CN114438251B - 鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的引物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的引物组合及其应用。属于农业分子生物学技术领域。本发明通过在大量的SSR引物中筛选出Primer17、Primer51、Primer125、Primer128和Primer140构成用于鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的引物组合，利用亲本和杂交种的基因组DNA进行PCR扩增，通过凝胶电泳处理获得电泳图谱，通过观察杂交种是否同时具有其亲本的特征谱带即可判定待测杂交种的真实性，该方法方便、快捷，操作步骤简单，能够对大量的待测杂交种进行快速鉴定，测定结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及农业分子生物学技术领域，更具体的说是涉及鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的引物组合及其应用。
背景技术
远缘杂交是创造作物新品种的重要途经，也是改良物种的有力工具。利用远缘杂交技术，可打破种、属间的隔离，拓宽遗传基础并为育种计划创造新的种质，从而有效地进行种间、属间目标遗传物质的转移。远缘杂交在油菜育种上已得到广泛应用，并取得显著成效。目前，国内外在甘蓝型油菜与萝卜远缘杂交及杂种鉴定方面的研究虽有报道，却为数不多。甘蓝型油菜与萝卜的杂交属于芸墓属与萝卜属之间的远缘杂交。甘蓝型油菜(B.napus)是经过白菜与甘蓝种间杂交，加倍形成的异源双二倍体。萝卜(Raphanus sativus)是十字花科一种非常重要的疏菜。萝卜中存在着许多有利的性状，例如优良的抗逆和抗虫性。植物遗传育种中，远缘杂交可以将萝卜中的优良基因转移到甘蓝型油菜中，从而拓宽甘蓝型油菜的遗传基础，改良甘蓝型油菜。
随着分子生物学技术的发展，分子标记技术越来越多的应用于农作物种子的真实性与品种纯度鉴定。分子标记鉴定技术是以DNA分子多态性为基础的一种遗传标记，能稳定遗传，可以反映生物的个体和群体特征。分子标记可以直接反映DNA水平上的差异，具有高度的专一性和特异性，其中SSR(simple sequence repeats)标记技术具有数量丰富、多态性高、共显性遗传、扩增稳定、易于检测等方面的优点。SSR标记通常具有共显性的特点，F1杂交种具有双亲等位基因的互补带型。SSR标记已成为现阶段用于鉴定种子纯度的常用方法，但是目前在油菜和萝卜杂交种使用SSR分子标记技术鉴定其真实性的报道鲜有。
本发明通过人工杂交获得甘蓝型油菜与萝卜的远缘杂种，并对杂种进行了分子标记鉴定，旨在拓宽甘蓝型油菜的遗传基础，为相关性状的转移和创造新的生物材料提供理论依据。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的引物组合及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明通过对甘蓝型油菜、萝卜及两者的杂交F1代种子进行萌发和实验培养，收集叶片提取基因组DNA。对亲本基因组DNA进行高通量测序，组装基因组信息并搜索全基因组中的SSR位点，并设计合成这些特异性位点相对应的引物，利用亲本和杂交种的基因组DNA进行PCR扩增，确定引物的特异性、有效性，挑选出最合适的5对引物用于杂交种的真实性鉴定。
鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的引物组合，引物组合为Primer17、Primer51、Primer125、Primer128和Primer140引物中的至少一种：
Primer17-F：5’-CCAATCCGACGATACAGGTT-3’；SEQ ID NO.1；
Primer17-R：5’-TTAGGGGGAGTTTCTTGCCT-3’；SEQ ID NO.2；或
Primer51-F：5’-TCCAAAAGGTCTCGTCTCTCA-3’；SEQ ID NO.3；
Primer51-R：5’-CACATTGGTTTGTTGGTTGC-3’；SEQ ID NO.4；或
Primer125-F：5’-CTTGTTTCCACCCTTTTCCA-3’；SEQ ID NO.5；
Primer125-R：5’-TTTCAACCACCATTAACAACCA-3’；SEQ ID NO.6；或
Primer128-F：5’-TTAGGGCTTTGGTCTTTGGA-3’；SEQ ID NO.7；
Primer128-R：5’-CACATCATGGCTTTCTCCAC-3’；SEQ ID NO.8；或
Primer140-F：5’-CGCAAATTTTTGCAATAGAGC-3’；SEQ ID NO.9；
Primer140-R：5’-TTTTTAGATTTGGGATAATTCTTACT-3’；SEQ ID NO.10。
鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的试剂或试剂盒，试剂或试剂盒含有上述的引物组合。
上述的引物组合在鉴定油菜和萝卜杂交种真实性中的应用。
一种鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的方法，包括如下步骤：
(1)油菜、萝卜及待测品种基因组DNA的提取；
(2)分别以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，用上述引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳处理，得到电泳图谱；
(4)对比待测品种以及其亲本的电泳图谱，若待测品种同时具有其亲本的特征谱带，则判定所述待测品种为真实；反之，为假。
进一步的，步骤(2)中PCR扩增的反应体系如下：
进一步的，步骤(2)中PCR扩增的反应程序如下：
进一步的，步骤(3)在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，电压150V，时间35min，上样量5μl。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明方法中用于鉴定的SSR标记能够在甘蓝型油菜、萝卜中扩增出差异明显的特征带，扩增条带清晰、非特异性片段少、重复性好。利用该SSR标记检测出既含有甘蓝型油菜又含有萝卜特有等位基因的杂合等位基因，可以快速判断二者杂交种的真实性。本发明操作简便、重复性好、通用性好、不受环境因素的影响，可准确快速的鉴定杂交子代的真实性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1中母本油菜YCY01萌芽时期图；
图2附图为本发明实施例1中父本萝卜YCL03萌芽时期图；
图3附图为本发明实施例1中杂交后代YCY01×YCL03萌芽时期图；
图4附图为本发明实施例1中母本与父本DNA提取电泳图，其中，1-6依次代表YCY01，YCY02，YCL01，YCL02，YCL03，YCL04；M代表marker；
图5附图为本发明实施例1中杂交后代(YCY01×YCL03)的DNA提取电泳图，其中，1-2依次代表YCY01，YCL03；3-8代表6株杂交后代(YCY01×YCL03)；M代表marker；
图6附图为本发明实施例2中利用引物Primer17进行杂交子代鉴定的PCR产物电泳图；其中，a为深背景图，b为浅背景图；父本为春露(YCL03)、母本为Y5A(YCY01)、3-8代表父母本的杂交后代的6株单株；
图7附图为本发明实施例2中利用引物Primer51进行杂交子代鉴定的PCR产物电泳图；其中，a为深背景图，b为浅背景图；父本为春露(YCL03)、母本为Y5A(YCY01)、3-8代表父母本的杂交后代的6株单株；
图8附图为本发明实施例2中利用引物Primer125进行杂交子代鉴定的PCR产物电泳图；父本为春露(YCL03)、母本为Y5A(YCY01)、3-8代表父母本的杂交后代的6株单株；
图9附图为本发明实施例2中利用引物Primer128进行杂交子代鉴定的PCR产物电泳图；父本为春露(YCL03)、母本为Y5A(YCY01)、3-8代表父母本的杂交后代的6株单株；
图10附图为本发明实施例2中利用引物Primer140进行杂交子代鉴定的PCR产物电泳图；父本为春露(YCL03)、母本为Y5A(YCY01)、3-8代表父母本的杂交后代的6株单株；。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
供试材料为油菜和萝卜。油菜品种(母本)为甘蓝型油菜“Y5A”(编号为YCY01)、“Y4-2A”(编号为YCY02)，均为江苏沿海地区农业科学研究所自育油菜核不育品种。萝卜品种(父本)为吉美红皮(编号为YCL01)、牛埔杙(编号为YCL02)、春露(编号为YCL03)、短叶十三(编号为YCL04)，均为引进中国油料作物研究所萝卜高抗根肿病品种。
实施例1
1.甘蓝型油菜、萝卜及其杂交F1代种子的萌发培养
分别挑选健康饱满的甘蓝型油菜和萝卜及其杂交F1代种子，用蒸馏水洗净后，置于润湿的贴有两层滤纸的玻璃培养皿内，并放在28℃光照培养箱内萌发，有光无光均可。3-4d后将萌芽的种子转移至吸水的海绵孔内继续培养，15d后即可采收，用于基因组DNA的提取。
三份样品种子萌发率都在80％以上，亲本及其杂交种都成功培养成苗，其中收获亲本植株各4g、8株F1代杂交种。
母本、父本及其杂交F1代种子的萌芽时期图如图1-3所示。
2.甘蓝型油菜、萝卜及其杂交F1代基因组DNA的提取
提取甘蓝型油菜、萝卜及其杂交F1代的基因组DNA，基因组DNA的提取使用杭州博日的Biospin植物基因组DNA提取试剂盒，产品编号为BSC13S1，具体方法参见提取试剂盒说明书。
提取得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，验证DNA纯度，具体结果见图4、图5。
3.甘蓝型油菜、萝卜基因组测序
对甘蓝型油菜和萝卜进行基因组测序。
4.SSR引物筛选
从全基因组中的SSR位点及其设计的相对应引物里筛选了150对引物，利用这150对引物与甘蓝型油菜(母本)、萝卜(父本)及8株(YCY01×YCL01、YCY01×YCL02、YCY01×YCL03、YCY01×YCL04、YCY02×YCL01、YCY02×YCL02、YCY02×YCL03、YCY02×YCL04、)杂交F1代基因组DNA进行PCR扩增。
先用合成的150对引物与亲本基因组DNA进行扩增，初步筛选出在父母本间能扩增出清晰的特异性条带的引物；再用筛选出的引物同时与亲本和杂交F1代DNA进行PCR扩增，挑选出能在杂交F1代表现出同时具有父母本特异性条带的合适引物，进行杂交种的真实性鉴定。
实验具体过程步骤如下：
(1)PCR反应体系(20μl)
(2)上述体系添加反应液后，按以下程序进行PCR扩增：
(3)PCR反应结束后进行10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压150V，时间35min，上样量5μl。
最后筛选出了5对引物，5对引物序列如下：
Primer17-F：5’-CCAATCCGACGATACAGGTT-3’；SEQ ID NO.1；
Primer17-R：5’-TTAGGGGGAGTTTCTTGCCT-3’；SEQ ID NO.2；
Primer51-F：5’-TCCAAAAGGTCTCGTCTCTCA-3’；SEQ ID NO.3；
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Primer125-F：5’-CTTGTTTCCACCCTTTTCCA-3’；SEQ ID NO.5；
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Primer128-F：5’-TTAGGGCTTTGGTCTTTGGA-3’；SEQ ID NO.7；
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Primer140-F：5’-CGCAAATTTTTGCAATAGAGC-3’；SEQ ID NO.9；
Primer140-R：5’-TTTTTAGATTTGGGATAATTCTTACT-3’；SEQ ID NO.10。
实施例2引物与亲本、杂交F1代PCR扩增
利用实施例1筛选出的引物进行杂交子代鉴定，具体步骤如下：
(1)油菜、萝卜及待测品种基因组DNA的提取：
基因组DNA的提取使用杭州博日的Biospin植物基因组DNA提取试剂盒，产品编号为BSC13S1，具体方法参见提取试剂盒说明书。
(2)分别以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，用Primer17、Primer51、Primer125、Primer128和Primer140引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物；PCR反应具体参数同实施例1；
(3)将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳处理，得到电泳图谱；具体处理参数同实施例1；
(4)对比待测品种以及其亲本的电泳图谱，PCR产物电泳图如图6-10所示。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 江苏沿海地区农业科学研究所
<120> 鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的引物组合及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttttagatt tgggataatt cttact 26
Claims (4)
1.鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的引物组合，其特征在于，所述引物组合为Primer17、Primer51、Primer125、Primer128和Primer140引物：
Primer17-F：5’-CCAATCCGACGATACAGGTT-3’；SEQ ID NO.1；
Primer17-R：5’-TTAGGGGGAGTTTCTTGCCT-3’；SEQ ID NO.2；
Primer51-F：5’-TCCAAAAGGTCTCGTCTCTCA-3’；SEQ ID NO.3；
Primer51-R：5’-CACATTGGTTTGTTGGTTGC-3’；SEQ ID NO.4；
Primer125-F：5’-CTTGTTTCCACCCTTTTCCA-3’；SEQ ID NO.5；
Primer125-R：5’-TTTCAACCACCATTAACAACCA-3’；SEQ ID NO.6；
Primer128-F：5’-TTAGGGCTTTGGTCTTTGGA-3’；SEQ ID NO.7；
Primer128-R：5’-CACATCATGGCTTTCTCCAC-3’；SEQ ID NO.8；
Primer140-F：5’-CGCAAATTTTTGCAATAGAGC-3’；SEQ ID NO.9；
Primer140-R：5’-TTTTTAGATTTGGGATAATTCTTACT-3’；SEQ ID NO.10；
油菜品种为甘蓝型油菜“Y5A”、“Y4-2A”；
萝卜品种为吉美红皮、牛埔杙、春露、短叶十三。
2.鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒含有权利要求1所述的引物组合。
3.权利要求1所述的引物组合在鉴定油菜和萝卜杂交种真实性中的应用；
油菜品种为甘蓝型油菜“Y5A”、“Y4-2A”；
萝卜品种为吉美红皮、牛埔杙、春露、短叶十三。
4.一种鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）油菜、萝卜及待测品种基因组DNA的提取；
（2）分别以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物；
（3）将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳处理，得到电泳图谱；
（4）对比待测品种以及其亲本的电泳图谱，若待测品种同时具有其亲本的特征谱带，则判定所述待测品种为真实；反之，为假；
油菜品种为甘蓝型油菜“Y5A”、“Y4-2A”；
萝卜品种为吉美红皮、牛埔杙、春露、短叶十三。
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2022
- 2022-02-24 CN CN202210172437.8A patent/CN114438251B/zh active Active
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