一致，准确率为100％(电泳检测结果见图2)。
本研究中获得了番茄抗颈腐根腐病连锁的Indel标记，不仅为番茄抗颈腐根腐病基因的克隆奠定基础，同时也为利用分子标记辅助选育抗颈腐根腐病的番茄新品种提供理论依据。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种与番茄抗颈腐根腐病基因Frl紧密连锁的Indel标记，其特征是，所述Indel标记的引物的核苷酸序列如下：
F：CTTTGTTGGTGACAAATTTG；
R：TGACCAAAACAAGTCCAGAG。
2.如权利要求1所述的Indel标记，其特征是，所述引物扩增的与番茄中感颈腐根腐病基因Frl连锁的特征条带为89bp，核苷酸序列如Seq ID No.1所示。
3.如权利要求1所述的Indel标记，其特征是，所述引物扩增的与番茄中抗颈腐根腐病基因Frl连锁的特征条带为98bp，核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
4.权利要求1-3中任一项所述的Indel标记在鉴别感颈腐根腐病和抗颈腐根腐病的番茄材料中的应用。
5.权利要求1-3中任一项所述的Indel标记在筛选对番茄颈腐根腐病抗感的番茄种质资源上的应用。
6.一种筛选对番茄颈腐根腐病抗感的番茄种质资源的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)采用权利要求1所述的Indel标记的引物对待选番茄材料的基因组DNA分别进行PCR扩增；
(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；
(3)从检测结果中筛选出与抗番茄颈腐根腐病基因Frl连锁的Indel标记特征条带一致的材料。
7.如权利要求6所述的方法，其特征是，所述步骤(3)引物扩增的与番茄中抗颈腐根腐病基因Frl连锁的特征条带为98bp；引物扩增的与番茄中感颈腐根腐病基因Frl连锁的特征条带为89bp。
8.如权利要求6所述的方法，其特征是，所述PCR扩增反应的总体系为10μL，其中50ng·μL-1DNA模板2μL，10μmol·L-1引物正向和反向各0.25μL，2×M5 HiPer plus TaqHifiPCRMix 5μL，双蒸水2.5μL。
9.如权利要求8所述的方法，其特征是，所述PCR扩增程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。
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