WO2007020983A1 - オオムギｅｓｔ配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用いるコムギの育種方法 - Google Patents

オオムギｅｓｔ配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用いるコムギの育種方法 Download PDF

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Kazuyoshi Takeda
Kazuhiro Sato
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for breeding wheat using a diploid wheat genetic map prepared using a barley EST sequence.
  • QTL Quant titative Trait Loci
  • RFLP markers obtained by hybridization
  • PCR-based for genetic map construction The use of markers has been promoted.
  • RAPDs see, for example, Non-Patent Document 2
  • AFLPs see, for example, Non-Patent Document 3
  • SSRs see, for example, Non-Patent Document 4.
  • the genome structure of wheat and barley can also be compared in part by the genetic map, but a new genetic map has been required to make a more detailed comparison.
  • using a wheat genetic map and a barley genetic map constructed with a common marker would enable more detailed comparisons.
  • the inventors have a high-density genetic map with the above-mentioned barley EST marker. Since we have a lot of useful information obtained from the high-density genetic map, we conceived the construction of a wheat genetic map using the barley E ST sequence. If a wheat genetic map can be constructed using the barley EST sequence, it will be possible to effectively use the genome information of the barley that the inventors have in breeding wheat.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a method for breeding wheat using a diploid wheat genetic map prepared using a barley EST sequence. It is in.
  • the present inventors have cultivated varieties of amplified DNA fragments obtained by amplifying diploid wheat genomic DNA as a cocoon using primers based on a uniquely developed barley EST sequence. Those having a polymorphism between were selected as DNA markers.
  • a diploid wheat genetic map was completed by mapping these DNA markers onto the diploid wheat chromosome (A genome).
  • the inventors further conducted QTL analysis on 16 types of agronomic traits using the genetic map of the diploid wheat, found QTL for all traits, and found the diploid wheat. We found that there is a sequence of DNA markers in the genetic map and the barley dense genetic map. As a result, the genetic map of the diploid wheat was confirmed to be very useful for wheat breeding, and the present invention was completed.
  • the method for breeding wheat according to the present invention uses a primer set designed based on a barley EST sequence, an amplification step for amplifying DNA using wheat genomic DNA as a saddle, and amplification
  • a method for breeding wheat comprising a polymorphism detection step for detecting a polymorphism of a DNA fragment comprising:
  • the DNA fragment is a DNA marker mapped on a genetic map covering the entire genome of diploid wheat, and at least 50 or more DNA markers mapped on the genetic map should be used. As a feature!
  • the barley EST sequence is preferably selected from the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 486.
  • the primer set has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 487 to 1458. That is, the primer set is preferably a combination of a primer having a base sequence ability represented by SEQ ID NO: n (n is an odd number) and a primer having a base sequence ability represented by SEQ ID NO: n + 1.
  • the wheat breeding method according to the present invention includes a DNA marker having a DNA fragment strength described in at least one of the following (a) to (g) among the at least 50 DNA markers: Furthermore, the method may include a step of determining the genotype of the locus involved in the panicle length.
  • a primer having the base sequence ability shown in SEQ ID NO: 947 and SEQ ID NO: 948 A primer obtained by combining a DNA fragment amplified using a primer set in combination with a primer consisting of a base sequence or a primer having a base sequence ability shown in SEQ ID NO: 949 and a primer having a base sequence ability shown in SEQ ID NO: 950 DNA fragments amplified using the set
  • the wheat breeding method according to the present invention includes a DNA marker comprising the DNA fragment described in at least one of the following (a) to (d) among the at least 50 DNA markers: In addition, it includes a step of determining the genotype of the locus involved in the cocoon length.
  • the wheat breeding method according to the present invention includes a DNA marker having a DNA fragment strength described in the following (a) among the at least 50 DNA markers, and further comprising: It may include a step of determining the genotype of the gene locus involved.
  • the wheat breeding method according to the present invention includes a DNA marker having a DNA fragment force described in at least one of the following (a) and (b): In addition, it may include a step of determining the genotype of the gene locus involved in the first internode length.
  • Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 943 and shown in SEQ ID NO: 944 A DNA fragment amplified using a primer set combined with a primer consisting of a base sequence or a primer combined with a primer with a base sequence ability shown in SEQ ID NO: 945 and a primer with a base sequence ability shown in SEQ ID NO: 946 A DNA fragment that is amplified using a set.
  • the wheat breeding method according to the present invention includes a DNA marker comprising the DNA fragment described in at least one of the following (a) to (h) among the at least 50 DNA markers: Furthermore, it may include the process of determining the genotype of the locus involved in intercob length.
  • the wheat breeding method according to the present invention includes a DNA marker having a DNA fragment ability described in the following (a) among the at least 50 DNA markers, and further a gene involved in heading date: It may include the step of determining the genotype of the locus.
  • the wheat breeding method according to the present invention includes a DNA marker comprising the DNA fragment according to at least one of the following (a) to (d) among at least 50 DNA markers: And includes the step of determining the genotype of the locus involved in the silkworm and the chief.
  • the wheat breeding method according to the present invention includes a DNA marker comprising the DNA fragment described in at least one of the following (a) to (d) among at least 50 DNA markers: Including the process of determining the genotypes of the loci involved in the samurai and guardian chiefs.
  • the wheat breeding method according to the present invention includes a DNA marker comprising the DNA fragment according to at least one of the following (a) to (c) among the at least 50 DNA markers: Furthermore, the method may include a step of determining the genotype of the locus involved in the grass type.
  • the wheat breeding method according to the present invention includes a DNA marker having a DNA fragment strength described in at least one of the following (a) and (b) among the at least 50 DNA markers.
  • it may further include the step of determining the genotype of the locus involved in 1000 grain weight.
  • the wheat breeding method according to the present invention includes a DNA marker comprising the DNA fragment according to at least one of the following (a) to (d) among at least 50 DNA markers: The process of determining the genotype of the locus involved It can be included.
  • the wheat breeding method according to the present invention includes a DNA marker comprising the DNA fragment according to at least one of the following (a) to (f) among the at least 50 DNA markers: Further, it may include a process of determining the genotype of a locus involved in dormancy (after 0 weeks).
  • the method for breeding wheat according to the present invention includes a DNA marker having at least one of the following (a) and (b) DNA fragments having a DNA fragment strength among one of the at least 50 DNA markers.
  • it may further include a step of determining the genotype of the gene that controls the color of the paste powder layer.
  • the DNA marker having the DNA fragment strength described in at least one of the following (a) and (b) is used among the at least 50 DNA markers.
  • the method may further include a step of determining the genotype of the gene that controls the leaf blade.
  • the wheat breeding method according to the present invention includes the DNA marker having at least one of the following (a) and (b) DNA markers, among the at least 50 DNA markers. And a step of determining a genotype of a gene that controls the degree of autumn seeding.
  • the wheat breeding method according to the present invention includes a DNA marker having a DNA fragment ability described in the following (a) to (g) among the at least 50 or more DNA markers.
  • a DNA marker having a DNA fragment ability described in the following (a) to (g) among the at least 50 or more DNA markers To include genotypes of loci involved in dormancy (after 0 weeks), dormancy (after 3 weeks), heading date, thousand grain weight, head length, number of spikelets and plant type Is preferred.
  • FIG. 1 is a diagram showing a diploid wheat genetic map prepared using barley EST sequences.
  • FIG. 2 is a diagram showing the correspondence between markers seated on the genetic map of 4A m chromosome and 5A m chromosome of diploid wheat and markers seated on the barley genetic map.
  • the wheat breeding method according to the present invention uses a set of primers designed on the basis of barley EST sequences, an amplification step of amplifying DNA using wheat genomic DNA as a saddle, and A polymorphism detection step of detecting a polymorphism of the DNA fragment.
  • the above DNA fragment is a DNA marker mapped on the genetic map of diploid wheat!
  • the breeding method of the present invention is a method for breeding wheat using a diploid wheat genetic map prepared using barley EST sequences. Therefore, first, a wheat EST sequence and a primer set designed based on the sequence will be described, and then a diploid wheat genetic map prepared using the barley EST sequence will be described. Explain! /
  • the barley EST sequence used for designing the primer set may be a part of the base sequence of barley cDNA.
  • the barley EST sequence, that is, the base sequence of barley cDNA can be obtained by using a known molecular biological technique.
  • the inventors prepared leaf power mRNA of several kinds of barley varieties, and prepared a cDNA library by a known method. Using the plasmid with these cDNAs as a template, adjusting the quality of the base sequence read in one sequence analysis on both sides using the base sequence of the plasmid part outside the insertion site as a primer, and removing the vector sequence
  • the barley EST array has been acquired. However, it is not limited to this.
  • the inventors currently have a database of about 240,000 barley EST sequences.
  • the barley EST sequence obtained by the inventors corresponds to two base sequences read by the 5 side and 3 'side force for one cDNA clone.
  • the primer set used in the present invention should be designed based on the barley EST sequence.
  • the primer set designed based on the barley EST sequence consists of a pair of forward primer consisting of a part of barley EST sequence and reverse primer that is also part of the complementary sequence of barley EST sequence. Intended.
  • the inventors have designed a primer set for each EST using the primer design software Primer3 based on the above-obtained barley EST sequence. These primer sets are designed to amplify DNA fragments by PCR under the same annealing temperature conditions. As a result, PCR can be performed simultaneously under the same conditions without the need to optimize PCR conditions for each individual primer set. Very useful.
  • a diploid wheat genetic map can be generated using the barley EST sequence. Specifically, for example, it can be produced as follows.
  • the inventors have crossed between wild diploid wheat species Triticum boeoticum Boiss. (Accession No. KT1-1) and diploid wheat cultivar Triticum monococcum L. (accession No. KT3-5). Recombinant inbred lines (hereinafter referred to as “: RIL”) 93 strains and parents were used to construct a genetic map of diploid wheat (see Example 1).
  • genomic DNA of parents (T. boeoticum Boiss. And T. monococcum L.) was used as a cage, and PCR was performed using a primer set designed based on the barley EST sequence. . And the primer set which can detect a polymorphism of parents was selected. Next, 243 pairs of primer sets were found that amplify DNA fragments that can serve as DNA markers by PCR using the selected primer set as the genomic DNA of the RIL population.
  • the barley EST sequence used for designing the primer set is not particularly limited, but is at least one selected from the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 486.
  • the base sequence is preferably.
  • These base sequences are barley EST sequences that the inventors have actually used for the genetic map generation of the above-mentioned diploid wheat.
  • SEQ ID NO: n (n is an odd number) and SEQ ID NO: n + 1 are the same nucleotide sequence (n) from which 5 ′ side force was read and the nucleotide sequence (n + 1) from which 3 ′ side force was also read.
  • the inventors only need to use one of the EST sequences for the same cDNA, and usually create a genetic map using the 3'-form barley EST sequence. However, those skilled in the art will easily understand that the same genetic map can be prepared using the EST sequence on the fifth side.
  • the primer set used in the wheat breeding method according to the present invention is The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: n (n is an odd number) among the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 487 to 1458 is not particularly limited as long as it is designed based on the wheat EST sequence.
  • the primer set is preferably a combination of a primer consisting of the above and a primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: n + 1. These primer sets are the primer sets actually used by the inventors for the genetic mapping of the above-described diploid wheat.
  • the primer set designed based on the barley EST sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a combination of primers each having the base sequence ability shown in SEQ ID NO: 487 and SEQ ID NO: 488. That is, the sequence number indicating the base sequence of the primer based on the individual base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 486 (former EST sequence) is expressed as follows: 2 X m-l) +4 86 and (2 X m) +486.
  • the DNA fragment is It becomes a DNA marker.
  • the DNA fragment that can serve as the DNA marker only needs to be mapped on the genetic map of diploid wheat.
  • a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: n (n is an odd number) and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: n + 1 are combined
  • the DNA fragment amplified by the primer set has been found by the inventors to have a polymorphism between “Tnticum boeoticum Boiss. KTl— ⁇ ” and “Triticum monococcum KT3-5”. Since V is mapped on the genetic map of body wheat, it is suitable as a primer set for use in the wheat breeding method according to the present invention.
  • Tables 1 and 2 show DNA markers mapped to the lA m chromosome of diploid wheat. The distance from the short arm is shown in order. Similarly, 2A m chromosomes in Tables 3 and 4, the 3A m chromosomes in Tables 5 and 6, the 4A m chromosome in Tables 7 and 8, the 5A m chromosomes in Tables 9 and 10, 6A m Table 11 shows the chromosome and Table 12 shows the 7A m chromosome.
  • the barley EST clone name used as the basis for designing the primer set used for amplification of the DNA marker is described as the marker name, and the corresponding sequence number is the nucleotide sequence of the barley EST clone. Is the sequence number corresponding to. Those without a sequence number are known RFLP markers.
  • Short arm end SEQ ID NO: SEQ ID NO: Ordered clone name (5 'side) (3' side) distance from short arm end (cM)
  • Tables 13 and 14 show the sequence numbers of the primers used to amplify the DNA marker mapped to the 1A 1 “chromosome of diploid wheat and the types of polymorphisms found in the DNA marker.
  • Tables 15 and 16 for the 2A m chromosome show 3A m staining.
  • Tables 13 to 24 show four types of polymorphism: CAPS, SNP, size_poly, and RFLP.
  • RFLP uses a known marker, and the polymorphisms found in DNA markers of diploid wheat obtained by the inventors using barley EST sequences are CAPS, SNP and size-poly.
  • size_poly is the length of the amplified fragment It is O polymorphism.
  • size_poly the amplified DNA fragment is subjected to electrophoresis, and the polymorphism can be detected by the difference in the position of the band or the presence or absence of the band.
  • CAPS is a polymorphism depending on the presence or absence of a restriction enzyme recognition sequence. Most are based on single nucleotide polymorphisms in restriction enzyme recognition sequences, but also include those based on insertion deletions of one or more bases. A marker whose type is described as SNP is a marker whose single nucleotide polymorphism or insertion deletion does not exist in the restriction enzyme recognition sequence. CAPS can be detected by the number of bands or the position of the band after subjecting the amplified DNA fragment to restriction enzyme treatment and electrophoresis. SNPs other than CAPS can be detected by SNP typing, that is, by actually confirming the base at the single nucleotide polymorphism site or insertion deletion site. However, it goes without saying that CAPS can also detect polymorphisms by SNP typing.
  • Table 25 to Table 38 show one of “Triticum boeoticum Boiss. KTl-1 Jr Triticum monococcum L. KTJ-5” among CAPS markers among the DNA markers obtained by the inventors; The nucleotide sequence near the type or insertion deletion, the restriction enzyme name, and the recognition sequence of the restriction enzyme are shown.
  • Tables 25 and 26 are for lA m chromosomes
  • Tables 27-29 are for 2A m chromosomes
  • Tables 30 and 31 are for 3A m chromosomes
  • Tables 32 and 33 are for 4A m chromosomes
  • Tables 34 and Table 35 shows the 5A m chromosome
  • Table 36 and Table 37 show the 6A m chromosome
  • Table 38 shows the 7A m chromosome.
  • Tables 39 to 50 show the nucleotide sequences near single nucleotide polymorphisms of SNP markers (other than CAPS) among the DNA markers obtained by the inventors.
  • Table 39 and Table 40 for lA m chromosome, Table 41 and Table 42 for 2A m chromosome, Table 43 and Table 44 for 3A m chromosome, Table 45 and Table 46 for 4A m chromosome, Table 47 and Table 48 shows the 5A m chromosome, Table 49 shows the 6A m chromosome, and Table 50 shows the 7A m chromosome. Some of these include multiple polymorphisms in one fragment.
  • n (A or C or G or T) or (unknown or other base)
  • the wheat breeding method comprises an amplification step of amplifying DNA using a set of primers designed on the basis of barley EST sequences and using wheat genomic DNA as a cage. And a polymorphism detection step for detecting a polymorphism of the amplified DNA fragment, wherein the DNA fragment is mapped onto a genetic map covering the entire genome of diploid wheat Any marker that uses at least 50 or more DNA markers mapped on the genetic map!
  • the diploid wheat is a wheat having A genome
  • this method can be applied to a wheat having A genome. That is, it can be used for breeding diploid wheat having A genome power, tetraploid wheat consisting of A genome and B genome, and hexaploid wheat consisting of A genome, B genome and D genome.
  • it is preferable to use for breeding diploid wheat that also has A-genomic power and particularly to diploid wheat that also has A-genomic power of cultivated varieties, diploid that is wild-type or cultivated A-genomic power.
  • Wheat deer It is best to use this method in the breeding process of introducing useful traits by crossing.
  • a useful trait of a diploid wheat can be introduced into a highly polyploid wheat by crossing a diploid wheat into which a useful trait has been introduced and a tetraploid wheat or a hexaploid wheat.
  • DNA markers are used in this method.
  • the 50 or more DNA markers are preferably selected with an appropriate inter-marker distance so that the entire A genome can be covered.
  • an appropriate inter-marker distance is selected so that the average inter-marker distance is 25 cM or less.
  • the average intermarker distance is less than 5 cM, which is most preferred.
  • the method for amplifying DNA is not particularly limited, and a known nucleic acid amplification method can be appropriately selected and used.
  • the PCR method is suitable as the nucleic acid amplification method used in this step.
  • the primer having the base sequence ability shown in SEQ ID NO: n (n is an odd number) and SEQ ID NO: n + 1 are shown.
  • these primer sets are designed to amplify DNA fragments by PCR under the same annealing temperature conditions. It is best to use the PCR method.
  • the method for extracting the genomic DNA of the test wheat individual force is not particularly limited.
  • the CTAB method see Murray HG et al. Nuc Acid Res (1980) 8: 4321-4325.
  • a known genomic DNA extraction method such as the method of Murray et al. (See Nucleic Acids 13 ⁇ 43., 8: 4321-4325, 1980) can be used.
  • the primer can be synthesized by a known method.
  • a commercially available DNA synthesizer may be used according to the instruction manual.
  • a method for detecting a polymorphism may be appropriately selected according to the type of polymorphism to be detected.
  • the primer having the base sequence ability shown in SEQ ID NO: n (n is an odd number) and the primer having the base sequence ability shown in SEQ ID NO: n + 1 are combined.
  • Polymorphisms found in DNA fragments amplified by primer sets can be classified into three types: CAPS, SNP and size_poly.
  • an amplified DNA fragment (PCR product) is subjected to electrophoresis, and a polymorphism can be detected by the difference in band position or the presence or absence of a band.
  • CAPS can be detected by, for example, subjecting the amplified DNA fragment to a restriction enzyme treatment, followed by electrophoresis, and the number of bands or the position of the band.
  • SNP can be detected by SNP typing, that is, by actually confirming the base at the single nucleotide polymorphism site or insertion deletion site. For example, SNP typing can be performed simply by using a commercially available SNP detection kit.
  • the method for detecting the polymorphism is not limited to the above example. In addition, polymorphisms other than those described above can be detected using a known detection method.
  • the breeding method according to the present invention it is possible to greatly improve the breeding of wheat, particularly the breeding of diploid wheat. Specifically, since DNA molecules that are located on all chromosomes can be amplified comprehensively and their polymorphisms can be detected, introduction of multiple useful traits can be confirmed at once. It is also made using barley EST sequence. It is also possible to breed wheat using the information of barley based on the correspondence between the diploid wheat genetic map and the barley genetic map prepared using the barley EST marker. For example, the presence or absence of the QTL can be estimated by detecting a wheat DNA marker corresponding to a DNA marker in the vicinity of the QTL that has been clarified in barley.
  • the breeding method according to the present invention may include steps other than the amplification step and the polymorphism detection step. For example, it is preferable to include the step of identifying a DNA marker that sits closest to the locus involved in a particular trait and determining the genotype of the DNA marker! /.
  • the inventors have established diploid wheat inheritance in which 243 DNA markers amplified with a primer set designed based on the barley EST sequence and 96 known RFLP markers are mapped. A map was prepared and QTL analysis was performed on 16 types of agronomic traits using the genetic map (see Example 2). As a result, we have found a DNA marker that sits closest to each QTL or gene. Therefore, in the breeding method according to the present invention, subsequent to the amplification step and the polymorphism detection step, a step of determining the genotype of a locus (gene) related to a specific trait (hereinafter referred to as “genotype determination step”). ), It is possible to determine the introduction of the target character.
  • each QTL or DNA marker between the DNA markers either the short arm side or the long arm side DNA marker polymorphism (genotype) V
  • the ability to determine the genotype of a locus (gene) It is preferable to make a determination based on the polymorphism (genotype) of both DNA groups on both sides.
  • Panicle length indicates the length to the tip of the panicle head, and the longer panicle length does not hinder the fullness of the grain, so the grain shape tends to be better. Therefore, the modification of panicle length is one of the important traits in agriculture and one of the breeding goals. Panicle length is a quantitative trait and is a trait determined by multiple loci.
  • the inventors used a diploid wheat genetic map generated using the barley EST sequence.
  • the QTLs involved in 4 panicle lengths were found by QTL analysis.
  • the genotype of each QTL is a polymorphism of a DNA marker amplified by a primer set that combines primers having the nucleotide sequence shown in the following SEQ ID NOs, that is, the DNA marker gene type »“ Triticum boeoticum Boiss.
  • KTl Force that is “1” type “Tnticum monococcum L.
  • KT3-5 can be detected and determined based on the genotype of the DNA marker. Refer to the corresponding marker in the above table for the types of polymorphism and the nucleotide sequence of the polymorphic site.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the lA m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 587 and 588 or the primer set of SEQ ID NOs: 589 and 590.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 591 and 592 or the primer set of SEQ ID NOs: 593 and 594.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the 2A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 759 and 760 or the primer set of SEQ ID NOs: 761 and 762.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified with the primer set of SEQ ID NOs: 763 and 764 or the primer set of SEQ ID NOs: 765 and 766.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the 3A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 947 and 948 or the primer set of SEQ ID NOs: 949 and 950. Since the QTL sits at the end of the long arm of the 3A m chromosome, there is no DNA marker amplified by the primer set designed based on the barley EST sequence on the long arm side of the QTL. However, a known RFLP marker (marker name: JIP) exists on the long arm side.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the 4A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 995 and 996, or the primer set of SEQ ID NOs: 997 and 998.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 999 and 1000 or the primer set of SEQ ID NOs: 1001 and 1002.
  • culm length is a quantitative trait and is a trait determined by a plurality of loci.
  • each QTL is a polymorphism of a DNA marker amplified by a primer set that combines primers having the nucleotide sequence shown in the following SEQ ID NOs, that is, the DNA marker gene type »“ Triticum boeoticum Boiss.
  • KTl Force that is “1” type “Tnticum monococcum L. KT3-5” type can be detected and determined based on the genotype of the DNA marker. Refer to the corresponding marker in the above table for the types of polymorphism and the nucleotide sequence of the polymorphic site.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present in the 2A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 759 and 760 or the primer set of SEQ ID NOs: 761 and 762.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified with the primer set of SEQ ID NOs: 763 and 764 or the primer set of SEQ ID NOs: 765 and 766.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the 5A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1235 and 1236 or the primer set of SEQ ID NOs: 1237 and 1238.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by a primer set of SEQ ID NOS: 1239 and 1240, or a primer set of SEQ ID NOS: 1241 and 1242
  • the number of spikelets is the number of grains attached to the spike, which is a guideline for estimating the yield. It can be said that the varieties with more spikelets have higher yields, and it is a preferable trait for cultivars to have more spikelets.
  • the number of spikelets is a quantitative trait that is determined by multiple loci.
  • the inventors used a diploid wheat genetic map generated using the barley EST sequence. QTL analysis related to one spikelet number was found by QTL analysis.
  • the gene type of the QTL is a polymorphism of a DNA marker amplified by a primer set in combination with a primer having the base sequence ability shown in the following SEQ ID No., that is, the residue of the DNA marker ⁇ It is possible to detect whether the force is “Triticum monococcum L. KT3-5” type, which is the “boeoticum Boiss. KT1-1” type, and to determine based on the genotype of the DNA marker. Please refer to the corresponding marker in the above table for the types of polymorphism and the base sequence of the polymorphic site.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present in the 3A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 947 and 948 or the primer set of SEQ ID NOs: 949 and 950. Since the QTL sits at the end of the long arm of the 3A m chromosome, there is no DNA marker amplified by the primer set designed based on the barley EST sequence on the long arm side of the QTL. However, a known RFLP marker (marker name: JIP) exists on the long arm side.
  • the first internode length indicates the length of the first head of the head, and the longer the first internode length, the easier it is to fall. Therefore, it can be said that a shorter trait length is the preferred trait for cultivars.
  • the first internode length is a quantitative trait and is a trait determined by multiple loci.
  • the genotype of the QTL is a polymorphism of a DNA marker amplified by a primer set that combines the primers having the base sequence ability shown in the following SEQ ID NOs, that is, the 3 ⁇ 4fe subtype of the DNA marker “Triticum boeoticum Boiss. KT1 — Check with “1” type »“ Triticum monoco ccum L. KT3-5 ”type can be detected and determined based on the genotype of the DNA marker. Refer to the corresponding marker in the above table for the polymorphism type and the nucleotide sequence of the polymorphic site.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL on the 3A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 939 and 940 or the primer set of SEQ ID NOs: 941 and 942 Is done.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 943 and 944 or the primer set of SEQ ID NOs: 945 and 946.
  • the cob internode length indicates the length of each cob and is an index of the density of grains in the panicle. If the cob internode length is too short, the grains will become smaller or thinner, so it is necessary to select breeding varieties with an appropriate cob internode length. Therefore, modification of the intercob length is one of the important breeding goals.
  • the intercob length is a quantitative trait that is determined by multiple loci.
  • each QTL is a polymorphism of a DNA marker amplified by a primer set in combination with a primer having a base sequence ability shown in the following SEQ ID No., that is, the residue of the DNA marker ⁇ It is possible to detect whether the force is “Triticum monococcum L. KT3-5” type, which is the “boeoticum Boiss. KT1-1” type, and to determine based on the genotype of the DNA marker. Please refer to the corresponding marker in the above table for the types of polymorphism and the base sequence of the polymorphic site.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the lA m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 503 and 504 or the primer set of SEQ ID NOs: 505 and 506. Further, the DNA marker on the long arm side is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 507 and 508 or the primer set of SEQ ID NOs: 509 and 510.
  • the QTL short arm DNA marker present on the 5A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1203 and 1204 or the primer set of SEQ ID NOs: 1205 and 1206.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1207 and 1208 or the primer set of SEQ ID NOs: 1209 and 1210
  • the DNA marker on the short arm side of the first QTL present on the 7A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1355 and 1356 or the primer set of SEQ ID NOs: 1357 and 1358.
  • the long arm DNA markers are SEQ ID NOS: 1359 and 1360. Or a primer set of SEQ ID NOS: 1361 and 1362.
  • the DNA marker on the short arm side of the second QTL present on the 7A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1395 and 1396, or the primer set of SEQ ID NOs: 1397 and 1398.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1399 and 1400 or the primer set of SEQ ID NOs: 1401 and 1402.
  • Heading date is a trait that is an indicator of early and late life.
  • the modification of heading date is an important breeding target for local adaptability and decentralization of harvesting work. For example, if cultivars with slightly different heading dates are cultivated, the harvesting work can be decentralized, making it possible to increase the efficiency of farming work and avoid dangers to obstacles.
  • the cultivation of wheat from the south of Honshu is carried out as a rice paddy crop, so it must be harvested before the rainy season or planting. Therefore, the development of early varieties is one of the important breeding goals of wheat in Japan.
  • the heading date is a quantitative trait and is a trait determined by a plurality of loci.
  • the QTL genotype is a polymorphism of a DNA marker amplified by a primer set in combination with a primer having the nucleotide sequence shown in the following SEQ ID No., i.e., the ⁇ typicum ooeoticum Boiss.
  • Whether the force is “Triticum monococcum L. KT3-5” type, which is “KTl-1” type, can be determined based on the genotype of the DNA marker. Please refer to the corresponding marker in the above table for the types of polymorphism and the base sequence of the polymorphic site.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present in the 3A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 947 and 948 or the primer set of SEQ ID NOs: 949 and 950. Since the QTL sits at the end of the long arm of the 3A m chromosome, there is no DNA marker amplified by the primer set designed based on the barley EST sequence on the long arm side of the QTL. However, the known RFLP marker (marker name: JIP) is long. Present on the arm side.
  • the length of the kite indicates the length of the kite, and the longer the kite is, the more advantageous it is for photosynthesis.
  • long pods can interfere with manual harvesting, and varieties without pods are being cultivated.
  • straw is not a problem for machine harvesting. Therefore, it is necessary to adjust the length of the straw according to the cultivation conditions.
  • culm length is a quantitative trait and is a trait determined by multiple loci.
  • the genotype of each QTL is a polymorphism of a DNA marker amplified by a primer set that combines primers having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: — Force that is “1” type “Tnticum monococcum L. KT3-5” type can be detected and determined based on the genotype of the DNA marker. Refer to the corresponding marker in the above table for the types of polymorphism and the nucleotide sequence of the polymorphic site.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the 5A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1115 and 1116 or the primer set of SEQ ID NOs: 1117 and 1118.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by a primer set of SEQ ID NOS: 1119 and 1120, or a primer set of SEQ ID NOS: 1121 and 1122
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the 7A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1407 and 1408 or the primer set of SEQ ID NOs: 1409 and 1410.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by a primer set of SEQ ID NOs: 1411 and 1412 or a primer set of SEQ ID NOs: 1413 and 1414
  • the guard is attached to the side of the floret and is the length of the guard.
  • the longer the protection the higher the humidity on the surface of the ears due to raindrops and dew, etc., and this is an incentive for the propagation of pathogenic bacteria and the occurrence of ear germination.
  • the long guardian is a quantitative trait and is a trait determined by a plurality of loci.
  • each QTL is a polymorphism of a DNA marker amplified by a set of primers combined with a primer having a base sequence ability shown in the following SEQ ID NO: It is possible to detect whether the force is “Tnticum monococcum L. KT3-5” type based on the genotype of the DNA marker. Refer to the corresponding marker in the above table for the polymorphism type and the nucleotide sequence of the polymorphism site.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the 3A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 943 and 944 or the primer set of SEQ ID NOs: 945 and 946.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 947 and 948 or the primer set of SEQ ID NOs: 949 and 950.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the 7A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1371 and 1372 or the primer set of SEQ ID NOs: 1373 and 1374.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by a primer set of SEQ ID NOS: 1375 and 1376 or a primer set of SEQ ID NOS: 1377 and 1378
  • the plant type shows the shape of the plant during wintering, and in cold regions, the varieties with the plant type tend to have higher wintering ability. Grass-type upright varieties are generally premature. Therefore, in the cultivar, it is necessary to change the grass type depending on the cultivation area.
  • the plant type is a quantitative trait and is a trait determined by a plurality of loci.
  • the inventors used a diploid wheat genetic map generated using the barley EST sequence.
  • the QTLs involved in two grass types were found by QTL analysis.
  • the genotype of each QTL is a polymorphism of a DNA marker amplified by a primer set that combines primers having the nucleotide sequence shown in the following SEQ ID NOs, that is, the DNA marker gene type »“ Triticum boeoticum Boiss.
  • KTl Force that is “1” type “Tnticum monococcum L.
  • KT3-5 can be detected and determined based on the genotype of the DNA marker. Refer to the corresponding marker in the above table for the types of polymorphism and the nucleotide sequence of the polymorphic site.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the 3A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 947 and 948 or the primer set of SEQ ID NOs: 949 and 950. Since the QTL sits at the end of the long arm of the 3A m chromosome, there is no DNA marker amplified by the primer set designed based on the barley EST sequence on the long arm side of the QTL. However, a known RFLP marker (marker name: JIP) exists on the long arm side.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the 5A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1259 and 1260 or the primer set of SEQ ID NOs: 1261 and 1262.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by a primer set of SEQ ID NOS: 1263 and 1264 or a primer set of SEQ ID NOS: 1265 and 1266
  • Thousand grain weight is a trait that measures the grain weight after ripening and converts it into a thousand grains, and serves as an index of grain weight.
  • the wheat flour recovery rate decreases, and conversely, if it is too large, the protein (Dalten) content required for bread tends to decrease. For this reason, it is necessary to select individuals with an appropriate thousand grain weight, and modification of the thousand grain weight is one of the important breeding goals.
  • Thousand grain weight is a quantitative trait and is a trait determined by multiple loci.
  • the QTL genotype is a combination of primers with the nucleotide sequence shown in the following SEQ ID NO: Detects polymorphism of DNA marker amplified by Limer set, that is, the force of “Triticum monococcu m L. KT3-5”, which is the type of force of “Triticum ooeoticum Boiss. KTl-1”
  • the determination can be made based on the genotype of the DNA marker. Please refer to the corresponding marker in the above table for the types of polymorphism and the base sequence of the polymorphic site.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the 2A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 735 and 736 or the primer set of SEQ ID NOs: 737 and 738.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 739 and 740 or the primer set of SEQ ID NOs: 741 and 742.
  • Cob shedding is a phenotype in which the cob becomes brittle after ripening and the seeds fall off (cob shedding), or the seeds do not fall off after ripening! /, Phenotype (cob non-shedding) Is a trait representing In wild species, it is important that the seeds fall naturally from the ears, that is, have the ability to fall off the cob in order to leave the next generation. On the other hand, although the cultivated species is basically non-cobbing, the hybrid is coccal-lossing when the cultivated species and the wild species are crossed. There are things to do. In the case of a cob-dropping individual, seeds fall naturally from the panicle and the yield cannot be evaluated. Therefore, it is important to be non-cob-free for the evaluation of agricultural traits. COB shedding is a quantitative trait that is determined by multiple loci.
  • each QTL is a polymorphism of a DNA marker amplified by a primer set in combination with a primer having a base sequence ability shown in the following SEQ ID No., that is, the residue of the DNA marker ⁇ It is possible to detect whether the force is “Triticum monococcum L. KT3-5” type, which is the “boeoticum Boiss. KT1-1” type, and to determine based on the genotype of the DNA marker. Please refer to the corresponding marker in the above table for the types of polymorphism and the base sequence of the polymorphic site.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the 4A m chromosome is SEQ ID NO: 1071 and Amplification is performed using the primer set of 1072 or the primer sets of SEQ ID NOs: 1073 and 1074.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by a primer set of SEQ ID NOs: 1075 and 1076 or a primer set of SEQ ID NOs: 1077 and 1078
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the 7A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1371 and 1372 or the primer set of SEQ ID NOs: 1373 and 1374.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by a primer set of SEQ ID NOS: 1375 and 1376 or a primer set of SEQ ID NOS: 1377 and 1378
  • each QTL is a polymorphism of a DNA marker amplified by a primer set in combination with a primer having the base sequence ability shown in the following SEQ ID NO: Triticum boeoticum Boiss. KT1-1 ”->" Triticum mono coccum L. KT3-5 "type can be detected and determined based on the genotype of the DNA marker.
  • SEQ ID NO: Triticum boeoticum Boiss. KT1-1 ”->" Triticum mono coccum L. KT3-5 "type can be detected and determined based on the genotype of the DNA marker.
  • the base sequence of the polymorphic site, etc. Refer to the appropriate marker in the table.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the lA m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 575 and 576 or the primer set of SEQ ID NOs: 577 and 578.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 579 and 580 or the primer set of SEQ ID NOs: 581 and 582.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present in the 3A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 835 and 836 or the primer set of SEQ ID NOs: 837 and 838.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified with the primer set of SEQ ID NOs: 839 and 840 or the primer set of SEQ ID NOs: 841 and 842.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the 5A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1123 and 1124 or the primer set of SEQ ID NOs: 1125 and 1126.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by a primer set of SEQ ID NOS: 1127 and 1128 or a primer set of SEQ ID NOS: 1129 and 1130
  • Each QTL The genotype of the DNA marker is a polymorphism of a DNA marker that is amplified by a primer set in combination with a primer having the base sequence ability shown in the following SEQ ID NO: Boiss.
  • KT1-1 Check “Triticum mono coccum L. KT3-5” type, and determine based on the genotype of the DNA marker. Refer to the corresponding marker in the above table for the polymorphism type and the nucleotide sequence of the polymorphic site.
  • the DNA marker on the short arm side of the first QTL present in the lA m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 591 and 592 or the primer set of SEQ ID NOs: 593 and 594. Further, the DNA marker on the long arm side is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 595 and 596 or the primer set of SEQ ID NOs: 597 and 598.
  • the DNA marker on the short arm side of the second QTL present in the lA m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 627 and 628 or the primer set of SEQ ID NOs: 629 and 630.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 631 and 632 or the primer set of SEQ ID NOs: 633 and 634.
  • the DNA marker on the short arm side of QTL present on the 3A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 903 and 904 or the primer set of SEQ ID NOs: 905 and 906. Further, the DNA marker on the long arm side is amplified by the primer set of SEQ ID NOS: 907 and 908 or the primer set of SEQ ID NOS: 909 and 910.
  • the paste layer color can be judged by visual inspection of each individual paste layer color before ripening. That is, it can be judged by whether or not the color of the film called the glue layer existing on the surface of the fruit inside the flower is colored.
  • the glue layer color is a trait governed by a single dominant gene and is inherited according to Mendel's law. There are two alleles at the locus that controls the color of the glue layer: the gene that colors the glue layer and the gene that expresses the uncolored light brown glue layer, and coloring is dominant.
  • the target trait controls the glue layer color.
  • the gene is on the chromosome on which it sits, not only the desired trait but also the glue layer A gene that controls color may be introduced at the same time. Therefore, if a variety having a colored paste layer is selected, it is highly possible that the variety with the desired trait is introduced.
  • the paste powder color can be used as an index for identifying the mixing of different varieties, making it possible to easily perform varieties inspections.
  • the inventors of the present invention have found that a DNA that dominates the paste layer color and that sits on the nearest neighbor by QTL analysis using a diploid wheat genetic map prepared using a barley EST sequence. I found a marker.
  • the genotype of the gene that controls the color of the paste powder layer is the polymorphism of the DNA marker that is amplified by the primer set that combines the primer consisting of the base sequence shown in the following SEQ ID NO. Cum boeoticum Boiss. KTl-1 ”type force“ Tnticum monococcum L. KT3-5 ”type can be detected and determined based on the genotype of the DNA marker.
  • For the types of polymorphism and the nucleotide sequence of the polymorphic site refer to the corresponding marker in the above table.
  • the DNA marker on the short arm side of the gene that controls the glue layer color present in the 4A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1055 and 1056, or the primer set of SEQ ID NOs: 1057 and 1058. Further, the DNA marker on the long arm side is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1059 and 1060 or the primer set of SEQ ID NOs: 1061 and 1062.
  • the leaf ridge can be confirmed by touching the ridge on the surface of the leaf.
  • Leaf trichomes are traits dominated by a single dominant gene and are inherited according to Mendel's law. There are two alleles at loci that control leaf blades: a gene that expresses leaves with hair folds and a gene that expresses leaves without hair folds, and leaves with hair folds are dominant .
  • the genes that control the leaf blades are seated. If it is on the chromosome, not only the desired trait but also the gene that controls the leaf wings may be introduced at the same time. If a varieties with a hair candy is selected, it can be said that it is highly likely to be a cultivar introduced with the desired trait. Also, the leafy hair buds are mixed with different varieties. It can also be used as an index for identifying the input, making it possible to easily carry out product inspection.
  • the inventors of the present invention have found that the DNA that dominates the leaf wings and sits on the nearest neighbor by QTL analysis using a diploid wheat genetic map prepared using the barley EST sequence. I found a marker.
  • the genotype of a gene that controls leaf blades is a polymorphism of a DNA marker that is amplified by a primer set that combines primers consisting of the nucleotide sequence shown in the following SEQ ID NO. Cum boeoticum Boiss. KTl—1 ”type force“ Tnticum monococcum L. KT3-5 ”type can be detected and determined based on the genotype of the DNA marker.
  • For the types of polymorphism and the nucleotide sequence of the polymorphic site refer to the corresponding marker in the above table.
  • the DNA marker on the short arm side of the gene that controls leaf blades present on the 5A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1247 and 1248 or the primer set of SEQ ID NOs: 1249 and 1250.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1251 and 1252, or the primer set of SEQ ID NOs: 1253 and 1254.
  • the degree of autumn sowing can be judged by the period of low temperature and short days necessary for flowering heading.
  • the degree of autumn sowing is adjusted according to the number of days until the leaf leaves develop under constant temperature conditions (normally 20 ° C). Varieties with a high degree of autumn sowing do not flower without leading to leaf development, whereas varieties with a low degree of autumn sowing (spring sowing) lead to short leaf development as the degree is low. Varieties with a high autumn sowing ability do not produce ears even when cultivated in spring, but are suitable for sowing in autumn and cultivating over winter. On the other hand, when cultivars with low autumn sowing properties are cultivated overwintering, they grow during autumn and may wither in the cold. Thus, it is important to change the degree of autumn sowing according to the cultivation environment in breeding.
  • the inventors put a gene that controls the degree of autumn dissemination and sits closest to each other by QTL analysis using a diploid wheat genetic map prepared using barley EST sequences. I found a DNA marker.
  • the genotype of the gene that governs the degree of autumn sowing is The polymorphism of the DNA marker amplified by the primer set that combines the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO., That is, the genotype of the DNA marker is “Triticum boeoticum Boiss. KT1-1” type; Triticum monococcum L. KT3-5 ”type can be detected and determined based on the genotype of the DNA marker. Please refer to the corresponding marker in the above table for the types of polymorphism and the base sequence of the polymorphic site.
  • the DNA marker on the short arm side of the gene that controls the degree of autumn dissemination on the 5A m chromosome is amplified by the primer set of SEQ ID NOs: 1255 and 1256 or the primer set of SEQ ID NOs: 1257 and 1258.
  • the DNA marker on the long arm side is amplified by the primer set of SEQ ID NOS: 1259 and 1260 or the primer set of SEQ ID NOS: 1261 and 1262.
  • the DNA marker comprising the DNA fragments described in the following (a) to (g) is included as an essential marker in at least 50 or more DNA markers used. It is preferable.
  • the inclusion of these markers is a very important trait as a wheat breeding target: dormancy after 0 weeks, dormancy after 3 weeks, heading date, 1000 grain weight, panicle length, number of spikelets and plant type It is possible to simultaneously determine the genotypes of loci involved in a single trial.
  • a DNA fragment amplified using a primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 735 and a primer having a base sequence ability shown in SEQ ID NO: 736 or shown in SEQ ID NO: 737
  • (b) A DNA fragment that is amplified using a primer set that combines a primer that also has the base sequence ability shown in SEQ ID NO: 739 and a primer that also has the base sequence ability shown in SEQ ID NO: 740, or the sequence shown in SEQ ID NO: 741
  • a DNA fragment amplified using a primer set comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 903 and a primer having the base sequence ability shown in SEQ ID NO: 904 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 905
  • a DNA fragment that is amplified using a primer set that is a combination of a primer consisting of a primer consisting of These are DNA markers linked to QTL that are involved in dormancy after 3 weeks.
  • a DNA marker other than the DNA markers described in (a) to (g) may be arbitrarily selected from the remaining 243 DNA markers, except for these, but preferential selection
  • a DNA marker linked to QTL present in the lA m chromosome involved in dormancy after 0 weeks (by the primer set of SEQ ID NOs: 575 and 576 or the primer set of SEQ ID NOs: 577 and 578) Amplified short arm DNA marker and long arm DNA marker amplified by the primer set of SEQ ID NO: 579 and 580, or the primer set of SEQ ID NO: 58 1 and 582).
  • the wheat breeding method according to the present invention can be more efficiently carried out by using an instrument.
  • an array type polymorphism detection instrument can be mentioned.
  • a device used for breeding wheat which is a DNA fragment or a part of it that is amplified by a primer set designed based on the wheat EST sequence using wheat genomic DNA as a saddle.
  • a primer set designed based on the wheat EST sequence using wheat genomic DNA as a saddle Is an instrument that is immobilized on a support and is capable of detecting polymorphisms present in the DNA fragment.
  • V is not limited to this.
  • the above-exemplified appliance will be described.
  • the DNA fragment amplified by the primer set designed based on the wheat EST sequence using the wheat genomic DNA as a cocoon is inherited in the wheat breeding method according to the present invention. It is a DNA marker mapped on the map. That is, the instrument may be an instrument in which a DNA marker mapped on the genetic map of diploid wheat is fixed on the support.
  • the DNA fragment to be fixed may be the whole or part of the amplified DNA fragment, as long as it contains a polymorphic site (eg, SNP site, deletion / insertion site, etc.).
  • a polymorphism such as SNP can be detected.
  • All of the DNA markers mapped to the genetic map of diploid wheat which preferably have DNA fragments derived from more than 50 DNA markers immobilized on the support, are immobilized. It is particularly preferred that Furthermore, it is preferred that the DNA anchored on the support is arranged in the same order as mapped on the genetic map, ie the order on the chromosome! /.
  • the support is not particularly limited as long as it can immobilize the polynucleotide, and may have any shape or material.
  • the material for the support for example, inorganic materials such as glass and silicon wafers, natural polymers such as paper, synthetic polymers such as nitrocellulose and nylon, synthetic polymers and natural polymers are generally used. List the gel bodies used be able to.
  • the shape of the support is not particularly limited as long as it has a sufficient area for immobilizing the polynucleotide.
  • a film having a two-dimensional extent such as a flexible film (membrane) and an intermediate flexible substrate can be preferably used. Note that the thickness of the substrate or film is not particularly limited, and may be appropriately set according to the material and application. Furthermore, various beads can be used as the support.
  • the wheat breeding method according to the present invention can be more efficiently carried out by using a kit.
  • a kit used for breeding wheat and having a primer set designed based on a wheat EST sequence can be mentioned. However, it is not limited to this.
  • the kit exemplified above will be described below.
  • kit is intended to mean a package including a container (eg, bottle, plate, tube, dish, etc.) containing a specific material.
  • a container eg, bottle, plate, tube, dish, etc.
  • an instruction manual for using the material is provided. Instructions for use may be written or printed on paper or other media, or attached to electronic media such as magnetic tape, computer-readable disk or tape, CD-ROM, etc. ,.
  • the primer set provided in the above-described kit includes a primer consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: n (n is an odd number) of SEQ ID NOS: 487 to 1458 and SEQ ID NO: n + A primer set in combination with a primer having a nucleotide sequence shown in 1 is preferred.
  • the primer sets provided in the kit are shown in SEQ ID NOS: 487 to 1458, which are more than one, and more preferably at least 50 or more are selected as the whole genome power of diploid wheat. It is particularly preferable to have all the primers with the ability to sequence.
  • the kit may include a primer set other than the primer set designed based on the barley EST sequence.
  • the specific configuration other than the primer set is not particularly limited, and necessary kits and kits may be selected by appropriately selecting necessary reagents and instruments.
  • necessary kits and kits may be selected by appropriately selecting necessary reagents and instruments.
  • the above-described polymorphism detection instrument may be configured as a kit. With the kit having the polymorphism detection instrument, the wheat breeding method according to the present invention can be implemented more rapidly and efficiently.
  • kit may be in accordance with the above-described method for breeding wheat according to the present invention.
  • Genomic DNA (1-5 g) was prepared by the method of Palotta et al. (Pallotta MA, Graham RD, Langridge P., Sparrow DHB and Barker SJ 2000. RFLP mapping of manganese efficiency in barley. Theor. Appl. Genel. 101: 11 00- 1108.), but RNase was not added to the final lysis TE buffer. [0207] (3) PCR product polymorphism detection
  • PCR reactions were performed in 96- or 384-well plates using the GeneAmp PCR System (Applied Biosystems).
  • PCR reaction system is 1 X Ex-Taqbuffer (Takara), forword-reverse primer 1.0 ⁇ M each, dNTPs 2.0 mM, MgCl 0.5 mM, template DNA lOng and
  • Ex-Taq DNA polymerase (Takara) 0.035U was added to ultrapure water to make 10 ⁇ 1. PCR conditions are 94 ° C for 2 minutes, 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute for 5 cycles, followed by 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, 72 ° C One minute was performed for 35 cycles at 72 ° C for 7 minutes.
  • Parents' genomic DNA was amplified by PCR using 2,695 pairs of Barley EST-derived primers, and agarose gel electrophoresis showed a band only on one parent (dominant marker), and the parents had different band sizes ( Size polymorphic marker) was selected.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the Sephadex G-50 (Amesham Biosciences) was filled into a Colum Loa der, flattened with a glass plate, and then reversed with the HV plate (MILLIPORE) placed on the Colum Loader. Then, Sephadex G-50 was transferred to the HV plate. Add ultrapure water 300 1 to the HV plate, leave it at room temperature for 3 hours, centrifuge at 900 XG for 2 minutes, recharge ultrapure water 1501, and repeat centrifugation at 900 XG for 2 minutes at least 3 times. It was.
  • BioDye Terminator vl.l Cycle Sequence RR-100 (Applied Bi osystems) 1.0 ⁇ U 5 X sequence buffer (Applied Biosystems) 1.0 ⁇ 1 and reverse primer 1.6 mM were used, and 5 ng of the purified PCR product was added and the total volume was adjusted to 10.0 1 with ultrapure water.
  • PCR conditions were 96 ° C for 2 minutes, followed by 25 cycles of 96 ° C for 10 seconds, 50 ° C for 5 seconds, and 60 ° C for 4 minutes.
  • the plate was centrifuged for several seconds, 125 mM EDTA 2.5 1 and 30% ethanol 30 1 were added, sealed with a seal, mixed by inversion several times, covered with aluminum foil, and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. After centrifugation at 3,100 g XG for 30 minutes, immediately reverse the plate and remove the supernatant. Add 30% 70% ethanol, centrifuge for 15 minutes with lJOOg XG, remove the supernatant again, 10 ⁇ l of Di Formamide (Applied Biosystems) was added, and after reacting with GeneAmp PCR Sy stem at 95 ° C. for 5 minutes, the plate was immediately transferred onto ice and protected from light.
  • Applied Biosystems Di Formamide
  • the purified sequence product was analyzed with ABI Prism 310 genetic analyzer (PE Applied Biosystems) or 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • the software was aligned using the software package software DNA SIS Pro Ver.2.0 (Hitachi Software), and the cleaved amplined polymorphism sequence (CAPS) was detected.
  • a barley EST-derived marker with polymorphism in parents was used for polymorphism analysis of RIL population. That is, PCR was performed using the selected primer set with the genomic DNA of the RIL population as a saddle type. As a result, 243 barley EST-derived markers were PCR-amplified in the RIL population.
  • MAPMAKER an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations.
  • the marker linkage threshold in each linkage group is LOD 3.0
  • the Kosambi map function is the map distance (KosamDi DD (1994) The estimation of map distances from recombination v alues. Annals of Eugenics 12 72-175) .
  • the total map distance was l, 038.5 cM and the average marker density was 3.0 cM / locus.
  • Fig. 1 shows a diploid comb genetic map prepared.
  • the top of each chromosome is the short arm end.
  • the right side of each chromosome shows the marker name, and the left side shows the distance (cM) of the short arm end force.
  • quantitative traits include Ear length, Culm length, Number of spikelets, First internode, ⁇ -internode length, Sugar paste f3 ⁇ 4, length (Rachis-interno de length), Heading date (day from April), Awn length, Glu me length, Plant type, Thousand- There are a total of 13 traits: kenel weight), cob shedding (Rach is brittleness), dormancy at 0 weeks (Dormancy at 0 week), and dormancy at 3 weeks (Dormancy at 3 weeks). There are three traits of qualitative development: Aleurone layer color, leaf hairiness (Leaf hairiness), and fall seeding degree (Vernalization requirement).
  • Heading date cocoon head, head length, number of spikelets, first internode length, cob internode length, leafy hair bud, paste layer color
  • the plant type was measured before harvesting, and the deciduousness of the cob, the culm length, the thousand grain weight, and the gill length were measured in the postharvest ear.
  • the heading date was the power of April 1st.
  • the culm length was measured from the ground to the base of the ear, and the head length was measured from the base of the ear to the tip (cm), 3 ears each.
  • the number of spikelets from the base of the spike to the tip of the spike was counted for 3 spikelets per line.
  • the length from the neck to the upper first node (cm) was measured for 3 lines in each line.
  • the cob internode length was measured for the length of the cob between the 10 spikelets in the center of the panicle (mm), and the culm length was measured for the length of the cocoon in the center of the panicle (cm).
  • Leaf blades were confirmed by touching the hair ears on the surface of the leaves, and 0 for sparse and 1 for dense.
  • the cob shedding was divided into four stages, with 0 being non-dropping and 3 being natural dropping.
  • the paste powder layer color was classified into four levels, with 0 being the complete white color and 3 being the full blue color.
  • the angle of the entire leaf with respect to the ground was indexed from five levels, almost vertical (0) to wiping (4).
  • the fall seeding degree test was conducted by absorbing seeds at 4 ° C for 4 days, then seeding 2 plants of 5 strains in one pot in a pot at a minimum room temperature of 15 ° C or more for 24 hours a day. Cultivated under long conditions and recorded the leaf development stage and number of leaves. The survey period was 120 days.
  • MAPMAKER / QTL ver. 1.1b (Lander ES, Botstein D (1989) Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics 121: 185-199) was used as the QTL analysis software. Simple interval mapping (SIM) was used as the QTL analysis algorithm. LOD 2.0 was used as a threshold for determining the presence or absence of QTL, and the QTL estimation interval was O.lcM.
  • Table 51 shows the results of QTL analysis of 13 types of quantitative traits. As apparent from Table 51, 1 QTL was detected in all three quantitative traits.
  • the QTL that sits on the chromosome lA m is based on the DNA marker amplified by the primer set (SEQ ID NOs: 589 and 590) designed based on the barley EST clone name k04016 and the barley EST clone name k00958. Must be present (interval: 24.6 cM) with the DNA marker amplified by the designed primer set (SEQ ID NOs: 589 and 590)
  • Peak LOD score is 2.2
  • Thousand-kenel weight (g) 2A m k04930-k06436 (11.7) 6.9 2.9 15.9 4.7 achis brittleness 4A m k03879-k! 6582 (29.4) 0.0 3.7 17.5 -0.7
  • Table 52 shows the QTL analysis results for the three types of qualitative traits. As is clear from Table 52, the positions of the three qualitative traits were identified.
  • the arrangement of markers was compared between the diploid wheat genetic map (linkage map) constructed in Example 1 and the barley genetic map (linkage map) in which the barley EST markers were mapped at high density.
  • the barley genetic map used for comparison was obtained from the cross between the brewing barley “Hardeum vulga re ssp. About 3,000 barley EST markers are mapped using the generated doubled haploid population, and the total distance of the map is 1,362.7 cM (Non-Patent Document 5: Nankaku N., Motoi Y ., Ueki ⁇ ., Sato ⁇ . And Takeda K. (2 005) High density SNP based EST map in barley. Proc. Plant & Animal Genomes XII I Conference, p317.) G
  • Figure 3 shows the total range of the diploid wheat genetic map constructed in Example 1 above. Based on the genotype of each marker using 96 selected DNA markers, which part originated from which parent The result of judging whether to do was shown.
  • the top of each chromosome is the short arm end, and the distance (cM) from the short arm end of the DNA marker used is shown on the right side of each chromosome.
  • Fig. 4 shows the results when the number of DNA markers used was 50, 25, and 14, compared with the case where 96 DNA markers were used.
  • the upper end of each chromosome is the short arm end, and the distance (cM) from the short arm end of the DNA marker used is shown on the right side of each chromosome.
  • the number of DNA markers was 50, recombination of a narrow region of lA m chromosome and 3A m chromosome was difficult to detect, but the same result was obtained when 96 other recombination sites were used. .
  • the number of DNA markers is 25, 3A m staining No recombination of the body was detected at all, and the accuracy of other chromosomes was reduced.
  • the number of DNA markers to be used in the 40 strains of the recombinant inbred line (RIL) created in Example 1 above, regarding the selection effect of QTL involved in dormancy after 0 weeks present on the lA m chromosome Were compared as 96, 50, 25, and 14. Specifically, for each individual of 40 lines, the genotype of the DNA marker used was determined, and the dormancy of seeds obtained from each individual immediately after harvesting was investigated by the method described in Example 2 above. did. Based on these results, we evaluated the dormancy-selective effect of the QTL genotype involved in the dormancy after 0 weeks present on the lA m chromosome. The QTL genotype was the DNA marker genotype closest to the QTL.
  • Figures 5, 6, 7, and 8 show the results of 96, 50, 25, and 14 DNA markers, respectively. From Fig. 5, when 96 DNA markers were used, the individual with QTL genotype A involved in dormancy after 0 weeks existing in lA m chromosome had a seed dormancy of S17.1% deeper, The selection effect was powerful.
  • Figure 6 shows that when 50 DNA markers were used, the seed dormancy of the individual with QTL genotype A, which is involved in the dormancy after 0 weeks, present on the lA m chromosome is 10.9% deeper and the selection effect was recognized.
  • Figure 25 shows that when 25 DNA markers are used, individuals with QTL genotype A that are involved in dormancy after 0 weeks in the lA m chromosome have a deeper seed dormancy of 5.9% and a selection effect.
  • Fig. 8 when 14 DNA markers are used, individuals with QTL genotype A involved in dormancy after 0 weeks present on lA m chromosome have a deep seed dormancy of -3.9% and are effective for selection. There was no fruit. Therefore, it was confirmed that the selection effect was recognized for a specific form by using 50 or more DNA markers.
  • the breeding target trait can be efficiently selected by the wheat breeding method according to the present invention. Furthermore, from the above results, the wheat breeding method according to the present invention For example, an individual that has a necessary region and does not have an unnecessary region is distinguished from a genomic region that is necessary for breeding and a genomic region that is unnecessary for breeding (genomic region that is preferably excluded). It can be easily understood that selective breeding of the body can be performed efficiently.
  • the method for breeding wheat according to the present invention uses a diploid wheat genetic map prepared using barley EST sequences.
  • the diploid wheat genetic map shows that 243 barley EST markers are seated throughout the wheat A genome and the distance between markers is 0-33.4 cM (average marker density: 3. OcMZlocus)
  • cM average marker density: 3. OcMZlocus
  • the wheat breeding method according to the present invention uses a diploid wheat genetic map prepared using a barley EST sequence, a high density of barley constructed with barley EST markers is used.
  • the barley genome information obtained from the genetic map can be efficiently used for wheat breeding. It also has the effect that a highly efficient breeding system such as a DNA array developed based on the barley gene sequence can be used as it is.
  • diploid wheat genetic map created using the barley EST sequence maps 16 useful agronomic traits QTLs or active genes, so 16 agriculturally useful Therefore, it is possible to quickly and easily breed wheat for selection of various traits, and to produce useful wheat varieties quickly and efficiently.
  • varieties useful for each agricultural trait can be bred by selecting traits of diploid wheat.
  • the genome of hexaploid wheat used for producing bread and straw is highly homologous to the genome of diploid wheat, the present invention
  • the trait and selection system identified in can be used to breed whole wheat.
  • a highly efficient breeding system such as a DNA array developed based on the barley gene sequence can be used as it is, and wheat can be bred using barley genome information. Therefore, it can be used for agriculture in general including crop production. It is also effective in the food industry using wheat as a raw material.

Abstract

　オオムギＥＳＴ配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用いるコムギの育種方法を提供する。 　オオムギＥＳＴ配列に基づいて設計されるプライマーセットを用い、コムギのゲノムＤＮＡを鋳型としてＤＮＡを増幅する増幅工程、および増幅されたＤＮＡ断片の多型を検出する多型検出工程を包含するコムギの育種方法である。ここで、上記ＤＮＡ断片は、二倍体コムギのゲノム全体を対象とする遺伝地図上にマップされているＤＮＡマーカーであり、当該遺伝地図上にマップされている少なくとも５０個以上のＤＮＡマーカーを用いる。

Description

明 細 書
ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用いる コムギの育種方法
技術分野
[0001] 本発明は、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用い るコムギの育種方法に関するものである。
背景技術
[0002] 従来、作物の育種は目標形質を有する栽培品種や野生種等を交配し、多数の個 体を実際に栽培して目標形質を有する個体を選抜し、当該目標形質を遺伝的に固 定ィ匕しなければならず、広大な圃場ゃ多大な人力、相当の年月が必要であった。ま た、目標形質が栽培環境因子に影響を受けやすい形質であれば、選抜個体が発現 している目標形質が遺伝子の表現型である力否かの判定が困難であった。
[0003] そこで、近年は育種期間の短縮、労働力および圃場面積の縮減、有用遺伝子の確 実な選抜を図るため、遺伝マーカーを指標とした選抜による育種法が用いられるよう になってきた。このような遺伝マーカーによる育種では、マーカーの遺伝子型により 幼苗段階で選抜が可能となり、目標形質の有無の確認も容易となる。遺伝マーカー を利用すれば効率的な育種が実現可能であるが、遺伝マーカーを利用した育種を 実現するためには、目標形質に強く連鎖した遺伝マーカーの開発が必須となる。
[0004] ところで、農業上重要な形質の多くは、雑種後代で連続的な変異を示すものが多 い。このような形質は、時間や長さなどの量的な尺度で測定されるので量的形質と呼 ばれている。量的形質は一般に、単一主働遺伝子支配の形質ではなぐ複数の遺伝 子の作用によって決定されて 、る場合が多 、。作物の育種にぉ 、て改良対象とされ る形質の多ぐ例えば収量や品質'食味等はこの量的形質であることが多い。
[0005] このような量的形質を司る遺伝子が染色体上に占める遺伝的な位置を QTL (Quan titative Trait Loci,量的形質遺伝子座）と称する。 QTLを推定する方法として、 QTL の近傍に存在する遺伝マーカーを利用する QTL解析が用いられる。 1980年代後半 に DNAマーカーが登場すると、 DNAマーカー利用による詳細な連鎖地図作成が大 きく進み、その地図に基づいて多くの生物で QTL解析が行われるようになった。
[0006] 以上のように、目標形質に連鎖する遺伝マーカーの開発は、染色体全体をカバー できる詳細な連鎖地図に基づいた精度の高い QTL解析により可能となり、得られた 遺伝マーカーを利用することにより、効率的な育種が実現できるといえる。
[0007] DNAマーカーに基づくコムギの遺伝地図に関しては、ハイブリダィゼーシヨンで得 られる RFLPマーカーによって最初に作製され (例えば非特許文献 1を参照）、その 後、遺伝地図構築のために PCRベースマーカーの利用が進められてきた。これらの マーカーには RAPDs (例えば非特許文献 2を参照）、 AFLPs (例えば非特許文献 3 を参照）、および SSRs (例えば非特許文献 4を参照）が主に用いられてきた。また、 最近、コムギにおいても ESTマーカーの開発が進み、連鎖地図上で ESTの位置付 けが報告されて 、る (例えば非特許文献 5を参照)。
[0008] 一方、ォォムギでは RFLPを用いた遺伝連鎖地図が構築されて以来、 STSs、 RA PDs、 SSRs, AFLPs, EST— SSRなどが地図構築に用いられてきた。なお、本発 明者らは、醸造用ォォムギ「はるなニ条」（Hordeum vulgare ssp. vulgare variety Har unanijo)と野生ォォムギ「11602」 (Hordeum vulgare ssp. spontaneum H602)との交酉己 から得られた倍加半数体（doubled haploid)集団を用いて、約 3,000のォォムギ EST マーカーがマップされ、 l,362.7cM (センチモルガン）をカバーするォォムギの高密 度連鎖地図 (遺伝地図）を構築して ヽる (非特許文献 6を参照)。
[0009] 遺伝地図構築によって、コムギとォォムギのゲノム構造は一部で比較が可能となり、 これらの種間にはマーカーの並びに相同性があることが報告されている（例えば、非 特許文献 7を参照)。
〔非特許文献 1〕
Chao S, Sharp PJ, Worland AJ, Koebner RMD, Gale MD (1989) RFLP- based tenet ic maps of wheat homoeologous group— 7 chromosomes. Theor Appl Genet 78: 493—5 04
〔非特許文献 2〕
Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV (1990) DNA polymorph isms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acias Res. 18(22):6531-5
〔非特許文献 3〕
Lolli C, Salvi ¾， Pasqualone A, Toberosa R， Blanco A (2000) Integration of AFLP markers into an RFLP— based map of durum wheat. Plant Breed. 119:393—401 〔非特許文献 4〕
Roder MS, Korzon V, Wendehake K, Plaschke J, Tixier MH, Leroy P, Ganal MW ( 1998) A microsatellite map of wheat. Genetics Soc America 149:2007-2023 〔非特許文献 5〕
Hossain KG, Kalavacharla V， Lazo GR， Hegstad J, Wentz MJ, Kianian PM, Simons K， Gehlhar S， Rust JL, Syamala RR， Obeori K， Bhamidimarri S， Karunadharma P， C hao S， Anderson OD, Qi LL, Echalier B， Gill BS, Linkiewicz AM, Ratnasiri A, Dubc ovsky J, Akhunov ED, Dvorak J, Miftahudin, Ross K， Gustafson JP, Radhawa HS, Di Ibirligi M, Gill KS, Peng JH, Lapitan NL, Greene RA, Bermudez— Kandianis CE， Sorr ells ME, Feril〇， Pathan MS, Nguyen HT， Gonzalez-Hernandez JL, Conley EJ， And erson JA, Choi DW, Fenton D， Close TJ, McGuire PE, Qualset CO, Kianian SF (20 04) A chromosome bin map of 2148 expressed sequence tag loci of wheat homoeolog ous group 7. Genetics. 168(2):687— 99
〔非特許文献 6〕
Nankaku Ν·， Motoi Υ·， Ueki Η·， Sato Κ· and Takeda K. (2005) High density SNP b ased EST map in barley. Proc. Plant & Animal Genomes XIII Conference, p317. 〔非特許文献 7〕
Varshney RK, Graner A, Sorrells ME (2005) Genie microsatellite markers in plants ： features and applications. Trends Biotechnol. 23(l):48-55
上述のように、従来構築されて！、る遺伝地図によってもコムギとォォムギのゲノム構 造は一部で比較可能であるが、より詳細な比較を行うためには、新たな遺伝地図の 構築が必要とされていた。特に、共通のマーカーにより構築されたコムギ遺伝地図と ォォムギ遺伝地図とを用いれば、より詳細な比較が可能になるものと考えられる。 発明者らは、上述のォォムギ ESTマーカーによる高密度遺伝地図を有しており、当 該高密度遺伝地図から得られる多数の有用な情報を有していることから、ォォムギ E ST配列を利用してコムギ遺伝地図の構築を着想した。ォォムギ EST配列を利用して コムギの遺伝地図が構築できれば、コムギの育種において、発明者らが有しているォ ォムギのゲノム情報を有効に利用することが可能となる。
[0011] 本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ォォムギ EST 配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用いるコムギの育種方法を提供 することにある。
発明の開示
[0012] 本発明者らは、上記の課題を解決するために、独自に開発したォォムギ EST配列 に基づくプライマーを用いて、二倍体コムギのゲノム DNAを铸型として増幅した増幅 DNA断片に品種間の多型を有するものを DNAマーカーとして選抜した。これらの D NAマーカーを二倍体コムギ染色体 (Aゲノム）上にマップすることにより、二倍体コム ギ遺伝地図を完成させた。発明者らは、さらに、 16種類の農業形質について、当該 二倍体コムギの遺伝地図を用いて QTL解析を行 、、全ての形質にっ 、て QTLを見 出すと共に、当該二倍体コムギの遺伝地図とォォムギ高密度遺伝地図とにおける D NAマーカーの並びに相関があることを見出した。その結果、当該二倍体コムギの遺 伝地図は、コムギの育種に非常に有用であることを確認し、本発明を完成させるに至 つた o
[0013] すなわち、本発明に係るコムギの育種方法は、ォォムギ EST配列に基づ 、て設計 されるプライマーセットを用い、コムギのゲノム DNAを铸型として DNAを増幅する増 幅工程、および増幅された DNA断片の多型を検出する多型検出工程を包含するコ ムギの育種方法であって、
上記 DNA断片は、二倍体コムギのゲノム全体を対象とする遺伝地図上にマップさ れている DNAマーカーであり、当該遺伝地図上にマップされている少なくとも 50個 以上の DNAマーカーを用いることを特徴として!/、る。
[0014] 上記ォォムギ EST配列は、配列番号 1ないし 486に示される塩基配列から選択さ れることが好ましい。
[0015] また、上記プライマーセットは、配列番号 487ないし 1458に示される塩基配列のう ち、配列番号 n(nは奇数）に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 n+ 1に 示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットであることが 好ましい。
また、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一のなかに、下記（a)〜（g)の少なくとも 1つに記載の DNA断片力もなる DNAマー カーを含み、さらに、穂長に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含す るちのでちよい。
(a)配列番号 587に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 588に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 589に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 59 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 591に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 592に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 593に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 59 4に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(c)配列番号 759に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 760に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 761に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 76 2に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(d)配列番号 763に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 764に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 765に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 76 6に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(e)配列番号 947に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 948に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 949に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 95 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(f)配列番号 995に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 996に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 997に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 99 8に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(g)配列番号 999に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1000に示され る塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される DNA断片または配列番号 1001に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1002に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用 V、て増幅される DNA断片。
また、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一のなかに、下記（a)〜（d)の少なくとも 1つに記載の DNA断片からなる DNAマー カーを含み、さら〖こ、稈長に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含す るちのでちよい。
(a)配列番号 759に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 760に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 761に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 76 2に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 763に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 764に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 765に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 76 6に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片 (c)配列番号 1235に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1236に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1237に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1238に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(d)配列番号 1239に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1240に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1241に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1242に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片。
[0018] また、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一のなかに、下記（a)に記載の DNA断片力もなる DNAマーカーを含み、さらに、小 穂段数に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含するものでもよい。 (a)配列番号 947に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 948に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 949に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 95 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片。
[0019] また、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一のなかに、下記（a)および (b)の少なくとも 1つに記載の DNA断片力もなる DNA マーカーを含み、さらに、第一節間長に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定するェ 程を包含するものでもよい。
(a)配列番号 939に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 940に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 941に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 94 2に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 943に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 944に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 945に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 94 6に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片。
また、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一のなかに、下記（a)〜（h)の少なくとも 1つに記載の DNA断片からなる DNAマー カーを含み、さら〖こ、穂軸節間長に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を 包含するものでもよ ヽ。
(a)配列番号 503に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 504に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 505に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 50 6に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 507に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 508に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 509に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 51 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(c)配列番号 1203に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1204に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1205に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1206に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(d)配列番号 1207に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1208に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1209に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1210に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片 (e)配列番号 1355に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1356に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1357に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1358に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(f)配列番号 1359に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1360に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1361に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1362に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(g)配列番号 1395に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1396に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1397に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1398に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(h)配列番号 1399に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1400に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1401に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1402に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片。
また、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一のなかに、下記 (a)に記載の DNA断片力もなる DNAマーカーを含み、さらに、出 穂日に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含するものでもよい。 (a)配列番号 947に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 948に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 949に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 95 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片。 [0022] また、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一のなかに、下記（a)〜（d)の少なくとも 1つに記載の DNA断片からなる DNAマー カーを含み、さら〖こ、芒長に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含す るちのでちよい。
(a)配列番号 1115に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1116に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1117に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1118に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(b)配列番号 1119に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1120に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1121に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1122に示される塩基配列力 なるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(c)配列番号 1407に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1408に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1409に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1410に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(d)配列番号 1411に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1412に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1413に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1414に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片。
[0023] また、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一のなかに、下記（a)〜（d)の少なくとも 1つに記載の DNA断片からなる DNAマー カーを含み、さら〖こ、護穎長に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含 するちのでちょい。 (a)配列番号 943に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 944に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 945に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 94 6に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 947に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 948に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 949に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 95 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(c)配列番号 1371に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1372に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1373に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1374に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(d)配列番号 1375に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1376に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1377に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1378に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片。
また、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一のなかに、下記（a)〜（c)の少なくとも 1つに記載の DNA断片からなる DNAマー カーを含み、さらに、草型に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含す るちのでちよい。
(a)配列番号 947に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 948に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 949に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 95 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 1259に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1260に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1261に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1262に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(c)配列番号 1263に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1264に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1265に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1266に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片。
[0025] また、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一のなかに、下記（a)および (b)の少なくとも 1つに記載の DNA断片力もなる DNA マーカーを含み、さらに、千粒重に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を 包含するものでもよ ヽ。
(a)配列番号 735に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 736に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 737に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 73 8に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 739に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 740に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 741に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 74 2に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片。
[0026] また、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一のなかに、下記（a)〜（d)の少なくとも 1つに記載の DNA断片からなる DNAマー カーを含み、さら〖こ、穂軸脱落性に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を 包含するものでもよ ヽ。
(a)配列番号 1071に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1072に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1073に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1074に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット 用いて増幅される DNA断片
(b)配列番号 1075に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1076に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1077に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1078に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(c)配列番号 1371に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1372に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1373に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1374に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(d)配列番号 1375に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1376に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1377に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1378に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片。
また、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一のなかに、下記（a)〜（f)の少なくとも 1つに記載の DNA断片からなる DNAマーカ 一を含み、さらに、休眠性 (0週間後）に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定するェ 程を包含するものでもよい。
(a)配列番号 575に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 576に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 577に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 57 8に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 579に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 580に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 581に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 58 2に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(c)配列番号 835に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 836に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 837に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 83 8に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(d)配列番号 839に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 840に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 841に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 84 2に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(e)配列番号 1123に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1124に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1125に示される塩基配列力 なるプライマーと配列 番号 1126に示される塩基配列力 なるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(f)配列番号 1127に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1128に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1129に示される塩基配列力 なるプライマーと配列 番号 1130に示される塩基配列力 なるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片。
また、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)〜（f)の少なく とも 1つに記載の DNA断片力もなる DNAマーカーを含み、さらに、休眠性（3週間後 )に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含する本発明に係るコムギの 育種方法は、ものでもよい。
(a)配列番号 591に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 592に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 593に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 59 4に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 595に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 596に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 597に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 59 8に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(c)配列番号 627に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 628に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 629に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 63 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(d)配列番号 631に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 632に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 633に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 63 4に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(e)配列番号 903に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 904に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 905に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 90 6に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片 (f)配列番号 907に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 908に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 909に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 91 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片。
[0029] また、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一のなかに、下記（a)および (b)の少なくとも 1つに記載の DNA断片力もなる DNA マーカーを含み、さらに、糊粉層色を支配する遺伝子の遺伝子型を判定する工程を 包含するものでもよ ヽ。
(a)配列番号 1055に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1056に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1057に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1058に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(b)配列番号 1059に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1060に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1061に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1062に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片。
[0030] また、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一のなかに、下記（a)および (b)の少なくとも 1つに記載の DNA断片力もなる DNA マーカーを含み、さらに、葉身毛茸を支配する遺伝子の遺伝子型を判定する工程を 包含するものでもよ ヽ。
(a)配列番号 1247に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1248に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1249に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1250に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片 (b)配列番号 1251に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1252に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1253に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1254に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片。
[0031] また、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一のなかに、下記（a)および (b)の少なくとも 1つに記載の DNA断片力もなる DNA マーカーを含み、さらに、秋播性程度を支配する遺伝子の遺伝子型を判定する工程 を包含するものでもよい。
(a)配列番号 1255に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1256に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1257に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1258に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(b)配列番号 1259に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1260に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1261に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1262に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片。
[0032] さらに、本発明に係るコムギの育種方法は、上記少なくとも 50個以上の DNAマー カーのなかに、下記（a)〜（g)に記載の DNA断片力もなる DNAマーカーを含み、さ らに、休眠性 (0週間後）、休眠性 (3週間後）、出穂日、千粒重、穂長、小穂段数およ び草型に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含することが好ましい。 (a)配列番号 735に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 736に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 737に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 73 8に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片 (b)配列番号 739に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 740に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 741に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 74 2に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(c)配列番号 903に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 904に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 905に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 90 6に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(d)配列番号 907に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 908に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 909に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 91 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(e)配列番号 947に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 948に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 949に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 95 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(f)配列番号 1123に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1124に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1125に示される塩基配列力 なるプライマーと配列 番号 1126に示される塩基配列力 なるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(g)配列番号 1127に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1128に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1129に示される塩基配列力 なるプライマーと配列 番号 1130に示される塩基配列力 なるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片。
[0033] 本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十 分わ力るであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白にな るだろう。
図面の簡単な説明
[0034] [図 1]ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を示す図であ る。
[図 2]二倍体コムギの 4Am染色体および 5Am染色体の遺伝地図に座乗するマーカーと ォォムギ遺伝地図に座乗するマーカーとの対応を示す図である。
[図 3]二倍体コムギの組換え近交系の 1系統を対象として、ゲノムのどの部分がどちら の親に由来するかのタイピングを 96個の DNAマーカーを用いて判定した結果を示 す図である。
[図 4]二倍体コムギの組換え近交系の 1系統を対象として、ゲノムのどの部分がどちら の親に由来するかのタイピングを 96個、 50個、 25個、 14個の DNAマーカーを用い て判定した結果を示す図である。
[図 5]0週間後の休眠性に関与する QTLの選抜効果を、 96個の DNAマーカーを用
V、て検討した結果を示す図である。
[図 6]0週間後の休眠性に関与する QTLの選抜効果を、 50個の DNAマーカーを用
V、て検討した結果を示す図である。
[図 7]0週間後の休眠性に関与する QTLの選抜効果を、 25個の DNAマーカーを用
V、て検討した結果を示す図である。
[図 8]0週間後の休眠性に関与する QTLの選抜効果を、 14個の DNAマーカーを用
V、て検討した結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0035] 本発明に係るコムギの育種方法は、ォォムギ EST配列に基づ ヽて設計されるブラ イマ一セットを用い、コムギのゲノム DNAを铸型として DNAを増幅する増幅工程、お よび増幅された DNA断片の多型を検出する多型検出工程を包含している。さらに、 上記 DNA断片は、二倍体コムギの遺伝地図上にマップされて!/、る DNAマーカーで ある。換言すると、本発明の育種方法は、ォォムギ EST配列を利用して作製された 二倍体コムギ遺伝地図を用いてコムギの育種を行う方法である。そこで、まず、ォォ ムギ EST配列および当該配列に基づ 、て設計されるプライマーセットにっ 、て説明 し、続ヽてォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図につ!/、て 説明する。
[0036] 〔ォォムギ EST配列およびプライマーセット〕
本発明において、プライマーセットの設計に用いられるォォムギ EST配列は、ォォ ムギ cDNAの塩基配列の一部であればよい。ォォムギ EST配列、すなわちォォムギ cDNAの塩基配列は、公知の分子生物学的手法を用いることにより取得することが できる。
[0037] 例えば、発明者らは、数種類のォォムギ品種の葉力 mRNAを調製し、公知の方 法により cDNAライブラリーを作製した。これらの cDNAが挿入されたプラスミドを铸 型とし、挿入部位の両外側のプラスミド部分の塩基配列をプライマーとして両側とも 1 回のシークェンス解析で読んだ塩基配列を品質調整し、ベクター配列を取り除くこと によりォォムギ EST配列を取得している。ただし、これに限定されるものではない。
[0038] 発明者らは、現在約 24万個のォォムギ EST配列をデータベース化している。なお 、発明者らが取得しているォォムギ EST配列は、 1つの cDNAクローンについて、 5， 側および 3 '側力 読んだ 2つの塩基配列が対応して 、る。
[0039] 本発明にお 、て用いられるプライマーセットは、ォォムギ EST配列に基づ 、て設計 されるものであればょ 、。ォォムギ EST配列に基づ 、て設計されるプライマーセットと は、ォォムギ EST配列の一部からなるフォワードプライマーと、ォォムギ EST配列の 相補配列の一部力もなるリバースプライマーとが 1対になったものが意図される。
[0040] 例えば、発明者らは、独自に取得した上記ォォムギ EST配列に基づ 、て、プライマ 一設計ソフトウェア Primer3を用いて各々の ESTにつ!/、てプライマーセットを設計して いる。これらのプライマーセットは、同一のアニーリング温度条件下の PCRによって D NA断片が増幅されるように設計されている。その結果、個々のプライマーセットごと に PCR条件を最適化する必要がなぐ同一条件下で同時に PCRを実施できるため、 非常に有用である。
[0041] 〔ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図〕
ォォムギ EST配列を利用して二倍体コムギ遺伝地図を作製することができる。具体 的には、例えば、以下のようにして作製することができる。
[0042] 発明者らは、二倍体コムギ野生種 Triticum boeoticum Boiss. (accession No. KT1- 1 )と二倍体コムギ栽培種 Triticum monococcum L. (accession No. KT3— 5)との交酉己力 ら育成した組換え近交系統（recombinant inbred lines以下「： RIL」と称する。） 93系統 および両親を用いて二倍体コムギの遺伝地図を作製した (実施例 1を参照のこと)。
[0043] まず、両親（T. boeoticum Boiss.および T. monococcum L.)のゲノム DNAをそれぞ れ铸型とし、ォォムギ EST配列に基づ 、て設計されたプライマーセットを用いて PCR を行った。そして、両親の多型が検出できるプライマーセットを選抜した。次に、選抜 されたプライマーセットを用いて RIL集団のゲノム DNAを铸型として PCRを行うことに より、 DNAマーカーとなり得る DNA断片を増幅する 243対のプライマーセットを見出 した。これら 243対のプライマーセットにより増幅される 243個の DNAマーカーおよ び 96個の既知コムギ RFLP (restriction fragment length polymorphism;制限酵素断 片長多型)マーカーを二倍体コムギの染色体上にマッピングすることにより、ォォムギ EST配列を利用した二倍体コムギ遺伝地図 (連鎖地図）を作製した。
[0044] 本発明に係るコムギの育種方法において、プライマーセットの設計に用いられるォ ォムギ EST配列は、特に限定されないが、配列番号 1ないし 486に示される塩基配 列から選択される少なくとも 1つ以上の塩基配列であることが好ましい。これらの塩基 配列は、発明者らが、上述の二倍体コムギの遺伝地図作製に実際に用いたォォムギ EST配列である。ここで、配列番号 n (nは奇数）および配列番号 n+ 1は同一の cDN Aを 5 '側力も読んだ塩基配列 (n)および 3 '側力も読んだ塩基配列 (n+ 1)である。し たがって、同一の cDNAについてはいずれか一方の EST配列を用いればよぐ発明 者らは、通常、 3 '側のォォムギ EST配列を用いて遺伝地図の作製を行っている。た だし、 5，側の EST配列を用いても同一の遺伝地図が作製できることを当業者は容易 に理解する。
[0045] また、本発明に係るコムギの育種方法において用いられるプライマーセットは、ォォ ムギ EST配列に基づ 、て設計されるものであれば特に限定されな 、が、配列番号 4 87ないし 1458に示される塩基配列のうち、配列番号 n (nは奇数）に示される塩基配 列からなるプライマーと配列番号 n+ 1に示される塩基配列力 なるプライマーとを組 み合わせたプライマーセットであることが好ましい。これらのプライマーセットは、発明 者らが実際に上述の二倍体コムギの遺伝地図作製に実際に用いたプライマーセット である。
[0046] ここで、配列番号 1に示されるォォムギ EST配列に基づ 、て設計されるプライマー セットは配列番号 487および配列番号 488に示される塩基配列力もそれぞれなるプ ライマーの組み合わせである。つまり、配列番号 1ないし 486に示される個々の塩基 配列 (ォォムギ EST配列）に基づくプライマーの塩基配列を示す配列番号は、プライ マー設計の基礎とするォォムギ EST配列の配列番号を mとすると、 (2 X m- l) +4 86および（2 X m) +486で表される。
[0047] コムギのゲノム DNAを铸型として、上述のォォムギ EST配列に基づ!/、て設計され るプライマーセットを用いて増幅される DNA断片中に多型があれば、当該 DNA断 片は DNAマーカーとなる。本発明に係るコムギの育種方法においては、当該 DNA マーカーとなり得る DNA断片が二倍体コムギの遺伝地図上にマップされていればよ い。
[0048] 上記配列番号 487ないし 1458に示される塩基配列のうち、配列番号 n (nは奇数） に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 n+ 1に示される塩基配列からな るプライマーとを組み合わせたプライマーセットにより増幅される DNA断片は、発明 者らによって「Tnticum boeoticum Boiss. KTl—丄」と「Triticum monococcumし KT3— 5 」との間に多型が見出されており、さらに、二倍体コムギの遺伝地図上にマップされて V、るので、本発明に係るコムギの育種方法に用いるプライマーセットとして好適である
[0049] 以下、発明者らが二倍体コムギ遺伝地図の作製に利用したォォムギ EST配列、プ ライマーセットおよび増幅 DNA断片（DNAマーカー）に見出された多型について詳 細に説明する。
[0050] 表 1および表 2に二倍体コムギの lAm染色体にマップされている DNAマーカーを 短腕からの距離の順に示した。同様に、 2Am染色体について表 3および表 4に、 3Am 染色体について表 5および表 6に、 4Am染色体について表 7および表 8に、 5Am染色 体について表 9および表 10に、 6Am染色体について表 11に、 7Am染色体について 表 12に示した。なお、各表においては、当該 DNAマーカーの増幅に用いられたプ ライマーセット設計の基礎となるォォムギ ESTクローン名をマーカー名として記載して おり、対応する配列番号は、上記ォォムギ ESTクローンの塩基配列に対応する配列 番号である。また、配列番号の記載がないものは、既知の RFLPマーカーである。
[表 1]
短腕末端 配列番号配列番号短腕末端から からの順序 クローン名 (5'側） (3，側） の距離 (cM)
1 k04435 1 2 0
2 k05258 3 4 2.3
3 k09231 5 6 2.7
4 k01431 7 8 4.7
5 CHSH 一 一 20.7
6 k09197 9 10 24.3
7 bcd98 一 - 35.5
8 rz166 一 一 44.5
9 rz251 - 一 45.8
9 cdo580 - 一 45.8
11 k08567 11 12 49.4
11 k08288 13 14 49.4
13 k01268 15 16 51.6
13 k08428 17 18 51.6
13 k08096 19 20 51.6
16 k10193 21 22 52.1
16 k08799 23 24 52.1
16 k01344 25 26 52.1
19 k07724 27 28 53.7
19 wec47 一 - 53.7
21 k08886 29 30 54.5
22 k07909 31 32 56.7
23 k09166 33 34 58.7
24 k08367 35 36 59.2
24 k01126 37 38 59.2
26 k09981 39 40 61.5
27 k07862 41 42 62.7
27 k10509 43 44 62.7
27 k03340 45 46 62.7
30 bcd454 - - 63.3
31 wec80 - - 64.8
32 k01953 47 48 65.4
33 k04957 49 50 71.6
34 k04016 51 52 74.1
35 k00958 53 54 85.3 2] 短腕末端 配列番号配列番号短腕末端から からの順序 クローン名 (5'側） (3'側) の距離 (cM)
36 bcd265a - 一 86.3
37 k02691 55 56 105.7
37 k05447 57 58 105.7
39 k08960 59 60 110.5
40 k04723 61 62 111.8
41 k08585 63 64 113.3
42 bcd307 一 - 114.7
43 wec92 - 一 116.3
44 k06270 65 66 121.1
45 k09402 67 68 121.7
46 k08529 69 70 127.6
47 k01199 71 72 129.5
47 k07906 73 74 129.5
47 k00288 75 76 133.6 3]
短腕末端 配列番号配列番号短腕末端から からの順序クローン名 (5'側） (3'側) の距離 (cM)
1 bcd348 一 一 0
2 cdo456 一 3.5
3 wec50 25
4 wec50 ― 一 25.9
5 k09259 77 78 42.6
5 k06156 79 80 42.6
7 k04152 81 82 44.2
8 k03429 83 84 50.4
8 k09013 85 86 50.4
10 k08436 87 88 51
11 k07732 89 90 51.6
12 k07640 91 92 52.2
13 k08866 93 94 54.1
14 k10006 95 96 62.1
15 k06946 97 98 63.6
16 k09978 99 100 64.1
16 k03636 101 102 64.1
16 rz753 一 一 64.1
16 k09169 103 104 64.1
16 k07593 105 106 64.1
16 k03301 107 108 64.1
16 k08203 109 110 64.1
16 k00871 111 112 64.1
24 k09891 113 114 65.2
24 k06833 115 116 65.2
26 k09216 117 118 66.9
26 k10967 119 120 66.9
28 wec54 ― ― 68
28 k04440 121 122 68
28 k01091 123 124 68
31 k04930 125 126 69.3
32 k06436 127 128 74.2
33 k11393 129 130 76.4
33 k01088 131 132 76.4
35 k01076 133 134 77.7 [0054] [表 4]
Figure imgf000029_0001
[0055] [表 5]
短腕末端 配列番号配列番号短腕末端から からの順序 クローン名 (5'側） (3'側) の距離 (cM)
1 k03920 161 162 0
2 k08239 163 164 0.5
3 k02515 165 166 10
4 k09849 167 168 14.3
5 cdo460 一 - 17.5
6 cdo395 一 - 23.4
7 k01240 169 170 28.8
7 k09336 171 172 28.8
7 k00796 173 174 28.8
10 k08649 175 176 29.3
11 cdo407 一 - 36.1
12 k06965 177 178 47
12 k04672 179 180 47
14 k08093 181 182 49.8
15 k04322 183 184 50.4
16 wec53 一 - 54.2
17 k06579 185 186 60.8
18 k04677 187 188 62
18 k06778 189 190 62
20 k06839 191 192 62.5
21 wee 102 一 一 63.9
22 k05129 193 194 65.5
23 abc176 一 一 69.7
24 psr578 一 一 71.2
25 k09883 195 196 72.1
26 k07096 197 198 72.6
27 k02491 199 200 73.2
28 k08106 201 202 80.2
29 k01229 203 204 85.6
30 rz444 一 - 88.1
30 k08244 205 206 88.1
32 k07837 207 208 89.2
33 k01163 209 210 94.5
34 k02004 211 212 110.5
35 wec97 一 一 113.1 ] 短腕末端 配列番号配列番号短腕末端から からの j頃序 クローン名 (5'側） (3'側) の距離 (cM)
36 k01412 213 214 1 1 7.3
37 k07920 215 216 1 17.6
38 abc1 74 一 - 128.6
39 k01427 217 218 137
40 k06054 219 220 138
41 psr1 205 - 一 138.6
42 k00686 221 222 146.3
43 k08619 223 224 148
44 k04598 225 226 149.1
45 k08978 227 228 150.8
46 k04421 229 230 160.4
47 wec57 - - 160.8
48 k06868 231 232 165.2
49 JIP 一 一 179.5 7]
Figure imgf000032_0001
]
Figure imgf000033_0001
]
Figure imgf000034_0001
10]
Figure imgf000035_0001
11]
Figure imgf000036_0001
12]
Figure imgf000037_0001
表 13および表 14に二倍体コムギの 1A1 "染色体にマップされている DNAマーカー の増幅に用いられたプライマーの配列番号および当該 DNAマーカーに見出された 多型の種類を示した。同様に、 2Am染色体について表 15および表 16に、 3Am染色 体について表 17および表 18に、 4Am染色体について表 19および表 20に、 5Am¾ 色体について表 21および表 22に、 6Am染色体について表 23に、 7Am染色体につ いて表 24に示した。
[表 13]
Figure imgf000038_0001
表 14] Name 使用プライマー (配列番号） marker type bcd265a 一 - RFLP k02691 597 598 CAPS k05447 601 602 CAPS k08960 605 606 SNIP k04723 609 610 CAPS k08585 613 614 SNP bcd307 - 一 RFLP wec92 - - RFLP k06270 61 7 61 8 CAPS k09402 621 622 CAPS k08529 625 626 SNP k01 199 629 630 SNP k07906 633 634 SNP k00288 637 638 CAPS 15]
Name 使用プライマ一 (配列番号） marker type
bcd348 一 - RFLP
cdo456 - 一 RFLP
wec50 - 一 RFLP
wec50 - 一 RFLP
k09259 641 642 CAPS
k06156 645 646 CAPS
k041 52 649 650 size poly (codominant) k03429 653 654 CAPS
k09013 657 658 CAPS
k08436 661 662 size poly (codominant) k07732 665 666 CAPS
k07640 669 670 SNP
k08866 673 674 SNP
k10006 677 678 CAPS
k06946 681 682 CAPS
k09978 685 686 CAPS
k03636 689 690 CAPS
rz753 一 - RFLP
k091 69 693 694 CAPS
k07593 697 698 CAPS
k03301 701 702 CAPS
k08203 705 706 SNP
k00871 709 710 SNP
k09891 71 3 714 SNP
k06833 71 7 718 CAPS
k09216 721 722 CAPS
k10967 725 726 SNP
wec54 - RFLP
k04440 729 730 CAPS
k01 091 733 734 SNP
k04930 737 738 CAPS
k06436 741 742 CAPS
1 393 745 746 SNP
k01 088 749 750 CAPS
k01 076 753 754 SNP 16]
Figure imgf000041_0001
17]
Figure imgf000042_0001
18]
Figure imgf000043_0001
19]
Figure imgf000044_0001
20]
Figure imgf000045_0001
21]
Figure imgf000046_0001
22]
Figure imgf000047_0001
23]
Figure imgf000048_0001
24]
Figure imgf000049_0001
表 13〜表 24には、多型の種類として CAPS、 SNP、 size_poly、 RFLPの 4種類を 示した。このうち RFLPは既知のマーカーを利用したものであり、発明者らがォォムギ EST配列を利用して取得した二倍体コムギの DNAマーカー中に見出した多型は C APS、 SNPおよび size—polyの 3種類に分類されている。 size_polyは増幅断片の長さ に ヽ力め O多型である。 size— polyのつ codominantは「Triticum boeoticum Boiss. K Τ1-1」と「Triticum monococcum L. KT3-5」のいずれを铸型とした場合にも DNAが増 幅される力 長さに違いがあるものであり、 dominantはいずれか一方のみの DNAが 増幅されるものである。 size_polyは、増幅 DNA断片を電気泳動に供し、バンドの位置 の違い、またはバンドの有無により多型を検出することができる。
[0077] CAPSは制限酵素認識配列の有無による多型である。制限酵素認識配列中の一 塩基多型に基づくものが大多数であるが、一塩基以上の挿入欠失に基づくものも含 まれる。マーカーの種類を SNPと記載したものは、一塩基多型または挿入欠失が制 限酵素認識配列中に存在しないマーカーである。 CAPSは増幅 DNA断片を制限酵 素処理した後に電気泳動に供し、バンド数またはバンドの位置により検出することが できる。 CAPS以外の SNPは SNPのタイピング、すなわち一塩基多型部位または揷 入欠失部位の塩基を実際に確認することにより検出できる。ただし、 CAPSについて も SNPのタイピングにより多型を検出できることはいうまでもない。
[0078] 表 25〜表 38に、発明者らが取得した DNAマーカーのうち、 CAPSマーカーにお ける「Triticum boeoticum Boiss. KTl-1 J t rTriticum monococcum L. KTJ- 5」の一; ¾ 基多型または挿入欠失近傍の塩基配列、制限酵素名および当該制限酵素の認識 配列を示した。表 25および表 26は lAm染色体について、表 27〜表 29は 2Am染色 体について、表 30および表 31は 3Am染色体について、表 32および表 33は 4Am染 色体について、表 34および表 35は 5Am染色体について、表 36および表 37は 6Am 染色体について、表 38は 7Am染色体について、それぞれ示した。これらの中には 1 断片中に複数の多型があるものも含まれて 、る。
[0079] また、表 39〜表 50に、発明者らが取得した DNAマーカーのうち、 SNPマーカー（ CAPS以外)の一塩基多型近傍の塩基配列を示した。表 39および表 40は lAm染色 体について、表 41および表 42は 2Am染色体について、表 43および表 44は 3Am染 色体について、表 45および表 46は 4Am染色体について、表 47および表 48は 5Am 染色体について、表 49は 6Am染色体について、表 50は 7Am染色体について、それ ぞれ示した。これらの中には 1断片中に複数の多型があるものも含まれて 、る。
[0080] 表 25〜表 50中、一塩基多型または挿入欠失を示す塩基に下線を付した。なお、 配列表においては、一塩基多型部位の塩基を「ユニバーサルコード」で示した。また
、表 9〜表 16に記載の制限酵素認識配列についても、「ユニバーサルコード」で表示 できる塩基にっ 、てはこれを用いた。
[0081] 「ユニバーサルコード」は以下の通り定義されて 、る。
111 :八またはじ
r: Gまたは A
w:AまたはT
5 : 0またはじ
：丁またはじ
0または丁
:八または〇またはじ
八またはじまたは丁
(1:八または0または丁
b : Gまたは Cまたは T
n: (Aまたは Cまたは Gまたは T)または（不明または他の塩基）
[0082] [表 25]
S260083
Figure imgf000052_0001
〔〕0084
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000054_0002
KT1 1
クローン名 KT35 配列番号制限酵素 認識配列0086 k07593 TTGTAACTTCCGCGTTCACTT 1528 BstUI CGCG
TTGTAACTTCTGCGTTCACTT
k03301 AAGTGATGATCAGGAGCCAGA 1529 Mbol GATC
AAGTGATGATGAGGAGCCAGA
k06833 -GGTCACGAACAGAAC 1534 BstUI CGCG
AGGCACGGTCGCGAACAGAAC 1535
k09216 GCTTGGCCTCGATCATTGCAA 1536 Mbol GATC
CCTTGGCCTCAATCATTGCAA
k04440 TAGTGAA丌 AATAACAGTAGG 1538 Asel ATTAAT
TAGTGAA丌 AGTAACAGTAGG
k04930 ATGAGACCCCGGCAGCGCCGT 1541 Bcnl CCSGG
ATGAGACCCCAGCAGCGCCGT
k06436 GACCCACCAGATAGGGCTCTG 1542 Mval CCWGG
GACCCACCAGGTAGGCCTGTG
k01088 GGTGTTGCGTCTCCTCACCAT 1544 BsmAI GTCTCN
GGTGTTGCGTTTCCTCACCAT
k04002 GTGAAACGCCAGCGTCAGATG 1550 HapII CCGG
GTGAAACGCCGGCGTCAGATG
k06574 CCACTGCCGCT6CAGGCTGGC 1552 Pstl CTGCAG
CCACTGCCGCCGCAGGCTGGC
k09946 TTGCGCGGCGGCCAAGAAGGC 1557 Haelll GGCC
TTGCGCGGCGACCAAGAAGGC
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000056_0002
〕〕〔〔0880
Figure imgf000057_0001
S320089
Figure imgf000058_0001
Figure imgf000059_0001
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s^〔〕w
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sa2w009
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^s §37
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sffl〔〕w0095
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39] 001V009101V00V01D90V0
0617 L 001V000101900V01990V0 οΐ7εεο ι
9V11V109V090100V90000
68W 9V11V109V0V9100V90000
90VVV1V0V00V1VV0V00VV
OOVVVlVOVOiVlVVOVOOVV
VVOVOOVIVOOOVVVIVOVOV
8 VVOVOOVlVDiOVVVlVOVOV L8660 1
1V9V00V00901111VV9VDV
m i 丄爾 09V009Vm丄 VV9V9V
010190V000V01909VVD01
019190V000901909VV901
VV0010090VV0900D1VV0V
VV0910990V0090001VV0V ん 9S額
丄 03V9i)i)9VV9iHVi)VCllV99
丄 i)i)V90i)9VVVi)丄 丄 V99 6 L60 1
丄 (WVi )丄 09V3i)丄 0390丄 9丄3
丄 iWVi)0ii)i)V99丄 3393丄 ί)丄 0 Z.6 L60 I 丄丄 丄 39丄丄 £)丄丄 9E)i V π
丄丄 9V3Vi)V_Li)V丄丄 9丄丄 99(HV Z.6 L60 I
V0111VV901VV099V10VV0
OL l V0111VV901DV0DDV10VV0
0V0V90100901D91V191V1
69 0V0V00100911091V191V1
IV91V1VVV91101910V0V0
89 1V91V1VVVD0101D10V0V0 0
V0110V001V0VV10119111
9 V0110V001V1VV1011D111
19901V9990101V0199909
99 10901V0990V01V0199909
VIDIODIVIVVVVOOOIVOVV
V191001V1VOVV0001VOVV
0909VV0VV0V0900011110
0900VV0VV0109D9011110
00V00V9VV09VVVV11V0VV
00V09V9VV0VVVVV11V0VV
^銎 ½2歷 981>i
丄 M T9lC/900Zdf/X3d ャ9 C860Z0/ .00Z OAV [0097] [表 40]
Figure imgf000067_0001
[0098] [表 41] //:/ O 06ϊ9ϊε900ί1£ ε860ίο/-οοίAV 99
Figure imgf000068_0001
[0099] [表 42]
Figure imgf000069_0001
[0100] [表 43]
Figure imgf000070_0001
[0101] [表 44]
Figure imgf000071_0001
[0102] [表 45]
KT1 1
クローン名 KT35 配列番号 k04149 ATAATATGATTAAAAAAGTGT 1 61 2
ATGATATGATAAAAAAAGTGT
k04149 TGGCAGTAAGGAAACTAATCC 1 61 3
TGGCAGTAAGAAAACTAATCC
k04149 AGGTTTCAGATAGTTCTTACT 1 614
AGGTTTCAGAGAGTTCTTACT
k06709 ATCTGTCTCCGTGCCTCTGAA 1615
ATCTGTCTCCATGCCTCTGAA
k06709 CTCTCATTTGTTAAGGTGGTA 1616
CTCTCATTTGGTAAGGTGGTA
k06709 ATCTGTCTCCGTGCCTCTGAA 1617
ATCTGTCTCCATGCCTCTGAA
k06709 CTCTCATTTGTTAAGGTGGTA 1618
CTCTCATTTGGTAAGGTGGTA
k08184 GAGGGAAGAACCAGATACAAG 1620
GAGGGAAGAAGCAGATACAAG
k081 84 CGGGCCCCGATGCCTGCAGCA 1621
CGGGCCCCGACGCCTGCAGCA
k081 84 TTGAGGGTGGTGAAGTCGACG 1622
TTGAGGGTGGCGAAGTCGACG
k03981 CAGTCTTAATGATGTTAATGC 1623
CAGTCTTAATAATGTTAATGC
k03981 TTTAGGGATCGAGATGAGTTT 1 624
TTTAGGGATCAAGATGAGTTT
k03981 CGTCGGATTCGACGTCTCCAT 1625
CGTCGGATTCAACGTCTCCAT
k01014 CAACCCAAAATGGAATCGACA 1 626
CAACCCAAAACGGAATCGACA
k01014 TCCTCCGTATATTGTGCTATG 1 627
TCCTCCGTATGTTGTGCTATG
k04748 TCACCTTGACGAACTCCTCGT 1634
TCACCTTGACAAACTCCTCGT
k06467 CCAGCCCCAACCAGCGTCCGT 1 642
CCAGCCCCAATCAGCGTCCGT
k06467 GCACCCGCCGCAGGCCTTGCT 1 643
GCACCCGCCGTAGGCCTTGCT [0103] [表 46]
Figure imgf000073_0001
[0104] [表 47] [solo]
Figure imgf000074_0001
T9lC/900Zdf/X3d ZL C860Z0/.00Z OAV KT1 1
クローン名 KT35 配列番号 k02341 CCTGCTGTTCATCATCCGGCT 1702
CCTGCTGTTCGTCATCCGGCT
k03767 CGAAGATGATGTGAAGGCGGT 1704
CGAAGATGATGTGAAGGCGGT
k08133 CTTTCACGGCATAGAAGCGGC 1 705
CTTTCACGGCGTAGAAGCGGC
k08133 CCTTGGCACCGTAGCGGTGCT 1 706
CCTTGGCACCATAGCGGTGCT
k03289 CTACTAGTAGCACATGCAACC 1707
CTACTAGTAGTACATGCAACC
k03289 TAATGTTACAAGCAATGAGAA 1708
TAATGTTACACGCAATGAGAA
k08198 GGTACTCGGAGACGAGGTCGT 1 709
GGTACTCGGAGACGAGGTCGT
k01301 GTTTTTTTTTTTAGAAAAGAA 1710
GTTTTTTTTT— AGAAAAGAA 171 1 k10866 GTAGCAGCGCAAGCTCCGCCA 1 712
GTAGCAGCGCGAGCTCCGCCA
k10866 CATCAGCTCCACTAGCCTCTC 1 713
CATCAGCTCCGCTAGCCTCTC
k10866 TACAATCTCTGAACACCCATA 1 714
TACAATCTCTCAACACCCATA
k10866 AGATCATGCTTGGACACTTGG 1 715
AGATCATGCTGGGACACTTGG 9]
KT1 1
クローン名 KT35 配列番号 k08070 AGATCAGGCGAGGTTGCCGCA 1 721
AGATCAGGCGGGGTTGCCGCA
k09062 AACATGGATATAAGGATATAT 1 722
AACATGGATACAAGGATATAT
k08994 TGGTGCCGTCGTGTCATCCTC 1 724
TGGTGCCGTCATGTCATCCTC
k07267 TTCTTGGGTTATTGACCCAAC 1726
TTCTTGGGTTCTTGACCGAAC
k07267 CAGCGAAGCAGTGCGAGGGTG 1727
CAGCGAAGCATTGCGAGGGTG
KT1 1
クローン名 KT35 配列番号 k08171 TCATGAGCATATCCATCAGAA 1737
TCATGAGCATGTCCATCAGAA
k01269 ATTCAGCAAGGGGGAAATGGG 1738
ATTCAGCAAGAGGGAAATGGG
k091 94 AGCGTACGCGGCGGATGTCCG 1742
AGCGTACGCGACGGATGTCCG
k00988 GAAATGCAGATTCATTGACCT 1 743
GAAATGCAGACTCATTGACCT
k08749 TCTCTCTGGCGAGCGATCCAG 1 45
TCTCTCTGGCAAGCGATCCAG
k07302 ACAAGTACTCTAGATCCCTAT 1747
ACAAGTACTCCAGATCCCTAT
k06507 TGTCGACTTCAGAGGGCGGCA 1748
TGTCGACTTCGGAGGGCGGCA
k07581 ACGACAGGTCGACGATCCGGT 1750
ACGACAGGTCAACGATCCGGT
k04173 TGTTGAATTA-ATTCAAGCCA 1751
TG丌 GAATTACATTCAAGCCA 1752 k09900 TGATCTCCTCTGTTCCCTCGG 1753
TGATCTCCTCCGTTCCCTCGG
k06964 ACGGAAAGAATGCCGCCGGAT 1 755
ACGGAAAGAACGCCGCCGGAT
k04741 ATCTACAACAGCATGGCGTCT 1758
ATCTACAACATCATGGCGTCT
k04741 GAAAAATCTACAGCCCTTTCA 1759
GAAAAATCTAAAGCCCTTTCA
k04770 ATATACACCGGCGTTTCTATC 1762
ATATACACCGCCGTTTCTATC
k04770 TGCGGATCACGGAGTTGAGGT 1763
TGCGGATCACAGAGTTGAGGT
k00906 CCGGTCACACACTCCTGCTTA 1764
CGGGTCACACGGTGGTGC丌 A
〔コムギの育種方法〕
本発明に係るコムギの育種方法は、ォォムギ EST配列に基づ ヽて設計されるブラ イマ一セットを用い、コムギのゲノム DNAを铸型として DNAを増幅する増幅工程、お よび増幅された DNA断片の多型を検出する多型検出工程を包含するものであって 、上記 DNA断片は、二倍体コムギのゲノム全体を対象とする遺伝地図上にマップさ れている DNAマーカーであり、当該遺伝地図上にマップされている少なくとも 50個 以上の DNAマーカーを用いるものであればよ!、。
[0108] 上記二倍体コムギは Aゲノム力 なるコムギであるため、本方法は、 Aゲノムを有す るコムギに適用することができる。すなわち、 Aゲノム力もなる二倍体コムギ、 Aゲノム および Bゲノムからなる四倍体コムギ、並びに Aゲノム、 Bゲノムおよび Dゲノムからな る六倍体コムギの育種に用いることができる。なかでも、 Aゲノム力もなる二倍体コム ギの育種に用いることが好適であり、特に、栽培種の Aゲノム力もなる二倍体コムギに 、野生種または栽培種の Aゲノム力 なる二倍体コムギカ 有用形質を交雑により導 入する育種過程において本方法を使用することが最適である。さらに、有用な形質の 導入された二倍体コムギと、四倍体コムギあるいは六倍体コムギとを交雑して、倍数 性の高いコムギに二倍体コムギの有用形質を導入することもできる。
[0109] 広範囲のマーカー情報を 1回の試行で得るためには、増幅工程において多数のプ ライマーセット同時に用い、後段の多型検出工程において多数の DNAマーカーの 多型を同時に検出することが好ましい。そのため、本方法においては少なくとも 50個 以上の DNAマーカーを用いる。当該 50個以上の DNAマーカーは、 Aゲノム全体を カバーできるように適度なマーカー間距離で選択されることが好ましい。本発明者ら が作製した二倍体コムギ遺伝地図にマップされているマーカーの場合、適度なマー カー間距離としては、平均マーカー間距離が 25cM以下となるように選択されること が好ましぐより好ましくは 20cM以下、さらに好ましくは 15cM以下、特に好ましくは 1 OcM以下、最も好ましくは 5cM以下である。二倍体コムギの遺伝地図にマップされて いる 243個の全 DNAマーカーを用いた場合、平均マーカー間距離は 5cM以下とな り、これが最も好ましいことは言うまでもない。
[0110] 増幅工程において、 DNAを増幅する方法は特に限定されず、公知の核酸増幅法 を適宜選択して用いることができる。なかでも、 PCR法は、本工程に用いる核酸増幅 法として好適である。特に、配列番号 487ないし 1458に示される塩基配列のうち、配 列番号 n (nは奇数）に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 n+ 1に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを複数同時に用 いる場合には、これらのプライマーセットは同一のアニーリング温度条件下の PCRに よって DNA断片が増幅されるように設計されているため、 PCR法を用いることが最適 である。
[0111] 増幅工程において、被検コムギ個体力 ゲノム DNAを抽出する方法は、特に限定 されず、例えば、 CTAB法（Murray HG et al. Nuc Acid Res (1980) 8: 4321- 4325.参 照）、 Murray等の方法（Nucleic Acids 1¾3.,8: 4321-4325,1980参照）など公知のゲノ ム DNA抽出法を用いることができる。
[0112] また、プライマーは公知の方法によって合成することができる。例えば、市販の DN A合成機を用いて、取扱説明書にしたがって合成すればよい。
[0113] 多型検出工程において、多型を検出する方法は、検出対象の多型の種類に応じて 適宜選択すればよい。上述のように、配列番号 487ないし 1458に示される塩基配列 のうち、配列番号 n (nは奇数）に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 n+ 1に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットにより増 幅される DNA断片に見出される多型は、 CAPS、 SNPおよび size_polyの 3種類に分 類できる。
[0114] size_polyは、例えば、増幅 DNA断片（PCR産物）を電気泳動に供し、バンドの位置 の違い、またはバンドの有無により多型を検出することができる。 CAPSは、例えば増 幅 DNA断片を制限酵素処理した後に電気泳動に供し、バンド数またはバンドの位 置により検出することができる。 SNPは SNPのタイピング、すなわち一塩基多型部位 または挿入欠失部位の塩基を実際に確認することにより検出できる。例えば、市販の SNP検出用キットなどを用いれば簡便に SNPのタイピングを行うことができる。なお、 多型を検出する方法は、上記例示に限定されるものではない。また、上記以外の多 型にっ 、ても公知の検出方法を用いて検出することができる。
[0115] 本発明に係る育種方法を用いることにより、コムギの育種、特に二倍体コムギの育 種を大幅に効率ィ匕することが可能となる。具体的には、全染色体に座乗する DNAマ 一力一を網羅的に増幅し、その多型を検出することができるため、複数の有用形質 の導入を一度に確認することができる。また、ォォムギ EST配列を利用して作製され た二倍体コムギ遺伝地図とォォムギ ESTマーカーを用いて作製されたォォムギ遺伝 地図との対応関係により、ォォムギの情報を利用してコムギの育種を行うことも可能で ある。例えば、ォォムギで明らかとなっている QTL近傍の DNAマーカーに対応する コムギの DNAマーカーを検出することにより、当該 QTLの有無を推定することができ る。
[0116] 本発明に係る育種方法においては、上記増幅工程および多型検出工程以外のェ 程を包含するものであってもよい。例えば、特定の形質に関与する遺伝子座の最も 近傍に座乗する DNAマーカーを特定し、当該 DNAマーカーの遺伝子型を判定す る工程を包含することが好まし!/、。
[0117] 発明者らは、上述したように、ォォムギ EST配列に基づいて設計されたプライマー セットで増幅される 243個の DNAマーカーおよび 96個の既知 RFLPマーカーがマツ ビングされた二倍体コムギ遺伝地図を作製し、当該遺伝地図を用いて 16種類の農 業形質について QTL解析を行った (実施例 2を参照のこと)。その結果、各 QTLまた は遺伝子の最も近傍に座乗する DNAマーカーを見出している。したがって、本発明 に係る育種方法において、増幅工程、多型検出工程に引き続き、特定の形質に関 与する遺伝子座 (遺伝子)の遺伝子型を判定する工程 (以下「遺伝子型判定工程」と 称する。）を行うことにより、目的の形質の導入を判定することが可能となる。
[0118] 遺伝子型判定工程においては、各 QTLまたは遺伝子を挟む DNAマーカーのうち 、いずれか一方 (短腕側または長腕側）の DNAマーカーの多型 (遺伝子型）に基づ V、て当該遺伝子座 (遺伝子）の遺伝子型を判定することができる力 両側の DNAマ 一力一の多型 (遺伝子型）に基づ 、て判定することが好ま 、。
[0119] 以下、本発明に係る育種方法において判定可能な形質について説明する。
[0120] (1)穂長（Ear length)
穂長は穂首力 穂の先端までの長さを示すものであり、穂長が長いものの方が粒の 充実を妨げないため、粒の形状が良好となる傾向がある。それゆえ穂長の改変は農 業上重要な形質の 1つであり、育種目標の 1つとなっている。なお、穂長は量的形質 であり、複数の遺伝子座により決定される形質である。
[0121] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、 4個の穂長に関与する QTLを見出した。各 QTLの遺伝子型 は、下記の配列番号に示される塩基配列力 なるプライマーを組み合わせたプライ マーセットにより増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマーカーの遺 子型 »「Triticum boeoticum Boiss. KTl— 1」型である力 「Tnticum monococcum L. KT3-5」型であるかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて判定するこ とができる。なお、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記表の該当 するマーカーを参照のこと。
[0122] lAm染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 587および 5 88のプライマーセット、または配列番号 589および 590のプライマーセットにより増幅 される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 591および 592のプライマーセ ット、または配列番号 593および 594のプライマーセットにより増幅される。
[0123] 2Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 759および 7 60のプライマーセット、または配列番号 761および 762のプライマーセットにより増幅 される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 763および 764のプライマーセ ット、または配列番号 765および 766のプライマーセットにより増幅される。
[0124] 3Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 947および 9 48のプライマーセット、または配列番号 949および 950のプライマーセットにより増幅 される。なお、当該 QTLは 3Am染色体の長腕末端に座乗するため、当該 QTLの長 腕側にォォムギ EST配列に基づ 、て設計されるプライマーセットにより増幅される D NAマーカーは存在しない。ただし、既知の RFLPマーカー（マーカー名： JIP)が長 腕側に存在する。
[0125] 4Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 995および 9 96のプライマーセット、または配列番号 997および 998のプライマーセットにより増幅 される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 999および 1000のプライマーセ ット、または配列番号 1001および 1002のプライマーセットにより増幅される。
[0126] (2)稈長（Culm length)
稈長とは地際力 穂首までの長さのことである。稈長が長いものは風の抵抗を受け 易ぐ降雨時に雨滴が穂に付着して重量を増す結果、倒れやすい傾向がある。その ため、栽培品種においては稈長が適度に短いことが好ましい形質であるといえる。ま た、あまり稈長が短すぎると、稈に基づいて展開している葉が十分に光を受けること ができないばかりか、機械収穫の際に穂の部分を効率よく収穫できなくなる。したが つて優良形質を有する品種を育種する際には、稈長を適度な長さに調節する必要が ある。なお、稈長は量的形質であり、複数の遺伝子座により決定される形質である。
[0127] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、 2個の稈長に関与する QTLを見出した。各 QTLの遺伝子型 は、下記の配列番号に示される塩基配列力 なるプライマーを組み合わせたプライ マーセットにより増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマーカーの遺 子型 »「Triticum boeoticum Boiss. KTl— 1」型である力 「Tnticum monococcum L. KT3-5」型であるかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて判定するこ とができる。なお、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記表の該当 するマーカーを参照のこと。
[0128] 2Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 759および 7 60のプライマーセット、または配列番号 761および 762のプライマーセットにより増幅 される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 763および 764のプライマーセ ット、または配列番号 765および 766のプライマーセットにより増幅される。
[0129] 5Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 1235および 1236のプライマーセット、または配列番号 1237および 1238のプライマーセットによ り増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 1239および 1240のプラ イマ一セット、または配列番号 1241および 1242のプライマーセットにより増幅される
[0130] (3)小穂段数（Number of spikelets)
小穂段数とは穂についている粒の数のことであり、収量を推定する際の目安となる 。小穂段数が多い品種ほど、その収量が高いといえ、栽培品種においては小穂段数 が多いことが好ましい形質であるといえる。なお、小穂段数は量的形質であり、複数 の遺伝子座により決定される形質である。
[0131] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、 1個の小穂段数に関与する QTLを見出した。当該 QTLの遺 伝子型は、下記の配列番号に示される塩基配列力 なるプライマーを組み合わせた プライマーセットにより増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマーカ ~~の遺 1ZS十型力「Triticum boeoticum Boiss. KT1— 1」型である力「Triticum monococc um L. KT3-5」型であるかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて判定 することができる。なお、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記表の 該当するマーカーを参照のこと。
[0132] 3Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 947および 9 48のプライマーセット、または配列番号 949および 950のプライマーセットにより増幅 される。なお、当該 QTLは 3Am染色体の長腕末端に座乗するため、当該 QTLの長 腕側にォォムギ EST配列に基づ 、て設計されるプライマーセットにより増幅される D NAマーカーは存在しない。ただし、既知の RFLPマーカー（マーカー名： JIP)が長 腕側に存在する。
[0133] (4)第一節間長（Top- internode length)
第一節間長は穂首力 上位第一節までの長さを示すものであり、第一節間長が長 いほど倒伏しやすい。したがって、栽培品種においては第一節間長が短いほうが好 ましい形質であるといえる。なお、第一節間長は量的形質であり、複数の遺伝子座に より決定される形質である。
[0134] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、 1個の第一節間長に関与する QTLを見出した。当該 QTLの 遺伝子型は、下記の配列番号に示される塩基配列力 なるプライマーを組み合わせ たプライマーセットにより増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマー カーの ¾fe子型力「Triticum boeoticum Boiss. KT1— 1」型でめる »「Triticum monoco ccum L. KT3-5」型であるかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて判 定することができる。なお、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記表 の該当するマーカーを参照のこと。
[0135] 3Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 939および 9 40のプライマーセット、または配列番号 941および 942のプライマーセットにより増幅 される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 943および 944のプライマーセ ット、または配列番号 945および 946のプライマーセットにより増幅される。
[0136] (5)穂軸節間長 (Rachis-internode length)
穂軸節間長は穂軸ひとつあたりの長さを示し、穂についている粒の密度の指標で ある。穂軸節間長が短すぎると粒が小さくなつたり薄くなつたりするため、適度な穂軸 節間長の育成品種を選抜する必要がある。したがって、穂軸節間長の改変は重要な 育種目標の 1つである。なお、穂軸節間長は量的形質であり、複数の遺伝子座により 決定される形質である。
[0137] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、 4個の穂軸節間長に関与する QTLを見出した。各 QTLの遺 伝子型は、下記の配列番号に示される塩基配列力 なるプライマーを組み合わせた プライマーセットにより増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマーカ ~~の遺 1ZS十型力「Triticum boeoticum Boiss. KT1— 1」型である力「Triticum monococc um L. KT3-5」型であるかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて判定 することができる。なお、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記表の 該当するマーカーを参照のこと。
[0138] lAm染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 503および 5 04のプライマーセット、または配列番号 505および 506のプライマーセットにより増幅 される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 507および 508のプライマーセ ット、または配列番号 509および 510のプライマーセットにより増幅される。
[0139] 5Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 1203および 1204のプライマーセット、または配列番号 1205および 1206のプライマーセットによ り増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 1207および 1208のプラ イマ一セット、または配列番号 1209および 1210のプライマーセットにより増幅される
[0140] 7Am染色体に存在する 1つ目の QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 135 5および 1356のプライマーセット、または配列番号 1357および 1358のプライマーセ ットにより増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 1359および 1360 のプライマーセット、または配列番号 1361および 1362のプライマーセットにより増幅 される。
[0141] 7Am染色体に存在する 2つ目の QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 139 5および 1396のプライマーセット、または配列番号 1397および 1398のプライマーセ ットにより増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 1399および 1400 のプライマーセット、または配列番号 1401および 1402のプライマーセットにより増幅 される。
[0142] (6)出穂日（Heading date(day from April))
出穂日は早生、晩生の指標となる形質である。出穂日の改変は地域適応性や収穫 作業の分散化等のために重要な育種目標となっている。例えば、出穂日が少しずつ 異なる品種を栽培すれば収穫作業を分散化することができ、農作業の効率化や障害 への危険回避を図ることが可能となる。また、日本においては本州以南のコムギの栽 培は水田の裏作として行われるので、梅雨や田植えの前に収穫する必要がある。そ のため日本においては早生品種の開発がコムギの重要な育種目標の 1つである。な お、出穂日は量的形質であり、複数の遺伝子座により決定される形質である。
[0143] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、 1個の出穂日に関与する QTLを見出した。当該 QTLの遺伝 子型は、下記の配列番号に示される塩基配列力 なるプライマーを組み合わせたプ ライマーセットにより増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマーカー の遺 十型力「Triticum ooeoticum Boiss. KTl— 1」型である力「Triticum monococcu m L. KT3-5」型であるかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて判定 することができる。なお、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記表の 該当するマーカーを参照のこと。
[0144] 3Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 947および 9 48のプライマーセット、または配列番号 949および 950のプライマーセットにより増幅 される。なお、当該 QTLは 3Am染色体の長腕末端に座乗するため、当該 QTLの長 腕側にォォムギ EST配列に基づ 、て設計されるプライマーセットにより増幅される D NAマーカーは存在しない。ただし、既知の RFLPマーカー（マーカー名： JIP)が長 腕側に存在する。
[0145] (7)芒長（Awn length)
芒長は芒の長さを示すものであり、芒が長いほど光合成に有利とされている。ただ し、長い芒は手作業での収穫の妨げになることもあり、芒のない品種も育成されてい る。一方で、機械収穫には芒は問題とならない。したがって、栽培条件によって芒の 長さを調節する必要がある。なお、芒長は量的形質であり、複数の遺伝子座により決 定される形質である。
[0146] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、 2個の芒長に関与する QTLを見出した。各 QTLの遺伝子型 は、下記の配列番号に示される塩基配列力 なるプライマーを組み合わせたプライ マーセットにより増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマーカーの遺 子型 »「Triticum boeoticum Boiss. KTl— 1」型である力 「Tnticum monococcum L. KT3-5」型であるかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて判定するこ とができる。なお、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記表の該当 するマーカーを参照のこと。
[0147] 5Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 1115および 1116のプライマーセット、または配列番号 1117および 1118のプライマーセットによ り増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 1119および 1120のプラ イマ一セット、または配列番号 1121および 1122のプライマーセットにより増幅される
[0148] 7Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 1407および 1408のプライマーセット、または配列番号 1409および 1410のプライマーセットによ り増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 1411および 1412のプラ イマ一セット、または配列番号 1413および 1414のプライマーセットにより増幅される
[0149] (8)護穎長（Glume length)
護穎長は小花の脇に付 、て 、る護穎の長さである。護穎が長ければ雨滴や露など で穂の表面の湿度が高くなるので、病原菌が繁殖したり穂発芽の発生する誘因とな る。また、種や品種によってその長さが異なることが知られている。したがって、護穎 の短い品種を育成すれば、障害に対する抵抗性を付与することができ、また、他の品 種と異なる護穎長を有する品種を育成すれば、異品種等の混入を容易に識別するこ とができる。そのため、護穎長の改変は重要な育種目標の 1つである。なお、護穎長 は量的形質であり、複数の遺伝子座により決定される形質である。
[0150] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、 2個の護穎長に関与する QTLを見出した。各 QTLの遺伝子 型は、下記の配列番号に示される塩基配列力 なるプライマーを組み合わせたブラ イマ一セットにより増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマーカーの 遺 十型力「Triticum ooeoticum Boiss. KTl— 1」型である力 「Tnticum monococcum L . KT3-5」型であるかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて判定する ことができる。なお、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記表の該 当するマーカーを参照のこと。
[0151] 3Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 943および 9 44のプライマーセット、または配列番号 945および 946のプライマーセットにより増幅 される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 947および 948のプライマーセ ット、または配列番号 949および 950のプライマーセットにより増幅される。
[0152] 7Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 1371および 1372のプライマーセット、または配列番号 1373および 1374のプライマーセットによ り増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 1375および 1376のプラ イマ一セット、または配列番号 1377および 1378のプライマーセットにより増幅される
[0153] (9)草型（Plant type)
草型は越冬時の植物体の姿を示すものであり、寒冷地においては草型が匍匐して いる品種ほど越冬性が高い傾向がある。また、草型の直立した品種は一般に早生で ある。したがって、栽培品種においては栽培地域によって草型を変える必要がある。 なお、草型は量的形質であり、複数の遺伝子座により決定される形質である。
[0154] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、 2個の草型に関与する QTLを見出した。各 QTLの遺伝子型 は、下記の配列番号に示される塩基配列力 なるプライマーを組み合わせたプライ マーセットにより増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマーカーの遺 子型 »「Triticum boeoticum Boiss. KTl— 1」型である力 「Tnticum monococcum L. KT3-5」型であるかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて判定するこ とができる。なお、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記表の該当 するマーカーを参照のこと。
[0155] 3Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 947および 9 48のプライマーセット、または配列番号 949および 950のプライマーセットにより増幅 される。なお、当該 QTLは 3Am染色体の長腕末端に座乗するため、当該 QTLの長 腕側にォォムギ EST配列に基づ 、て設計されるプライマーセットにより増幅される D NAマーカーは存在しない。ただし、既知の RFLPマーカー（マーカー名： JIP)が長 腕側に存在する。
[0156] 5Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 1259および 1260のプライマーセット、または配列番号 1261および 1262のプライマーセットによ り増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 1263および 1264のプラ イマ一セット、または配列番号 1265および 1266のプライマーセットにより増幅される
[0157] (10)千粒重（Thousand- kenel weight)
千粒重は、登熟後の粒の重さを測定して千粒分に換算したものであり、粒の重さの 指標となる形質である。コムギでは、千粒重が小さすぎると小麦粉の回収率が少なく なり、逆に大きすぎるとパンに必要なタンパク質 (ダルテン)含有率が低下する傾向に ある。このため、適度な千粒重の個体を選抜する必要があり、千粒重の改変は重要 な育種目標の 1つである。なお、千粒重は量的形質であり、複数の遺伝子座により決 定される形質である。
[0158] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、 1個の千粒重に関与する QTLを見出した。当該 QTLの遺伝 子型は、下記の配列番号に示される塩基配列力 なるプライマーを組み合わせたプ ライマーセットにより増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマーカー の遺 十型力「Triticum ooeoticum Boiss. KTl— 1」型である力「Triticum monococcu m L. KT3-5」型であるかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて判定 することができる。なお、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記表の 該当するマーカーを参照のこと。
[0159] 2Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 735および 7 36のプライマーセット、または配列番号 737および 738のプライマーセットにより増幅 される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 739および 740のプライマーセ ット、または配列番号 741および 742のプライマーセットにより増幅される。
[0160] (11)穂軸脱落性（Rachis brittleness)
穂軸脱落性は、登熟後穂軸がもろくなつて種子が落ちる表現型 (穂軸脱落性)、ま たは登熟後も種子が落ちな!/、表現型 (穂軸非脱落性)を表す形質である。野生種で は、次世代を残すために穂から自然に種子が落ちること、すなわち穂軸脱落性を有 することが重要である。一方、栽培種は基本的に穂軸非脱落性であるものの、栽培 種と野生種の交雑では雑種が穂軸脱落性となり、また、栽培種同士の交雑からも穂 軸脱落性の雑種が分離することがある。穂軸脱落性の個体では穂から自然に種子が 落ちて収量の評価ができな 、ので、農業形質の評価のためには穂軸非脱落性であ ることが重要である。なお、穂軸脱落性は量的形質であり、複数の遺伝子座により決 定される形質である。
[0161] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、 2個の穂軸脱落性に関与する QTLを見出した。各 QTLの遺 伝子型は、下記の配列番号に示される塩基配列力 なるプライマーを組み合わせた プライマーセットにより増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマーカ ~~の遺 1ZS十型力「Triticum boeoticum Boiss. KT1— 1」型である力「Triticum monococc um L. KT3-5」型であるかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて判定 することができる。なお、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記表の 該当するマーカーを参照のこと。
[0162] 4Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 1071および 1072のプライマーセット、または配列番号 1073および 1074のプライマーセットによ り増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 1075および 1076のプラ イマ一セット、または配列番号 1077および 1078のプライマーセットにより増幅される
[0163] 7Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 1371および 1372のプライマーセット、または配列番号 1373および 1374のプライマーセットによ り増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 1375および 1376のプラ イマ一セット、または配列番号 1377および 1378のプライマーセットにより増幅される
[0164] (12) 0週間後の休眠'性 (Dormancy at 0 week)
収穫したば力りの種子は休眠性を持っており、すぐには発芽しないことが知られて いる。野生種ではこの傾向が強ぐ栽培種でもある程度の休眠性を持っている。休眠 性が全くな!/、と、収穫前の降雨によって種子が穂にっ 、たまま発芽してしまう穂発芽 という障害が発生する。すなわち、休眠性は穂発芽に対する抵抗性因子として働く形 質である。しかしながら、休眠性が深すぎると、圃場で翌年まで発芽せずに雑草化す るなどの問題が生じる。したがって、適度の休眠性を有するように改変することは、重 要な育種目標となっている。なお、休眠性は量的形質であり、複数の遺伝子座により 決定される形質である。
[0165] 0週間後の休眠性の調査には、黄化した直後の穂を収穫して乾燥し、直ちに 20 °Cのフリーザーに保存した種子を用いた。保存した種子を休眠覚醒させずに吸水さ せ、 25°Cで 4日後の発芽率を調査した。
[0166] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、 3個の休眠性 (0週間後）に関与する QTLを見出した。各 QTL の遺伝子型は、下記の配列番号に示される塩基配列力 なるプライマーを組み合わ せたプライマーセットにより増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマ 一力一の逾ィ云子型力「Triticum boeoticum Boiss. KT1— 1」型でめる »「Triticum mono coccum L. KT3-5」型であるかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて 判定することができる。なお、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記 表の該当するマーカーを参照のこと。
[0167] lAm染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 575および 5 76のプライマーセット、または配列番号 577および 578のプライマーセットにより増幅 される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 579および 580のプライマーセ ット、または配列番号 581および 582のプライマーセットにより増幅される。
[0168] 3Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 835および 8 36のプライマーセット、または配列番号 837および 838のプライマーセットにより増幅 される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 839および 840のプライマーセ ット、または配列番号 841および 842のプライマーセットにより増幅される。
[0169] 5Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 1123および 1124のプライマーセット、または配列番号 1125および 1126のプライマーセットによ り増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 1127および 1128のプラ イマ一セット、または配列番号 1129および 1130のプライマーセットにより増幅される
[0170] (13) 3週間後の休眠性（Dormancy at 3 weeks)
収穫したば力りの種子は休眠性を持っており、すぐには発芽しないことが知られて いる。野生種ではこの傾向が強ぐ栽培種でもある程度の休眠性を持っている。休眠 性が全くな!/、と、収穫前の降雨によって種子が穂にっ 、たまま発芽してしまう穂発芽 という障害が発生する。すなわち、休眠性は穂発芽に対する抵抗性因子として働く形 質である。しかしながら、休眠性が深すぎると、圃場で翌年まで発芽せずに雑草化す るなどの問題が生じる。したがって、適度の休眠性を有するように改変することは、重 要な育種目標となっている。なお、休眠性は量的形質であり、複数の遺伝子座により 決定される形質である。
[0171] 3週間後の休眠性の調査には、黄化した直後の穂を収穫して乾燥し、直ちに 20 °Cのフリーザーに保存した種子を用いた。保存した種子を 25°Cで 3週間休眠覚醒し 、その後吸水させ、 25°Cで 4日後の発芽率を調査した。
[0172] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、 3個の休眠性 (3週間後）に関与する QTLを見出した。各 QTL の遺伝子型は、下記の配列番号に示される塩基配列力 なるプライマーを組み合わ せたプライマーセットにより増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマ 一力一の逾ィ云子型力「Triticum boeoticum Boiss. KT1— 1」型でめる »「Triticum mono coccum L. KT3-5」型であるかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて 判定することができる。なお、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記 表の該当するマーカーを参照のこと。
[0173] lAm染色体に存在する 1つ目の QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 591 および 592のプライマーセット、または配列番号 593および 594のプライマーセットに より増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 595および 596のプライ マーセット、または配列番号 597および 598のプライマーセットにより増幅される。
[0174] lAm染色体に存在する 2つ目の QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 627 および 628のプライマーセット、または配列番号 629および 630のプライマーセットに より増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 631および 632のプライ マーセット、または配列番号 633および 634のプライマーセットにより増幅される。
[0175] 3Am染色体に存在する QTLの短腕側の DNAマーカーは、配列番号 903および 9 04のプライマーセット、または配列番号 905および 906のプライマーセットにより増幅 される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 907および 908のプライマーセ ット、または配列番号 909および 910のプライマーセットにより増幅される。
[0176] (14)糊粉層色（Aleurone layer color)
糊粉層色は、登熟前に各個体の糊粉層色を目で見て調査することにより判断する ことができる。すなわち、穎花の内側の子実表面に存在する糊粉層という膜の部分に 着色するカゝ否かで判断できる。
[0177] 糊粉層色は、単一の主働遺伝子が支配する形質であり、メンデルの法則にしたが つて遺伝する。糊粉層色を支配する遺伝子座には糊粉層に着色する遺伝子と着色 のない薄茶色の糊粉層を発現する遺伝子との 2つの対立遺伝子があり、着色が優性 である。例えば、薄茶色の糊粉層を表す品種に、着色の糊粉層を表す野生種等から 有用形質を交雑育種により選抜しょうとする場合に、目的とする形質が糊粉層色を支 配する遺伝子が座乗している染色体上にあれば、目的とする形質のみでなく糊粉層 色を支配する遺伝子も同時に導入される場合がある。よって着色した糊粉層を有す る品種を選抜すれば、目的とする形質が導入された品種に当たる可能性が高いとい える。また糊粉層色を異品種の混入を識別する指標としても利用が可能となり、品種 検定等を容易に行なうことが可能となる。
[0178] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、糊粉層色を支配する遺伝子を挟み、かつ最も近傍に座乗する DNAマーカーを見出した。糊粉層色を支配する遺伝子の遺伝子型は、下記の配列 番号に示される塩基配列からなるプライマーを組み合わせたプライマーセットにより 増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマーカーの遺伝子型が「Triti cum boeoticum Boiss. KTl— 1」型である力 「Tnticum monococcum L. KT3— 5」型であ るかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて判定することができる。な お、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記表の該当するマーカー を参照のこと。
[0179] 4Am染色体に存在する糊粉層色を支配する遺伝子の短腕側の DNAマーカーは、 配列番号 1055および 1056のプライマーセット、または配列番号 1057および 1058 のプライマーセットにより増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 10 59および 1060のプライマーセット、または配列番号 1061および 1062のプライマー セットにより増幅される。
[0180] (15)葉身毛茸（Leaf hairiness)
葉身毛茸は、葉の表面の毛茸を触って確認することができる。
[0181] 葉身毛茸は、単一の主働遺伝子が支配する形質であり、メンデルの法則にしたが つて遺伝する。葉身毛茸を支配する遺伝子座には毛茸を有する葉を発現する遺伝 子と毛茸を有しない葉を発現する遺伝子との 2つの対立遺伝子があり、毛茸を有する 葉が優性である。例えば、毛茸のない品種に、毛茸のある野生種等力 有用形質を 交雑育種により選抜しょうとする場合に、目的とする形質が葉身毛茸を支配する遺伝 子が座乗している染色体上にあれば、目的とする形質のみでなく葉身毛茸を支配す る遺伝子も同時に導入される場合がある。毛茸のある品種を選抜すれば、目的とする 形質が導入された品種に当たる可能性が高いといえる。また葉身毛茸を異品種の混 入を識別する指標としても利用が可能となり、品種検定等を容易に行なうことが可能 となる。
[0182] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、葉身毛茸を支配する遺伝子を挟み、かつ最も近傍に座乗する DNAマーカーを見出した。葉身毛茸を支配する遺伝子の遺伝子型は、下記の配列 番号に示される塩基配列からなるプライマーを組み合わせたプライマーセットにより 増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマーカーの遺伝子型が「Triti cum boeoticum Boiss. KTl— 1」型である力 「Tnticum monococcum L. KT3— 5」型であ るかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて判定することができる。な お、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記表の該当するマーカー を参照のこと。
[0183] 5Am染色体に存在する葉身毛茸を支配する遺伝子の短腕側の DNAマーカーは、 配列番号 1247および 1248のプライマーセット、または配列番号 1249および 1250 のプライマーセットにより増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 12 51および 1252のプライマーセット、または配列番号 1253および 1254のプライマー セットにより増幅される。
[0184] (16)秋播性程度（Vernalization requirement)
秋播性程度は出穂開花のために必要な低温'短日の期間によって判断できる。秋 播性程度は連続照明下の恒温条件 (通常 20°C)での止葉展開まで日数によって調 查する。秋播性程度の高い品種は止葉展開に至らずに開花しないのに対して、秋播 性程度の低い (春播性)品種はその程度が低いほど短期間で止葉展開に至る。秋播 性程度が高い品種は春播栽培しても穂が出ないが、秋に播種して越冬して栽培する のに適している。一方、秋播性の低い品種を越冬栽培すると、秋の間に生長が進み ,寒さで枯れることがある。このように、品種改良においては栽培環境によって秋播性 の程度を変えることが重要である。
[0185] 発明者らは、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図を用 いた QTL解析により、秋播性程度を支配する遺伝子を挟み、かつ最も近傍に座乗す る DNAマーカーを見出した。秋播性程度を支配する遺伝子の遺伝子型は、下記の 配列番号に示される塩基配列からなるプライマーを組み合わせたプライマーセットに より増幅される DNAマーカーの多型、すなわち当該 DNAマーカーの遺伝子型が「T riticum boeoticum Boiss. KT1— 1」型である；^「Triticum monococcum L. KT3— 5」型で あるかを検出し、当該 DNAマーカーの遺伝子型に基づいて判定することができる。 なお、多型の種類、多型部位の塩基配列等については、上記表の該当するマーカ 一を参照のこと。
[0186] 5Am染色体に存在する秋播性程度を支配する遺伝子の短腕側の DNAマーカー は、配列番号 1255および 1256のプライマーセット、または配列番号 1257および 12 58のプライマーセットにより増幅される。また、長腕側の DNAマーカーは、配列番号 1259および 1260のプライマーセット、または配列番号 1261および 1262のプライマ 一セットにより増幅される。
[0187] 本発明に係る育種方法においては、用いられる少なくとも 50個以上の DNAマーカ 一の中に、以下の（a)〜（g)に記載の DNA断片からなる DNAマーカーを必須マー カーとして含むことが好ましい。これらのマーカーを含むことにより、コムギの育種目 標として非常に重要な形質である、 0週間後の休眠性、 3週間後の休眠性、出穂日、 千粒重、穂長、小穂段数および草型に関与する遺伝子座の遺伝子型を 1回の試行 で同時に判定することが可能となる。
[0188] (a)配列番号 735に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 736に示され る塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される DNA断片または配列番号 737に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 7 38に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用い て増幅される DNA断片。これらは千粒重に関与する QTLに連鎖する DNAマーカ 一である。
[0189] (b)配列番号 739に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 740に示され る塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される DNA断片または配列番号 741に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 7 42に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用い て増幅される DNA断片。これらは千粒重に関与する QTLに連鎖する DNAマーカ 一である。
(c)配列番号 903に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 904に示され る塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される DNA断片または配列番号 905に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 9 06に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用い て増幅される DNA断片。これらは 3週間後の休眠性に関与する QTLに連鎖する DN Aマーカーである。
(d)配列番号 907に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 908に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 909に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 91 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片。これらは 3週間後の休眠性に関与する QTLに連鎖する DNA マーカーである。
(e)配列番号 947に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 948に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 949に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 95 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片。これらは出穂日、穂長、小穂段数および草型に関与する QT Lに連鎖する DNAマーカーである。
(f)配列番号 1123に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1124に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1125に示される塩基配列力 なるプライマーと配列 番号 1126に示される塩基配列力 なるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片。これらは 0週間後の休眠性に関与する QTLに連鎖 する DNAマーカーである。
(g)配列番号 1127に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1128に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1129に示される塩基配列力 なるプライマーと配列 番号 1130に示される塩基配列力 なるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片。これらは 0週間後の休眠性に関与する QTLに連鎖 する DNAマーカーである。
[0191] 当該（a)〜（g)に記載の DNAマーカー以外の DNAマーカーは、 243個の DNAマ 一力一からこれらを除いた残りの中から任意に選択すればよいが、優先的選択するこ とが好ましい DNAマーカーとして、 0週間後の休眠性に関与する lAm染色体に存在 する QTLに連鎖する DNAマーカー（配列番号 575および 576のプライマーセット、 または配列番号 577および 578のプライマーセットにより増幅される短腕側の DNA マーカー、および、配列番号 579および 580のプライマーセット、または配列番号 58 1および 582のプライマーセットにより増幅される長腕側の DNAマーカー）、 0週間後 の休眠性に関与する 3Am染色体に存在する QTLに連鎖する DNAマーカー（配列 番号 835および 836のプライマーセット、または配列番号 837および 838のプライマ 一セットにより増幅される短腕側の DNAマーカー、および、配列番号 839および 84 0のプライマーセット、または配列番号 841および 842のプライマーセットにより増幅さ れる長腕側の DNAマーカー）、 3週間後の休眠性に関与する lAm染色体に存在す る 1つ目の QTLに連鎖する DNAマーカー（配列番号 591および 592のプライマーセ ット、または配列番号 593および 594のプライマーセットにより増幅される短腕側の D NAマーカー、および、配列番号 595および 596のプライマーセット、または配列番 号 597および 598のプライマーセットにより増幅される長腕側の DNAマーカー）、 3 週間後の休眠性に関与する lAm染色体に存在する 2つ目の QTLに連鎖する DNA マーカー（配列番号 627および 628のプライマーセット、または配列番号 629および 630のプライマーセットにより増幅される短腕側の DNAマーカー、および、配列番号 631および 632のプライマーセット、または配列番号 633および 634のプライマーセ ットにより増幅される長腕側の DNAマーカー）を挙げることができる。
[0192] さらに、上述の形質（1)〜（16)の QTLまたは主働遺伝子に連鎖する DNAマーカ 一を各形質につき少なくとも 1つ以上選択すれば、コムギの育種に有用な 16種類の 形質の遺伝子型を同時に判定することが可能である。より好ましくは、 16種類の形質 の全ての QTLおよび主働遺伝子に連鎖する DNAマーカーを全て選択することであ る。
[0193] 〔本発明に係るコムギの育種方法の実施に用いられる器具〕
本発明に係るコムギの育種方法は、器具を用いることによってより効率的に実施す ることができる。例えば、アレイ形態の多型検出器具を挙げることができる。具体的に は、「コムギの育種に用いられる器具であって、コムギのゲノム DNAを铸型としてォォ ムギ EST配列に基づいて設計されるプライマーセットにより増幅される DNA断片ま たはその一部が支持体上に固定されており、当該 DNA断片に存在する多型を検出 可能となっている器具。」を挙げることができる。ただし、これに限定されるものではな V、。以下に上記例示した器具にっ 、て説明する。
[0194] 上記器具において、コムギのゲノム DNAを铸型としてォォムギ EST配列に基づい て設計されるプライマーセットにより増幅される DNA断片は、本発明に係るコムギの 育種方法において、二倍体コムギの遺伝地図上にマップされている DNAマーカー である。すなわち、当該器具は、二倍体コムギの遺伝地図上にマップされている DN Aマーカーが支持体上に固定ィ匕されている器具であればよい。固定ィ匕される DNA 断片は、多型部位 (例えば、 SNP部位、欠失 ·挿入部位など）が含まれていれば、増 幅された DNA断片の全体でもよぐその一部でもよ 、。
当該器具に固定ィ匕されている DNAと、本発明に係るコムギの育種方法における増 幅工程で増幅された DNA断片とをノヽイブリダィゼーシヨンさせることにより、増幅され た DNA断片中に存在する SNPなどの多型を検出することができる。
[0195] 支持体上には 50個以上の DNAマーカーに由来する DNA断片が固定化されてい ることが好ましぐ二倍体コムギの遺伝地図にマップされている DNAマーカーの全て が固定ィ匕されていることが特に好ましい。さらに、支持体上に固定ィ匕されている DNA は、遺伝地図にマッピングさている順序、すなわち、染色体上の順序と同一の順序で 配置されて 、ることが好まし!/、。
[0196] 支持体は、ポリヌクレオチドを固定ィ匕可能なものであれば特に限定されるものでは なぐどのような形状や材質であってもよい。支持体の材料としては、一般的には、例 えば、ガラス、シリコンウェハ等の無機系材料、紙等の天然高分子、ニトロセルロース やナイロン等の合成高分子、合成高分子や天然高分子を用いたゲル体等を挙げる ことができる。また、支持体の形状も、ポリヌクレオチドを固定ィ匕できる十分な面積を 有するものであれば特に限定されるものではないが、一般的には、可撓性が小さい 力ほとんど無い基板、可撓性を有する膜 (メンブレン)、その中間となる可撓性基板等 のように、二次元的な広がりを有するものを好ましく用いることができる。なお、上記基 板や膜の厚みについては特に限定されるものではなぐその材質や用途に応じて適 宜設定すればよい。さらに、支持体として各種ビーズを用いることもできる。
[0197] 〔本発明に係るコムギの育種方法の実施に用いられるキット〕
本発明に係るコムギの育種方法は、キットを用いることによってより効率的に実施す ることができる。具体的には、例えば、「コムギの育種に用いられるキットであって、ォ ォムギ EST配列に基づ 、て設計されるプライマーセットを備えるキット。」を挙げること ができる。ただし、これに限定されるものではない。以下に上記例示したキットについ て説明する。
[0198] 本明細書中において「キット」は、特定の材料を内包する容器 (例えば、ボトル、プレ ート、チューブ、ディッシュなど)を備えた包装が意図される。好ましくは当該材料を使 用するための使用説明書を備える。使用説明書は、紙またはその他の媒体に書かれ ていても印刷されていてもよぐあるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能デ イスクまたはテープ、 CD-ROMなどのような電子媒体に付されてもょ 、。
[0199] 上記例示のキットに備えられるプライマーセットとしては、配列番号 487ないし 1458 に示される塩基配列のうち、配列番号 n (nは奇数）に示される塩基配列からなるブラ イマ一と配列番号 n+ 1に示される塩基配列力 なるプライマーとを組み合わせたプ ライマーセットが好ましい。また、キットに備えられるプライマーセットは、複数であるこ と力 子ましく、二倍体コムギのゲノム全体力も選択される少なくとも 50個以上であるこ とがより好ましぐ配列番号 487ないし 1458に示される塩基配列力もなるプライマー が全て備えられて ヽることが特に好ま 、。
[0200] また、当該キットには、ォォムギ EST配列に基づいて設計されたプライマーセット以 外のものが備えられて 、てもよ 、。当該プライマーセット以外の具体的な構成にっ ヽ ては特に限定されるものではなぐ必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成 とすればよい。例えば、ポリメラーゼ、ノ ッファまたは反応チューブなどを挙げることが できる。また、上述の多型検出器具をキットの構成としてもよい。多型検出器具を備え る構成のキットにより、本発明に係るコムギの育種方法を一層迅速かつ効率的に実 施することが可能となる。
[0201] 当該キットの使用方法は、上述した本発明に係るコムギの育種方法に準じればよい ことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
[0202] なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様お よび以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、 そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ当業者は、本 発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
[0203] また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中に ぉ ヽて参考として援用される。
[0204] 〔実施例〕
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定される ものではない。
[0205] 〔実施例 1：ォォムギ EST配列を利用した二倍体コムギ遺伝地図の構築〕
(1)マップ集団の作成
二 1铃体コム 野生種 Triticum boeoticum Boiss. (^accession No. KT1— 1)と二倍体コ ムギ栽培種 Triticum monococcum L. (accession No. KT3- 5)との交配から育成した 組換え近交系統（RIL) 93系統および両親、さらにその RFLP情報（Shindo C, Sasaku ma T., Watanabe Ν. and Noda K. (2002) Two-gene systems of vernalization require ment and narrow-sense earliness in einkorn wheat. Genome 45: 5o3- 569.)を用いた
[0206] (2) DNA抽出
RIL集団と両親の葉身を約 10cm採取し、 1.5mlエツペンドルフチューブに入れ液体 窒素で凍結後、プラスチック製の乳棒で粉砕した。ゲノム DNA (1-5 g)は Palottaら の方法（Pallotta M.A., Graham R.D., Langridge P., Sparrow D.H.B. and Barker S.J. 2000. RFLP mapping of manganese efficiency in barley. Theor. Appl. Genet. 101: 11 00-1108.)に従って抽出したが、最終溶解の TE bufferには RNaseをカ卩えなかった。 [0207] (3) PCR産物の多型検出
PCR反応は GeneAmp PCR System (Applied Biosystems)を使用して 96穴プレートま たは 384穴プレートで行った。 PCR反応系は 1 X Ex- Taqbuffer (Takara)、 forword-reve rseプライマー各 1.0 μ M、 dNTPs 2.0mM、 MgCl 0.5mM、テンプレート DNA lOngおよ
2
び Ex- Taq DNA polymerase (Takara) 0.035Uに超純水をカ卩えて 10 μ 1とした。 PCRの 条件は 94°C 2分間の後、 94°C 30秒、 65°C 30秒、 72°C 1分を 5サイクル、続けて 94°C 30秒、 65°C 30秒、 72°C 1分を 35サイクル、 72°C 7分で行った。 PCR産物 10 /z 1に loadi ng dye (0.25% bromophenol blue、 0.25% xylene cyanoU 30% Glycerol) 2 μ 1を加え、そ のうち 6 μ 1を 0.5 X TBE buffer (45mM Tris— acetateゝ 45mM Boric acid, ImM EDTA ( pH8.0))にェチジゥムブロマイド（Sigma)を加えた 2% (w/v)ァガロースゲルで分離し た。
[0208] 両親のゲノム DNAをォォムギ EST由来のプライマー 2,695対を用いて PCR増幅し、ァ ガロースゲル電気泳動で片親でのみでバンドが出現したもの（優性マーカー）および 両親のバンドのサイズが異なるもの（サイズ多型マーカー）を選抜した。
[0209] 両親とも同サイズのバンド (ァガロースゲル上で目視によりサイズの違 、が認識でき ないバンド）が出現したものについては、塩基配列を解析し、一塩基多型 (SNP)を検 出した。 SNPマーカーのうち、いずれかの多型部位に制限酵素サイトがあるものは CA PSマーカーとし、制限酵素サイトのないものは SNPタイピングマーカーとして選抜した
[0210] PCR産物の精製をするために Sephadex G- 50 (Amesham Biosciences)を Colum Loa derに充填し、ガラス板で平らにした後、 Colum Loader上に HV plate (MILLIPORE)を 乗せた状態で逆転し、 HV plateに Sephadex G- 50を移した。 HV plateには超純水 300 1を加え、室温で 3時間放置し、 900 X Gで 2分間遠心をした後、超純水 150 1をカロえ 、 900 X Gで 2分間の遠心を 3回以上繰り返した。各 wellの中央に PCR産物を入れた後 、タイタープレート (PS- microplate; Greiner)、遠心用アダプター、 HV plate, HV plate 蓋の順に重ねて、 900 X Gで 3分間遠心し、さらに向きを変えてさらに 3分間遠心をし た。
[0211] シーケンス反応には、 BioDye Terminator vl.l Cycle Sequence RR- 100 (Applied Bi osystems) 1.0 μ U 5 X sequence buffer (Applied Biosystems) 1.0 μ 1および reverseプラ イマ一 1.6mMを用い、精製した PCR産物 5ngをカ卩えて超純水で全量を 10.0 1にした 。 PCRの条件は 96°C 2分の後、 96°C 10秒、 50°C 5秒、 60°C 4分を 25サイクル行った。 シーケンス産物は、プレートを数秒遠心にかけた後、 125mM EDTAを 2.5 1と 100% エタノールを 30 1加え、シールで密閉して数回転倒混和した後、アルミ箔で覆い、 室温で 15分間放置した。さらに、 3,100g X Gで 30分間遠心後、すぐに plateを逆転して 上清を取り除き、 70%エタノールを 30 1カ卩え、 lJOOg X Gで 15分間遠心後、再度上 清を除去し、 Hi-Di Formamide (Applied Biosystems)を 10 μ 1カ卩え、 GeneAmp PCR Sy stemで 95°C 5分間反応後、直ちに氷上にプレートを移し遮光した。精製したシーケン ス産物は ABI Prism 310 genetic analyzer (PE Applied Biosystems)または 3100 Geneti c Analyzer (Applied Biosystems)で分析した。配列データの解析には巿販パッケージ ソフト DNA SIS Pro Ver.2.0 (日立ソフト)を用いてァライメントし、両親の塩基配列の相 ϊ Χ^り cleaved amplined polymorphism sequence (CAPS) 検出した。
[0212] (4)遺伝地図 (連鎖地図）の構築
両親で多型がみられたォォムギ EST由来マーカーを RIL集団の多型解析に用いた 。すなわち、 RIL集団のゲノム DNAを铸型として、選抜されたプライマーセットを用いて PCRを行った。その結果、 RIL集団で PCR増幅したォォムギ EST由来マーカーは 243 個であった。
[0213] RIL集団における、 243個のォォムギ EST由来マーカーおよび 96個の既知 RFLPマ 一力一分離データを、 MAPMAKER/EXP ver. 3.0 (Lander ES, Green P, Abrahamson J, Barlow A, Daly MJ (1987) MAPMAKER: an interactive computer package for con structing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations.)を 用いて検出し、上述の Shindoら（2002)の RFLP情報に加えて遺伝地図を作製した。 各連鎖群でのマーカー連鎖の閾値は LOD 3.0とし、 Kosambi地図関数を地図距離 【こ用 ヽ 7こ (KosamDi DD (1994) The estimation of map distances from recombination v alues. Annals of Eugenics 12 72-175)。
[0214] その結果、 lAm染色体に 49個（EST由来: 38、 RFLP: 11)、 2Am染色体に 57個（EST 由来: 42、 RFLP: 15) , 3Am染色体に 49個（EST由来: 36、 RFLP:13)、 4Am染色体に 54 個（EST由来: 40、 RFLP:14)、 5Am染色体に 67個（EST由来: 39、 RFLP:28)、 6Am染色 体に 27個（EST由来: 19、 RFLP:8)、 7Am染色体に 36個（EST由来: 38、 RFLP:11)が座
/f しプ 。
[0215] 地図の距離の合計は l,038.5cMで、平均マーカー密度は 3.0cM/locusであった。
[0216] なお、図 1に作製された二倍体コム遺伝地図を示した。図 1において、各染色体とも 上が短腕末端である。また、各染色体の右側がマーカー名、左側が短腕末端力もの 距離 (cM)を表している。
[0217] 〔実施例 2：二倍体コムギの農業形質遺伝子座の解析〕
上記実施例 1で作製した二倍体コムギ遺伝地図を用いて、 16種類の農業形質に っ ヽて QTL解析を実施した。
[0218] (1)対象形質
13種類の量的形質および 3種類の質的形質を対象とした。
[0219] 具体的には、量的形質は、穂長（Ear length)、稈長 (Culm length)、小穂段数 (Num ber of spikelets 、第一節間お、 Γορ- internode length)、糖糊節 f¾，長 (Rachis- interno de length)、出穂日（Heading date(day from April))、芒長（Awn length)、護穎長（Glu me length)、草型（Plant type)、千粒重（Thousand- kenel weight)、穂軸脱落性 (Rach is brittleness)、 0週間後の休眠性（Dormancy at 0 week)および 3週間後の休眠性（ Dormancy at 3 weeks)の合計 13形質である。質的开質は、糊粉層色（Aleurone layer color)、葉身 ¾ (Leaf hairiness)および秋播'性程度 (Vernalization requirement の 3形質である。
[0220] (2)植物の栽培
RIL集団 114系統と両親を、岡山大学資源生物科学研究所の網室で 2004年 11月中 旬に播種し、育成した。各系統および両親は直径 24cm X深さ 21cmのプラスチック製 育成鉢に培養土 (藤野実業)を入れ各 2個体ずつ栽培した。このうち各 1系統 1個体は 岡山大学資源生物科学研究所の実験圃場へ 2005年 1月に移植し、畦幅 90cm、株間 30cmで栽培した。
[0221] (3)形質の評価
出穂日、稈長、穂長、小穂段数、第一節間長、穂軸節間長、葉身毛茸、糊粉層色 および草型は収穫前に測定し、穂軸脱落性、芒長、千粒重および護穎長は収穫後 の穂で測定した。
[0222] 出穂日は 4月 1日力 最初に穂の基部が出るまでの日数とした。稈長は地面から穂 の基部まで、穂長は穂の基部から先端までの長さ (cm)をそれぞれ各系統 3穂ずつ測 定した。小穂段数は穂基部から穂先端までの小穂数を各系統 3穂ずつ数えた。第一 節間長は穂首から上位第一節までの長さ (cm)を各系統 3穂計測した。穂軸節間長は 穂中央部 10小穂間の穂軸の長さ (mm)、芒長は穂中央部の芒の長さ (cm)を各系統 3 穂ずつ計測した。葉身毛茸は葉の表面の毛耳を触って確認し、疎の場合を 0、密な 場合を 1とした。穂軸脱落性は非脱落性を 0、自然脱落性を 3とする 4段階に分けた。 糊粉層色は粒色が完全な白色を 0とし、粒色が完全な青色を 3とする 4段階に分類し た。また、草型は地面に対して葉全体の角度をほぼ垂直 (0)からほふく (4)の 5段階に 指数化した。
[0223] 秋播性程度の検定は種子を 4日間 4°Cで吸水させた後、各系統 2個体を 5系統ずつ 1鉢に播種して、最低室温 15°C以上の温室で 24時間日長の条件下で栽培し、止葉 展開期と葉数を記録した。なお、調査期間は 120日間とした。
[0224] 休眠性の調査のため、黄化した直後の穂を収穫して乾燥し、ただちに- 20°Cのフリ 一ザ一で保存した。なお、休眠 0週目については各系統 20粒ずつ、 3週目について は各系統 50粒ずつを供試した。 0週目のサンプルはシャーレで吸水後 25°C、 4日後の 発芽率、 3週目では 25°Cで 3週間休眠覚醒後、吸水させ 25°Cで 4日後の発芽率を調 ベて休眠性とした。
[0225] (4) QTL解析
QTL解析用ソフトウェアには MAPMAKER/QTL ver. 1.1b (Lander ES, Botstein D ( 1989) Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics 121:185- 199)を使用した。 QTL解析のアルゴリズムには、シンプルィ ンターパルマッピング（SIM : simple interval mapping)を用いた。 QTLの有無の判定 には LOD 2.0を閾値として用い、 QTL推定のインターバルは O.lcMで行った。
[0226] (5)結果
13種類の量的形質の QTL解析結果を表 51に示した。表 51から明らかなように、 1 3種類の量的形質の全てに QTLが検出された。
[0227] 表 51においては、例えば、穂長（Ear length)については、
(1)穂長に関与する 4つの QTLが検出されたこと
(2) 4つの QTLは、それぞれ染色体 lAm、 2Am、 3Amおよび 4Amに座乗すること
(3)染色体 lAmに座乗する QTLは、ォォムギ ESTクローン名 k04016に基づいて設計さ れたプライマーセット（配列番号 589および 590)により増幅される DNAマーカーとォ ォムギ ESTクローン名 k00958に基づいて設計されたプライマーセット（配列番号 589 および 590)により増幅される DNAマーカーとの間（インターバル： 24.6cM)に存在す ること
(4) k04016に基づく DNAマーカーから 14.3cMの位置に QTLのピークが存在すること
(5)ピークの LODスコアが 2.2であること
(6)この QTLで表現型の分散の 13.5%を説明できること
(7)この QTLが Triticum monococcum L. (accession No. KT3- 5)型のアレルを有する と、穂長が 17.6mm短くなること
が示されて 、る。他の形質につ!、ても同様に読み取ることができる。
[0228] [表 51]
Table 1 . QTLs associated with agronomic traits on the linkage map detected by simple interval mapping (SIM)
Trait Chromo- Marker interval (cM) Position1) LOD2) Var.3 Weight4) some (cM) (%)
Ear length (mm) lAm k0401 6-k009 8 (24.6) 14.3 2.2 13.5 -17.6
2A111 k04121-k04002 (21.4) 0,0 2.6 12.4 18.4
3Am k06868-JIP (30.5) 16.1 3.2 23.1 -25.3
4Am k03896-k04551 (5.0) 0.0 2.7 13.6 -18.9
Culm length (cm) 2Am k04121-lc04002 (21.4) 0.0 3.8 17.8 16.6
5Am k03067-k06941 (27.8) 1.1 3.3 16.0 15.2
Number of spikelets 3Am k06868-JIP (30.5) 13.2 10.1 56.0 -9.7
Top-intemode length (cm) 3Am k08978-k04421 (18.9) 6.4 3.7 22.1 8.9 achis-internode length lAm k09197-k08567 (56.5) 42.7 3.3 17.8 -0.4
(mm) 5Am k09893-k08521 (18.0) 13.3 2.2 11.0 0.3
7Am k09194-k00988 (5.7) 2.8 4.6 22.1 -0.4
7Am k07581-k04173 (7.2) 1.4 2.7 13.7 -0.3
Heading date (day from April) 3Am k06868-JIP (30.5) 11.5 16,9 69.1 -26.7
A wii length (mm) 5Am k09501 -k02886 (3.3) 0.0 2.1 10.3 -1.8
7Am k04448 i06964 (19.0) 5.1 3.1 1 6.6 -1.7
Glume length (mm) 3Am k04421-k06868 (14.8) 10.4 2,9 15.8 0.1
7Am k01956-k03614 (7.9) 0.0 2.2 1 0.6 -0.1
Plant type 3Am k06868-JIP (30,5) 15.1 4.2 28.9 -1.5
5Ani k0130] -kl 0866 (2.2) 1.5 3.5 17.0 -1.1
Thousand-kenel weight (g) 2Am k04930-k06436 (11.7) 6.9 2.9 15.9 4.7 achis brittleness 4Am k03879-k!)6582 (29.4) 0.0 3.7 17.5 -0.7
7Am k01956-k03614 (7.9) 1.8 3.0 15.5 -0.7
Dormancy at 0 week (%) lAm k03340-k01953 (29.4) 5.8 3.6 20,0 9.9
3Ani Ic08649-k06965 (42.2) 16.6 4.9 25.2 10.8
5Am k01313-k03463 (1.1) 0.3 2.9 15.7 -10.5
Dormancy after 3 weeks (%) T Am k00958-k02691 (46.7) 0.1 4.2 20.6 21.4 lAm k01 199-k07906 (Ll) 0.0 3.1 15.8 17.3
3Am k01163-k02004 (33.4) 27.8 3.2 20.6 21.0
1) : Distance of peak LOD score position from the left side marker
2) : Pcak LOD score
3) : Explained variance
4) : Estimated additive effect of KT3-5 allele
3種類の質的形質の QTL解析結果を表 52に示した。表 52から明らかなように、 3 類の質的形質の座乗位置が特定された。
表 52においては、例えば、糊粉層色（Aleurone layer color)については、 (1)染色体 4Amに座乗すること (2)ォォムギ ESTクローン名 k04722に基づ 、て設計されたプライマーセット（配列番号 1057および 1058)により増幅される DNAマーカーとォォムギ ESTクローン名 k09478 に基づいて設計されたプライマーセット (配列番号 1061および 1062)により増幅さ れる DNAマーカーとの間（インターバル： 3.9cM)に存在すること
(3) k04722に基づく DNAマーカーから 2.3cMの位置に QTLのピークが存在すること が示されて 、る。他の形質につ!、ても同様に読み取ることができる。
[表 52]
Table 2. Chromosome locations of aleurone laver color, leaf
hairiness and vernalization requirement on the linkage map
Trait Chromo- Marker interval (cM) Position1) some (cM)
Aleurone layer color 4A k04722-k09478 (3.9)
Leaf hairiness 5 A' k08133-k03289 (7.5)
Vernalization requireme: 5 A' k08198-k01301 (9.2)
1): Distance of peak LOD score position from the left side marker なお、両親（T. boeoticum Boiss.および T. monococcum L.)を比較した場合の各形 質の表現型は、表 53に示したとおりである。
[表 53]
形質 T. boeoticum Boiss. KT1 -1 「. monococcum L. Κ 3-5
穂長 15.4cm 10.6cm
稈長 95.3cm 105.2cm
小穂段数 42 30 第一節間長 16.ん m 43.6cm 穂軸節間長 3.9mm 2.7mm 出穂日 4月 25日 4月 1曰 芒長 1 1.8cm 1 1.2cm
護穎長 0.9cm 1 .1 cm 草型 匍匐（5) やや直立（2)
千粒重 6.0g 24.8g 小穂脱落性 易 難
休眠性 (0週間後） 発芽粒 0% 発芽粒 40«½ 休眠性 (3週間後） 発芽粒 6% 発芽粒 96% 糊粉層色 着色 無着色 葉身毛茸 有 揠 秋播性程度 秋播 春播 注)秋播性程度以^) 、は圃場での調査による
〔実施例 3：ォォムギ EST配列を利用した二倍体コムギ遺伝地図とォォムギ遺伝地 図との比較〕
上記実施例 1で構築した二倍体コムギ遺伝地図（連鎖地図）とォォムギ ESTマーカ 一が高密度にマップされたォォムギ遺伝地図 (連鎖地図）との間で、マーカーの並び を比較した。
[0232] ( 1)ォォムギ遺伝地図
比較に用いたォォムギ遺伝地図は、醸造用ォォムギ「はるなニ条」（Hordeum vulga re ssp. vulgare variety Harunanijo)と野生才ォム = 「H602」 (Hordeum vulgare ssp. s pontaneum H602)との交配から得られた倍加半数体（doubled haploid)集団を用いて 、約 3,000のォォムギ ESTマーカーがマップされており、地図の距離の合計は 1 ,362.7 cMである（非特許文献 5 : Nankaku N.， Motoi Y.， Ueki Η., Sato Κ. and Takeda K. (2 005) High density SNP based EST map in barley. Proc. Plant & Animal Genomes XII I Conference, p317.) G
[0233] (2)結果
二倍体コムギとォォムギの同祖の連鎖群では対応するマーカーの並びが同じにな る場合が多力つた。し力しながら、 4Am染色体および 5Am染色体の長腕末端部にそれ ぞれォォムギの 5H染色体および 4H染色体の長腕末端部に座乗する DNAマーカー に対応する DNAマーカーが座乗して!/、た。
[0234] 図 2に二倍体コムギの 4Am染色体および 5Am染色体の遺伝地図に座乗するマーカ 一とォォムギ遺伝地図に座乗するマーカーとの対応を示した。図 2において、各染色 体とも上が短腕末端である。また、各染色体の右側がマーカー名、左側が短腕末端 からの距離（cM)を表している。この結果から、 Devosら（Devos K.M. and Gale M.D. ( 2000) Genome relationships: the grass model in current research. Plant Cell 12: 637 -646.)が過去に報告しているように、二倍体コムギとォォムギにおいて、同祖群 4およ び 5に逆位転座が存在することが明確に示された。
[0235] 〔実施例 4：網羅的ゲノムタイピングの検討〕
網羅的ゲノムタイピングにお 、て高精度の解析結果を得るためには、何個のマーカ 一を用いればょ 、かを検討した。
[0236] (1)両親力 の由来部分の同定
上記実施例 1で作成した組換え近交系（RIL)の 1系統を対象として、ゲノムのどの 部分がどちらの親に由来するかのタイピングを行った。
[0237] 図 3に上記実施例 1で構築した二倍体コムギ遺伝地図の全範囲力 選択した 96個 の DNAマーカーを用いて各マーカーの遺伝子型に基づいて、どの部分がどちらの 親に由来するかを判定した結果を示した。図 3において、各染色体とも上が短腕末端 であり、用いた DNAマーカーの短腕末端からの距離 (cM)を各染色体の右側に示し ている。 lAm染色体に 3箇所、 2Am染色体に 4箇所、 3Am染色体に 4箇所、 4Am染色体 に 3箇所、 5Am染色体に 2箇所、 6Am染色体に 0箇所、 7Am染色体に 1箇所の組換えが 存在した。
[0238] 図 4に、用いる DNAマーカー数を 50個、 25個、 14個としたときの結果を、 96個の DNAマーカーを用いた場合と比較して示した。図 4において、各染色体とも上が短 腕末端であり、用いた DNAマーカーの短腕末端からの距離 (cM)を各染色体の右側 に示している。 DNAマーカー数を 50個とした場合は、 lAm染色体および 3Am染色体 の狭い領域の組換えが検出できな力つたが、それ以外の組み換え箇所は 96個の用 いた場合と同じ結果を得た。一方、 DNAマーカー数を 25個とした場合は、 3Am染色 体の組換えが全く検出できず、その他の染色体についても精度の低下が認められた
。また、 DNAマーカー数を 14個とした場合は、遺伝子型の同定が不可能である。
[0239] (2) 0週間後の休眠性に関与する QTLの選抜効果の検討
lAm染色体に存在する 0週間後の休眠性に関与する QTLの選抜効果について、上 記実施例 1で作成した組換え近交系（RIL)の 40系統を対象として、用いる DNAマー カーの数を 96個、 50個、 25個、 14個として比較した。具体的には、 40系統の各個 体について、用いた DNAマーカーの遺伝子型を判定するとともに、各個体から得ら れた収穫直後の種子の休眠性を、上記実施例 2に記載の方法で調査した。これらの 結果に基づいて、 lAm染色体に存在する 0週間後の休眠性に関与する QTLの遺伝 子型による休眠性の選抜効果を評価した。なお、当該 QTLの遺伝子型は、当該 QT Lに最も近い DNAマーカーの遺伝子型とした。
[0240] 図 5、図 6、図 7および図 8に、それぞれに DNAマーカー 96個、 50個、 25個および 14個の結果を示した。図 5より、 DNAマーカーを 96個用いた場合、 lAm染色体に存 在する 0週間後の休眠性に関与する QTLの遺伝子型が Aである個体は種子休眠性 力 S17.1%深くなり、選抜効果は大き力つた。図 6より、 DNAマーカーを 50個用いた場 合、 lAm染色体に存在する 0週間後の休眠性に関与する QTLの遺伝子型が Aである 個体は種子休眠性が 10.9%深くなり、選抜効果が認められた。図 7より、 DNAマーカ 一を 25個用いた場合、 lAm染色体に存在する 0週間後の休眠性に関与する QTLの 遺伝子型が Aである個体は種子休眠性が 5.9%深くなり、選抜効果は小さかった。図 8より、 DNAマーカーを 14個用いた場合、 lAm染色体に存在する 0週間後の休眠性 に関与する QTLの遺伝子型が Aである個体は種子休眠性が- 3.9%深くなり、選抜効 果はなかった。したがって、 50個以上の DNAマーカーを用いることにより、特定の形 質について選抜効果が認められることが確認された。
[0241] 以上のように、ゲノム全体を対象とする二倍体コムギ遺伝地図から少なくとも 50個 以上の DNAマーカーを適度なマーカー間距離で選択して用いることにより、網羅的 ゲノムタイピングにお 、て高精度の解析結果を得ることができることが確認された。し たがって、本発明に係るコムギの育種方法により、育種目標の形質を効率よく選抜で きることが実証された。さらに、以上の結果から、本発明に係るコムギの育種方法によ れば、育種に必要なゲノム領域と、育種に不必要なゲノム領域 (除外することが好ま しいゲノム領域)とを区別して、必要な領域を有し、かつ、不必要な領域を有しない個 体の選抜育種を効率よく行うことができることが容易に理解できる。
[0242] なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様ま たは実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのよう な具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に 記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。 産業上の利用の可能性
[0243] 本発明に係るコムギの育種方法は、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍 体コムギ遺伝地図を用いるものである。当該二倍体コムギ遺伝地図は、 243個のォ ォムギ ESTマーカーがコムギの Aゲノム全体にわたって座乗しており、マーカー間距 離が 0〜33. 4cM (平均マーカー密度： 3. OcMZlocus)であるので、ゲノム全体か ら複数のマーカーを適度なマーカー間距離で選択し、同時に各マーカーの多型を 検出すれば、 1回の試行で Aゲノム全体の組み換え情報を取得することができると ヽ う効果を奏する。
[0244] また、本発明に係るコムギの育種方法は、ォォムギ EST配列を利用して作製された 二倍体コムギ遺伝地図を用いるものであるため、ォォムギ ESTマーカーにより構築さ れたォォムギの高密度遺伝地図によって得られたォォムギゲノム情報をコムギの育 種に効率良く利用できるという効果を奏する。また、ォォムギの遺伝子配列に基づい て開発された DNAアレイ等の高能率の育種システムをそのまま利用できるという効 果を奏する。
[0245] さらに、ォォムギ EST配列を利用して作製された二倍体コムギ遺伝地図には 16種 類の有用な農業形質の QTLまたは主働遺伝子がマップされているため、 16種類の 農業上有用な形質を選抜対象とするコムギの育種を迅速'簡便に行うことができ、有 用なコムギ品種の育成を短期間で効率よく行うことができるという効果を奏する。
[0246] 本発明によれば、二倍体コムギの形質を選抜することによってそれぞれの農業形質 に対して有用な品種を育成することができる。また、パンや麵を製造するために使用 される六倍体コムギのゲノムは二倍体コムギのゲノムとも相同性が高いので、本発明 で同定された形質および選抜システムはコムギ全体の育種にも利用することができる 。また、ォォムギの遺伝子配列に基づいて開発された DNAアレイ等の高能率の育種 システムをそのまま利用し、ォォムギのゲノム情報によってコムギの育種をすることが できる。したがって、作物生産をはじめとする農業全般に利用可能である。さらには、 コムギを原料とする食品産業においても有効である。

Claims

請求の範囲
[1] ォォムギ EST配列に基づ 、て設計されるプライマーセットを用い、コムギのゲノム D
NAを铸型として DNAを増幅する増幅工程、および
増幅された DNA断片の多型を検出する多型検出工程
を包含するコムギの育種方法であって、
上記 DNA断片は、二倍体コムギのゲノム全体を対象とする遺伝地図上にマップさ れている DNAマーカーであり、当該遺伝地図上にマップされている少なくとも 50個 以上の DNAマーカーを用いることを特徴とするコムギの育種方法。
[2] 上記ォォムギ EST配列は、配列番号 1ないし 486に示される塩基配列から選択さ れることを特徴とする請求項 1に記載の育種方法。
[3] 上記プライマーセットは、配列番号 487ないし 1458に示される塩基配列のうち、配 列番号 n (nは奇数）に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 n+ 1に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットであることを特徴 とする請求項 1に記載の育種方法。
[4] 上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)〜（g)の少なくとも 1 つに記載の DNA断片からなる DNAマーカーを含み、
さらに、穂長に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含することを特 徴とする請求項 1に記載の育種方法。
(a)配列番号 587に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 588に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 589に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 59 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 591に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 592に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 593に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 59 4に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片 (c)配列番号 759に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 760に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 761に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 76 2に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(d)配列番号 763に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 764に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 765に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 76 6に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(e)配列番号 947に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 948に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 949に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 95 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(f)配列番号 995に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 996に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 997に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 99 8に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(g)配列番号 999に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1000に示され る塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される DNA断片または配列番号 1001に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1002に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用 V、て増幅される DNA断片
上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)〜（d)の少なくとも 1 つに記載の DNA断片からなる DNAマーカーを含み、
さらに、稈長に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含することを特 徴とする請求項 1に記載の育種方法。
(a)配列番号 759に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 760に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 761に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 76 2に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 763に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 764に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 765に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 76 6に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(c)配列番号 1235に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1236に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1237に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1238に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(d)配列番号 1239に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1240に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1241に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1242に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)に記載の DNA断片 からなる DNAマーカーを含み、
さらに、小穂段数に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含すること を特徴とする請求項 1に記載の育種方法。
(a)配列番号 947に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 948に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 949に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 95 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
[7] 上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)および (b)の少なくと も 1つに記載の DNA断片からなる DNAマーカーを含み、
さらに、第一節間長に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含するこ とを特徴とする請求項 1に記載の育種方法。
(a)配列番号 939に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 940に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 941に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 94 2に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 943に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 944に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 945に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 94 6に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
[8] 上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)〜（h)の少なくとも 1 つに記載の DNA断片からなる DNAマーカーを含み、
さらに、穂軸節間長に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含するこ とを特徴とする請求項 1に記載の育種方法。
(a)配列番号 503に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 504に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 505に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 50 6に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 507に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 508に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 509に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 51 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(c)配列番号 1203に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1204に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1205に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1206に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(d)配列番号 1207に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1208に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1209に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1210に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(e)配列番号 1355に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1356に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1357に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1358に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(f)配列番号 1359に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1360に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1361に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1362に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(g)配列番号 1395に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1396に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1397に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1398に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(h)配列番号 1399に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1400に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1401に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1402に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
[9] 上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)に記載の DNA断片 力 なる DNAマーカーを含み、
さら〖こ、出穂日に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含することを 特徴とする請求項 1に記載の育種方法。
(a)配列番号 947に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 948に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 949に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 95 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
[10] 上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)〜（d)の少なくとも 1 つに記載の DNA断片からなる DNAマーカーを含み、
さらに、芒長に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含することを特 徴とする請求項 1に記載の育種方法。
(a)配列番号 1115に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1116に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1117に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1118に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(b)配列番号 1119に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1120に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1121に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1122に示される塩基配列力 なるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(c)配列番号 1407に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1408に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1409に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1410に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(d)配列番号 1411に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1412に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1413に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1414に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)〜（d)の少なくとも 1 つに記載の DNA断片からなる DNAマーカーを含み、
さらに、護穎長に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含することを 特徴とする請求項 1に記載の育種方法。
(a)配列番号 943に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 944に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 945に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 94 6に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 947に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 948に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 949に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 95 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(c)配列番号 1371に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1372に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1373に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1374に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片 (d)配列番号 1375に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1376に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1377に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1378に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
[12] 上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)〜（c)の少なくとも 1 つに記載の DNA断片からなる DNAマーカーを含み、
さらに、草型に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含することを特 徴とする請求項 1に記載の育種方法。
(a)配列番号 947に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 948に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 949に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 95 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 1259に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1260に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1261に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1262に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(c)配列番号 1263に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1264に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1265に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1266に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
[13] 上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)および (b)の少なくと も 1つに記載の DNA断片からなる DNAマーカーを含み、
さらに、千粒重に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含することを 特徴とする請求項 1に記載の育種方法。 (a)配列番号 735に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 736に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 737に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 73 8に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 739に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 740に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 741に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 74 2に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)〜（d)の少なくとも 1 つに記載の DNA断片からなる DNAマーカーを含み、
さらに、穂軸脱落性に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含するこ とを特徴とする請求項 1に記載の育種方法。
(a)配列番号 1071に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1072に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1073に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1074に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット 用いて増幅される DNA断片
(b)配列番号 1075に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1076に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1077に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1078に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(c)配列番号 1371に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1372に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1373に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1374に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(d)配列番号 1375に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1376に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1377に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1378に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)〜（f)の少なくとも 1 つに記載の DNA断片からなる DNAマーカーを含み、
さらに、休眠性 (0週間後）に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含 することを特徴とする請求項 1に記載の育種方法。
(a)配列番号 575に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 576に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 577に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 57 8に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 579に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 580に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 581に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 58 2に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(c)配列番号 835に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 836に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 837に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 83 8に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(d)配列番号 839に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 840に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 841に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 84 2に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(e)配列番号 1123に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1124に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1125に示される塩基配列力 なるプライマーと配列 番号 1126に示される塩基配列力 なるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(f)配列番号 1127に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1128に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1129に示される塩基配列力 なるプライマーと配列 番号 1130に示される塩基配列力 なるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)〜（f)の少なくとも 1 つに記載の DNA断片からなる DNAマーカーを含み、
さらに、休眠性 (3週間後）に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含 することを特徴とする請求項 1に記載の育種方法。
(a)配列番号 591に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 592に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 593に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 59 4に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 595に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 596に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 597に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 59 8に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(c)配列番号 627に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 628に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 629に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 63 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(d)配列番号 631に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 632に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 633に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 63 4に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(e)配列番号 903に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 904に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 905に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 90 6に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(f)配列番号 907に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 908に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 909に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 91 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)および（b)の少なくと も 1つに記載の DNA断片からなる DNAマーカーを含み、
さらに、糊粉層色を支配する遺伝子の遺伝子型を判定する工程を包含することを 特徴とする請求項 1に記載の育種方法。
(a)配列番号 1055に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1056に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1057に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1058に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(b)配列番号 1059に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1060に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1061に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1062に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
[18] 上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)および（b)の少なくと も 1つに記載の DNA断片からなる DNAマーカーを含み、
さらに、葉身毛茸を支配する遺伝子の遺伝子型を判定する工程を包含することを 特徴とする請求項 1に記載の育種方法。
(a)配列番号 1247に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1248に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1249に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1250に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(b)配列番号 1251に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1252に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1253に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1254に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
[19] 上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)および（b)の少なくと も 1つに記載の DNA断片からなる DNAマーカーを含み、
さらに、秋播性程度を支配する遺伝子の遺伝子型を判定する工程を包含すること を特徴とする請求項 1に記載の育種方法。
(a)配列番号 1255に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1256に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1257に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1258に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(b)配列番号 1259に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 1260に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1261に示される塩基配列力もなるプライマーと配列 番号 1262に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
上記少なくとも 50個以上の DNAマーカーのなかに、下記（a)〜（g)に記載の DN A断片力 なる DNAマーカーを含み、
さらに、休眠性 (0週間後）、休眠性 (3週間後）、出穂日、千粒重、穂長、小穂段数 および草型に関与する遺伝子座の遺伝子型を判定する工程を包含することを特徴と する請求項 3に記載の育種方法。
(a)配列番号 735に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 736に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 737に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 73 8に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(b)配列番号 739に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 740に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 741に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 74 2に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(c)配列番号 903に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 904に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 905に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 90 6に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(d)配列番号 907に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号 908に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 909に示される塩基配列力 なるプライマーと配列番号 91 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(e)配列番号 947に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 948に示される 塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅される D NA断片または配列番号 949に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 95 0に示される塩基配列力もなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて 増幅される DNA断片
(f)配列番号 1123に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1124に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1125に示される塩基配列力 なるプライマーと配列 番号 1126に示される塩基配列力 なるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
(g)配列番号 1127に示される塩基配列力もなるプライマーと配列番号 1128に示さ れる塩基配列からなるプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて増幅さ れる DNA断片または配列番号 1129に示される塩基配列力 なるプライマーと配列 番号 1130に示される塩基配列力 なるプライマーとを組み合わせたプライマーセット を用いて増幅される DNA断片
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