CN112159863A - 一种培育具有细长籽粒的水稻直立穗品种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种培育具有细长籽粒的水稻直立穗品种的方法。水稻粒形调控基因GS9和直立穗基因qPE9‑1遗传距离相近，在育种实践中一般表现为连锁遗传。遗传分析显示GS9与qPE9‑1基因间没有互作，表现为加性效应。与原始直立穗品种相比，导入功能缺失型gs9等位基因，使籽粒变细长，而不改变其他农艺性状。本发明为改进水稻品种具有十分积极的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种遗传生物学领域，特别是涉及一种培育具有细长籽粒和直立穗的水稻品种的方法。
背景技术
水稻品种产量潜力的提高，归功于株型的改良，而穗型是水稻理想株型研究的重要内容。在粳稻育种中，由弯曲穗型到直立穗型是十分重要的株型转变。直立穗型品种普遍表现出较高的生物产量、干物质生产速率和产量潜力。
粒形是稻米重要外观品质性状，也是水稻产量的主要影响因素。由于不同文化背景的消费者对籽粒形状偏好不同，总体来说，偏细长粒形的稻米更受大部分消费者的欢迎。然而粳稻品种的粒形一般为短圆状。籽粒形状已成为育种家选育优质米品种的一个重要指标。
水稻粒形变异也极为复杂，粒形性状属于复杂的数量性状，育种家很难通过传统方法来高效地改良水稻粒形。通过分子标记辅助选择得到含有特定等位基因的近等基因系，这样的种质资源是研究QTL效应以及分子育种的好材料。
了解基因间互作效应及其调控方式，对育种实践有重要的意义，对解析粒形调控的分子网络也有重要理论意义。因为有些基因的互作表现加性效应，可直接聚合育种实现对目标现状的改良；而有些基因的互作表现上位性效应，影响预期目标性状的实现。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种培育具有细长籽粒的水稻直立穗品种的方法，用于解决现有技术中水稻植株穗形和粒形无法兼顾的问题。
我们明确了粒形调控基因GS9和直立穗基因qPE9-1之间的遗传互作效应。遗传分析显示GS9与qPE9-1基因间没有互作，表现为加性效应，因此可利用gs9等位基因改良直立穗品种的粒形，而不会因为基因间拮抗作用影响植株的其他农艺性状。因此，培育具有细长籽粒和直立穗的水稻品种的方法可以这样进行：利用包含自然变异的gs9等位基因的水稻植株与另一包含qpe9-1等位基因水稻植株杂交，获得包含gs9/qpe9-1基因的杂交水稻植株。
水稻qpe9-1基因的Genbank号：FJ554569。
水稻gs9基因的Genbank号：MF621928。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种gs9和qpe9-1等位基因联合在制备获得具有细长粒和直立穗的水稻植株的应用。
本发明的另一方面提供了一种培育具有细长籽粒和直立穗的水稻品种的方法，所述方法包括构建含有gs9/qpe9-1基因的杂交水稻植株。
进一步地，所述水稻植株中含有gs9gs9qpe9-1qpe9-1基因。
进一步地，所述方法具体包括：将含有gs9等位基因的水稻植株与含有qpe9-1等位基因的水稻植株杂交，培育，筛选出含有gs9和qpe9-1等位基因组合的水稻植株。
进一步地，所述方法包括：
(1)将含有gs9/qPE9-1等位基因的水稻植株与含有GS9/qpe9-1等位基因的水稻植株杂交，培育，获得F1；
(2)种植上述F1种子，成熟期收种获得F2种子；筛选出含有目的基因的单株；
(3)种植单株收获自交F3种子；
(4)种植上述自交F3种子，通过分子标记筛选出GS9与qPE9-1基因间发生遗传重组的单株，收获自交F4种子；
(5)种植自交F4种子筛选出含有gs9gs9qpe9-1qpe9-1的单株，并在抽穗期与轮回亲本杂交；
(6)将获得的植株与轮回亲本回交，筛选目的植株A。
进一步地，所述方法包括：
(7)将步骤(6)获得的植株A种子种植，从中选出株叶形态与轮回亲本相近且标记基因型为杂合型的单株继续与轮回亲本回交，获得植株B；
(8)将植株B种子种植，从中选出株叶形态与轮回亲本相近且标记基因型为杂合型的单株继续与轮回亲本回交，获得植株C；
(9)将植株C种子种植，从中选出株叶形态与轮回亲本相近且标记基因型为杂合型的单株继续与轮回亲本回交，获得植株D1；
(10)种植植株D1的种子，从中选出株叶形态与轮回亲本相近且标记基因型为杂合型的单株自交，获得D2种子；
(11)种植D2种子，从中选出株叶形态与轮回亲本相近且标记基因型仍为gs9gs9qpe9-1qpe9-1纯合型的单株自交，获得目的植株。
本发明的另一方面提供了一种用于检测qpe9-1等位基因的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.5，反向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
本发明的另一方面提供了一种鉴定qpe9-1等位基因的方法，所述方法包括采用如上所述的引物对目的基因进行检测。
进一步地，所述方法利用所述引物采用PCR扩增待检测基因，所述PCR的条件为：94℃预变性4min，94℃变性35s，55℃退火35s，72℃延伸35s，72℃再延伸4min。
本发明的另一方面提供了上述引物对在鉴定qpe9-1等位基因中的应用。
如上所述，本发明的gs9/qpe9-1等位基因组合在水稻育种方面的应用，具有以下有益效果：
利用本发明培育的gs9/qpe9-1等位基因组合株系快速改良直立穗品种的粒形，获得籽粒细长的新品系。
附图说明
图1是水稻遗传材料筛选群体的构建路线。
图2是GS9和qPE9-1不同等位基因组合新品系的植株表型。
图3是GS9和qPE9-1不同等位基因组合新品系的籽粒表型。
图4是粒形功能标记gs9-1和gs9-2对不同水稻品种的PCR扩增后在2％的琼脂糖电泳的结果。泳道M为DNA Marker；泳道V1-V9依次为原始粒形变异株系、近等基因系NPB-gs9、日本晴、2661、武育粳8号、武育粳27号、盐稻8号、9311、清芦占11。
图5是直立穗功能标记InDel901对不同的水稻品种的PCR扩增后在3％的琼脂糖胶电泳结果。泳道M为DNA Marker；泳道1-6依次为日本晴、中花11、9311、清芦占11、2661、武育粳27号。
图6是利用gs9等位基因改良商业化直立穗品种的粒形。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1：GS9和qPE9-1不同等位基因组合材料的构建
以粳稻品种日本晴为受体的高世代回交群体中(日本晴详见中国作物种质信息网http://icgr.caas.net.cn/)，选育了一个近等基因系NPB-gs9，gs9是一个自然突变等位基因，但在自然品种中还没有类似等位基因的存在，其具有良好的改良粒形的效应。日本晴是极少数含有qPE9-1等位基因的粳稻品种，表现为弯曲穗表型。具体选育步骤如下(图1)：
将携带gs9qPE9-1等位基因的近等基因系NPB-gs9与携带GS9qpe9-1等位基因的直立穗品系2661进行杂交，获得杂交F1种子；种植上述F1种子，成熟期收种获得F2种子；种植上述F2种子，通过基因内完全连锁的分子标记筛选出杂合基因型GS9gs9qPE9-1qpe9-1的单株，以及纯合基因型gs9gs9qPE9-1qPE9-1(记为I型)的单株；种植上述筛选的单株，收获自交F3种子；种植上述自交F3种子，通过分子标记筛选出GS9与qPE9-1基因间发生遗传重组的单株，收获自交F4种子；种植自交F4种子，通过分子标记筛选出标记基因型为GS9GS9qPE9-1qPE9-1(记为II型)、gs9gs9qpe9-1qpe9-1(记为III型)的单株，并在抽穗期将I、II、III型单株与轮回亲本2661杂交；种植上述获得的BC1F1种子，从中选出株叶形态与轮回亲本2661相近且标记基因型为杂合型的单株继续与轮回亲本2661回交，获得BC2F1种子；种植上述BC2F1种子，从中选出株叶形态与轮回亲本2661相近且标记基因型为杂合型的单株继续与轮回亲本2661回交，获得BC3F1种子；种植上述BC3F1种子，从中选出株叶形态与轮回亲本2661相近且标记基因型为杂合型的单株继续与轮回亲本2661回交，获得BC4F1种子；种植上述BC4F1种子，从中选出株叶形态与轮回亲本2661相近且标记基因型为杂合型的单株自交，获得BC4F2种子；种植上述BC4F2种子，从中选出株叶形态与轮回亲本2661相近且标记基因型仍为I、II、III纯合型的单株自交，获得BC3F3株系。
通过鉴定获得水稻新品系2661-I、2661-II和2661-III，其中2661-III含有gs9gs9qpe9-1qpe9-1基因是育种实践中理想的等位基因组合，打破了原来自然变异gs9等位基因与qpe9-1等位基因间的不利连锁，因此是理想的育种原始种质资源。
实施例2：GS9和qPE9-1基因遗传互作分析
以实施例1中获得的水稻新品系2661-I(携带gs9qPE9-1等位组合)、2661-II(携带GS9qPE9-1等位组合)、2661-III(携带gs9qpe9-1等位组合)和亲本2661(携带GS9qpe9-1等位组合)为材料，分析GS9和qPE9-1基因间的遗传互作效应。
与亲本2661相比，株系2661-III的不同在于，其携带gs9等位基因，表现为株叶形态没有差异(图2)，而籽粒细长(图3)。与亲本2661相比，株系2661-II的不同在于，其携带qPE9-1等位基因，表现为株高增加(图2)，而粒长变长、粒宽不变(图3)。与亲本2661相比，株系2661-I的不同在于，其携带gs9qPE9-1等位基因，表现为株高增加(图2)，而粒长变长、粒宽变窄(图3)。
从上述比较来看，gs9和qPE9-1基因间有累加效应，且这两个基因都对粒长有作用；GS9和qPE9-1基因在植株叶片形态等方面均表现为互不影响，是累加效应。
使用粒长指标进行定量描述，单独的gs9基因对粒长的贡献效应是9.14％，单独的qPE9-1基因对粒长的贡献效应是4.29％。如果两个基因间相互没有影响，那么理论上两者聚合的效应是13.43％，而实际两者聚合的效应是12.9％，大致等于其理论值。这些结果表明GS9和qPE9-1基因影响水稻发育是一种加性效应的关系，即GS9和qPE9-1基因间没有遗传互作效应。
实施例3：gs9-1和gs9-2分子标记的设计与检测
与GS9基因比较，gs9等位基因的第2外显子上发生了长片段插入(下述称为该长片段插入位点)。根据该长片段插入位点设计特异性的连锁标记gs9-1和gs9-2，用来验证这个特殊位点(图4)。其序列特征为：
gs9-1-F：5’-CTCGCTTTCTTTACCTATGTTCAAGCCTTC-3’；(SEQ IDNO.1)
gs9-1-R：5’-GGCTTTTGTGATTTTCCAAAGAAT-3’；(SEQ IDNO.2)
gs9-2-F：5’-TGCCCATAATCTCAACACTT-3’；(SEQ IDNO.3)
gs9-2-R：5’-CTGCTTGCGTCCCAGAAA-3’。(SEQ IDNO.4)
在该插入位点无长片段插入是野生型水稻(称为GS基因型)，在该插入位点有长片段插入是突变水稻(称为gs基因型)。
用引物gs9-1和gs9-2对水稻总DNA进行PCR扩增，得到的PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定(图4)。PCR反应体系：1ug的模板DNA，0.5ul的10mM浓度的正向引物和反向引物，10ul的2×Taq Master Mix，8ul的超纯水。PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃变性35s，55℃退火35s，72℃延伸35s，72℃再延伸4min。
如果电泳后能够获得清晰可见的谱带，则说明该水稻植株的基因型为gs型(图4)；如果电泳后没有获得清晰可见的谱带，则说明该水稻植株的基因型为GS型(图4)。
实施例4：InDel901分子标记的设计与检测
与qPE9-1基因比较，qpe9-1等位基因在第2内含子上存在一个特殊的15个碱基的插入位点(下述称为该插入位点)。根据该插入位点设计特异性的插入缺失标记InDel901，InDel901-F为5’-GTGCTTTGGAACCACTCT-3’(SEQ IDNO.5)，InDel901-R为5’-ATAGCAAATGGCAAATGG-3’(SEQ IDNO.6)。
PCR反应体系：1ug的模板DNA，0.5ul的10mM浓度的正向引物和反向引物，10ul的2×Taq Master Mix，8ul的超纯水。PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃变性35s，55℃退火35s，72℃延伸35s，72℃再延伸4min。
对于含有直立穗等位基因qpe9-1的品种，在该插入位点为有15bp的插入，能够扩增出164bp的片段(称为pe基因型)。对于不含有qpe9-1的品种，能够扩增出146bp的片段(称为PE基因型)。用3％的琼脂糖凝胶电泳鉴定(图5)，如果电泳后能够获得pe型或PE9型对应大小的谱带，则说明该水稻植株含有或者不含有直立穗基因qpe9-1。
实施例5：利用III型等位基因组合改良直立穗品种武育粳27的粒形
以含有gs9gs9qpe9-1qpe9-1等位基因的水稻新品系2661-III为供体亲本，以武育粳27为轮回亲本，进行连续回交选育，轮回亲本武育粳27是典型的直立穗品种，其含有qpe9-1基因，在该位点上与供体亲本的基因型完全一致。因此，用实施例3中的与等位基因gs9完全连锁的分子标记进行辅助选择，构建gs9等位基因的近等基因系WY27-gs9，省去了打破不利连锁的步骤，大大加快了育种进程。
保持植株生长条件一致，观察近等基因系WY27-gs9及其对照株系WY27-GS9的农艺性状表现，结果近等基因系WY27-gs9籽粒较对照细长，稻米也表现为细长，垩白状况明显改善，同时其他农艺性状没有显著差异(图6)。因此，新选育品系WY27-gs9可在保持产量等其他优异综合性状的基础上，表现出粒形细长，垩白减少的外观品质改良效应。外观品质是消费者判断稻米品质好坏的重要依据，具有极其重要的商品价值。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种培育具有细长籽粒的水稻直立穗品种的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcgctttct ttacctatgt tcaagccttc 30
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcttttgtg attttccaaa gaat 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcccataat ctcaacactt 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgcttgcgt cccagaaa 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgctttgga accactct 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atagcaaatg gcaaatgg 18
Claims (10)
1.gs9和qpe9-1等位基因联合在培育获得具有细长粒和直立穗的水稻植株的应用。
2.一种培育具有细长籽粒和直立穗的水稻品种的方法，所述方法包括构建含有gs9/qpe9-1等位基因的杂交水稻植株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述水稻植株中含有gs9gs9qpe9-1qpe9-1基因。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括：将含有gs9等位基因的水稻植株与含有qpe9-1等位基因的水稻植株杂交，培育，筛选出含有gs9和qpe9-1等位基因组合的水稻植株。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将含有gs9/qPE9-1等位基因的水稻植株与含有GS9/qpe9-1等位基因的水稻植株杂交，培育，获得F1；
(2)种植上述F1种子，成熟期收种获得F2种子；筛选出含有目的基因的单株；
(3)种植单株收获自交F3种子；
(4)种植上述自交F3种子，通过分子标记筛选出GS9与qPE9-1基因间发生遗传重组的单株，收获自交F4种子；
(5)种植自交F4种子筛选出含有gs9gs9qpe9-1qpe9-1的单株，并在抽穗期与轮回亲本杂交；
(6)将获得的植株与轮回亲本回交，筛选目的植株A。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
(7)将步骤(6)获得的植株A种子种植，从中选出株叶形态与轮回亲本相近且标记基因型为杂合型的单株继续与轮回亲本回交，获得植株B；
(8)将植株B种子种植，从中选出株叶形态与轮回亲本相近且标记基因型为杂合型的单株继续与轮回亲本回交，获得植株C；
(9)将植株C种子种植，从中选出株叶形态与轮回亲本相近且标记基因型为杂合型的单株继续与轮回亲本回交，获得植株D1；
(10)种植植株D1的种子，从中选出株叶形态与轮回亲本相近且标记基因型为杂合型的单株自交，获得D2种子；
(11)种植D2种子，从中选出株叶形态与轮回亲本相近且标记基因型仍为gs9gs9qpe9-1qpe9-1纯合型的单株自交，获得目的植株。
7.一种用于检测qpe9-1等位基因的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.5，反向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
8.一种鉴定qpe9-1等位基因的方法，所述方法包括采用如权利要求7所述的引物对目的基因进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法利用所述引物采用PCR扩增待检测基因，所述PCR的条件为：94℃预变性4min，94℃变性35s，55℃退火35s，72℃延伸35s，72℃再延伸4min。
10.如权利要求7所述的引物对在鉴定qpe9-1等位基因中的应用。
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- 2020-09-25 CN CN202011021397.4A patent/CN112159863B/zh active Active
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