JP2005229849A - 休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーおよびその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】 オオムギ等のイネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーとその利用法を提供する。
【解決手段】 オオムギの詳細な連鎖地図を作成し、ＱＴＬ解析を行うことにより、オオムギ５Ｈ染色体上に座乗する休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する二組の遺伝子マーカーを見出した。
【選択図】 なし

Description

本発明は、新規遺伝マーカーおよびその利用法に関するものであり、特に、オオムギ等のイネ科植物における休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーと、その利用に関するものである。

収穫したばかりの種子は休眠性を持っており、すぐには発芽しないことが知られている。野生型のオオムギではこの傾向が強く、栽培種でもある程度の休眠性を持っている。休眠性が全くないと、収穫前の降雨によって種子が穂についたまま発芽してしまう穂発芽という障害が発生する。すなわち、休眠性は穂発芽に対する抵抗性因子として働く形質である。しかしながら、休眠性が深すぎると、圃場で翌年まで発芽せずに雑草化したり、ビール醸造の麦芽を作る際に芽が出ないという問題が生じる。したがって、適度の休眠性を有するように改変することは、重要な育種目標となっている。

従来、作物の育種は目標形質を有する栽培品種や野生種等を交配し、多数の個体を実際に栽培して目標形質を有する個体を選抜し、当該目標形質を遺伝的に固定化しなければならず、広大な圃場や多大な人力、相当の年月が必要であった。例えば、休眠性を目標形質とした場合には、選抜対象集団を栽培し、穂発芽するか否かを調査したり、休眠性が深すぎることがないかを調査した後に、選抜すべき個体を特定しなければならなかった。また、目標形質が栽培環境因子に影響を受けやすい形質であれば、選抜個体が発現している目標形質が遺伝子の表現型であるか否かの判定が困難であった。

そこで、近年は育種期間の短縮、労働力および圃場面積の縮減、有用遺伝子の確実な選抜を図るため、遺伝マーカーを指標とした選抜による育種法が用いられるようになってきた。このような遺伝マーカーによる育種では、マーカーの遺伝子型により幼苗段階で選抜が可能となり、目標形質の有無の確認も容易となる。したがって、遺伝マーカーを利用すれば効率的な育種が実現可能である。そして、遺伝マーカーを利用した育種を実現するためには、目標形質に強く連鎖した遺伝マーカーの開発が必須となる。

ところで、農業上重要な形質の多くは、雑種後代で連続的な変異を示すものが多い。このような形質は、時間や長さなどの量的な尺度で測定されるので量的形質と呼ばれている。上記休眠性も量的形質の１つであることが知られている。量的形質は一般に、単一主働遺伝子支配の形質ではなく、複数の遺伝子の作用によって決定されている場合が多い。作物の育種において改良対象とされる形質の多く、例えば収量や品質・食味等はこの量的形質であることが多い。

このような量的形質を司る遺伝子が染色体上に占める遺伝的な位置をＱＴＬ（Quantitative Trait Loci、量的形質遺伝子座）と称する。ＱＴＬを推定する方法として、ＱＴＬの近傍に存在する遺伝マーカーを利用するＱＴＬ解析が用いられる。１９８０年代後半にＤＮＡマーカーが登場すると、ＤＮＡマーカー利用による詳細な連鎖地図作成が大きく進み、その地図に基づいて多くの生物でＱＴＬ解析が行われるようになった。

以上のように、目標形質に連鎖する遺伝マーカーの開発は、染色体全体をカバーできる詳細な連鎖地図に基づいた精度の高いＱＴＬ解析により可能となり、得られた遺伝マーカーを利用することにより、効率的な育種が実現できるといえる。

上記遺伝マーカーに関する技術としては、オオムギを例に挙げると、１）オオムギにアルミニウム耐性を付与する遺伝子に連鎖する遺伝マーカーとその利用に関する技術（特許文献１参照）や、２）オオムギ染色体由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規なプライマーセット（特許文献２参照）とその利用に関する技術等が、本発明者らによって提案されている。
特開２００２−２９１４７４号公報（２００２（平成１４）年１０月８日公開） 特開２００３−１１１５９３号公報（２００３（平成１５）年４月１５日公開）

上述のように、イネ科植物の休眠性は穂発芽の抵抗性因子として働く形質であるため、休眠性の改変は重要な育種目標の１つである。しかし、休眠性は複数の遺伝子座が関与する場合が多いため、実際に休眠性を調査する選抜方法では休眠性に関与する遺伝子（遺伝子座）を確実に選抜しているか否かを確認することが困難である。そこで休眠性を改変した植物の育種には遺伝マーカーを利用することが非常に有効である。休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーが開発され、利用可能となれば、休眠性改変植物の育種の大幅な効率化を実現することが可能となる。

本発明は、上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、イネ科植物、特にオオムギにおける休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する新規遺伝マーカーと、その代表的な利用法とを提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、発明者らが有するオオムギＥＳＴ配列に基づいてプライマーセットを設計し、当該プライマーセットにより増幅されるオオムギゲノム断片の多型の有無により遺伝マーカー（ＤＮＡマーカー）を開発した。さらに、醸造用オオムギ「はるな二条」と野生オオムギ「Ｈ６０２」の交雑Ｆ１から作出した倍加半数体（doubled haploid、以下「ＤＨ」と略記する。）集団を材料として、上記遺伝マーカー間の連鎖を検出して、当該ＤＨ系統の連鎖地図を作成し、この連鎖地図に基づいて休眠性に関与する遺伝子座のＱＴＬ解析を行った。その結果、休眠性に関与する遺伝子座を５Ｈ染色体上に２つ検出した。本発明者等はさらに解析を進め、これら休眠性に関与する遺伝子座にそれぞれ連鎖する新規遺伝マーカーを見いだした。すなわち本発明は、上記新規知見により完成されたものであり、以下の発明を包含する。

すなわち本発明にかかる遺伝マーカーは、イネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーであって、上記休眠性に関与する遺伝子座から０ないし５センチモルガンの範囲内の距離に位置することを特徴としている。上記遺伝マーカーは、休眠性に関与する遺伝子座に強連鎖するため、当該遺伝マーカーと休眠性に関与する遺伝子座間で分離して組み換えが起こる確率は低い。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、例えば休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、休眠性改変イネ科植物の生産（作出）・判別等を行うことが可能となる。

さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、上記イネ科植物がムギ類であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギ・コムギ等のムギ類において休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、休眠性改変ムギ類の生産（作出）・判別等を行うことが可能となる。

さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ムギ類がオオムギであることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギにおいて休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、休眠性改変オオムギの生産（作出）・判別等を行うことが可能となる。

さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ゲノムＤＮＡが５Ｈ染色体であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギの５Ｈ染色体上に存在する休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、休眠性改変オオムギの生産（作出）・判別等を行うことが可能となる。

さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第一プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、休眠性改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。

また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第二プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、休眠性改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。

また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第三プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、休眠性改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。

また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第四プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、休眠性改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。

一方、本発明にかかるＤＮＡ断片の単離方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを用いて休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することを特徴としている。本発明にかかる遺伝マーカーは休眠性に関与する遺伝子座に強連鎖するものであり、上記遺伝マーカーを目標にクローニングを行えば、休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を容易に単離することが可能となる。

また本発明にかかる休眠性改変イネ科植物の生産方法は、上記本発明にかかるＤＮＡ断片の単離方法により得られた上記休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を、イネ科植物のゲノムＤＮＡに導入することを特徴としている。上記イネ科植物はムギ類であることが好ましく、オオムギであることがより好ましい。当該生産方法により、休眠性改変イネ科植物を生産することが可能となる。また、当該生産方法により得られた休眠性改変イネ科植物も、本発明に含まれる。

また本発明にかかる休眠性改変イネ科植物を選抜する方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを指標として、休眠性改変イネ科植物を選抜する方法である。上記本発明にかかる遺伝マーカーは、休眠性に関与する遺伝子座に強連鎖するため、当該遺伝マーカーと休眠性に関与する遺伝子座間で分離して組み換えが起こる確率が非常に低い。それゆえ上記遺伝マーカーを検出することによって、試験対象植物における休眠性に関与する遺伝子座の遺伝子型を容易に判別することができ、選抜すべき個体を容易に見出すことが可能となる。

本発明にかかる遺伝マーカーは、休眠性に関与する遺伝子座と連鎖するため、当該遺伝マーカーを指標として休眠性を改変したイネ科植物の育種を可能とする。したがって、休眠性改変植物の効率的な育種が実現できるという効果を奏する。より具体的には、幼苗段階で目的個体を選抜できるため、実際に植物個体の休眠性を調査した後に目的の個体を選抜する必要がなくなり、育種期間を短縮できるという効果を奏する。また、複数の遺伝子座を同時に選抜できるために、観察によって選抜するよりも、確実に目的とする遺伝子型を得ることができる。さらに、労働力および圃場面積を縮減できるという効果を奏する。

また、本発明にかかる遺伝マーカーを指標として選抜育種を行えば、栽培環境因子による表現型への影響を排除することが可能となる。したがって、有用遺伝子（遺伝子座）の確実な選抜ができるという効果を奏する。

さらに、上記遺伝マーカーを指標として選択的に育種された休眠性改変植物は、穂発芽に対する抵抗性を有しているという効果を奏する。

本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。

本発明は、イネ科植物における休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーとその利用の一例とに関するものである。以下、本発明にかかる遺伝マーカー、本発明の利用の一例について説明する。

（１）本発明にかかる遺伝マーカー
本発明にかかる遺伝マーカーは、イネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、休眠性に関与する遺伝子座に連鎖しているものであればよい。イネ科植物としてはムギ類であることが好ましく、オオムギであることが特に好ましい。イネ科植物とは、オオムギ属、コムギ属、イネ等の植物であればよく、特に限定されるものではない。また、ムギ類とは、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、ライコムギ、エンバク等を意味する。

休眠性とは、収穫後の種子が一定期間発芽しない性質を表す形質を意味する。休眠性の調査は、例えば、収穫から一定期間後の種子の発芽率を調査すること等により行うことができる。休眠性が全くないと穂発芽という障害が発生し、逆に休眠性が深すぎると、圃場で翌年まで発芽せずに雑草化したり、ビール醸造の麦芽を作る際に芽が出ないという問題が生じる。したがって、適度な休眠性を有している品種が、栽培品種として好ましい。そのため、休眠性の改変は重要な育種目標の１つである。

休眠性は量的形質であり、複数の遺伝子座により決定される形質である。量的形質はＱＴＬ解析により当該量的形質に関与している遺伝子座の染色体上の位置を推定することができる。以下、本発明者らがオオムギにおいて開発した休眠性に関与する遺伝子座と連鎖する遺伝マーカーについて詳細に説明する。なお、本発明に係る遺伝マーカーはこれらに限定されるものではない。

本発明者らは、醸造用オオムギ「はるな二条」と野生オオムギ「Ｈ６０２」との交雑Ｆ１から作出した倍加半数体（ＤＨ）集団を用いて、高密度連鎖地図を作成した。すなわち、本発明者らが有するオオムギＥＳＴ（expressed sequence tag）配列に基づいて設計されたプライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを増幅し、「はるな二条」と「Ｈ６０２」との間に増幅断片長の多型を有するものや、増幅断片長の制限酵素による消化のパターンが異なる多型を有するものを特定し、これらのＤＮＡマーカーを含む約５００遺伝子座からなる連鎖地図を構築した。この連鎖地図および本発明者らが測定した上記ＤＨ集団９３個体についての休眠性のデータに基づいて、休眠性に関与する遺伝子座のＱＴＬ解析を行った。その結果、休眠性に関与する遺伝子座を５Ｈ染色体上に２つ検出した。本発明に係る遺伝マーカーは５Ｈ染色体上に座乗する２つの休眠性に関与する遺伝子座のうち一方の休眠性に関与する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する２つの遺伝マーカーと、他方の休眠性に関与する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する２つの遺伝マーカーである。発明者らは５Ｈ染色体上に検出された一方の休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーを「ｋ０４６１８」および「ｋ００２０４」、他方の休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーを「ｋ００１０１」および「ｋ０６４７２」と命名した。

ｋ０４６１８は、
ＡＴＣＡＧＧＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＡＧＧ（配列番号１）に示される塩基配列を有するプライマー、および
ＡＧＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＣＡＣＡＡＧＡＣ（配列番号２）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅されるＤＮＡマーカーであり、上記５Ｈ染色体上に検出された休眠性に関与する遺伝子座から短腕側に２ないし４．５センチモルガン（以下ｃＭと表示する）の距離に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ESTクローン名：bah62n12、配列番号１５）に基づいて設計されている。図１に当該ＥＳＴの塩基配列を示した。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号１）および上記プライマー配列（配列番号２）の相補配列である。はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間に断片長多型があり、はるな二条のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される断片のサイズは約６００ｂｐ、Ｈ６０２のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される断片のサイズは約５５０ｂｐと異なる。図２に第一プライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅した断片の電気泳動像を示した。図２（ａ）、（ｂ）とも両端は分子量マーカーである。図２（ａ）は、左端（分子量マーカーを除く）から順に、はるな二条、Ｈ６０２、はるな二条とＨ６０２の交雑Ｆ１、ＤＨ集団の１〜４５の増幅断片である。図２（ｂ）は、左端（分子量マーカーを除く）から順に、ＤＨ集団の４６〜９３の増幅断片である。図２から明らかなように、増幅産物のサイズを確認することにより、対象個体が当該５Ｈ染色体に座乗する休眠性に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。

ｋ００２０４は、
ＡＧＣＧＡＴＡＡＧＴＡＡＣＣＧＡＧＣＣＡ（配列番号３）に示される塩基配列を有するプライマー、および
ＧＧＡＧＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡ（配列番号４）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記５Ｈ染色体上に検出された休眠性に関与する遺伝子座から長腕側に０ないし２．５ｃＭの距離に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ESTクローン名：baak21h06、配列番号１６）に基づいて設計されている。図３に当該ＥＳＴの塩基配列を示した。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号３）および上記プライマー配列（配列番号４）の相補配列である。はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にＳＮＰ（single nucleotide polymorphisms；一塩基多型）がある。図４に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号９）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号１０）である。□で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＨｈａＩの認識配列（GCGC）を示す。図４から明らかなように、はるな二条の増幅産物は制限酵素ＨｈａＩの認識配列（GCGC）を有しているためＨｈａＩで切断されるが、Ｈ６０２の増幅産物は上記認識配列部分のＣがＧに変異しているため（GCGG）制限酵素ＨｈａＩで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーｋ００２０４は、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーであり、上記第二プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＨｈａＩ切断により、対象個体が当該５Ｈ染色体に座乗する休眠性に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。

ｋ００１０１は、
ＧＣＧＧＴＧＣＴＴＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴＡ（配列番号５）に示される塩基配列を有するプライマー、および
ＣＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＴＧＣＣＡＡＧＴ（配列番号６）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記５Ｈ染色体上に検出された休眠性に関与する遺伝子座から短腕側に約３．９ｃＭの距離に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ESTクローン名：baak15n22、配列番号１７）に基づいて設計されている。図５に当該ＥＳＴの塩基配列を示した。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号５）および上記プライマー配列（配列番号６）の相補配列である。はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にＳＮＰがある。図６に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号１１）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号１２）である。□で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＨｈａＩの認識配列（GCGC）を示す。図６から明らかなように、はるな二条の増幅産物は制限酵素ＨｈａＩの認識配列（GCGC）を有しているためＨｈａＩで切断されるが、Ｈ６０２の増幅産物は上記認識配列部分のＧがＴに変異しているため（GCTC）制限酵素ＨｈａＩで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーｋ００１０１は、ＣＡＰＳマーカーであり、上記第三プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＨｈａＩ切断により、対象個体が当該５Ｈ染色体に座乗する休眠性に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。

ｋ０６４７２は、
ＴＴＡＡＣＣＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＧＧＡＡ（配列番号７）に示される塩基配列を有するプライマー、および
ＧＧＣＡＡＴＴＴＡＣＧＣＴＣＴＴＧＣＴＣ（配列番号８）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記５Ｈ染色体上に検出された休眠性に関与する遺伝子座から長腕側に約０．８ｃＭの距離に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ESTクローン名：BaAK28L22、配列番号１８）に基づいて設計されている。図７に当該ＥＳＴの塩基配列を示した。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号７）および上記プライマー配列（配列番号８）の相補配列である。はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にＳＮＰがある。図８に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号１３）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号１４）である。□で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＡｆａＩの認識配列（GTAC）を示す。図８から明らかなように、Ｈ６０２の増幅産物は制限酵素ＡｆａＩの認識配列（GTAC）を有しているためＡｆａＩで切断されるが、はるな二条の増幅産物は上記認識配列部分のＣがＧに変異しているため（GTAG）制限酵素ＡｆａＩで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーｋ０６４７２は、ＣＡＰＳマーカーであり、上記第四プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＡｆａＩ切断により、対象個体が当該５Ｈ染色体に座乗する休眠性に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。

ここで、１センチモルガン（１ｃＭ）とは、２つの遺伝子座の間に１％の頻度で交叉が起きるときの、両遺伝子座間の距離を表す単位である。

ところで、増幅に際して鋳型として用いられるゲノムＤＮＡは、植物体より従来公知の方法で抽出可能である。具体的には、植物体からゲノムＤＮＡを抽出するための一般法（Murray,M.G. and W.F.Thompson(1980) Nucleic Acids Res.8:4321-4325. など参照）が好適な例として挙げられる。また、上記のゲノムＤＮＡは、根、茎、葉、生殖器官など、オオムギの植物体を構成するいずれの組織を用いても抽出可能である。また、場合によってはオオムギのカルスから抽出してもよい。なお、上記生殖器官には、花器官（雄性・雌性生殖器官を含む）や種子も含まれる。ゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、オオムギの幼苗期の葉を用いて行われる。この理由としては、組織の摩砕が比較的容易であり、多糖類などの不純物の混合割合が比較的少なく、また、種子から短期間で育成可能である点が挙げられる。さらに、幼苗段階で個体の選抜が可能となり、育種期間を大幅に短縮できる点が挙げられる。

またオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーの組み合わせを用いて増幅する方法は、従来公知のＤＮＡ増幅法を採用することができる。一般には、ＰＣＲ法（ポリメラ−ゼ連鎖反応法）や、その改変法が用いられる。ＰＣＲ法や、その改変法を用いる際の反応条件は特に限定されるものではなく、通常と同様の条件下で増幅することができる。

（２）本発明の利用
〔休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の単離方法〕
上述のとおり本発明にかかる遺伝マーカー（ｋ０４６１８、ｋ００２０４）は、オオムギ５Ｈ染色体上に検出された２つの休眠性に関与する遺伝子座のうち、一方の遺伝子座に連鎖するものであり、本発明にかかる遺伝マーカー（ｋ００１０１、ｋ０６４７２）は、他方の遺伝子座に連鎖するものである。よって、ｋ０４６１８、ｋ００２０４の遺伝マーカーを用いることによってオオムギ５Ｈ染色体上に検出された２つの休眠性に関与する遺伝子座のうち、一方の遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することができ、ｋ００１０１、ｋ０６４７２の遺伝マーカーを用いることによって他方の遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することができる。

単離とは、目的のＤＮＡ断片、すなわち休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片をクローニングすることを意味することはいうまでもないが、広義には交雑Ｆ１集団から戻し交配等により、両親のうち一方の休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を有する個体を選抜し、その遺伝子座領域のみを目的品種に導入する同質遺伝子系統の作製も単離に含まれる。

本発明にかかる遺伝マーカーを用いて休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離する方法としては特に限定されるものではないが、例えば次のような方法を挙げることができる。

オオムギでは本発明者らが開発を進めている「はるな二条」を含めて、ゲノムＤＮＡのＢＡＣライブラリーが２種類作成されており、現在複数のＢＡＣライブラリーが開発中である。そこで、このようなＢＡＣライブラリーを用いて、従来公知のマップベースクローニングの手法にしたがって、休眠性に関与する遺伝子座と当該遺伝子座に連鎖する本発明の遺伝マーカーとで当該マーカーを含むＢＡＣクローンを同定し、そこからＢＡＣのコンティグを作成して塩基配列を確定することにより、最終的に休眠性に関与する遺伝子座に到達することができる。

また、上述のように、交雑Ｆ１に一方の親を戻し交配することにより、他方の親の休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を目的品種に導入して（広義の）単離をすることができる。

なお、上記方法をはじめとする休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離する際には、目的とする休眠性に関与する遺伝子座に対してなるべく近傍に座乗する遺伝マーカーを選択して用いることが好ましい。目的とする休眠性に関与する遺伝子座と遺伝マーカーの間で組み換えが起こる確率がより低くなり、より確実に休眠性に関与する遺伝子座を含む断片を単離することができるからである。

〔休眠性改変植物の生産方法、および当該生産方法によって得られた休眠性改変植物〕
上記本発明にかかる休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の単離方法によって得られた休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片をイネ科植物のゲノムＤＮＡに導入することによって、休眠性改変イネ科植物を生産することが可能である。イネ科植物としてはムギ類であることが好ましく、オオムギであることが特に好ましい。また、例えば、オオムギから単離された休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片をオオムギ以外のイネ科植物に導入することも可能であり、同一属間のみでの単離、導入に限定されるものではない。

上記ＤＮＡ断片を導入する方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。より具体的には、例えばアグロバクテリウムまたはパーティクルガンを用いてイネ科植物のゲノムＤＮＡに導入することによって生産すればよく、これにより、休眠性改変品種が得られることとなる。例えば、雑誌The Plant Journal(1997) 11(6),1369-1376 には、Sonia Tingay等により、Agrobacterium tumefaciens を用いてオオムギを形質転換する方法が開示されており、この方法を利用して形質転換オオムギを生産可能である。

また、目的とする休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を有する植物個体と、当該ＤＮＡ断片を導入しようとする植物個体との交雑により、休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を、植物に導入することも可能である。この方法では、交雑が可能である限りにおいて、他の種や属の植物が有する休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の導入が可能である。

本発明にかかる休眠性改変植物は、上記本発明にかかる生産方法により得られるものである。当該休眠性改変植物は、休眠性を深くする表現型を有する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を導入した場合には元の品種の休眠性より深い休眠性を有する品種となり、休眠性を浅くする表現型を有する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を導入した場合には元の品種の休眠性より浅い休眠性を有する品種となる。例えば、休眠性のほとんどない品種に休眠性を深くする表現型を有する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を導入すれば、穂発芽を生じない品種を得ることができる。また、休眠性の深い品種に休眠性を浅くする表現型を有する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を導入すれば、収穫後短期間でビール醸造用の麦芽を作ることができるようになり、利用価値の高い品種を得ることができる。

〔休眠性改変イネ科植物の選抜方法〕
本発明にかかる休眠性改変イネ科植物の選抜方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを指標として休眠性改変イネ科植物を選抜する方法であればよく、その他の工程、条件、材料等は特に限定されるものではない。例えば、従来公知の作物育種法を利用することができる。

より具体的には、例えば、交配等により作出した植物のゲノムＤＮＡを抽出し、本発明に係る遺伝マーカーの遺伝子型を指標として植物を選抜する方法が挙げられる。遺伝マーカーを検出する手段としては、例えば、対象とする植物から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として上記第一ないし第四プライマーセットのいずれかを用いて増幅したＤＮＡ断片について、断片長または断片の制限酵素消化パターンの観察を挙げることができる。

なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

〔使用植物〕
醸造用オオムギ「はるな二条」（Hordeum vulgare ssp. vulgare variety Harunanijo）と野生オオムギ「Ｈ６０２」（Hordeum vulgare ssp. spontaneum H602）との交配から得られたＦ１の花粉を培養して半数体（haploid）を育成し、自然倍加した倍加半数体（doubled haploid）９３個体からなる集団を使用した。

〔連鎖地図の作成〕
本発明者らが有するオオムギＥＳＴ配列約１２万をphredによって再度ベースコールした後、quality score 20でトリミングし、ベクターマスキングを行って３’端約６万配列を得た。これらの配列からphrapによってcontig 8,753、 singlet 6,686からなるUnigeneを作成した。プライマー作成ソフトPrimer3によって、400bpを中心として150-500bpのcDNA配列を増幅するプライマーセット約11,000を作成した。このうち約5,100のプライマーセットについて、はるな二条とＨ６０２との間に増幅されるゲノム断片の多型の有無を検出するために、それぞれのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によってバンドの有無、バンド数、バンドサイズを調査し、マーカーとなり得るものを選択した。さらに、バンドサイズに多型のない場合は、増幅断片をダイレクトシークエンスすることにより塩基配列の差異を検出し、３９種類の制限酵素に対してＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）化が可能なものをマーカーとして選択した。

以上により、上記はるな二条とＨ６０２との交雑Ｆ１由来のＤＨ集団について、合計４９９遺伝子座のマーカーからなる連鎖地図を構築した。この連鎖地図の平均マーカー密度は3.0cM/locus、全長は1,470cMである。

〔遺伝子型の判定〕
ＤＨ集団各個体の遺伝子型の判定は、上記ＤＨ集団の連鎖地図にマッピングされたマーカーを用いて行った。すなわち、各個体の新鮮な葉の組織から分離したＤＮＡを鋳型として、ＥＳＴ配列に基づいて設計したプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。断片長多型マーカーについてはＰＣＲ産物の電気泳動により遺伝子型を判定した。ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーについては、ＰＣＲ産物を制限酵素で消化し、電気泳動により遺伝子型を判定した。

〔休眠性の調査〕
ＤＨ集団の各個体から得られた種子について、５週間または１０週間２５℃の条件で休眠を覚醒させた後、種子を発芽させ、４日後の発芽粒数を調査してその割合を各ＤＨ個体の発芽率（％）とし，その値を休眠性として用いた。覚醒期間５週間後の各ＤＨ個体の発芽率の分布を図９（ａ）に、覚醒期間１０週間後の各ＤＨ個体の発芽率の分布を図９（ｂ）にそれぞれ示した。図５において、白矢印ははるな二条、黒矢印はＨ６０２の発芽率を示し、縦軸は個体数を横軸は発芽率（％）を示す。図９から明らかなように、はるな二条は５週間または１０週間の覚醒によりほぼ１００％の発芽率を示し、Ｈ６０２はいずれの場合も発芽率は０であった。一方ＤＨ集団の各個体は、０〜１００％の間に連続的に分布した。

〔ＱＴＬ解析〕
ＱＴＬ解析のアルゴリズムには、シンプルインターバルマッピング（simple interval mapping、以下「ＳＩＭ」と略記する。）とコンポジットインターバルマッピング（composite interval mapping以下「ＣＩＭ」と略記する。）を用い、解析ソフトウエアにはそれぞれ、ＭＡＰＭＡＫＥＲ／ＱＴＬとＱＴＬ Ｃａｒｔｏｇｒａｐｈｅｒを用いた。ＬＯＤスコアの閾値を２に設定し、ＬＯＤスコアが２を超えた場合に当該２つのマーカー区間内の最もＬＯＤの大きな位置にＱＴＬの存在を推定した。

〔結果〕
結果を表１に示した。表１から明らかなように、覚醒期間５週間後のデータからＳＩＭにより休眠性に関与する１つのＱＴＬが検出された。このＱＴＬは５Ｈ染色体上に存在し、遺伝マーカーk04618から2.6cMの位置で遺伝マーカーk00204に挟まれる位置に座乗し、ＬＯＤスコアは19.8である。このＱＴＬで表現型の分散の71.0％を説明できる。また、このＱＴＬの存在で５週間の覚醒処理により68.1％の種子が発芽する。さらに、覚醒期間１０週間後のデータからＳＩＭにより休眠性に関与する１つのＱＴＬが検出された。また、ＣＩＭにより休眠性に関与する１つのＱＴＬが検出された。ＳＩＭにより検出されたＱＴＬは５Ｈ染色体上に存在し、遺伝マーカーk04618から3.9cMの位置で遺伝マーカーk00204に挟まれる位置に座乗し、ＬＯＤスコアは24.6である。このＱＴＬで表現型の分散の74.7％を説明できる。また、このＱＴＬの存在で１０週間の覚醒処理により70.4％の種子が発芽する。ＣＩＭにより検出されたＱＴＬも５Ｈ染色体上に存在し、遺伝マーカーk00101から3.9cMの位置で遺伝マーカーk06472に挟まれる位置に座乗し、ＬＯＤスコアは4.2である。このＱＴＬで表現型の分散の34.8％を説明できる。また、このＱＴＬの存在で１０週間の覚醒処理により56.9％の種子が発芽する。

本発明にかかる遺伝マーカーは、休眠性改変植物の育種、休眠性に関与する遺伝子の単離等に用いることができ、育種の効率化に大きく貢献することが期待される。したがって、広く農業全般に利用可能であり、さらには、オオムギ等を原料とする食品産業においても有効である。また、生物分野の基礎研究、特に植物ゲノム研究等にも利用可能である。

オオムギＥＳＴクローン：bah62n12の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。 （ａ）、（ｂ）は遺伝マーカーｋ０４６１８における、Ｈ６０２とはるな二条との間の断片長多型を示す電気泳動画像である。（ａ）は、左から、はるな二条、Ｈ６０２、はるな二条とＨ６０２の交雑Ｆ１、ＤＨ集団１〜４５の増幅断片の電気泳動画像であり、（ｂ）は、左から、ＤＨ集団４６〜９３の増幅断片の電気泳動画像である。 オオムギＥＳＴクローン：baak21h06の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。 遺伝マーカーｋ００２０４における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。 オオムギＥＳＴクローン：baak15n22の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。 遺伝マーカーｋ００１０１における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。 オオムギＥＳＴクローン：BaAK28L22の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。 遺伝マーカーｋ０６４７２における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。 図９（Ａ）は覚醒期間５週間後のＤＨ集団各個体の休眠性の分布を示すグラフであり、図９（Ｂ）は覚醒期間１０週間後のＤＨ集団各個体の休眠性の分布を示すグラフである。

Claims (14)

1. イネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、休眠性に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーであって、
   上記休眠性に関与する遺伝子座から０ないし５センチモルガンの範囲内の距離に位置することを特徴とする遺伝マーカー。
2. 上記イネ科植物がムギ類であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝マーカー。
3. 上記ムギ類がオオムギであることを特徴とする請求項２に記載の遺伝マーカー。
4. 上記ゲノムＤＮＡが５Ｈ染色体であることを特徴とする請求項３に記載の遺伝マーカー。
5. 配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝マーカー。
6. 配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝マーカー。
7. 配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝マーカー。
8. 配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝マーカー。
9. 請求項１ないし８のいずれか１項に記載の遺伝マーカーを用いて休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することを特徴とするＤＮＡ断片の単離方法。
10. 請求項９に記載の単離方法により得られた上記休眠性に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を、イネ科植物のゲノムＤＮＡに導入することを特徴とする休眠性改変イネ科植物の生産方法。
11. 上記イネ科植物がムギ類であることを特徴とする請求項１０に記載の休眠性改変イネ科植物の生産方法。
12. 上記ムギ類がオオムギであることを特徴とする請求項１１に記載の休眠性改変イネ科植物の生産方法。
13. 請求項１０ないし１２のいずれか１項に記載の休眠性改変イネ科植物の生産方法によって得られた休眠性改変イネ科植物。
14. 請求項１ないし８のいずれか１項に記載の遺伝マーカーを指標として、休眠性改変イネ科植物を選抜する方法。

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