KR20170070074A - 개선된 내병성을 갖는 토마토 식물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 토마토 황화 잎 말림 바이러스 (TYLCV)에 대해 내성을 나타내고, 그리고 괴사와 같은 불리한 관련 형질은 결핍된 토마토 식물을 제공한다. 이러한 식물은 S. 칠렌세로부터의 내병성과 관련된 신규한 유전자이입된 게놈 영역을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 내병성 표현형을 갖는 식물 또는 생식질을 생산, 육종, 식별, 및 선별하기 위한 신규한 다형성 마커를 포함하는 조성물, 및 방법이 제공된다.

Description

개선된 내병성을 갖는 토마토 식물{TOMATO PLANTS WITH IMPROVED DISEASE RESISTANCE}
관련 출원에 대한 교차 -참조
본 출원은 전문이 본원에 참조로 인용된, 2014년 10월 15일에 출원된 미국 가출원 제62/064,375호에 대한 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은, 감소된 식물 괴사를 갖는 내병성을 나타내는 토마토 식물을 생산하기 위한 농업 분야, 더욱 구체적으로 이를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
서열 목록의 통합
파일명 "SEMB019WO_ST25"로 포함된, 서열 목록(크기 11.1 킬로바이트-Microsoft Windows 운영 체제에 의해 측정된 크기)은 2015년 10월 13일에 만들어졌으며, 전자 제출 방식에 의해 본 출원과 함께 제출되며, 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
내병성은 농업에서, 구체적으로 식용 작물 생산에 있어서 중요한 형질(trait)이다. 내병성 대립유전자가 미재배 토마토 세포주에서 식별되었지만, 이러한 대립유전자를 재배 세포주에 도입하려는 노력들이 내성 대립유전자와 함께 유해 형질의 도입에 의해 방해받는다. 식물 육종법에서 마커-보조 선발(MAS)의 사용은 관심 형질에 연결된 유전자 마커에 기초하여 식물을 선발할 수 있게 하였다. 그러나, 비록 형질과 관련된 유전자가 특성화되었더라도 식물에서 바람직한 형질을 식별하거나 추적하기 위한 정확한 마커는 자주 이용 불가능하다. 이러한 어려움은 다유전자성 또는 양적 유전, 및 종종 목적하는 표현형의 발현의 근간을 이루는 유전적 배경의 불완전한 이해와 같은 요인들에 의해 더욱 복잡해진다. 따라서, MAS에서 사용하기 위한 정확하고 유효한 마커의 부재하에서는, 특정 내병성 표현형을 나타내는 신규한 식물 세포주를 생산하는 것이 실현 가능하지 않을 수 있다.
발명의 요약
일 양태에서, 본 발명은 염색체 6 상에 솔라눔 칠렌세 (Solanum chilense)로부터의 재조합 유전자이입(recombinant introgression)을 포함하는 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물을 제공하며, 여기서 상기 재조합 유전자이입은 제1 대립유전자가 결핍된 식물에 비해 토마토 황화 잎 말림 바이러스(tomato yellow leaf curl virus)에 대한 개선된 내성을 부여하는 제1 대립유전자를 포함하고, 상기 재조합 유전자이입은 상기 제1 대립유전자에 유전적으로 연결되고, 괴사를 부여하는 제2 대립유전자가 결핍된다. 특정 구현예에서, 솔라눔 칠렌세 (Solanum chilense) 로부터의 재조합 유전자이입은 하기에 위치한다: 대략 30.20 Mbp 내지 30.88 Mbp (염색체 6 상에서), 또는 대략 30.69 Mbp 내지 30.88 Mbp (염색체 6 상에서), 대략 30.71 Mbp 내지 30.88 Mbp (염색체 6 상에서), 대략 30.32 Mbp 내지 30.71 Mbp (염색체 6 상에서), 또는 대략 30.88 Mbp 내지 31.80 Mbp (염색체 6 상에서).
기타 구현예에서, 식물은 유전자좌 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)에 솔라눔 칠렌세 대립유전자를 포함하고 유전자좌 NSLYC005134429 (서열 번호: 3)에 솔라눔 칠렌세 대립유전자가 결핍되거나, 또는 식물은 유전자좌 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)에 솔라눔 칠렌세 대립유전자를 포함하고 유전자좌 NSLYC009077970 (서열 번호: 2)에 솔라눔 칠렌세 대립유전자가 결핍되거나, 또는 식물은 NSLYC005134429 (서열 번호: 3) 및 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)이 측면에 있는 게놈 분절 내에 S. 칠렌세 공여체 DNA를 포함하거나, 또는 식물은 NSLYC009077970 (서열 번호: 2) 및 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)이 측면에 있는 게놈 분절 내에 S. 칠렌세 공여체 DNA를 포함하거나, 또는 식물은 NSLYC008382908 및 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)이 측면에 있는 게놈 분절 내에 S. 칠렌세 공여체 DNA를 포함하거나, 또는 식물은 NSLYC009418370 (서열 번호: 4) 및 NL231193이 측면에 있는 게놈 분절 내에 S. 칠렌세 공여체 DNA를 포함한다. 기타 구현예에서, 본 발명은 세포, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 과실, 꽃, 또는 화분을 포함한, 이러한 식물의 식물 부분을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 a) 청구항 1의 토마토 식물을 자신과 또는 상이한 유전자형의 제2 토마토 식물과 교배하여 하나 이상의 자손 식물을 생산하는 단계; 및 b) 상기 재조합 유전자이입을 포함하는 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하는, 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대해 개선된 내성을 갖는 토마토 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 자손 식물의 선택은 (1) 토마토 식물에서 상기 제1 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자좌에 솔라눔 칠렌세 대립유전자를 포함하고/하거나 상응하는 유전자좌에 존재하는 대립유전자가 결핍되어 있고, 및 (2) 토마토 식물에서 괴사를 부여하는 상기 제2 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자좌에 솔라눔 칠렌세 대립유전자가 결핍되어 있고/있거나 상응하는 유전자좌에 존재하는 대립유전자를 포함하는 자손 식물을 식별하는 것을 포함한다. 기타 구현예에서, 상기 자손 식물의 선택는 마커-보조 선발 (MAS)을 포함한다. 추가의 구현예에서, 마커-보조 선발 (MAS)은 NSLYC005134429 (서열 번호: 3), NSLYC009077970 (서열 번호: 2), NSLYC009418370 (서열 번호: 4), NSLYC008383071 (서열 번호: 1), NSLYC008382908, 및 NL231193으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자를 검출하는 것을 포함한다. 또 다른 추가 구현예에서, 자손 식물은 F2-F6 자손 식물이거나, 또는 자손 식물을 생산하는 단계는 2-7 세대의 역교배로부터와 같은 역교배를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 a) 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대한 내성을 부여하고 괴사를 부여하는 솔라눔 칠렌세로부터의 제2 대립유전자에 식물에서 유전적으로 연결되는 제1 대립유전자에 대해 이형접합성인 토마토 식물을 수득하는 단계; (b) 식물의 자손을 수득하는 단계; 및 (c) 자손이 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대해 내성을 부여하는 상기 제1 대립유전자를 포함하지만 괴사를 부여하는 상기 제2 대립유전자는 포함하지 않도록 재조합이 발생하는 적어도 제1 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하고; 상기 제1 자손 식물의 선택은 NSLYC005134429 (서열 번호: 3), NSLYC009077970 (서열 번호: 2), NSLYC009418370 (서열 번호: 4), NSLYC008383071 (서열 번호: 1), NSLYC008382908, 및 NL231193으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는, 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대해 개선된 내성을 나타내는 토마토 식물을 수득하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 자손 식물은 F2-F6 자손 식물이거나, 또는 자손 식물의 생산은 2-7 세대의 역교배로부터와 같은 역교배를 포함한다. 기타 구현예에서, 본 발명은 이러한 방법에 의해 생산된 식물, 또는 세포, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 과실, 꽃, 및 화분으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 이러한 식물의 부분을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 마커 NSLYC008374675 (서열 번호: 5)에 TT 대립유전자, 및 마커 NSLYC008375578 (서열 번호: 6)에 GG 대립유전자를 포함하는 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물을 제공하며, 여기서, 상기 대립유전자는 괴사의 결핍 또는 괴사에 대한 내성을 부여한다. 일 구현예에서, 방법은 d) 괴사와 관련된 염색체 2에 대한 대립유전자에 대해 선택하는 단계를 추가로 포함하고; 여기서 상기 선택은 마커 NSLYC008374675 (서열 번호: 5)에 CC 대립유전자, 또는 마커 NSLYC008375578 (서열 번호: 6)에 AA 대립유전자를 포함하는 식물에 대한 선택을 포함하며, 여기서 상기 대립유전자의 존재는 괴사를 부여한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 a) 괴사에 대해 내성을 부여하는 제1 대립유전자에 대해 이형접합성인 토마토 식물을 수득하는 단계; (b) 식물의 자손을 수득하는 단계; 및 (c) 자손이 괴사에 대해 내성을 부여하는 상기 제1 대립유전자를 포함하도록 재조합이 발생하는 적어도 제1 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하고; 여기서 상기 제1 자손 식물의 선택은 마커 NSLYC008374675 (서열 번호: 5) 및 마커 NSLYC008375578 (서열 번호: 6)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자를 검출하는 것을 포함하고, 상기 대립유전자가 괴사의 결핍 또는 괴사에 대한 내성을 부여하는, 괴사에 대해 내성을 나타내는 토마토 식물을 수득하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대해 개선된 내성을 나타내는 토마토 식물을 수득하는 방법을 제공하고, 이는 (a) 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대해 내성을 부여하고 괴사를 부여하는 솔라눔 칠렌세로부터의 제2 대립유전자에 식물에서 유전적으로 연결되는 제1 대립유전자에 대해 이형접합성인 토마토 식물을 수득하는 단계; (b) 식물의 자손을 수득하는 단계; 및 (c) 자손이 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대해 내성을 부여하는 상기 제1 대립유전자를 포함하지만 괴사를 부여하는 상기 제2 대립유전자는 포함하지 않도록 재조합이 발생하는 적어도 제1 자손 식물을 선택하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르면, 자손 식물의 선택은 솔라눔 칠렌세 염색체 6으로부터의 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대해 내성을 부여하는 대립유전자를 포함하고, 이에 연결되어 제2 유전자좌가 결핍된 식물에 비해 괴사, 감소된 결과(fruit set), 또는 감소된 과실 크기 중의 하나 이상을 부여하는 제2 유전자좌가 결핍된 식물을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 방법의 일 구현예에서, 상기 제1 자손 식물의 선택은 재조합이 유전자좌 NSLYC009418370 (서열 번호: 4)과 유전자좌 NL231193 사이에서 발생하는 자손을 선택하는 것을 포함한다. 특정한 구현예에서, 방법은 NSLYC008383071 (서열 번호: 1), NSLYC009418370 (서열 번호: 4), NSLYC008382908, 및 NL231193으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자를 검출하는 단계를 포함한다. 기타 구현예에서, 방법은 (d) 단계 (c)에서 선택된 식물들 중에서 추가의 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하며; 여기서 상기 추가의 자손 식물의 선택은 NSLYC009418370 (서열 번호: 4) 및 NL231193으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자를 검출하는 것을 포함한다. 기타 구현예에서, 본 발명은 상기 방법들 중의 어느 하나에 의해 생산된 식물을 제공한다.
도 1: 염색체 6의 Mi (선충) - Ty (제미니바이러스) 영역에서의 재조합체의 비교를 보여준다. 왼쪽에서 오른쪽까지의 컬럼은 다음과 같다: 유전적 소스, 선충 형질에 대한 마커를 포함한 22개 마커 검정(1), 및 제미니바이러스 형질에 대한 세 개의 Ty-1 마커(2-4)에 이어, 제미니바이러스 아그로접종으로부터의 표현형 결과, 포장 내성, 및 잎 괴사의 평가, 이것은 Ty-1 유전자이입으로부터의 유전적 드래그(genetic drag)의 징후이다. 유전자형은 도면에서 보여지는 바와 같이 명암법으로 나타내어져 있다. "nd"는 데이터없음을 표지한다.
도 2: S. 칠렌세부터의 Ty-1 유전자이입을 포함하는 F2 개체군에서의 유전자형 및 표현형 데이터로부터 유도된 LOD 플롯을 보여준다.
도 3: 일부 마커 유전자좌에서의 유전자형과 함께, Ty-1 유전자이입을 포함하는 일부 F3 세포주에 대한 평균 괴사 순위를 보여준다. "esc"는 소정의 마커 유전자좌에서 S. 에스쿨렌툼(S. esculentum)으로부터 유래하는 DNA를 나타내고, "chi"는 소정의 마커 유전자좌에서 S. 칠렌세로부터 유래하는 DNA를 나타낸다.
도 4: 도 3에 나타낸 마커를 사용하여 측정된 공여체 S. 칠렌세 DNA와 S. 에스쿨렌툼 DNA 사이의 중단점의 위치에 기초하여 도 3에 나타낸 몇 가지 식물 세포주에 대한 평균 괴사 스코어를 보여준다.
도 5: 도 2에 나타낸 바와 같은 괴사와 관련된 염색체 2에 대한 두 개의 마커 유전자좌에서의 유전자형과 함께, 몇 가지 식물 세포주에 대한 평균 괴사 등급을 보여준다.
도 6: Ty-1의 대략적인 영역(염색체 6의 20 내지 34 Mbp 사이)의 몇 가지 마커 유전자좌에서의 일련의 F4 재조합 세포주의 유전자형을 보여준다. SNP에 기초한 높은 상관성이 있는 TaqMan 검정은 NSLYC008426102이다. 회색 SNP는 취약성 모체(FIR-16-1078 및 FDR-16-0197)에 존재하는 SNP와 동일함을 의미하고, 백색 SNP는 저항 모체(FIR-AY06074 및 FDR-16-2133)에 존재하는 SNP와 동일함을 의미한다. 두 번째 컬럼에는, TYLCV 시험 스코어가 나타내어져 있다.
도 7: Ty-1의 대략적인 영역(염색체 6의 30.3 Mbp 내지 31.8 Mbp 사이)의 몇 가지 마커 유전자좌에서의 일련의 재조합 세포주의 유전자형을 보여준다. 회색은 공여체 S. 칠렌세 대립유전자를 나타내고 백색은 수용체 S. 에스쿨렌툼 대립유전자를 나타낸다.
도 8: 결과에 대한 성능 시험의 결과(식물의 개수당 숙성 과실의 총 개수)를 보여준다.
도 9: 결과에 대한 성능 시험의 결과(과실의 개수당 총 수확 중량 kg)를 보여준다.
도 10: 유전자이입(대략 260 kb)의 묘사를 보여준다.
토마토 황화 잎 말림 바이러스(TYLCV)는 토마토 식물에서의 심각한 수량 감소의 원인이 되는 식물 병원성 바이러스이다. 일부 야생 토마토 종이 TYLCV에 대한 내성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 이러한 종으로부터의 TYLCV 내성 대립유전자를 재배 토마토 세포주에 유전자이입하기 위해 집중적인 노력이 이루어져 왔다. 그러나, 야생 종으로부터의 내성 대립유전자는 괴사와 같은 바람직하지 못한 작물 형질을 동반하기 때문에 이러한 노력들이 제한되어 왔다. 토마토 식물에서 TYLCV로 인한 수량 감소는 상당한 문제를 남긴다.
처음으로, 본 발명은 야생 종으로부터의 Ty1 유전자이입과 이전에 관련되었던 유해한 괴사 없이 TYLCV에 대해 높은 수준의 내성을 나타내는 토마토 식물을 야기하는, 재배 또는 엘리트 토마토 세포주로의 솔라눔 칠렌세로부터의 내병성 대립유전자의 신규한 유전자이입을 제공한다. 특정한 구현예에서, 본 발명은 토마토의 리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum)(솔라눔 리코페르시 쿰(Solanum lycopersicum)으로도 알려짐) 종에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 당업계에 상당한 발전을 나타낸다. 식물 육종 동안의 관련 괴사 없이 유전자이입된 대립유전자를 추적하기 위한 신규하고 정확한 마커를 추가로 제공함으로써, 본 발명은 임의의 목적하는 토마토 유전자형으로의 내병성의 유전자이입을 가능케 한다.
TYLCV에 대한 내성은 통상적으로 S. 칠렌세로부터의 Ty-1 유전자좌의 유전자이입을 통해 수득된다. 그러나, Ty-1 유전자이입은 전형적으로 대규모이며, 이러한 유전자이입을 포함하는 식물은 괴사를 포함한 작물학적으로 허용되지 않는 형질을 나타낸다. Ty-1 유전자이입을 포함하는 식물에서 괴사의 발병 또는 증증도를 감소시키려는 노력들은 부분적으로 Ty-1 유전자좌 근처의 염색체 6의 동원체 영역에서의 억제된 재조합으로 인해 성공적이지 못하였다. 또한, Ty-1 유전자좌를 둘러싼 일부 유전자 영역은 재배 세포주와 비교하여 야생 토마토 세포주에서 도치되어, 재조합을 더욱 방해한다. S. 칠렌세로부터의 Ty-1 대립유전자의 유전자이입은 각종 토마토 세포주에 걸쳐 내성과 감소된 괴사를 갖는 유전자형과 정확히 상관성이 있는 현존하는 마커 및 검정의 부족에 의해 더욱 더 복잡해진다.
재배 토마토 세포주로의 S. 칠렌세로부터의 Ty-1 내성 대립유전자의 성공적인 유전자이입의 많은 장애에도 불구하고, 본 발명자들은 놀랍게도 Ty-1 유전자이입과 이전에 관련되었던 유해한 형질 없이 TYLCV에 대해 내성을 부여하는 S. 칠렌세로부터의 신규한 유전자이입을 생산할 수 있었다. 일부 구현예에서, 본 발명은 마커 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)에는 공여체 S. 칠렌세 DNA를 포함하고 마커 NSLYC009077970 (서열 번호: 2)에는 수용자 DNA를 포함하는 식물을 제공한다. 기타 구현예에서, 본 발명은 마커 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)에는 공여체 S. 칠렌세 DNA를 포함하고 마커 NSLYC005134429 (서열 번호: 3)에는 수용자 DNA를 포함하는 식물을 제공한다. 기타 구현예에서, 본 발명은 NSLYC009077970 (서열 번호: 2)과 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)이 측면에 있는 게놈 분절 내에 또는 NSLYC005134429 (서열 번호: 3)와 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)이 측면에 있는 게놈 분절 내에 S. 칠렌세 공여체 DNA를 포함하는 식물을 제공한다.
본 발명은 괴사 없이 TYLCV 내성을 부여하는 염색체 6의 Ty-1 영역에 신규한 재조합 유전자이입을 포함하는 식물을 생산하는데 사용될 수 있는 신규한 형질-연관 마커를 추가로 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 표 1, 4, 6, 및 7에 나타낸 마커를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 식물에서 TYLCV 내성에 유전학적으로 연관된 것으로 나타난 신규한 마커 NSLYC008383071 (서열 번호: 1), NSLYC009418370 (서열 번호: 4), NSLYC009077970 (서열 번호: 2), 및 NSLYC005134429 (서열 번호: 3)를 제공한다.
본 발명은 유해한 괴사 또는 기타의 허용되지 않는 형질 없이 동형접합적으로 배치될 수 있는 Ty-1 유전자이입을 추가로 제공한다. Ty-1 대립유전자는 통상적으로 Ty-1 유전자이입을 포함하는 식물에 의해 나타내어지는 괴저성 증상의 중증도를 감소시키려는 노력으로 이형접합적으로 배치되었다. 그러나, 엘리트 세포주에서 S. 칠렌세로부터 유래된 Ty-1 대립유전자의 이형접합성 배치가 괴사와 같은 부정적인 형질을 피하기 위해 필요하다는 당업계의 믿음과는 달리, 본 발명은 식물에서 허용되지 않는 수준의 괴사 없이 동형접합적으로 배치될 수 있는 Ty-1 내성 대립유전자를 제공한다. 따라서, 본 발명의 신규 감소된 유전자이입은 현존 기술을 능가하는 상당한 이점을 제공한다.
본 발명은 토마토 염색체 2에 괴사에 대한 내성을 부여하는 신규한 QTL 뿐만 아니라 QTL과 관련된 핵산 서열 및 유전자 마커를 추가로 식별한다. 이러한 유전자좌 내에 또는 이에 유전적으로 연결된 유리한 대립유전자를 갖는 식물의 선택을 위해 본원에 제공된 신규한 마커의 사용은 괴저성 증상이 감소되거나 부재하는 식물의 개발을 가능케 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 염색체 2에 대한 마커에서 유리한 대립유전자를 갖는 식물을 선택하거나 육종함으로써 괴저성 증상이 감소되거나 부재한 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 이러한 대립유전자를 포함하지 않는 식물과 비교하여 감소된 괴사를 나타내는, 마커 NSLYC008374675 (서열 번호: 5) 내에 TT 대립유전자를 갖는 식물 및 마커 NSLYC008375578 (서열 번호: 6) 내에 GG 대립유전자를 갖는 식물을 제공한다.
본 발명은 식물 육종 동안 본원에 제공된 게놈 영역을 정확하게 식별 및 추적할 수 있는 신규한 마커 및 검정을 추가로 제공한다. 유전적으로 다양한 토마토 세포주는 부분적으로 Ty-1 영역에서의 억제된 재조합으로 인해 교배하기가 어려울 수 있기 때문에, 통상의 육종법을 사용하여 S. 칠렌세로부터의 관련 괴사 없는 TYLCV 내성 대립유전자를 엘리트 토마토 세포주 또는 재배 세포주로 도입하는 것은 불확실한 결과를 갖는 자손 스크린을 위한 엄청나게 큰 분리 집단을 필요로 한다. 따라서, 마커-보조 선발(MAS)은 엘리트 품종으로의 야생 토마토 대립유전자의 효과적인 유전자이입에 있어서의 개선이다. 그러나, TYLCV 내성에 대한 이전에 공지되었던 마커들은 관련 괴사 없는 TYLCV 내성을 선택하지 못했다. 이와 달리, 본 발명은 표현형을 관찰하기 위해 큰 식물 개체군을 숙성되도록 성장시킬 필요 없이 내병성 및 감소된 괴사와 관련된 유전자형을 검출하기 위한 개선되고 유효한 마커를 제공함으로써 관련 괴사 없이 Ty1의 MAS를 가능케 한다.
I. 토마토 식물에서 TYLCV 내성 및 감소된 괴사와 관련된 게놈 영역, 대립유전자, 및 다형체
본 발명은 식물 육종 동안 유전자이입을 추적하기 위한 다형성 핵산 및 관련 마커와 함께, 토마토 식물에서 내병성 및 감소된 식물 괴사와 관련된 하나 이상의 대립유전자의 신규한 유전자이입을 제공한다.
TYLCV는 성장 주기의 어느 단계에서도 토마토 식물을 감염시킬 수 있고 토마토 작물에서 수율 및 품질에 있어서의 심각한 감소를 초래할 수 있다. 따라서, TYLCV 내성의 효과적인 근원을 식별하기 위해 집중적인 ㄴ노력이 이루어져 왔다. 그러나, 야생 종으로부터의 이전에 공지되었던 유전자이입은 식물 괴사와 관련되었다. 특히, TYLCV 내성 유전자의 이전에 공지되었던 유전자이입을 지닌 재배 토마토 세포주는 잎의 괴사를 나타낸다. 괴사의 발병을 감소시키려는 노력으로 수년간의 선택적 육종에도 불구하고, 이러한 노력들은 여전히 일상적으로 당업계에서 관찰되고 있다.
TYLCV 내성을 나타내는 야생 토마토 유형, 예를 들면, S. 칠렌세는 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 특정 구현예에 따라 사용될 수 있다. 다른 TYLCV 내성 근원이 또한 당업계에 기재되고 공지되어 있다(예를 들면, 참조; Vidavsky et al., Phytopathology, 88(9):910-4, 1998; Hutton et al., HortScience, 47(3):324-327, 2012; Ji et al., HortScience, 44(3):614-618, 2009).
본 발명의 개선된 유전자 마커 및 검정을 사용하여, 본 출원인은 재배 세포주에 유전자이입된 경우 더 적은 불리한 형질들과 관련된 S. 칠렌세로부터의 신규한 TYLCV 내성 영역을 성공적으로 식별할 수 있었다. 특정 구현예에서, 본 발명은 마커 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)에는 공여체 S. 칠렌세 DNA를 포함하고 마커 NSLYC009077970 (서열 번호: 2)에는 수용자 DNA를 포함하는 식물을 제공한다. 기타 구현예에서, 본 발명은 마커 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)에는 공여체 S. 칠렌세 DNA를 포함하고 마커 NSLYC005134429 (서열 번호: 3)에는 수용자 DNA를 포함하는 식물을 제공한다. 기타 구현예에서, 본 발명은 NSLYC009077970 (서열 번호: 2)과 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)이 측면에 있는 게놈 분절 내에 또는 NSLYC005134429 (서열 번호: 3)와 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)이 측면에 있는 게놈 분절 내에 S. 칠렌세 공여체 DNA를 포함하는 식물을 제공한다.
본 발명은 재배 토마토 세포주에 유전자이입되는 경우 TYLCV 내성과 관련되지만 괴사와는 관련되지 않는 염색체 6 상에서 대략 30.20 Mbp (NSLYC005134429, 서열 번호: 3) 내지 30.88 Mbp (NSLYC009418370, 서열 번호: 4), 대략 30.69 Mbp (NSLYC009077970, 서열 번호: 2) 내지 30.88 Mbp (NSLYC009418370, 서열 번호: 4), 또는 대략 30.71 Mbp (NSLYC008383071, 서열 번호: 1) 내지 30.88 Mbp (NSLYC009418370, 서열 번호: 4)의 게놈 분절을 추가로 식별하고 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 TYLCV에 대한 내성을 나타내고 괴사는 나타내지 않는, 마커 NL0232061, NL0216350, NL0244835, NSLYC005134413, NSLYC005134429 (서열 번호: 3), 및 NSLYC008382908 중의 하나 이상에 수용자 DNA를 포함하고 마커 NSLYC008373232, NSLYC009078368, NSLYC009077969, NSLYC009077970 (서열 번호: 2), NSLYC008383071 (서열 번호: 1), NSLYC009418370 (서열 번호: 4), NSLYC008426177, 및 NL231193 중의 하나 이상에 S. 칠렌세 공여체 DNA를 포함하는 식물을 제공한다.
기타 구현예에서, 본 발명은 표 1, 4, 6, 및 7에 기재된 마커와 같이 본원에 기재된 바와 같은 유전자좌를 식별하는데 사용될 수 있는 신규한 마커를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 식물에서 TYLCV 내성에 유전학적으로 연관된 것으로 나타난 신규한 마커 NSLYC008383071 (서열 번호: 1), NSLYC009418370 (서열 번호: 4), NSLYC009077970 (서열 번호: 2), 및 NSLYC005134429 (서열 번호: 3)를 제공한다.
II. 내병성과 관련된 게놈 영역의 유전자이입
마커-보조된 유전자이입은 제1 유전적 배경으로부터 제 2 유전적 배경으로 하나 이상의 마커에 의해 규정된 염색체 영역의 전이를 포함한다. 상기 유전자이입된 게놈 영역이 포함된 교배 자손은 제 1 유전적 배경의 원하는 유전자이입된 게놈 영역의 특징적인 마커와 제 2 유전적 배경의 특징적인 연계된 그리고 연계안된 마커들의 조합에 의해 식별될 수 있다.
본 발명은 재배 세포주로의 본원에 개시된 S. 칠렌세로부터의 게놈 영역 중의 하나 이상의 유전자이입을 식별 및 추적하기 위한 신규한 정밀 마커를 제공한다. 본 발명은 표 1, 4, 6, 및 7에 제시된 마커를 포함한, 식물 육종 동안 본원에 개시된 신규한 유전자이입을 식별 및 추적하기 위한 마커를 추가로 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 식물에서 TYLCV 내성에 유전학적으로 연관된 것으로 나타난 신규한 마커 NSLYC008383071 (서열 번호: 1), NSLYC009418370 (서열 번호: 4), NSLYC009077970 (서열 번호: 2), 및 NSLYC005134429 (서열 번호: 3)를 제공한다.
본 발명의 게놈 간격 중의 어느 하나 내의 또는 이에 연결된 마커는 목적하는 유전적 배경으로의 내병성과 관련된 게놈 영역의 유전자이입을 포함하는 각종 육종 노력에서 유용할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 내병성과 관련된 마커의 40 cM, 20 cM, 15 cM, 10 cM, 5cM, 2 cM, 또는 1 cM 내의 마커는 내병성 표현형과 관련된 게놈 영역의 마커-보조 유전자이입에 사용될 수 있다.
나머지 게놈 서열의 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 또는 99%가 생식질의 마커 특징을 지니는 목적하는 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자이입된 영역을 포함하는 토마토 식물이 제공된다. 게놈 영역과 밀접하게 연관되거나 이에 인접한 영역을 포함하는 유전자이입된 영역 및 본원에 제공되고 내병성 표현형과 관련된 마커를 포함하는 토마토 식물이 또한 제공된다.
III. 내병성 토마토 변종의 개발
대부분의 육종 목적을 위하여, 상업적 육종은 “재배되는”, “재배되는 유형(cultivated type)” 또는 “엘리트(elite)”인, 생식질 내에서 작용한다. "엘리트" 변종은 수율 및 기타의 선택된 형질을 포함한, 보다 우수한 작물학적 성능을 위한 육종 및 선택으로부터 야기되는 변종을 나타낸다. 유사하게, "재배" 변종 또는 "품종"은 농업에서 재배를 위한 바람직한 특징을 위해 선택되고 변종의 번식을 통해 유지될 수 있는 식물 또는 식물군이다. 엘리트 변종 또는 품종은 원예 성능에 대해 평가되는 경우 일반적으로 좋은 활약을 하기 때문에 육종하기가 더 쉽다. 다수의 재배 및 엘리트 토마토 (S. 리코페르시쿰 또는 L. 에스쿨렌툼) 타입이 개발되었으며, 이것은 작물학적으로 더 우수하며 상업적 재배를 위해 적합하다. 그러나, 재배되는 생식질의 이행 장점은 대립유전자 다양성 결여에 의해 상쇄될 수 있다. 육종가들은 일반적으로 이러한 균형을 수용하는데, 그 이유는 유전적으로 다양한 원천으로 육종할 때보다 재배되는 재료로 작업할 때 진행이 더 신속하기 때문이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 야생 종으로부터의 Ty1 유전자이입과 이전에 관련되었던 유해한 괴사 없이 TYLCV에 대한 높은 수준의 내성을 나타내는 토마토 식물을 초래하는, 엘리트 토마토 세포주, 또는 재배 토마토 세포주로의 솔라눔 칠렌세로부터의 내병성 대립유전자의 신규한 유전자이입을 제공한다. 이러한 유전자이입은 본 발명의 신규한 유전자이입 이외에, 다수의 작물학적 엘리트 형질을 가질 수 있는 우수한 토마토 식물을 제공할 수 있다.
이와 달리, 재배 생식질이 비-재배 생식질과 교배되는 경우, 육종가는 비재배 타입으로부터 신규한 대립유전자에의 접근을 수득할 수 있다. 그러나, 이러한 접근은 다양한 세포주들 간의 교배와 관련된 비옥함 문제, 및 비재배 모체로부터의 부정적인 연관 드래그(linkage drag)로 인해 상당한 어려움을 나타낸다. 토마토 식물에서, S. 칠렌세와 같은 비재배 타입은 내병성과 관련된 대립유전자를 제공할 수 있다. 그러나, 이러한 비재배 타입은 괴사에 대한 취약성 또는 과실 결함과 같은 불량한 원예 품질을 가질 수 있다.
연관 드래그 또는 낮은 유전력의 문제를 피하면서 비재배 세포주로부터의 바람직한 내성 유전자를 엘리트 재배 세포주로 유전자이입하는 방법은 장기간의 종종 고된 공정이다. 따라서 야생 연관물로부터 유래된 대립유전자를 배치하는데 있어서의 성공은 표현형 스크린을 대체하는 신뢰할만한 마커 검정 및 유해 영향이 없는 최소의 또는 절두된 유전자이입에 크게 의존한다. 성공은 내병성과 같은 정량적 형질에 대한 유전적 획득량에 초점을 맞추도록 주요 속성에 대한 유전학을 단순화시킴으로써 추가로 정의된다. 게다가, 비재배 세포주로부터의 게놈 영역을 유전자이입하는 방법은 MAS에 대한 정확한 마커의 이용가능성에 의해 크게 촉진될 수 있다.
따라서, 당업계의 숙련가는 본 발명에 의해 제공된 대립유전자, 다형체, 및 마커는 유전적 배경으로의 본원에서 식별된 게놈 영역 중의 어느 하나의 추적 및 도입을 가능케 하는 것으로 알고 있다. 또한, 본원에 개시된 내병성과 관련된 게놈 영역은 하나의 유전자형에서 다른 유전자형으로 유전자이입시키고 MAS를 사용하여 추적할 수 있다. 따라서, 출원인의 내병성과 관련된 정확한 마커의 발견은 유리한 표현형을 갖는 토마토 식물의 개발을 촉진시킬 것이다. 예를 들면, 종자는 내병성과 관련된 목적하는 게놈 영역을 포함하는 식물을 선택하기 위해 본 발명의 마커를 사용하여 종자를 유전자형 분석할 수 있다. 게다가, MAS는 목적하는 유전자이입에 대해 동형접합성이거나 이형접합성인 식물의 식별을 가능케 한다.
종간 교배(inter-species cross)는 또한 억제된 재조합 및 낮은 생식력 또는 번식력을 가진 식물을 야기할 수 있다. 예를 들면, 억제된 재조합은 토마토 선충 내성 유전자 Mi, 보리에서의 Mla 및 Mlg 유전자, 밀에서의 Yr17 및 Lr20 유전자, 포도덩굴에서의 Run1 유전자, 및 땅콩에서의 Rma 유전자에 대해 관찰되었다. 감수분열 재조합은 유전적 배경에 걸친 유리한 대립유전자의 전이, 유해한 게놈 단편의 제거, 및 유전적으로 연결된 형질의 피라미드화를 가능케 하기 때문에 고전적인 육종을 위해 필수적이다. 따라서, 정확한 마커의 부재하에서, 억제된 재조합은 육종가로 하여금 자손 스크린을 위해 분리 집단을 확장시키게 한다.
큰 집단의 표현형 평가는 시간-소모적이고, 자원 집약적이며 모든 환경에서 재현 가능한 것은 아니다. 마커-보조 선발이 실행 가능한 대안을 제공한다. SNP와 같은 독특한 다형체를 검출하도록 고안된 분자 검정이 다용도이다. 그러나, 이들은 단일 검정으로는 토마토 종 내에서 및 토마토 종 간에 대립유전자를 구별하지 못할 수 있다. 결실과 같은 염색체의 구조적 재배열이 합성적으로 표지된 올리고뉴클레오티드의 연장 및 혼성화를 손상시킨다. 복제 이벤트의 경우에, 차별 없이 단일 반응으로 다중 카피가 증폭된다. 따라서, 정확하고 매우 예측적인 마커의 개발 및 검증이 성공적인 MAS 육종 프로그램을 위해 필수적이다.
IV. 분자 지원된 육종 기술
본 발명의 실시에 이용될 수 있는 유전 마커는 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: 제한 단편 길이 다형(RFLP), 증폭된 단편 길이 다형 (AFLP), 단순 서열 반복부 (SSR), 단순 서열 길이 다형 (SSLPs), 단일 뉴클레오티드 다형 (SNP), 삽입/결곤 다형 (Indel), 가변 수 텐덤 반복부 (VNTR), 렌덤 증폭된 다형 DNA (RAPD), 이소자임, 그리고 당업자에게 공지된 기타 마커. 작물 식물에서의 마커 발견 및 개발은 마커-보조 육종 활성에의 적용을 위한 초기 프레임워크를 제공한다 (미국 특허 공개 번호: 2005/0204780, 2005/0216545, 2005/0218305, 및 2006/00504538). 생성된 “유전 지도”는 서로에 대하여 특정화된 유전자좌의 관련 위치를 나타낸다 (대립유전자에 대한 다형 핵산 마커 또는 임의의 다른 유전자좌가 식별될 수 있다).
단일 뉴클레오티드 변화와 같은 최소한의 것이 포함된 다형이 다양한 방식에서 분석될 수 있다. 예를 들면, 단일 가닥 입체 형태적 다형태(Orita et al. (1989) Genomics, 8(2), 271-278), 변성 구배 젤 전기영동(Myers (1985) EPO 0273085), 또는 절단 단편 길이 다형태(Life Technologies, Inc., Gathersberg, MD)를 포함한 전기영동 기술에 의해 검출될 수 있지만, DNA 시퀀싱의 광범위한 이용가능성이 증폭된 산물을 바로 간단히 서열분석하는 것을 더욱 용이하게 한다. 일단 다형 서열 차이가 공지되면, 특이적 대립유전자의 PCR 증폭의 일부 형태 (PASA; Sommer, et al. (1992) Biotechniques 12(1), 82-87), 또는 다중 특이적 대립유전자의 PCR 증폭 (PAMSA; Dutton and Sommer (1991) Biotechniques, 11(6), 700-7002)이 전형적으로 관련된, 자손 테스트를 위한 신속한 검정이 설계될 수 있다.
다형 마커는 세포주 또는 변종의 동일성 정도를 측정하기 위한 검정 식물에 대한 유용한 도구로 작용한다(U.S. 특허 번호 6,207,367). 이러한 마커는 표현형과의 연관을 결정하는 기초가 되며, 유전 획득(gain)을 추진하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법의 특정 구현예들에 있어서, 다형 핵산은 토마토 식물에서 내병성과 연관된 유전자형의 탐지, 내병성과 연관된 유전자형을 가진 토마토 식물의 탐지, 그리고 내병성과 연관된 유전자형을 가진 토마토 식물을 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법의 특정 구현예에서, 다형 핵산을 이용하여 게놈 안에 질병 내성과 관련된 유전자이입된 유전자좌가 포함된 토마토 식물을 만들 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에 있어서, 다형 핵산을 이용하여 내병성과 연관된 유전자좌가 포함된 자손 토마토 식물을 육종할 수 있다.
유전적 마커는 “우성(dominant)” 또는 “공동우성(codominant)” 마커를 포함할 수 있다. “공동우성” 마커는 2개 또는 그 이상의 대립유전자 (이배수체 개체당 2개)의 존재를 드러내 보인다. “우성” 마커는 오직 단일 대립유전자의 존재를 드러낸다. 마커는 공동우성 방식으로 선호적으로 유전되어, 이배수체 유전자좌에서 두 대립유전자, 또는 삼배수체 또는 사배수체 유전자좌에서 다중 대립유전자의 존재는 바로 탐지가능하며, 그리고 이들은 환경적 변화가 없는, 즉, 이들의 유전력은 1이다. 마커 유전자형은 일반적으로 이배수체 유기체에서 각 유전자좌에 2개의 마커 대립유전자를 포함한다. 각 유전자좌의 표지 대립유전자 조성은 동형접합성(homozygous) 또는 이형접합성(heterozygous)일 수 있다. 동협접합성은 한 유전자좌에 있는 두 대립유전자가 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 특징화되는 상태다. 이형접합성은 동일한 유전자좌에 대립유전자가 상이한 상태를 지칭한다.
유전 다형(가령, 유전자형 결정을 위한)의 존재 또는 부재를 결정하는 핵산-기반 분석은 식별, 선별, 유전자이입 및 이와 유사한 것들을 위한 육종 프로그램에 이용될 수 있다. 유전 다형 분석을 위한 광범위한 다양한 유전 마커가 이용가능하며, 당업자들에게 공지되어 있다. 상기 분석을 이용하여 내병성 토마토 식물과 연관된 또는 이와 연결된 유전 마커를 포함하는 또는 유전마커에 연계된 유전자, 유전자의 일부분, QTL, 대립유전자 또는 게놈 영역을 선별할 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 핵산 분석 방법은 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: PCR-기반 탐지 방법들 (예를 들면, TaqMan 분석), 마이크로어레이(microarray) 방법들, 질량 분석-기반 방법들 및/또는 전체-게놈 서열분석을 포함하는 핵산 서열분석 방법들. 특정 구현예들에서, DNA, RNA, 또는 cDNA 샘플에서 다형 부위 탐지는 핵산 증폭 방법들을 사용하여 실행될 수 있다. 이러한 방법들은 상기 다형 부위에 뻗어있는, 또는 다형 부위와 이의 전단 또는 말단에 위치한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 농도를 특이적으로 증가시킨다. 이러한 증폭된 분자는 겔 전기영동, 형광 탐지 방법들, 또는 다른 수단에 의해 바로 탐지될 수 있다.
상기 증폭을 달성하는 일 방법은 하기를 이용한다: 폴리머라아제 쇄 반응 (PCR) (Mullis et al. 1986 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273; 유럽 특허 제50,424호; 유럽 특허 제84,796호; 유럽 특허 제258,017호; 유럽 특허 제237,362호; 유럽 특허 제201,184호; U.S. 특허 제4,683,202호; U.S. 특허 제4,582,788호; 및 U.S. 특허 제4,683,194호) (다형체를 이의 이중-가닥 형태로 정의하는 인접 서열에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍을 사용함). 질량 분석에 근거한 DNA의 유형결정(typing) 방법이 또한 이용될 수 있다. 이러한 방법들은 미국 특허 번호 6,613,509 및 6,503,710, 및 본 명세서의 참고자료에서 개시된다.
DNA 서열에서 다형은 U.S. 특허 번호 5,468,613; 5,217,863; 5,210,015; 5,876,930; 6,030,787; 6,004,744; 6,013,431; 5,595,890; 5,762,876; 5,945,283; 5,468,613; 6,090,558; 5,800,944; 5,616,464; 7,312,039; 7,238,476; 7,297,485; 7,282,355; 7,270,981; 및 7,250,252(이들의 전문은 본 명세서의 참고자료에 편입됨)에서 공개된 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는 당분야에 공지된 다양한 효과적인 방법에 의해 탐지 또는 유형결정될 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물 및 방법들은 게놈 DNA 샘플 안에 다형의 유형결정을 위한 임의의 다형 유형결정 방법과 병용될 수 있다. 이용되는 이들 게놈 DNA 샘플는 식물에서 바로 단리된 게놈 DNA, 클론된 게놈 DNA, 또는 증폭된 게놈 DNA를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
예를 들면, DNA 서열에서의 다형체는 U.S. 특허 제5,468,613호 및 제5,217,863호에 기재된 바와 같은 대립유전자-특이 올리고뉴클레오티드(ASO) 프로브에의 혼성화에 의해 검출될 수 있다. U.S. 특허 번호 5,468,613은 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 공개하는데, 이때 핵산 서열 안에 단일 또는 다중 뉴클레오티드 변화는 뉴클레오티드 변화가 포함된 서열이 증폭되고, 막 상에 스팟(spotted)되고, 그리고 라벨된 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브로 처리되는 공정에 의해 핵산에서 탐지될 수 있다.
표적 핵산 서열은 예를 들어 U.S. 특허 번호 5,800,944에서 공개된 프로브 결찰(ligation) 방법들에 의해 또한 탐지될 수 있는데, 이때 관심 서열은 증폭되고, 프로브에 혼성화되고, 결찰되어, 프로브의 라벨된 부분이 탐지된다.
다형 탐지에 마이크로어레이가 또한 이용될 수 있는데, 여기에서 한 지점에서 표적 서열에서의 차이로 부분적 프로브 혼성화가 일어날 수 있도록 단일 서열을 나타내도록 올리고뉴클레오티드 프로브 세트는 중첩 방식으로 어셈블리된다 (Borevitz et al., Genome Res. 13:513-523 (2003); Cui et al., Bioinformatics 21:3852-3858 (2005). 임의의 하나의 마이크로어레이 상에서, 유전자 및/또는 넌코딩 영역이 될 수 있는 다수의 표적 서열이 있을 것으로 예상되며, 여기에서 각 표적 서열은 단일 프로브보다는 일련의 중첩되는 올리고뉴클레오티드에 의해 나타난다. 이 플렛포옴은 다수의 다형의 고처리량 스크리닝을 제공한다. 마이크로어레이-기반 방법들에 의한 표적 서열의 유형 결정은 U.S. 특허 번호 6,799,122; 6,913,879; 및 6,996,476에서 개시된다.
SNP 및 Indel을 탐지하는 다른 방법들은 단일 염기 연장 (SBE) 방법들을 포함한다. SBE 방법들의 예로는 U.S. 특허 번호 6,004,744; 6,013,431; 5,595,890; 5,762,876; 및 5,945,283에서 공개된 것들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
다형을 탐지하는 또다른 방법에서, SNP 및 Indel은 U.S. 특허 번호 5,210,015; 5,876,930; 및 6,030,787에서 공개된 방법에 의해 탐지될 수 있는데, 5’ 형광 리포터 염료 및 3’ 소광 염료를 가진 올리고뉴클레오티드 프로브는 상기 프로브의 5’ 및 3’ 단부에 공유적으로 연계된다. 상기 프로브가 무손상(intact) 상태인 경우, 소광 염료에 리포터 염료의 근접은 가령 Forster-유형 에너지 전달에 의해, 리포터 염료 형광의 억제를 초래한다. PCR 동안, 포워드 및 리버스 프라이머들은 다형의 측면에 있는 표적 DNA의 특이적 서열에 혼성화되며, 혼성화 프로브는 상기 증폭된 PCR 산물 안 다형-포함 서열에 혼성화된다. 후속 PCR 주기에서, 5’ (화살표) 3’ 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리메라제는 상기 프로브를 절단하고, 소광 염료로부터 리포터 염료를 분리시켜, 상기 리포터 형광의 증가를 초래한다.
또 다른 구현예에서, 관심 유전자좌 또는 유전자좌들은 핵산 서열분석 기술을 이용하여 직접 서열분석될 수 있다. 핵산 서열분석을 위한 방법들은 당업계에 공지되어 있으며, 454 Life Sciences (Branford, CT), Agencourt Bioscience (Beverly, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA), LI-COR Biosciences (Lincoln, NE), NimbleGen Systems (Madison, WI), Illumina (San Diego, CA), 및 VisiGen Biotechnologies (Houston, TX)에 의해 제공되는 기술들을 포함한다. 이러한 핵산 서열분석 기술은 병행(parallel) 비드 어레이, 결찰에 의한 서열분석, 모세관 전기영동, 전자 마이크로칩, “바이오칩(biochips)”, 마이크로어레이, 병향 마이크로칩, 및 단일-분자 어레이와 같은 포멧을 포함한다.
정의
다음의 정의는 본 발명을 더 잘 규정하고, 본 발명의 실시에서 당업자를 안내하기 위하여 제공된다. 달리 주지되지 않는다면, 용어는 당업계의 통상의 숙련가에 의해 통상적인 어구에 따르는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “식물”은 식물 세포, 식물 원형질체(protoplasts), 토마토 식물이 재생될 수 있는 조직 배양물의 식물 세포, 식물 캘리(calli), 식물 무리(clumps) 및 식물 또는 식물의 일부분, 가령, 화분, 꽃, 종자, 잎, 줄기 및 이와 유사한 것에서 고유한 식물 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “집단(population)”은 공통적인 부계 파생을 공유하는, 유전적으로 이종성인 식물 무리를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “변종(variety)” 및 “품종(cultivar)”이란 이들의 유전적 혈통에 의해 유사한 식물 군을 말하며, 동일 종 안에 다른 변종으로부터 성능(performance)이 식별될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “대립유전자(allele)”는 염색체 상에 주어진 유전자좌에서 게놈 서열의 2개 또는 그 이상의 대체 형태를 지칭한다.
“양적 형질 위치(Quantitative Trait Locus (QTL))”는 표현형의 발현에 영향을 주는 최소한 제 1 대립유전자를 암호화하는 염색체 위치를 말한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “마커(marker)”는 유기체간을 구별하는데 이용될 수 있는 탐지가능한 특징을 말한다. 이러한 특징의 예로는 유전 마커, 생화학적 마커, 대사물질, 형태학적 특징 및 작물 특징을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “표현형(phenotype)”이란 유전자 발현에 의해 영향을 받을 수 있는 세포 또는 유기체의 탐지가능한 특징을 말한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “유전자형(genotype)”이란 식물을 구성하는 특이적 대립유전자를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "엘리트" 변종은 수율 및 기타의 선택된 형질을 포함하여 보다 우수한 작물학적 성능을 위한 육종 및 선택으로부터 야기되는 임의의 변종을 의미한다. "엘리트 식물"은 엘리트 변종에 속하고 다양한 바람직한 형질을 갖는 식물을 나타낸다. 다수의 엘리트 변종이 이용 가능하며 토마토 육종 분야의 숙련가들에게 알려져 있다. "엘리트 개체군"은 토마토와 같은 소정의 작물 종의 작물학적으로 우수한 유전자형의 측면에서 최첨단을 나타내는 사용될 수 있는 엘리트 개체 또는 변종의 모음이다. 유사하게, "엘리트 생식질" 또는 생식질의 엘리트 품종은 작물학적으로 우수한 생식질이다.
"재배" 변종 또는 "품종"은 변종의 번식을 통해 유지될 수 있는, 농업에서 성장되는 경우 바람직한 특징을 위해 선택되는 식물 또는 식물군이다. 재배 변종은 야생에서 자연 발생적인 것은 아니며, 대신 재배를 위해 바람직한 특징을 수득하기 위한 인간 개입의 결과이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 유전적 좌에 이용될 때, 용어 “유전자이입된(introgressed)”이란 역교배를 통하여 새로운 유전 배경으로 도입되는 유전적 좌를 말한다. 유전적 좌의 유전자이입은 작물 육종 방법들 및/또는 분자 유전 방법들에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 분자 유전 방법들은 동형 재조합, 비-동형 재조합, 부위-특이적 재조합을 제공하는 다양한 식물 형질변환 기술 및/또는 방법들, 및/또는 유전자좌 치환 또는 유전자좌 전환을 제공하는 게놈 변형을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 핵산 마커 및/또는 게놈 영역 내용에서 이용된 용어 "연계된(linked)"이란 마커 및/또는 게놈 영역은 동일한 연계 군 또는 염색체 상에 위치하며, 이들은 감수분열시에 분리되는 경향이 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "괴사"는 식물 또는 식물 조직의 맥락에서 사용되는 경우 갈변하고 사멸하는 조직을 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "괴사"는 또한 황백화(chlorosis)의 발병을 포함할 수 있으며, 여기서 황백화 조직은 정상적으로 녹색인 조직의 황색 또는 백색 변색에 의해 표시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "내성 유전자좌"는 질병에 대한 내성 또는 내성과 관련된 유전자좌를 의미한다. 예를 들면, 본 발명에 따르는 내성 유전자좌는, 일 구현예에서, 토마토 황화 잎 말림 바이러스 (TYLCV)에 대한 내성 또는 취약성을 조절할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "내성 대립유전자"는 질병에 대한 내성 또는 내성과 관련된 핵산 서열을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 질병 상태에 대한 식물에서의 "내성" 또는 "개선된 내성"은 식물이 비-내성 또는 덜 내성인 식물보다 질병 부담을 더 많이 감소시킬 수 있다는 표시이다. 내성은 "내성" 식물이 유사한 질병 상태에서 성장되는 다른 (덜 내성인) 식물(예컨대, 다른 식물 변종)에 비해 질병 부담을 더 많이 감소시킬 수 있음을 나타내는 상대어이다. 숙련가는 질병 상태에 대한 식물 내성은 광범위하게 다양하며, 더-내성이거나 덜-내성인 표현형의 스펙트럼을 나타낼 수 있음을 인지할 것이다. 그러나, 단순 관찰에 의해, 숙련가는 일반적으로 질병 상태 하에서 상이한 식물, 식물 변종, 또는 식물 계열의 상대적인 내성을 알 수 있으며, 더욱이 "내성"의 표현형적 단계적 차이를 또한 인지할 것이다.
숙련가는 질병 상태에 대한 식물 내성은 광범위하게 다양하며, 더-내성이거나 덜-내성인 표현형의 스펙트럼을 나타낼 수 있음을 인지할 것이다. 그러나, 단순 관찰에 의해, 숙련가는 일반적으로 질병 상태 하에서 상이한 식물, 식물 변종, 또는 식물 계열의 상대적인 내성을 알 수 있으며, 더욱이 "내성"의 표현형적 단계적 차이를 또한 인지할 것이다.
용어 "약"은 하나의 값이 그 값을 측정하기 위해 이용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함한다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 본 개시내용이 유일한 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 뒷받침하더라도, 유일한 대안을 지칭하거나 또는 대안이 상호 배타적인 것으로 달리 명확하게 표시되지 않는 한 "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다. 청구범위에서 단어 "포함하는" 또는 다른 개방적 용어와 함께 사용되는 경우, 단수형은 명백히 나타내지 않는 한 "하나 이상"을 나타낸다. 용어 "포함하다," "갖다"는 개방형 연결 동사이다. "포함하다," "포함하는," "갖다," "갖는"과 같은 이들 동사 중 하나 이상의 임의의 형태 또는 시제 역시 개방형이다. 예를 들면, 하나 이상의 단계를 "포함하는," "갖는" 어떤 방법은 그러한 하나 이상의 단계만을 가지는 것으로 한정되지 않으며, 열거되지 않은 다른 단계들을 또한 포괄한다. 유사하게, 하나 이상의 형질을 "포함하는," "갖는" 어떤 식물은 그러한 하나 이상의 형질만을 포함하는 것으로 한정되지 않으며, 열거되지 않은 다른 형질들도 포괄한다.
실시예
실시예 1
Ty -1을 포함하는 재조합 토마토 세포주의 식별
S. 칠렌세 LA1969로부터의 Ty-1 TYLCV 내성 유전자좌를 엘리트 S. 리코페르시콘 식물에 유전자이입하여, TYLCV에 대해 높은 수준의 내성을 갖는 몇 가지 육종 세포주를 초래하였다. 그러나, 이러한 세포주는 괴사를 포함하는, S. 칠렌세로부터의 Ty-1 유전자이입과 관련된 바람직하지 않은 작물학적 형질을 나타내었다. 표 1에 나타낸 분자 마커는 감소된 괴사 발병률과 TYLCV 내성을 유지하는 재조합체의 식별을 위해 개발되었다.
표 1. Ty-1 재조합체의 식별을 위한 염색체 6에 대한 마커.
마커 위치
NL0233580 24,527,065
NL0233570 3,293,791
NL0234045 22,036,414
NL0233833 34,148,452
NL0233541 3,294,160
NL0347537 28,852,768
NL0347530 3,329,633
NL0347552 23,690,907
NL0244835 29,785,303
NL0231187 31,166,320
NL5113529 27,693,113
NL5113524 2,404,524
NL5113488 2,207,760
NL5113492 634,983
NL5113500 2,842,081
NL5113496 3,540,443
NL5113520 30,622,375
NL5113518 1,162,062
NL5113489 1,238,761
NL5113515 21,357,322
NL5113464 31,664,916
NL5132888 20,421,231
NL0215181 14,499,315
NL0216011 23,120,245
NL0217856 12,044,896
NL0216387 22,496,662
NL5132908 20,493,538
NL5132893 3,020,831
NL5132900 20,710,909
NL5132906 8,115,068
이러한 Ty-1 관련 마커의 사용은 토마토 세포주 11039-1, 09GA0361-11 및 08TK01-26-2의 식별을 유도하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 세포주 11039-1은 마커 Q_NL5113515와 Q_NL5113488 간의 재조합을 포함한다. 이러한 세포주는 TYLCV 취약성이지만 여전히 잎 괴사를 나타내며, 이것은 Ty-1 내성 유전자좌는 마커 Q_NL5113515의 우측(염색체에서 남쪽)에 위치하는 반면 S. 칠렌세 유전자이입으로부터의 괴사 유전자좌의 적어도 몇 개의 성분은 마커 Q_NL5113488의 좌측(염색체에서 북쪽)에 위치함을 시사한다. 세포주 09GA0361-11은 CD67의 우측으로의 재조합을 포함하고 TYLCV 내성이면서 감소된 잎 괴사를 나타낸다. 심지어 더 작은 유전자이입이 세포주 08TK01-26-2에서 식별되었으며, 이는 실지에서 및 보다 조절된 상태(TYLCV로의 아그로-접종) 하에서 TYLCV 내성을 나타낸다.
실시예 2
맵핑 개체군
모체 변종 Petit(FIR-191-PETIT) 및 Screen(FIR-191-SCREEN)을 교배하여 Ty-1 유전자이입을 포함하는 식물에서 괴사 및 기타 형질의 추가의 분석을 위한 F2 개체군을 생성하였다. FIR-191-PETIT는 칠렌세 유전자이입을 포함하는 모체이다. F2 개체군으로부터의 9200개 종자를 심고 마커 NL0232070 및 NL0231193로 분석하여 209개의 검증된 재조합체를 야기하였다. 이들 재조합체 중에서, 42개를 온실에서 성장시켜 자가수정 (F3) 종자를 생산하고, F3 식물을 괴사에 대해 표현형 분석하였다. NL0232070과 NL0231193 간의 재조합 이벤트를 위해 고정된 F3 세포주 중의 25개를 Ty-1 유전자이입의 분석을 위해 온실 조건에서 성장시켰다.
실시예 3
맵핑 개체군에서 TYLCV 내성 및 괴사의 평가
식물을 다음의 가루이(whitefly) 접종 프로토콜을 사용하여 TYLCV 내성에 대해 평가하였다. 식물을 제1 본엽 단계(파종한지 대략 3주 후)에서 48시간 동안 TYLCV를 지닌 가루이(Bemisia tabaci (Q biotype))에 노출시켰다. 식물을 표 2에 나타낸 스케일에 따라 TYLCV 내성에 대해 스코어링하고, 표 3에 나타낸 스케일을 사용하여 괴사에 대해 평가하였다. 스코어링은 취약성 대조 식물의 적어도 90%가 TYLCV로 감염되었을 때(스코어 9) 접종한지 15일 및 30일 후에 수행하였다.
표 2. TYLCV 스코어링 스케일
평가 척도 정의 1 = 증상 없음.
3 = 천엽(top leaves)의 가장자리에 약간의 황색 반점 또는 줄무늬.
5 = 천엽의 분명한 황화, 말림(curling)은 없음.
7 = 천엽의 분명한 황화 및 말림. 식물의 일부 성장 저하가 일어날 수 있다.
9 = 식물의 심한 성장 저하, 천엽의 심한 말림 및 황화.
생물학적 검정을 검증하기 위한 표준 취약성 대조 식물의 적어도 90%가 TYLCV로 감염되어야 한다(스코어 9).
표 3. 괴사 스코어링 스케일. 스코어링을 위해 모든 잎이 식물에 남아 있다.
평가 척도 정의 1 = 괴사 없음; 녹색 잎.
2 = 잎 가장자리가 괴사를 보임; 남은 잎은 여전히 녹색임.
3 = 경도의 괴사; 하위엽에 약간의 선명한 괴사 반점. 황백화 없음. 녹색 잎.
4 = 경도의 괴사; 잎에 가벼운 반점 및 식물의 하부의 잎에 선명한 괴사 반점.
5 = 중간 정도의 괴사; 잎에 선명한 반점 및 식물의 하부의 잎에 선명한 괴사 반점.
6 = 식물의 하부의 잎에 괴사 및 경도의 황백화.
7 = 식물의 약 75%의 잎에 다수의 괴사 반점 및 황백화.
8 = 심한 괴사 및 황백화. 식물의 상부에만 약간의 녹색 잎이 남아 있다.
9 = 식물이 완전히 괴사 및 황백화.
실시예 4
괴사 QTL의 식별
실시예 2에 기재된 F2 개체군의 종자를 심고 식물을 인공 조명 없이 겨울에 온실 조건 하에서 성장시켰다. 낮은 <12 h이고, 밤 온도는 >15℃이며, 낮 온도는 최대 < 25℃이었다. 괴사는 실시예 3에 기재된 프로토콜을 사용하여 평가하였다. F2 식물을 개별적으로 샘플링하고 게놈에 걸쳐 분포된 마커의 일련의 TaqMan 검정으로 유전자형 분석하였다. 검정 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 20 sec에 이어, 95℃에서 3 sec 및 60℃에서 20초의 35회 반복, 및 20℃에서 유지.
유전자형 및 표현형 데이터를 조합하여, > 3.0의 확률(LOD) 값의 로그를 갖는 두 개의 QTL을 기본 설정(default settings)을 갖는 R/qtl을 사용하여 검출할 수 있다. 주요 QTL이 도 2에 나타낸 바와 같이 염색체 6에 위치하였다. 표 4는 염색체 2 및 6에 식별된 QTL을 측면에 갖는 마커에 대한 LOD 값을 보여준다.
표 4. 괴사에 대한 유의도를 보여주는 마커에 대한 LOD 데이터.
마커 Chr. Pos. LOD
NSLYC008374675 (서열 번호:5) 2 39 3.051654449
NSLYC008375578 (서열 번호:6) 2 59.57 2.589825655
NL0250996 6 3.3 57.03813316
NSLYC009418370 (서열 번호:4) 6 6.94 49.53995957
NSLYC008427230 6 17.31 36.44859245
실시예 5
염색체 6 상에서의 Ty -1 유전자이입 내의 괴사 유전자좌의 맵핑
S. 칠렌세 Ty-1 유전자이입을 포함하는 실시예 2에 기재된 F3 개체군을 Ty-1 유전자이입으로부터 유래된 괴사와 관련된 유전자좌를 식별하기 위해 추가로 분석하였다. 표 5는 F3 개체군에 대한 괴사 스코어링 결과 및 4월 및 5월 시점에서 각 세포주에 대한 평균 괴사 스코어를 보여준다. Ty-1을 둘러싸고 있는 영역에서 이러한 F3 개체군을 유전자형 분석하기 위해 일련의 마커를 개발하였으며, 이러한 마커가 표 6에 나타내어져 있다.
이러한 마커로 Ty-1 영역을 분석하는 경우, Ty-1이 위치한 염색체 6의 동원체 영역에는 재조합이 거의 관찰되지 않음을 주지하였다. 염색체 6의 5-25 cM 영역에서의 추가의 마커의 개발은 재조합 이벤트를 검출하기 위한 가능성을 증가시켰다. 이러한 신규한 분자 마커는 또한 큰 개체군을 스크리닝하여 괴사와 같은 Ty-1 유전자이입과 이전에 관련되었던 바람직하지 못한 작물학적 형질의 발생을 또한 감소시키거나 없애면서 Ty-1 내성 유전자에 의해 부여되는 TYLCV에 대한 높은 수준의 내성을 나타내는 보다 작은 Ty-1 유전자이입을 포함하는 식물을 선택할 수 있게 하였다.
도 3은 마커 NL0232061과 NL231193 사이에 재조합 이벤트를 포함하는 F3 세포주 및 대조 세포주에 대한 유전자형 분석 데이터를 보여준다. 4월 및 5월 시점에서의 평균 괴사 스코어가 또한 나타내어져 있다. 도 4는 도 3에 나타낸 마커를 사용하여 측정된 공여체 S. 칠렌세 DNA 및 S. 에스쿨렌툼 DNA 사이의 파단점(break point)을 기준으로, 하여, 도 3에 나타낸 몇 가지 식물 세포주에 대한 평균 괴사 스코어를 보여준다. 이러한 데이터는 염색체의 상부로부터 마커 NSLYC008382908이 Ty-1 유전자이입을 가진 식물에 대해 이전에 관찰되었던 증가된 수준의 괴사를 나타내지 않을 때까지 S. 칠렌세 Ty-1 공여체 DNA가 S. 에스쿨렌툼 DNA로 대체된 Ty-1 유전자이입을 포함하는 식물을 명백히 입증한다.
표 5. F3 식물에 대한 괴사 스코어링 결과.
F3 Pop. 번호 4월 4월 평균 5월 5월 평균
식물 1 식물 2 식물 3 식물 4 식물 1 식물 2 식물 3 식물 4
TJD0015 8 9 8 8 8 7 7 8 7 7.25
TJD0006 8 9 7 8 8 8 9 7 8 8
TJD0061 2 2 1 3 2 1 2 1 2 1.5
TJD00132 3 1 4 x 2.67 2 1 2 x 1.67
TJD0021 1 1 2 x 2.25 1 2 2 x 2.25
TJD0026 1 x x x 1 1 x x x 1
TJD0018 1 1 2 1 1.25 2 1 2 1 1.5
TJD0027 2 2 3 x 2.33 1 1 2 x 1.33
TJD0029 1 1 x x 1 2 2 x x 2
TJD0020 1 1 1 x 1 1 1 1 x 1
TJD0017 2 2 1 1 1.5 1 1 1 1 1
TJD0007 6 5 2 4.33 5 4 2 3.67
TJD0022 8 8 9 8 8.25 7 7 9 7 7.5
TJD00143 7 1 x x 4 4 1 x x 2.5
00144 7 8 5 x 6.67 6 7 3 x 5.33
00204 8 9 8 9 8.67 8 8 8 8 8
00214 8 8 8 9 8.25 8 8 8 9 8.25
TJD0028 3 9 8 9 7.25 2 8 7 9 6.5
TJD0030 5 2 2 x 4.25 6 3 2 x 4.75
TJD0023 5 2 x x 3.5 6 2 x x 4
TJD0002 2 5 2 x 3 2 4 3 x 3
TJD0004 2 6 7 1 4 2 5 6 1 3.5
TJD0005 2 1 3 2 2 2 2 3 3 2.5
TJD0008 3 9 x x 6 3 7 x x 5
TJD0010 4 3 2 2 2.75 4 3 2 2 2.75
TJD0009 2 1 2 3 2 2 1 2 1 1.5
00184 9 x x x 9 9 x x x 9
TJD0019 8 8 2 x 6 7 7 3 x 5.67
1esc 대조군
2ESC 대조군
3일 식물은 이형임
4chi 대조군
표 6. 토마토 염색체 6 상에서의 Ty-1 영역에서 마커와 관련된 서열.
마커 명칭 물리학
Pos . 		Gen.
Pos. 		SNP
NL0232061 21,597,226 4.32 G/A
NL0216350 27,605,333 4.25 T/C
NL0244835 29,785,303 7.47 GGTT/*
NSLYC005134413 30,027,432 7.88 A/T
NSLYC005134429 (서열 번호:3) 30,199,948 8.23 */C
NSLYC008382908 30,322,811 8.51 G/A
NSLYC008373232 30,523,713 8.93 C/T
NSLYC009078368 30,623,862 9.14 C/A
NSLYC009077969 30,658,888 9.21 A/G
NSLYC009077970 (서열 번호:2) 30,689,718 9.27 G/T
NSLYC008383071 (서열 번호:1) 30,711,829 9.31 T/C
NSLYC009418370 (서열 번호:4) 30,876,429 9.64 T/*
NSLYC008426177 30,892,169 9.67 A/T
NL0231193 31,800,043 11.6 AC
NL0232070 2,633,793 3.66 AC
NSLYC005134405 29,150,417 6.4 C/G
실시예 6
염색체 2에서 괴사와 관련된 QTL의 식별
도 2 및 표 4에 나타난 바와 같이, 괴사와 관련된 QTL이 염색체 2에서 식별되었다. TT_GG 단상형(마커 NSLYC008374675 (서열 번호: 5)에서의 TT 대립유전자, 및 마커 NSLYC008375578 (서열 번호: 6)에서의 GG 대립유전자)은 표 7 및 도 5에 나타낸 바와 같이 괴사 감소 또는 부재와 관련된다. 따라서, TT_GG 단상형을 갖는 식물에서의 괴사는 상이한 괴사 QTL과 관련된다. CC_AA 단상형(마커 NSLYC008374675 (서열 번호: 5)에서의 CC 대립유전자, 및 마커 NSLYC008375578 (서열 번호: 6)에서의 AA 대립유전자)은 괴사와 관련된다. 이러한 대립유전자를 갖는 토마토 세포주는 전형적으로 중간 수준이기는 하지만 괴사를 나타낼 수 있다(도 5). VIC 프로브 서열, FAM 프로브 서열, 및 마커 NSLYC008374675 및 마커 NSLYC008375578에 대한 전방향 및 역방향 프라이머가 각각 서열 번호: 7-8, 9-10, 11-12, 및 13-14로서 제공된다.
표 7. 토마토 염색체 2에서 괴사와 관련된 마커.
마커 명칭 서열 번호 물리학
Pos . 		비괴사성 대립유전자 괴사 대립유전자
NSLYC008374675 5 34,929,994 TT CC
NSLYC008375578 6 38,823,651 GG AA
실시예 7
TaqMan 검정
TaqMan 검정은 마커 NSLYC008426102를 사용하여 염색체 6 (염기 위치 32,987,053)에서 SNP를 검출하기 위해 개발되었다. 유전형분석은 염색체 6의 20 및 34 Mbp 사이의 Ty-1 영역에 위치한 TaqMan 검정으로의 일련의 F4 재조합 세포주 상의 것을 결과로 하였다. TaqMan 검정은 존재하는 재조합 개체군에 대해 100% 상관성을 나타내었다(도 6).
실시예 8
괴사 없는 TYLCV 내성의 형질 유전자이입
전형적인 Ty-1 유전자이입을 포함하고 괴사를 나타내는 토마토 세포주를 본원에 기재되고 괴사를 거의 또는 전혀 나타내지 않는 감소된 Ty-1 유전자이입을 포함하는 토마토 세포주와 교배한다. 이러한 교배로부터의 자손 식물을 역교배하여 BC1 세대를 생산한다. BC1 자손 식물을 본 발명의 감소된 Ty-1 유전자이입의 존재를 나타내는 마커 NSLYC009077970 (서열 번호: 2)에서의 S. 에스쿨렌툼 대립유전자를 위해 선택한다. BC1 자손 식물 또는 추가의 자손 식물을 마커 NSLYC009418370 (서열 번호: 4)에서의 S. 칠렌세 대립유전자의 존재를 위해 선택하여 Ty-1 유전자이입을 따른다. 추가로, 괴사의 발병은 마커 NSLYC008374675 (서열 번호: 5) 및 NSLYC008375578 (서열 번호: 6)을 사용함으로써 기재된 염색체 2 QTL 간격에서 괴사의 부재와 관련된 대립유전자를 위해 선택함으로써 더욱 조정될 수 있다.
실시예 9
보다 작은 Ty -1 유전자이입 크기를 갖는 재조합 토마토 식물
Ty-1과 바람직하지 않은 괴사 드래그 간의 연결을 끊기 위해 공여체 S. 칠렌세 DNA를 덜 갖는 Ty-1 유전자이입을 가진 토마토 식물을 생산하기 위해, 마커 NSLYC008382908 (8.51 cM)과 NSLYC008383071 (9.31 cM, 서열 번호: 1) 간의 재조합을 위한 초기 선택을 수행하였다(도 7 참조). 다음으로, S. 칠렌세 DNA의 양을 최소화시키고 이에 따라 유전자이입의 크기를 감소시키기 위한 마커 NSLYC009418370 (9.64 cM, 서열 번호: 4)과 NL231193 (11.58 cM) 간의 재조합을 위한 선택. 마커 NSLYC008382908 및 NL231193에 대한 서열이 표 9에 제공되어 있다. 선택된 재조합체를 10개 식물 각각의 4회 복제물에 가루이를 접종함으로써 TYLCV에 대한 내성에 대해 시험하였다. 추가로, 성숙 과실의 전체 식물 수확 및 총 수확 중량 및 과실 계수를 6개 식물 각각의 4회 복제물에 대해 수행하였다. 이러한 시험 수행의 결과는 하기에 나타난다: 표 8 및, 도 8 및 도 9.
표 8. 효능 시험의 일원 ANOVA에 대한 평균 값.
배경 그룹 A 그룹 B 설정 DI LSM 스튜던트 t 시험 (α = 0.05)
FDR-14-818 P RP TY1-1 9.00 A
FDR-15-2061 RC RP TY1-2 9.00 A
FDR-15-2061 P RP TY1-3 9.00 A
FDR-15-2061 P RP TY1-4 9.00 A
FDR-15-2061 RC RP TY1-4 9.00 A
FDR-15-2061 P RP TY1-5 8.90 A
FDR-15-2061 RC RP TY1-5 8.90 A
FDR-15-2061 P RP TY1-2 8.70 A
FDR-14-818 RC RP TY1-1 8.40 A
FDR-15-2061 RC RP TY1-3 7.48 식 B
FDR-15-2061 RC D TY1-5 4.65 C
FDR-15-2061 RC D TY1-4 4.20 C, D
FDR-15-2061 RC D TY1-2 4.18 C, D
FDR-9Q08133 P D TY1-1 3.80 D, E
FDR -15-2061 RC D TY1-3 3.65 D, E, F
FDR-15-2107 P D TY1-5 3.25 E, F
FDR-15-2107 P D TY1-4 3.04 E, F
FDR-15-2107 P D TY1-3 2.97 F
FDR-15-2107 P D TY1-2 2.89 F
FDR-14-818 RC D TY1-1 2.03 G
토마토 염색체 6에 대한 유전자이입을 특성화하기 위해 서열 포획를 수행하였다(도 10). 유전자이입은 대략 260 kb인 것으로 측정되었으며, 이러한 유전자이입이 삽입된 식물은 괴사의 결핍, 및 과실 크기 및 결과 드래그를 나타내면서 TYLCV에 대한 내성을 보유하였다.
표 9. 마커 서열
마커 대립유전자 VIC 서열 FAM 서열 F 서열 R 서열
NSLYC008382908 G/A CTCAATGGCAAACAA (서열 번호:15) CCTCAATGACAAACAA (서열 번호:16) AGAAAAATGTGGCCATGGGTAACT (서열 번호:17) GGTAGCCTTAGATGCAATAGTGTGA (서열 번호:18)
NL0231193 AC TCTACACAAAAGAATGC (서열 번호:19) TCTACACAAACGAATGC (서열 번호:20) CTTGGGAGATACTCTCTGTTGCTT (서열 번호:21) GCCCAACAGATGATCTTTAAGAATGG (서열 번호:22)
* * * * * * * * * * * *
본 명세서에 개시 및 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예에 대해 기재되었지만, 해당 변형은 본 발명의 개념, 정신 및 범주로부터 벗어나는 일 없이 본 명세서에 기재한 조성물 및/또는 방법에 대해 그리고 단계들에서 또는 단계들의 순서에서 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 더 구체적으로는 화학적으로 그리고 생리학적으로 관련된 특정 제제는 본 명세서에 기재된 제제를 대신할 수 있는 한편, 동일 또는 유사한 결과가 달성될 수 있다는 것이 분명할 것이다. 당업계의 숙련가들에게 자명한 이러한 모든 유사한 치환체 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같이 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 여겨진다.
SEQUENCE LISTING <110> Seminis Vegetable Seeds, Inc. <120> TOMATO PLANTS WITH IMPROVED DISEASE RESISTANCE <130> SEMB:019WO <150> 62/064,375 <151> 2014-10-15 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 764 <212> DNA <213> Solanum tomato <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (76)..(76) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (83)..(83) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (97)..(99) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (102)..(104) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (106)..(110) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (192)..(192) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (204)..(204) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (293)..(293) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (347)..(347) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (461)..(461) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (520)..(520) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (534)..(534) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (543)..(543) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (545)..(545) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (595)..(595) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (643)..(643) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (655)..(655) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (686)..(686) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (698)..(698) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (709)..(709) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 cataaccatg acacctcacc ttgaatttgt cgtgtcaatg catccntnac caaggctaat 60 aaaaaaggct aagggntgat tcntggtgca accccannna annngnnnnn tgctcagagt 120 ctcctcccag tgtccttaca tgagtattgg cttcatcata tataccctta ttttcctagt 180 gtaagccaca tntatacctc tagnctccaa tcaactccat agaaccttcc ttgggacttc 240 atggtaagcc ttctctaggt ggatgaatat catcggtaag tccttcgctt ccntatattg 300 ctccaccagt ctttttacga gatgaatgac ttctgtcatt caggccntga catgaatcta 360 aacaggtttt caaaaatagc cacgcccctc ctccctctaa tctccaccac cctctcccaa 420 accttcatat tgtagcttag cagcttgata ccctttggtt nttgcaattt tagatgtcac 480 ccttgttcat gaacaacaaa atcattgtac ttcacctccn ttcttcaggc atcnttgtgt 540 ccnanaaacg acattaaaca actctgtcaa gcactccaca cctgccctgt ctgcnacctt 600 ccaaaattca actgggatct cgtctggccc agtcactcta ccnttatgcc agggncgaac 660 ctacatagtg tcaagagggt ccatangaac ccacttcnta aaaaaattna tattgtatat 720 ataggtagat ttggtttgtc ttctggacaa tacatgtata gata 764 <210> 2 <211> 121 <212> DNA <213> Solanum tomato <400> 2 aaaccaattc acaacaaaga tgatgatatc ctttaactac tgtaaggcta gggagtacct 60 gtatttcaag ttatacggaa aacaatgcat cactccagtt gcaatcatga caagtgcagc 120 a 121 <210> 3 <211> 747 <212> DNA <213> Solanum tomato <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (69)..(70) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (86)..(86) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (91)..(91) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (126)..(126) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (159)..(159) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (162)..(162) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (187)..(187) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (206)..(206) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (249)..(255) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (277)..(277) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (306)..(306) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (351)..(351) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (368)..(368) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (381)..(381) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (384)..(384) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (414)..(415) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (417)..(424) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (528)..(528) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (530)..(530) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (685)..(685) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 caatttctct ttgttctcct tgcttattta taatcaaaat catcagtaaa caaaaaaant 60 aattaaacnn aaatgtaacc taaatnaact naccttctcc aaatcttctt gtaaatatct 120 aacaanggag gcaaccattt atattttcca ttttggtcnt anattcccac atttttctta 180 aaatacnttt taggaattaa tattancttc tttatatgtg caacatcttt cacatatttt 240 gttatatann nnnnnatata tgagatttgt ctacaantca aagtaacaaa atgttataaa 300 aaaaanctca taagataatt gaattttcct atactccatc atcaatccat ngctaaatgg 360 gattaacntg acatttttat natntagcta tgaaatttta tctgtcgcta attnngnnnn 420 nnnnagaaag agatgatgat atatacatac cttaatagat ggattggatg aagaagcaga 480 aagaagtcca gttattgttt tattatcact tccttttgta ttttcaanan gatcaacctt 540 gttggtagtc aacgtaatta ttgttctagc tccttcgtaa caagctgcac atattgtatt 600 tcttggtggc cttaaaataa atggcatcgc gctacatata gaacaatcca tatttatttg 660 tgcgcttcga ttaatttttt tctgntcaat attcgaagaa gaaattactg aactcaaatg 720 atcaatgaag aagagacgat gatcgat 747 <210> 4 <211> 338 <212> DNA <213> Solanum tomato <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (94)..(94) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (119)..(119) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (139)..(139) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (172)..(172) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (179)..(179) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (191)..(191) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (202)..(203) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (213)..(213) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (230)..(230) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (234)..(234) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (244)..(244) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (253)..(253) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (257)..(257) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (262)..(262) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (271)..(271) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (277)..(277) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (280)..(280) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (284)..(285) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (313)..(314) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 aagnattata aagatgcata canaataann nataccagag aatcaaaaca cttaaaaaga 60 cagatatgtt tttctatcat tctgttcctg cacnaaaagt aataaatttt gtaagcatnt 120 gttcttcaca aatgatatnc tccctccgtt gcaatttgtt tgtttgatat tnacttgana 180 cggagtttaa naaagtgaag anngcttttg aanattgtgg tcttgaaagn aatntgttga 240 attnaccaaa atntccntca ancttatggt nttaaanagn ctanntggaa agttaaaatt 300 aaatagttgt cannaaaagg aaagaggtct taaacatg 338 <210> 5 <211> 101 <212> DNA <213> Solanum tomato <400> 5 agtcttcctg ctcctggccc ttccgaaaga agtcaacaca gtacttctct tcctcctccc 60 catcagaaag ctcacccctc accagcttat catataactt a 101 <210> 6 <211> 101 <212> DNA <213> Solanum tomato <400> 6 gaagatttgt gggtattgat gcaaaagaag aatgttgatg ctgacttggg aagttacacc 60 attagattac aaggattggt tgcgaataac caggttaacg a 101 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe <400> 7 cagtacttct cttcctcctc 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe <400> 8 tctaatggtg taacttccca ag 22 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe <400> 9 agtacttctc tccctcctc 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe <400> 10 ctaatggtgt aactccccaa g 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 11 cctggccctt ccgaaagaa 19 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 12 gtgggtattg atgcaaaaga agaatgt 27 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 13 gggtgagctt tctgatggg 19 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 14 tcgttaacct ggttattcgc aacc 24 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 15 ctcaatggca aacaa 15 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 16 cctcaatgac aaacaa 16 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 17 agaaaaatgt ggccatgggt aact 24 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 18 ggtagcctta gatgcaatag tgtga 25 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 19 tctacacaaa agaatgc 17 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 20 tctacacaaa cgaatgc 17 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 21 cttgggagat actctctgtt gctt 24 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 22 gcccaacaga tgatctttaa gaatgg 26

Claims (35)

  1. 염색체 6 상에서 솔라눔 칠렌세 (Solanum chilense)로부터의 재조합 유전자이입을 포함하는, 재배 토마토 식물 변종(cultivated tomato plant variety)의 토마토 식물로서,
    상기 재조합 유전자이입은 제1 대립유전자가 결핍된 식물에 비해 토마토 황화 잎 말림 바이러스(tomato yellow leaf curl virus)에 대한 개선된 내성을 부여하는 제1 대립유전자를 포함하고, 그리고 상기 재조합 유전자이입은 상기 제1 대립유전자에 유전적으로 연결되고, 괴사를 부여하는 제2 대립유전자가 결핍된, 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물.
  2. 청구항 1에 있어서, 솔라눔 칠렌세로부터의 상기 재조합 유전자이입이 염색체 6 상에서 대략 30.20 Mbp 내지 30.88 Mbp 사이에 위치하는, 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물.
  3. 청구항 2에 있어서, 솔라눔 칠렌세로부터의 상기 재조합 유전자이입이 염색체 6 상에서 대략 30.69 Mbp 내지 30.88 Mbp 사이에 위치하는, 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물.
  4. 청구항 3에 있어서, 솔라눔 칠렌세로부터의 상기 재조합 유전자이입이 염색체 6 상에서 대략 30.71 Mbp 내지 30.88 Mbp 사이에 위치하는, 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물.
  5. 청구항 1에 있어서, 솔라눔 칠렌세로부터의 상기 재조합 유전자이입이 염색체 6 상에서 대략 30.32 Mbp 내지 30.71 Mbp 사이에 위치하는, 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물.
  6. 청구항 1에 있어서, 솔라눔 칠렌세로부터의 상기 재조합 유전자이입이 염색체 6 상에서 대략 30.88 Mbp 내지 31.80 Mbp 사이에 위치하는, 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 식물이, 유전자좌 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)에는 솔라눔 칠렌세 대립유전자를 포함하고, 그리고 유전자좌 NSLYC005134429 (서열 번호: 3)에는 솔라눔 칠렌세 대립유전자가 결핍된, 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 식물이, 유전자좌 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)에는 솔라눔 칠렌세 대립유전자를 포함하고, 그리고 유전자좌 NSLYC009077970 (서열 번호: 2)에는 솔라눔 칠렌세 대립유전자가 결핍된, 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 식물이, NSLYC005134429 (서열 번호: 3)와 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)이 측면에 있는 게놈 분절 내에 S. 칠렌세 공여체 DNA를 포함하는, 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 식물이, NSLYC009077970 (서열 번호: 2)와 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)이 측면에 있는 게놈 분절 내에 S. 칠렌세 공여체 DNA를 포함하는, 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 식물이, NSLYC008382908과 NSLYC008383071 (서열 번호: 1)이 측면에 있는 게놈 분절 내에 S. 칠렌세 공여체 DNA를 포함하는, 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 식물이, NSLYC009418370 (서열 번호: 4)과 NL231193이 측면에 있는 게놈 분절 내에 S. 칠렌세 공여체 DNA를 포함하는, 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물.
  13. 청구항 1의 식물의 식물 부분.
  14. 청구항 13에 있어서, 세포, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 과실, 꽃, 또는 화분인 식물 부분.
  15. 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대해 개선된 내성을 갖는 토마토 식물을 생산하는 방법으로서,
    (a) 청구항 1의 토마토 식물을, 자신과 또는 상이한 유전자형의 제2 토마토 식물과 교배하여 하나 이상의 자손 식물을 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 재조합 유전자이입을 포함하는 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 자손 식물의 선택은, (1) 상기 토마토 식물에서 상기 제1 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자좌에 솔라눔 칠렌세 대립유전자를 포함하고/하거나, 상응하는 유전자좌에 존재하는 대립유전자가 결핍되어 있고, 그리고 (2) 상기 토마토 식물에서 괴사를 부여하는 상기 제2 대립유전자에 유전적으로 연결된 유전자좌에 솔라눔 칠렌세 대립유전자가 결핍되어 있고/있거나, 상응하는 유전자좌에 존재하는 대립유전자를 포함하는 자손 식물을 식별하는 것을 포함하는, 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 자손 식물의 선택은, 마커-보조 선발 (MAS)을 포함하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 마커-보조 선발 (MAS)이 NSLYC005134429 (서열 번호: 3), NSLYC009077970 (서열 번호: 2), NSLYC009418370 (서열 번호: 4), NSLYC008383071 (서열 번호: 1), NSLYC008382908, 및 NL231193로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는, 방법.
  19. 청구항 15 에 있어서, 상기 자손 식물이 F2 내지 F6 자손 식물인, 방법.
  20. 청구항 15에 있어서, 상기 자손 생산은 역교배를 포함하는, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 역교배가 역교배의 2 내지 7 세대를 포함하는, 방법.
  22. 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대해 개선된 내성을 나타내는 토마토 식물을 수득하는 방법으로서,
    (a) 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대해 내성을 부여하고, 그리고 괴사를 부여하는 솔라눔 칠렌세로부터의 제2 대립유전자에 상기 식물 내 유전적으로 연결되는 제1 대립유전자에 대해 이형접합성인 토마토 식물을 수득하는 단계;
    (b) 식물의 자손을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 자손이, 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대해 내성을 부여하는 상기 제1 대립유전자를 포함하지만, 괴사를 부여하는 상기 제2 대립유전자는 포함하지 않도록, 재조합이 발생하는 적어도 제1 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하고;
    상기 제1 자손 식물의 선택은 NSLYC005134429 (서열 번호: 3), NSLYC009077970 (서열 번호: 2), NSLYC009418370 (서열 번호: 4), NSLYC008383071 (서열 번호: 1), NSLYC008382908, 및 NL231193으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는, 방법.
  23. 청구항 22 에 있어서, 상기 자손 식물이 F2 내지 F6 자손 식물인, 방법.
  24. 청구항 22에 있어서, 상기 자손 식물의 생산은 역교배를 포함하는, 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 역교배가 역교배의 2 내지 7 세대를 포함하는 방법.
  26. 청구항 22의 방법에 의해 생산된 식물.
  27. 청구항 26에 있어서, 세포, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 과실, 꽃, 및 화분으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 식물의 부분.
  28. 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물로서,
    마커 NSLYC008374675 (서열 번호: 5)에 TT 대립유전자, 및 마커 NSLYC008375578 (서열 번호: 6)에 GG 대립유전자를 포함하고,
    상기 대립유전자가 괴사의 결핍 또는 괴사에 대한 내성을 부여하는, 재배 토마토 식물 변종의 토마토 식물.
  29. 청구항 22에 있어서,
    d) 괴사와 관련된 염색체 2에 대한 대립유전자에 대해 선택하는 단계를 추가로 포함하고;
    상기 선택은 마커 NSLYC008374675 (서열 번호: 5)에 CC 대립유전자, 또는 마커 NSLYC008375578 (서열 번호: 6)에 AA 대립유전자를 포함하는 식물에 대해선택하는 것을를 포함하고, 그리고 상기 대립유전자의 존재는 괴사를 부여하는, 방법.
  30. 괴사에 대해 내성을 나타내는 토마토 식물을 수득하는 방법으로서,
    (a) 괴사에 대해 내성을 부여하는 제1 대립유전자에 대해 이형접합성인 토마토 식물을 수득하는 단계;
    (b) 상기 식물의 자손을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 자손이 괴사에 대해 내성을 부여하는 상기 제1 대립유전자를 포함하도록, 재조합이 발생하는 적어도 제1 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하고;
    상기 제1 자손 식물의 선택은 마커 NSLYC008374675 (서열 번호: 5) 및 마커 NSLYC008375578 (서열 번호: 6)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자를 검출하는 것을 포함하고, 그리고 상기 대립유전자는 괴사에 대한 내성, 또는 이의 결핍을 부여하는, 방법.
  31. 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대해 개선된 내성을 나타내는 토마토 식물을 수득하는 방법으로서,
    (a) 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대해 내성을 부여하고, 그리고 괴사를 부여하는 솔라눔 칠렌세로부터의 제2 대립유전자에 상기 식물 내 유전적으로 연결되는 솔라눔 칠렌세로부터의 제1 대립유전자에 대해 이형접합성인 토마토 식물을 수득하는 단계;
    (b) 식물의 자손을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 자손이 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대해 내성을 부여하는 상기 제1 대립유전자를 포함하지만, 괴사를 부여하는 상기 제2 대립유전자는 포함하지 않도록, 재조합이 발생하는 적어도 제1 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하고;
    상기 제1 자손 식물의 선택이 유전자좌 NSLYC009418370 (서열 번호: 4)과 유전자좌 NL231193 사이에 재조합이 발생하는 자손을 선택하는 것을 포함하는, 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 선택은 NSLYC008383071 (서열 번호: 1), NSLYC008382908, NSLYC009418370 (서열 번호: 4), 및 NL231193로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는, 방법.
  33. 청구항 31에 있어서,
    (d) 단계 (c)에서 선택된 식물들 또는 후속적인 이의 자손 중에서 추가의 자손 식물을 선택하는 단계를 추가로 포함하고,
    이의 추가의 재조합은 유전자좌 NSLYC009418370 (서열 번호: 4) 및 유전자좌 NL231193 사이에서 발생하는, 방법.
  34. 청구항 31에 있어서, 상기 선택이, 상기 재조합이 발생하지 않은 식물과 비교하여, 괴사, 감소된 결과(fruit set), 및 감소된 과실 크기로부터 선택된 하나 이상의 형질의 결핍으로서 상기 자손 식물을 식별하는 것을 포함하는, 방법.
  35. 청구항 31의 방법에 의해 생산된, 식물.
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Assaf Eybishtz, Tomato yellow leaf curl virus infection of a resistant tomato line with a silenced sucrose transporter gene LeHT1, Planta (2010) 231:537-548 *
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