KR20230175355A - 오이 모자이크 바이러스에 대한 저항성을 부여하는 신규 qtl - Google Patents
오이 모자이크 바이러스에 대한 저항성을 부여하는 신규 qtl Download PDFInfo
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Abstract
오이 모자이크 바이러스 저항성 표현형을 갖는 식물 또는 생식질을 생산하거나, 확인하거나, 또는 선택하는 방법과 함께, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)에 대한 저항성을 나타내는 오이 식물이 제공된다. 이러한 방법은 질병 저항성을 부여하는 게놈 영역을 이입하는 것을 포함하는, CMV에 대한 저항성을 나타내는 오이 식물을 생산하는 방법; 또는 CMV에 대한 저항성을 나타내는 오이 식물을 선택하는 방법을 포함한다. 이입된 질병 저항성 대립유전자를 포함하는 식물을 검출하기 위한 다형성 마커를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
Description
서열 목록의 포함
26 킬로바이트 (MS-Windows®에서 측정됨)이고 2022년 6월 21일에 생성된 "SEMB048USP1_ST25.txt"로 명명된 파일을 함유하는 서열 목록은 35개의 서열을 포함하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 식물 육종의 분야 및 보다 구체적으로 오이 모자이크 바이러스 (CMV)에 대한 개선된 저항성을 나타내는 오이 식물을 생산하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
오이 모자이크 바이러스 (CMV: Cucumber mosaic virus)의 증상은 전형적으로 전체 식물의 왜화, 모자이크 또는 모틀링, 잎 및 과실 상의 둥근무늬병, 및 잎의 다양한 성장 왜곡 예컨대 커핑, 퍼커링 및 스트래핑 뿐만 아니라 과실 상의 암종을 포함한다. 극한 상황에서, 병에 걸린 식물의 일부 또는 심지어 전체 식물은 질병으로 죽을 수 있다. 오이는 전 세계적으로 가장 많이 재배된 5종의 채소 중 하나이다. 따라서, CMV에 대한 저항성은 오이의 생산에 특히 중요한 형질이다. 비록 일부 CMV 저항성 대립유전자가 확인되어 있지만, 바이러스에 대한 지속가능한 저항성의 맵핑 및 도입은 여전히 현대 식물 육종의, 특히 채소에서의 주요 챌린지 중 하나이다. 게다가, 식량 공급 사슬의 세계화는 새로운 바이러스 균주 또는 종의 확산에 유리하다. 따라서, CMV에 대한 증가된 저항성을 부여하는 새로운 저항성 대립유전자 뿐만 아니라 이들 저항성 대립유전자를 상업용 계통 내로 이입하여 CMV 감염에 대한 개선된 저항성을 갖는 새로운 품종을 제공하는 보다 효과적인 방법을 확인하기 위한 계속적인 필요가 관련 기술분야에 존재한다.
하나의 측면에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)에 대한 저항성을 나타내는 오이 식물을 생산하는 방법으로서, 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호(SEQ ID NO): 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20); 또는 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 오이 모자이크 바이러스 저항성 대립유전자를 식물 내로 이입하는 것을 포함하며; 여기서 이입된 CMV 저항성 대립유전자는 식물에게 대립유전자를 포함하지 않는 식물과 비교하여 CMV에 대한 증가된 저항성을 부여하는 것인 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 이입은 하기를 포함한다: a) 염색체 분절을 포함하는 오이 식물을 그 자신과 또는 제2 오이 식물과 교배시켜 1개 이상의 자손 식물을 생산하는 것; 및 b) 염색체 분절을 포함하는 자손 식물을 선택하는 것. 추가 실시양태에서, 염색체 2 상의 염색체 분절을 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-122638 하에 기탁되어 있다. 일부 실시양태에서, 염색체 6 상의 염색체 분절을 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-122638 하에 기탁되어 있다. 다른 실시양태에서, 오이 모자이크 바이러스 저항성 대립유전자는 (a) 상기 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M24 (서열식별번호: 32) 및 마커 로커스 M25 (서열식별번호: 33)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내에 위치된 것; 또는 (b) 상기 식물의 게놈에서 염색체 6 상의 마커 로커스 M26 (서열식별번호: 34) 및 마커 로커스 M27 (서열식별번호: 35)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내에 위치된 것으로 추가로 정의된다. 또 다른 실시양태에서, 염색체 분절은 마커 로커스 M5 (서열식별번호: 12), 마커 로커스 M6 (서열식별번호: 13), 마커 로커스 M7 (서열식별번호: 14), 마커 로커스 M8 (서열식별번호: 15), 마커 로커스 M9 (서열식별번호: 16), 마커 로커스 M10 (서열식별번호: 17), 마커 로커스 M11 (서열식별번호: 18), 및 마커 로커스 M12 (서열식별번호: 19)로 이루어진 군으로부터 선택된 염색체 2 상의 마커 로커스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염색체 분절은 마커 로커스 M13 (서열식별번호: 2), 마커 로커스 M14 (서열식별번호: 3), 마커 로커스 M15 (서열식별번호: 4), 마커 로커스 M16 (서열식별번호: 5), 마커 로커스 M17 (서열식별번호: 6), 마커 로커스 M18 (서열식별번호: 7), 마커 로커스 M19 (서열식별번호: 8), 및 마커 로커스 M20 (서열식별번호: 9)으로 이루어진 군으로부터 선택된 염색체 6 상의 마커 로커스를 포함한다. 추가 실시양태에서, 방법은 식물의 게놈에서 염색체 5 상의 마커 로커스 M21 (서열식별번호: 29) 및 마커 로커스 M22 (서열식별번호: 30); 염색체 5 상의 마커 로커스 KT316424 및 마커 로커스 KT316425; 또는 염색체 6 상의 마커 로커스 SSR9-56 및 마커 로커스 SSR11-177에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 CMV 저항성 대립유전자를 식물 내로 이입하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 CMV 저항성 대립유전자 및 식물의 게놈에서 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 CMV 저항성 대립유전자를 식물 내로 이입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이입은 역교배, 마커-보조 선택, 또는 CMV 저항성에 대한 검정을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법에 의해 수득가능한 오이 식물이 제공되며, 여기서 식물은 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 CMV 저항성 대립유전자, 또는 식물의 게놈에서 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 CMV 저항성 대립유전자를 포함하거나, 또는 여기서 식물은 식물의 게놈에서 염색체 5 상의 마커 로커스 M21 (서열식별번호: 29) 및 마커 로커스 M22 (서열식별번호: 30); 또는 염색체 5 상의 마커 로커스 KT316424 및 마커 로커스 KT316425에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 CMV 저항성 대립유전자를 추가로 포함하며, 임의의 가능한 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 측면에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)에 대한 증가된 저항성을 갖는 오이 식물을 선택하는 방법으로서, (a) CMV 저항성 대립유전자를 포함하는 오이 식물을 제2 오이 식물과 교배시켜 자손 식물의 집단을 생산하는 것; 및 (b) CMV 저항성 대립유전자를 포함하는 자손 식물을 선택하는 것을 포함하며; 여기서 자손 식물을 선택하는 것은 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20); 또는 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 또는 그에 유전적으로 연결된 마커 로커스를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 자손 식물을 선택하는 것은 상기 식물의 게놈에서 (a) 염색체 2 상의 마커 로커스 M24 (서열식별번호: 32) 및 마커 로커스 M25 (서열식별번호: 33); 또는 (b) 염색체 6 상의 마커 로커스 M26 (서열식별번호: 34) 및 마커 로커스 M27 (서열식별번호: 35)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 또는 그에 유전적으로 연결된 마커 로커스를 검출하는 것으로 추가로 정의된다. 다른 실시양태에서, 자손 식물을 선택하는 것은 마커 로커스 M5 (서열식별번호: 12), 마커 로커스 M6 (서열식별번호: 13), 마커 로커스 M7 (서열식별번호: 14), 마커 로커스 M8 (서열식별번호: 15), 마커 로커스 M9 (서열식별번호: 16), 마커 로커스 M10 (서열식별번호: 17), 마커 로커스 M11 (서열식별번호: 18), 마커 로커스 M12 (서열식별번호: 19), 마커 로커스 M13 (서열식별번호: 2), 마커 로커스 M14 (서열식별번호: 3), 마커 로커스 M15 (서열식별번호: 4), 마커 로커스 M16 (서열식별번호: 5), 마커 로커스 M17 (서열식별번호: 6), 마커 로커스 M18 (서열식별번호: 7), 마커 로커스 M19 (서열식별번호: 8), 또는 마커 로커스 M20 (서열식별번호: 9)을 포함하는 핵산을 검출하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 자손 식물은 F2-F6 자손 식물이거나 또는 자손 식물을 생산하는 것은 역교배를 포함한다.
추가 측면에서, 하기를 포함하는, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)에 대한 저항성을 나타내는 오이 식물을 선택하는 방법이 제공된다: a) CMV에 대한 저항성을 포함하는 양친을 갖는 자손 식물의 집단을 수득하는 것; b) 집단을 적어도 1개의 핵산 마커로 스크리닝하여 CMV 저항성에 유전적으로 연결된 다형성을 검출하는 것; 및 c) 집단으로부터 CMV 저항성과 연관된 일배체형을 포함하는 1개 이상의 자손 식물을 선택하는 것, 여기서 일배체형은 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20); 또는 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 CMV 저항성 대립유전자를 포함함. 일부 실시양태에서, 자손 식물을 선택하는 것은 하기를 포함한다: (a) 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 또는 그에 유전적으로 연결된 마커 로커스를 검출하는 것; (b) 식물의 게놈에서 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 또는 그에 유전적으로 연결된 마커 로커스를 검출하는 것; 또는 (c) 마커 로커스 M5 (서열식별번호: 12), 마커 로커스 M6 (서열식별번호: 13), 마커 로커스 M7 (서열식별번호: 14), 마커 로커스 M8 (서열식별번호: 15), 마커 로커스 M9 (서열식별번호: 16), 마커 로커스 M10 (서열식별번호: 17), 마커 로커스 M11 (서열식별번호: 18), 마커 로커스 M12 (서열식별번호: 19), 마커 로커스 M13 (서열식별번호: 2), 마커 로커스 M14 (서열식별번호: 3), 마커 로커스 M15 (서열식별번호: 4), 마커 로커스 M16 (서열식별번호: 5), 마커 로커스 M17 (서열식별번호: 6), 마커 로커스 M18 (서열식별번호: 7), 마커 로커스 M19 (서열식별번호: 8), 및 마커 로커스 M20 (서열식별번호: 9)으로 이루어진 군으로부터 선택된 로커스에서 적어도 1개의 다형성을 검출하는 것. 다른 실시양태에서, 자손 식물은 F2-F6 자손 식물이거나 또는 자손 식물을 생산하는 것은 역교배를 포함한다. 추가 실시양태에서, 집단을 스크리닝하는 것은 PCR, 단일 가닥 입체형태적 다형성 분석, 변성 구배 겔 전기영동, 절단 단편 길이 다형성 분석, TAQMAN 검정, 및/또는 DNA 시퀀싱을 포함한다. 특정 실시양태에서, CMV 저항성 오이 식물은 염색체 2 상에 CMV 저항성 대립유전자를 포함하며, 대립유전자를 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-122638 하에 기탁되어 있다. 다른 실시양태에서, CMV 저항성 오이 식물은 염색체 6 상에 CMV 저항성 대립유전자를 포함하며, 대립유전자를 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-122638 하에 기탁되어 있다.
또 다른 측면에서, 하기를 포함하는, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)에 대한 저항성을 나타내는 오이 식물을 선택하는 방법이 제공된다: a) 1개 이상의 식물을 적어도 1개의 핵산 마커로 스크리닝하여 CMV 저항성에 유전적으로 연결된 다형성을 검출하는 것; 및 b) CMV 저항성과 연관된 일배체형을 포함하는 1개 이상의 식물을 선택하는 것, 여기서 일배체형은 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20); 또는 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 CMV 저항성 대립유전자를 포함함. 일부 실시양태에서, CMV 저항성 대립유전자는 (a) 상기 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M24 (서열식별번호: 32) 및 마커 로커스 M25 (서열식별번호: 33)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내에 위치된 것; 또는 (b) 상기 식물의 게놈에서 염색체 6 상의 마커 로커스 M26 (서열식별번호: 34) 및 마커 로커스 M27 (서열식별번호: 35)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내에 위치된 것으로 추가로 정의된다. 다른 실시양태에서, 1개 이상의 식물을 선택하는 것은 하기를 포함한다: (a) 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 또는 그에 유전적으로 연결된 마커 로커스를 검출하는 것; (b) 식물의 게놈에서 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 또는 그에 유전적으로 연결된 마커 로커스를 검출하는 것; 또는 (c) 마커 로커스 M5 (서열식별번호: 12), 마커 로커스 M6 (서열식별번호: 13), 마커 로커스 M7 (서열식별번호: 14), 마커 로커스 M8 (서열식별번호: 15), 마커 로커스 M9 (서열식별번호: 16), 마커 로커스 M10 (서열식별번호: 17), 마커 로커스 M11 (서열식별번호: 18), 마커 로커스 M12 (서열식별번호: 19), 마커 로커스 M13 (서열식별번호: 2), 마커 로커스 M14 (서열식별번호: 3), 마커 로커스 M15 (서열식별번호: 4), 마커 로커스 M16 (서열식별번호: 5), 마커 로커스 M17 (서열식별번호: 6), 마커 로커스 M18 (서열식별번호: 7), 마커 로커스 M19 (서열식별번호: 8), 및 마커 로커스 M20 (서열식별번호: 9)으로 이루어진 군으로부터 선택된 로커스에서 적어도 1개의 다형성을 검출하는 것. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 식물을 스크리닝하는 것은 PCR, 단일 가닥 입체형태적 다형성 분석, 변성 구배 겔 전기영동, 절단 단편 길이 다형성 분석, TAQMAN 검정, 및/또는 DNA 시퀀싱을 포함한다.
또 다른 추가 측면에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 저항성 대립유전자를 포함하는 오이 식물을 확인하는 방법으로서: (a) 적어도 제1 오이 식물로부터 핵산을 수득하는 것; 및 (b) 핵산에서 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20); 또는 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절의 존재를 나타내는 적어도 제1 유전적 마커의 존재를 확인하는 것을 포함하며, 여기서 CMV 저항성 대립유전자는 식물에게 대립유전자를 포함하지 않는 식물과 비교하여 CMV에 대한 증가된 저항성을 부여하는 것인 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 확인은 하기에 유전적으로 연결된 마커를 검출하는 것을 포함한다: (a) 마커 로커스 M5 (서열식별번호: 12), 마커 로커스 M6 (서열식별번호: 13), 마커 로커스 M7 (서열식별번호: 14), 마커 로커스 M8 (서열식별번호: 15), 마커 로커스 M9 (서열식별번호: 16), 마커 로커스 M10 (서열식별번호: 17), 마커 로커스 M11 (서열식별번호: 18), 및 마커 로커스 M12 (서열식별번호: 19); 또는 (b) 마커 로커스 M13 (서열식별번호: 2), 마커 로커스 M14 (서열식별번호: 3), 마커 로커스 M15 (서열식별번호: 4), 마커 로커스 M16 (서열식별번호: 5), 마커 로커스 M17 (서열식별번호: 6), 마커 로커스 M18 (서열식별번호: 7), 마커 로커스 M19 (서열식별번호: 8), 및 마커 로커스 M20 (서열식별번호: 9).
도 1: 염색체 2 (패널 A), 염색체 6 (패널 B), 및 염색체 5 (패널 C)의 물리적 맵 상의 상이한 오이 모자이크 바이러스 QTL의 도식적인 개요를 제시한다.
도 2: 실험적 설계 및 유전율을 포함하는 전장 게놈 연관 분석 (GWAS)에 사용된 다양성 패널, 집단 조성, 및 GWAS에 대해 필터링된 게놈 변이체 수의 요약을 제시한다.
도 3: 5개의 유전적 그룹에 걸친 오이 수탁물의 조직을 제시하며 (A) 각각의 색상은 수탁물의 원예 그룹 (공지된 경우)을 나타냈다. (B) 9개의 유전적 그룹에 대한 오이 수탁물의 백분율 속성을 나타내는 막대 플롯. 수탁물은 드물게 1개의 유전적 그룹에 100% 기인하였고 관찰된 혼합물은 육종 프로그램 사이의 교배로부터 생성된다. 값은 snmf R 패키지로 추출되었다. 유전적 그룹은 원예 그룹과 일치하였다. (C) 다양성 패널에서의 표현형 분산을 나타내는 막대 플롯. 수탁물은 이 그룹의 기여도가 0.6 초과였을 때 유전적 그룹에 지정되었고, 그룹이 이 임계치에 도달하지 못한 경우에, 수탁물은 혼합된 것으로 간주되었다 (흑색). 그룹당 수탁물의 수는 괄호에 표시된다.
도 4: 9개의 유전적 그룹에 걸친 오이 수탁물의 조직을 제시하며 (A) 각각의 색상은 수탁물의 원예 그룹 (공지된 경우)을 나타냈다. (B) 9개의 유전적 그룹에 대한 오이 수탁물의 백분율 속성을 나타내는 막대 플롯. 수탁물은 드물게 1개의 유전적 그룹에 100% 기인하였고 관찰된 혼합물은 육종 프로그램 사이의 교배로부터 생성된다. 값은 snmf R 패키지로 추출되었다. 유전적 그룹은 원예 그룹과 일치하였다. (C) 각각의 바이러스에 대한 다양성 패널에서의 표현형 분산을 나타내는 막대 플롯. 수탁물은 이 그룹의 기여도가 0.6 초과였을 때 유전적 그룹에 지정되었고, 그룹이 이 임계치에 도달하지 못한 경우에, 수탁물은 혼합된 것으로 간주되었다 (흑색). 그룹당 수탁물의 수는 괄호에 표시된다. 도 5: (i) 유전적 구조 (가장 밝은 회색 음영) 및 이전 MLMM 단계로부터의 상위 SNP (중간 회색 음영)의 고정 효과 (ii) 무작위 효과 (유전적, 가장 어두운 회색 음영) 및 (iii) 오류 (흑색) 사이의 표현형 분산의 분배를 제시한다. 백색 파선은 본페로니 보정을 사용하여 유의한 SNP를 나타낸다.
도 6: GWAS 분석에 상응하는 맨하탄 플롯을 제시한다. 유의성 임계치는 2개의 파선에 의해 표시된다. 플롯은 제1 KQ9 MLMM 단계로부터 수집된 p-값으로부터 수립되었다 (마커 보정 없음). CMV는 염색체 2, 5, 및 6에서 3개의 단리된 QTL을 가졌다. chr7에서의 피크는 chr6에서의 피크와 중복되어 사라졌다.
도 7: 유전적 구조 및 저항성의 수준과 관련하여 염색체 2 상의 QTL의 유전적 조직 (7.7 Mb 내지 9.6 Mb의 26793개 SNP) (A) 지역 친족의 히트맵 (B) 수탁물의 유전적 그룹 (도 4 색상 코드 참조)을 제시한다. (C) CMV 1-저항성, 9-감수성에 대한 저항성 수준. (D) 각각의 수탁물의 일배체형. SNP가 참조 게놈 CCL과 동형접합일 때 흑색이고, 대안적인 동형접합에 대해 백색이고, 이형접합에 대해 회색이다. 흑색 화살표 (하단)는 상위 SNP의 위치를 나타낸다.
도 8: 유전적 구조 및 저항성의 수준과 관련하여 염색체 6 상의 QTL의 유전적 조직 (A) 지역 친족의 히트맵 (B) 수탁물의 유전적 그룹 (도 4 색상 코드 참조)을 제시한다. (C) CMV 1-저항성, 9-감수성에 대한 저항성 수준. (D) 각각의 수탁물의 일배체형. SNP가 참조 게놈 CCL과 동형접합일 때 흑색이고, 대안적인 동형접합에 대해 백색이고, 이형접합에 대해 회색이다. 흑색 화살표 (하단)는 상위 SNP의 위치를 나타낸다.
도 9: 유전적 구조 및 저항성의 수준과 관련하여 염색체 5 상의 QTL의 유전적 조직 (A) 지역 친족의 히트맵 (B) 수탁물의 유전적 그룹 (도 4 색상 코드 참조)을 제시한다. (C) CMV 1-저항성, 9-감수성에 대한 저항성 수준. (D) 각각의 수탁물의 일배체형. SNP가 참조 게놈 CCL과 동형접합일 때 흑색이고, 대안적인 동형접합에 대해 백색이고, 이형접합에 대해 회색이다. 흑색 화살표 (하단)는 상위 SNP의 위치를 나타낸다.
도 2: 실험적 설계 및 유전율을 포함하는 전장 게놈 연관 분석 (GWAS)에 사용된 다양성 패널, 집단 조성, 및 GWAS에 대해 필터링된 게놈 변이체 수의 요약을 제시한다.
도 3: 5개의 유전적 그룹에 걸친 오이 수탁물의 조직을 제시하며 (A) 각각의 색상은 수탁물의 원예 그룹 (공지된 경우)을 나타냈다. (B) 9개의 유전적 그룹에 대한 오이 수탁물의 백분율 속성을 나타내는 막대 플롯. 수탁물은 드물게 1개의 유전적 그룹에 100% 기인하였고 관찰된 혼합물은 육종 프로그램 사이의 교배로부터 생성된다. 값은 snmf R 패키지로 추출되었다. 유전적 그룹은 원예 그룹과 일치하였다. (C) 다양성 패널에서의 표현형 분산을 나타내는 막대 플롯. 수탁물은 이 그룹의 기여도가 0.6 초과였을 때 유전적 그룹에 지정되었고, 그룹이 이 임계치에 도달하지 못한 경우에, 수탁물은 혼합된 것으로 간주되었다 (흑색). 그룹당 수탁물의 수는 괄호에 표시된다.
도 4: 9개의 유전적 그룹에 걸친 오이 수탁물의 조직을 제시하며 (A) 각각의 색상은 수탁물의 원예 그룹 (공지된 경우)을 나타냈다. (B) 9개의 유전적 그룹에 대한 오이 수탁물의 백분율 속성을 나타내는 막대 플롯. 수탁물은 드물게 1개의 유전적 그룹에 100% 기인하였고 관찰된 혼합물은 육종 프로그램 사이의 교배로부터 생성된다. 값은 snmf R 패키지로 추출되었다. 유전적 그룹은 원예 그룹과 일치하였다. (C) 각각의 바이러스에 대한 다양성 패널에서의 표현형 분산을 나타내는 막대 플롯. 수탁물은 이 그룹의 기여도가 0.6 초과였을 때 유전적 그룹에 지정되었고, 그룹이 이 임계치에 도달하지 못한 경우에, 수탁물은 혼합된 것으로 간주되었다 (흑색). 그룹당 수탁물의 수는 괄호에 표시된다. 도 5: (i) 유전적 구조 (가장 밝은 회색 음영) 및 이전 MLMM 단계로부터의 상위 SNP (중간 회색 음영)의 고정 효과 (ii) 무작위 효과 (유전적, 가장 어두운 회색 음영) 및 (iii) 오류 (흑색) 사이의 표현형 분산의 분배를 제시한다. 백색 파선은 본페로니 보정을 사용하여 유의한 SNP를 나타낸다.
도 6: GWAS 분석에 상응하는 맨하탄 플롯을 제시한다. 유의성 임계치는 2개의 파선에 의해 표시된다. 플롯은 제1 KQ9 MLMM 단계로부터 수집된 p-값으로부터 수립되었다 (마커 보정 없음). CMV는 염색체 2, 5, 및 6에서 3개의 단리된 QTL을 가졌다. chr7에서의 피크는 chr6에서의 피크와 중복되어 사라졌다.
도 7: 유전적 구조 및 저항성의 수준과 관련하여 염색체 2 상의 QTL의 유전적 조직 (7.7 Mb 내지 9.6 Mb의 26793개 SNP) (A) 지역 친족의 히트맵 (B) 수탁물의 유전적 그룹 (도 4 색상 코드 참조)을 제시한다. (C) CMV 1-저항성, 9-감수성에 대한 저항성 수준. (D) 각각의 수탁물의 일배체형. SNP가 참조 게놈 CCL과 동형접합일 때 흑색이고, 대안적인 동형접합에 대해 백색이고, 이형접합에 대해 회색이다. 흑색 화살표 (하단)는 상위 SNP의 위치를 나타낸다.
도 8: 유전적 구조 및 저항성의 수준과 관련하여 염색체 6 상의 QTL의 유전적 조직 (A) 지역 친족의 히트맵 (B) 수탁물의 유전적 그룹 (도 4 색상 코드 참조)을 제시한다. (C) CMV 1-저항성, 9-감수성에 대한 저항성 수준. (D) 각각의 수탁물의 일배체형. SNP가 참조 게놈 CCL과 동형접합일 때 흑색이고, 대안적인 동형접합에 대해 백색이고, 이형접합에 대해 회색이다. 흑색 화살표 (하단)는 상위 SNP의 위치를 나타낸다.
도 9: 유전적 구조 및 저항성의 수준과 관련하여 염색체 5 상의 QTL의 유전적 조직 (A) 지역 친족의 히트맵 (B) 수탁물의 유전적 그룹 (도 4 색상 코드 참조)을 제시한다. (C) CMV 1-저항성, 9-감수성에 대한 저항성 수준. (D) 각각의 수탁물의 일배체형. SNP가 참조 게놈 CCL과 동형접합일 때 흑색이고, 대안적인 동형접합에 대해 백색이고, 이형접합에 대해 회색이다. 흑색 화살표 (하단)는 상위 SNP의 위치를 나타낸다.
오이 모자이크 바이러스 (CMV)는 전 세계의 온화한 지역 전반에 걸친 임의의 바이러스의 가장 넓은 숙주 범위 중 하나를 갖는다. 식물의 800종 초과의 종이 감염될 수 있고, 60종 초과의 진딧물 종이 이 바이러스에 대한 벡터이다. CMV는 쿠쿠모바이러스 군의 구성원이고 고도로 다양하다. CMV의 60종 초과의 균주가 확인되어 있다.
이전에, cmv6.1로 확인되고 마커 SSR9-56 및 SSR11-177에 의해 플랭킹된, 1개의 저항성 QTL은 염색체 6에 대해 맵핑되었다 (Shi et al. 2018). 추가적으로, 마커 로커스 KT316424 및 마커 로커스 KT316425와 연관된, '심손'에서의 염색체 5 상에 위치된 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 1 (RDR1) 유전자의 작은 유전자 패밀리의 증가된 발현은 CMV에 대한 증가된 저항성과 연관된 것으로 제시되어 있다 (Leibman et al. 2018). 그러나, CMV에 대한 오이 저항성의 유전적 아키텍처는 복잡하고 오이에서의 CMV에 대한 저항성에 대한 보고는 가변적이다 (Martin-Hernandez et Pico 2021). 게다가, 이전 유전학 연구는 지금까지 오직 오이 다양성의 아주 작은 일부만을 고려한 것으로 보인다.
대조적으로, 본 개시내용은 전체로서 CMV에 대한 오이 저항성의 구조를 평가하기 위해 큰 다양성 패널을 사용하는 전장 게놈 연관 분석 (GWAS)을 제공한다. 고정 효과로서 이전 단계로부터 가장 유의한 SNP를 도입한 반복 GWAS (MLMM) 접근법을 통해, CMV에 대한 저항성을 부여하는 3개의 로커스가 염색체 2 ("chr2"), 염색체 5 ("chr5"), 및 염색체 6 ("chr6") 상에 확인되었다. 염색체 6 상에서 확인된 로커스와 관련하여, 놀랍게도 cmv6.1로부터 20 Mb 초과 떨어져 물리적으로 위치된 것이 발견되었다. 따라서, 본원에 기재된 염색체 2 및 6 상의 로커스는 새롭게 확인된 CMV 저항성 로커스를 나타내고 오이에서 CMV 저항성을 조작하기 위한 가치있는 새로운 도구를 제공한다.
본원에 개시된 바와 같은, 공개 오이 게놈 맵 버전 오이 차이니즈 롱 (CCL)의 원시품종의 염색체 2 상의 7,671,123 bp에서의 [T/C] 변화를 갖는 SNP 마커인 M1 (Li et al. 2019), 공개 오이 게놈 맵 버전 오이 차이니즈 롱 (CCL)의 원시품종의 염색체 2 상의 9,602,331 bp에서의 [G/A] 변화를 갖는 SNP 마커인 M2, 공개 오이 게놈 맵 버전 오이 차이니즈 롱 (CCL)의 원시품종의 염색체 6 상의 29,444,900 bp에서의 [A/T] 변화를 갖는 SNP 마커인 M3, 및 공개 오이 게놈 맵 버전 오이 차이니즈 롱 (CCL)의 원시품종의 염색체 6 상의 31,058,514 bp에서의 [C/A] 변화를 갖는 SNP 마커인 M4, 공개 오이 게놈 맵 버전 오이 차이니즈 롱 (CCL)의 원시품종의 염색체 5 상의 6,284,008 bp에서의 [C/T] 변화를 갖는 SNP 마커인 M21, 및 공개 오이 게놈 맵 버전 오이 차이니즈 롱 (CCL)의 원시품종의 염색체 5 상의 7,437,769 bp에서의 [T/C] 변화를 갖는 SNP 마커인 M22가 이 영역을 확인하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 M1 및 M2는 염색체 2 상의 염색체 분절에 대한 플랭킹 마커이고; 여기서 M3 및 M4는 염색체 6 상의 염색체 분절에 대한 플랭킹 마커이고; 여기서 M21 및 M22는 염색체 5 상의 염색체 분절에 대한 플랭킹 마커이다. 오이의 공개 게놈은 예를 들어 CuGenDB (http://cucurbitgenomics.org/)의 오이 (차이니즈 롱) 게놈 v3에서 또는 NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/1639?genome_assembly_id=749658)로부터의 진뱅크 어셈블리 수탁 GCA_000004075.3에서 이용가능하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 출원에 처음으로 제공된 마커 서열이 공개 게놈의 임의의 버전 (또는 후기 버전)에 위치될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 개시내용의 하나의 측면은 따라서 오이 모자이크 바이러스 (CMV)에 대한 저항성을 나타내는 오이 식물을 생산하는 방법으로서, 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20); 또는 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 오이 모자이크 바이러스 저항성 대립유전자를 식물 내로 이입하는 것을 포함하며; 여기서 이입된 CMV 저항성 대립유전자는 식물에게 대립유전자를 포함하지 않는 식물과 비교하여 CMV에 대한 증가된 저항성을 부여하는 것인 방법을 제공한다. 다른 측면에서, 오이 모자이크 바이러스 저항성 대립유전자는 (a) 상기 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M24 (서열식별번호: 32) 및 마커 로커스 M25 (서열식별번호: 33)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내에 위치된 것; 또는 (b) 상기 식물의 게놈에서 염색체 6 상의 마커 로커스 M26 (서열식별번호: 34) 및 마커 로커스 M27 (서열식별번호: 35)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내에 위치된 것으로 추가로 정의된다.
또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법에 의해 수득가능한 오이 식물이 제공되며, 여기서 식물은 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 CMV 저항성 대립유전자, 또는 식물의 게놈에서 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 CMV 저항성 대립유전자를 포함하며, 여기서 식물은 식물의 게놈에서 염색체 5 상의 마커 로커스 M21 (서열식별번호: 29) 및 마커 로커스 M22 (서열식별번호: 30); 또는 염색체 5 상의 마커 로커스 KT316424 및 마커 로커스 KT316425에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 CMV 저항성 대립유전자를 추가로 포함하며, 임의의 가능한 이들의 조합을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 식물은 본질적으로 생물학적 공정에 의해 배타적으로 수득되지 않는다.
일부 실시양태에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)에 대한 저항성을 나타내는 오이 식물을 선택하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 1개 이상의 식물을 적어도 1개의 핵산 마커로 스크리닝하여 CMV 저항성에 유전적으로 연결된 다형성을 검출하는 것, 및 CMV 저항성에 유전적으로 연결된 상기 다형성을 포함하는 1개 이상의 식물을 선택하는 것을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 선택하는 것은 상기 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20); 또는 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 또는 그에 유전적으로 연결된 마커 로커스를 검출하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 하기를 포함한다: a) 1개 이상의 식물을 적어도 1개의 핵산 마커로 스크리닝하여 CMV 저항성에 유전적으로 연결된 다형성을 검출하는 것; 및 b) CMV 저항성과 연관된 일배체형을 포함하는 1개 이상의 식물을 선택하는 것, 여기서 일배체형은 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20); 또는 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 CMV 저항성 대립유전자를 포함함. 특정한 실시양태에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)에 대한 저항성을 나타내는 오이 식물을 선택하는 것은 분자 유전학 기술을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용을 검토하는 관련 기술분야의 통상의 기술자는 1개 이상의 식물을 적어도 1개의 핵산 마커로 스크리닝하여 CMV 저항성에 유전적으로 연결된 다형성을 검출함으로써 오이 모자이크 바이러스 (CMV)에 대한 저항성을 나타내는 오이 식물을 선택하는 데 기술적 방법을 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 표 1에 제시된 마커를 제공하며, 이는 식물에서 오이 모자이크 바이러스 저항성에 유전적으로 연결된 것으로 제시되어 있다.
특정한 실시양태에서, CMV 저항성 대립유전자를 포함하는 식물이 제공된다. 본원에 기재된 CMV 저항성 대립유전자는 오이 모자이크 바이러스에 대한 강력한 저항성을 제공한다. 본원에 기재된 식물을 생산하는 방법이 추가로 제공된다. 본 개시내용은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 오이 모자이크 바이러스 저항성을 부여하는 염색체 2, 5, 및 6 상에 CMV 저항성 대립유전자를 포함하는 식물을 생산하고/거나 선택하는 데 사용될 수 있는 형질-연결된 마커를 제공한다.
본 개시내용은 염색체 2 및 염색체 6 상의 QTL을 확인함으로써 오이에서 CMV 저항성을 수득하는 데 유의한 발전을 제공한다. 이들 QTL은 관련 기술분야에 공지된 것과 구별된다. 또한, 대립유전자가 식물 육종 동안 정확히 이입되고 추적되는 것을 허용하는 저항성 대립유전자와 연관된 마커가 제공된다. 이와 같이, 본 개시내용은 임의의 목적하는 오이 유전자형 내로의 질병 저항성 대립유전자의 이입을 가능하게 한다.
I. 오이 식물에서 오이 모자이크 바이러스 저항성과 연관된 게놈 영역, 대립유전자, 및 다형성
다형성 핵산과 함께, 오이 모자이크 바이러스 저항성과 연관된 1개 이상의 대립유전자의 이입 및 식물 육종 동안 이입을 추적하기 위해 연결된 마커가 본원에 제공된다.
오이 모자이크 바이러스 저항성을 나타내는 오이 계통은 관련 기술분야에 공지되어 있고 본 개시내용에 따라 본원에 제공된 형질-연결된 마커와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 염색체 2, 5, 및 6 상의 염색체 분절을 포함하는 오이 계통 APDM3130438MO가 본 개시내용에 따른 CMV 저항성에 대한 공급원으로서 사용될 수 있으며, 여기서 염색체 분절을 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-122638 하에 기탁되어 있다. 유사하게, 염색체 2, 5, 및 6 상의 염색체 분절을 포함하는 오이 계통 APDM3130430MO가 본 개시내용에 따른 CMV 저항성에 대한 공급원으로서 또한 사용될 수 있으며, 여기서 염색체 분절을 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-122639 하에 기탁되어 있다.
개선된 유전적 마커 및 본원에 기재된 검정을 사용하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 오이 모자이크 바이러스 저항성 대립유전자를 포함하는 식물을 성공적으로 생산하고/거나 선택할 수 있으며, 이는 대립유전자(들)를 포함하지 않는 식물과 비교하여 CMV에 대한 증가된 저항성을 부여한다. 특정 실시양태에서, 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20) 및/또는 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 오이 모자이크 바이러스 저항성 대립유전자를 식물 내로 이입하는 방법이 본원에 제공된다. 본 개시내용은 따라서 관련 기술분야에서 유의한 발전을 나타낸다.
II. 오이 모자이크 바이러스 저항성과 연관된 게놈 영역의 이입
마커-보조 이입은 제1 유전적 배경에서 제2 유전적 배경으로의 1개 이상의 마커에 의해 정의된 염색체 영역의 전달을 수반한다. 이입된 게놈 영역을 함유하는 교배의 후손은 제1 유전적 배경으로부터의 목적하는 이입된 게놈 영역의 마커 특징 및 제2 유전적 배경의 연결된 및 연결되지 않은 마커 특징 둘 다의 조합에 의해 확인될 수 있다.
재배된 계통 내로의 CMV 저항성 식물로부터의 본원에 개시된 1개 이상의 게놈 영역의 이입을 확인하고 추적하기 위한 정확한 마커가 본원에 제공된다. 식물 육종 동안 본원에 개시된 이입을 확인하고 추적하기 위한 마커가 추가로 제공되며, 표 1에 제시된 마커를 포함한다.
본원에 기재된 게놈 구간 중 임의의 것 내에 또는 그에 연결된 마커는 목적하는 유전적 배경 내로의 질병 저항성과 연관된 게놈 영역의 이입을 포함하는 다양한 육종 노력에 유용할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 질병 저항성과 연관된 마커의 40 cM, 20 cM, 15 cM, 10 cM, 5cM, 2 cM, 또는 1 cM 내 마커가 질병 저항성 표현형과 연관된 게놈 영역의 마커-보조 이입에 사용될 수 있다.
남아 있는 게놈 서열의 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 또는 99%가 반복친 생식질의 마커 특징을 보유하는, 목적하는 표현형과 연관된 1개 이상의 이입된 영역을 포함하는 오이 식물을 생산하고, 선택하고, 확인하는 방법이 또한 제공된다. 본원에 제공된 게놈 영역 및 마커에 밀접하게 연결되거나 또는 인접하고 질병 저항성 표현형과 연관된 영역을 포함하는 이입된 영역을 포함하는 오이 식물을 생산하고, 선택하고, 확인하는 방법이 또한 제공된다.
III. 질병 저항성 오이 품종의 개발
대부분의 육종 목적을 위해, 상업적 육종가는 "재배되거나", "재배된 유형", 또는 "엘리트"인 생식질 내에서 작업한다. 이들 재배된 계통은 육종 동안 반복친으로서 또는 반복친 대립유전자의 공급원으로서 사용될 수 있다. 재배된 또는 엘리트 생식질은 그가 일반적으로 원예 성능에 대해 평가될 때 잘 수행하기 때문에 육종하기에 보다 용이하다. 많은 재배된 오이 유형이 개발되어 왔고 농경학적으로 엘리트이고 상업용 재배에 적절한 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 그러나, 재배된 생식질이 제공하는 성능 이점은 대립유전자 다양성의 결여에 의해 상쇄될 수 있다. 육종가는 일반적으로 진행이 유전적으로 다양한 공급원으로 육종할 때보다 재배된 물질로 작업할 때 더 빠르기 때문에 이 교환을 수용한다.
대조적으로, 재배된 생식질이 비-재배된 생식질과 교배될 때, 육종가는 비-재배된 유형으로부터의 신규 대립유전자에 접근할 수 있다. 비-재배된 생식질은 육종 동안 공여자 대립유전자의 공급원으로서 사용될 수 있다. 그러나, 이 접근법은 일반적으로 다양한 계통 사이의 교배와 연관된 임성 문제, 및 비-재배된 양친으로부터의 부정적인 연관 지체로 인해 상당한 어려움을 제시한다. 예를 들어, 비-재배된 오이 유형은 질병 저항성과 연관된 대립유전자를 제공할 수 있다. 그러나, 이들 비-재배된 유형은 불량한 원예 품질 예컨대 불량한 과실 형상, 농경학적으로 허용되지 않는 식물 구조, 및/또는 괴사를 가질 수 있다.
연관 지체 또는 낮은 유전율을 갖는 문제를 피하면서 비-재배된 계통으로부터의 바람직한 저항성 유전자를 엘리트 재배된 계통 내로 이입하는 공정은 길고 종종 고된 공정이다. 야생형 친족으로부터 유래된 대립유전자를 배치하는 데 있어 목적하는 형질을 제공하나 해로운 효과가 결여되는 최소 또는 말단절단된 이입을 도입하는 것이 종종 바람직하다. 이입을 돕기 위해 신뢰성이 높은 마커 검정이 표현형 스크린보다 바람직하다. 성공은 주요 속성에 대한 유전학을 단순화하여 정량적 형질 예컨대 질병 저항성에 대한 유전적 획득에 집중하는 것을 허용함으로써 발전된다. 게다가, 비-재배된 계통으로부터의 게놈 영역을 이입하는 공정은 MAS에 대한 정확한 마커의 이용가능성에 의해 크게 촉진될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 따라서 본 개시내용에 의해 제공된 대립유전자, 다형성, 및 마커가 본원에 확인된 게놈 영역 중 임의의 것의 추적 및 임의의 유전적 배경 내로의 그의 도입을 허용한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 본원에 개시된 질병 저항성과 연관된 게놈 영역은 하나의 유전자형으로부터 또 다른 것으로 이입되고 MAS를 사용하여 추적될 수 있다. 따라서, 질병 저항성과 연관된 정확한 마커의 본 개시내용은 유익한 표현형을 갖는 오이 식물의 개발을 용이하게 할 것이다. 예를 들어, 종자는 질병 저항성과 연관된 목적하는 게놈 영역을 포함하는 식물을 선택하기 위해 본 개시내용의 마커를 사용하여 유전자형결정될 수 있다. 게다가, MAS는 목적하는 이입에 동형접합 또는 이형접합인 식물의 확인을 허용한다.
종간 교배는 또한 억제된 재조합 및 낮은 임성 또는 번식력을 갖는 식물을 초래할 수 있다. 예를 들어, 억제된 재조합은 토마토 선충 저항성 유전자 Mi, 보리에서의 Mla 및 Mlg 유전자, 밀에서의 Yr17 및 Lr20 유전자, 포도덩굴에서의 Run1 유전자, 및 땅콩에서의 Rma 유전자에 대해 관찰되었다. 감수분열 재조합은 그가 유전적 배경에 걸쳐 유리한 대립유전자의 전달, 유해한 게놈 단편의 제거, 및 유전적으로 단단히 연결된 피라미드화 형질을 가능하게 하기 때문에 전형적 육종에 필수적이다. 따라서 억제된 재조합은 육종가로 하여금 목적하는 유전적 조합에 도달하기 위해 자손 스크린을 위한 분리 집단을 확대하는 것을 강요한다.
큰 집단의 표현형 평가는 시간이 걸리고, 자원-집중적이고 모든 환경에서 재현가능하지 않다. 마커-보조 선택은 실현가능한 대안을 제공한다. 고유한 다형성, 예컨대 SNP를 검출하도록 설계된 분자 검정은 다목적이다. 그러나, 이들은 단일 검정에서 오이 종 내에서 및 사이에서 대립유전자를 구별하는 데 실패할 수 있다. 염색체의 구조적 재배열 예컨대 결실은 합성적으로 표지된 올리고뉴클레오티드의 혼성화 및 연장을 손상시킨다. 복제 사건의 경우에, 다중 카피는 차이 없이 단일 반응에서 증폭된다. 정확하고 고도로 예측적인 마커의 개발 및 검증이 따라서 성공적인 MAS 육종 프로그램에 필수적이다.
IV. 마커 보조 육종 및 유전자 조작 기술
본 발명의 실시에 사용될 수 있는 유전적 마커는 제한 단편 길이 다형성 (RFLP), 증폭된 단편 길이 다형성 (AFLP), 단순 서열 반복부 (SSR), 단순 서열 길이 다형성 (SSLP), 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), 삽입/결실 다형성 (Indel), 가변수 연쇄 반복부 (VNTR), 및 무작위 증폭된 다형성 DNA (RAPD), 이소자임, 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 마커를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 농작물에서의 마커 발견 및 개발은 마커-보조 육종 활성에의 적용을 위한 초기 프레임워크를 제공한다 (미국 특허 공개 번호: 2005/0204780, 2005/0216545, 2005/0218305, 및 2006/00504538). 생성된 "유전적 맵"은 서로에 대한 특징규명된 로커스 (다형성 핵산 마커 또는 대립유전자가 확인될 수 있는 임의의 다른 로커스)의 상대 위치의 표시이다.
단일 뉴클레오티드 변화만큼 적게 포함하는 다형성은 다수의 방식으로 검정될 수 있다. 예를 들어, 검출은 단일 가닥 입체형태적 다형성 (Orita, et al. (1989) Genomics, 8(2), 271-278), 변성 구배 겔 전기영동 (Myers (1985) EPO 0273085), 또는 절단 단편 길이 다형성 (라이프 테크놀로지스, 인크.(Life Technologies, Inc.), 메릴랜드주 게이더스버그)을 포함하는 전기영동 기술에 의해 이루어질 수 있으나, DNA 시퀀싱의 광범위한 이용가능성은 종종 증폭된 산물을 직접적으로 간단히 시퀀싱하는 것을 보다 용이하게 만든다. 다형성 서열 차이가 공지되면, 신속한 검정이 자손 시험에 대해 설계될 수 있으며, 이는 특이적 대립유전자의 PCR 증폭 (PASA; Sommer, et al. (1992) Biotechniques 12(1), 82-87), 또는 다수의 특이적 대립유전자의 PCR 증폭 (PAMSA; Dutton and Sommer (1991) Biotechniques, 11(6), 700-7002)의 일부 버전을 전형적으로 수반한다.
다형성 마커는 계통 또는 품종의 동일성의 정도를 결정하기 위해 식물을 검정하는 데 유용한 도구로서 역할을 한다 (미국 특허 번호 6,207,367). 이들 마커는 표현형과의 연관을 결정하기 위한 기초를 형성하고 유전적 획득을 구동하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 다형성 핵산은 오이 식물에서 질병 저항성과 연관된 유전자형을 검출하고, 질병 저항성과 연관된 유전자형을 갖는 오이 식물을 확인하고, 질병 저항성과 연관된 유전자형을 갖는 오이 식물을 선택하는 데 사용될 수 있다. 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 다형성 핵산은 그의 게놈에 질병 저항성과 연관된 이입된 로커스를 포함하는 오이 식물을 생산하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 다형성 핵산은 질병 저항성과 연관된 로커스 또는 로커스들을 포함하는 자손 오이 식물을 육종하는 데 사용될 수 있다.
유전적 마커는 "우성" 또는 "공동우성" 마커를 포함할 수 있다. "공동우성" 마커는 2개 이상의 대립유전자 (이배체 개체당 2개)의 존재를 나타낸다. "우성" 마커는 오직 단일 대립유전자만의 존재를 나타낸다. 마커는 바람직하게는 이배체 로커스에서 두 대립유전자, 또는 삼배체 또는 사배체 로커스에서 다수의 대립유전자의 존재가 용이하게 검출가능하고, 이들이 환경적 변이가 없도록, 즉, 이들의 유전율이 1이도록 공동우성 방식으로 유전된다. 마커 유전자형은 전형적으로 이배체 유기체의 각각의 로커스에서 2개의 마커 대립유전자를 포함한다. 각각의 로커스의 마커 대립유전자 조성은 동형접합 또는 이형접합일 수 있다. 동형접합성은 로커스에서의 두 대립유전자가 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 특징규명되는 상태이다. 이형접합성은 로커스에서의 2개의 대립유전자가 상이한 상태를 지칭한다.
유전적 다형성의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 (즉 유전자형결정하기 위한) 핵산-기반 분석은 확인, 선택, 이입 등을 위한 육종 프로그램에 사용될 수 있다. 유전적 다형성의 분석을 위한 광범위한 유전적 마커가 이용가능하고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 분석은 오이 식물에서 질병 저항성에 연결되거나 또는 그와 연관되는 유전적 마커를 포함하거나 또는 그에 연결되는 유전자, 유전자의 부분, QTL, 대립유전자, 또는 게놈 영역을 선택하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 핵산 분석 방법은 PCR-기반 검출 방법 (예를 들어, TaqMan 검정), 마이크로어레이 방법, 질량 분광분석법-기반 방법 및/또는 전체 게놈 시퀀싱을 포함하는 핵산 시퀀싱 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, DNA, RNA, 또는 cDNA의 샘플에서의 다형성 부위의 검출은 핵산 증폭 방법의 사용을 통해 촉진될 수 있다. 이러한 방법은 다형성 부위에 걸치거나, 또는 그에 원위 또는 근위에 위치된 해당 부위 및 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 농도를 특이적으로 증가시킨다. 이러한 증폭된 분자는 겔 전기영동, 형광 검출 방법, 또는 다른 수단에 의해 용이하게 검출될 수 있다.
이러한 증폭을 달성하는 하나의 방법은 그의 이중-가닥 형태에서 다형성을 정의하는 근위 서열에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍을 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) (Mullis et al. (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273; 유럽 특허 50,424; 유럽 특허 84,796; 유럽 특허 258,017; 유럽 특허 237,362; 유럽 특허 201,184; 미국 특허 4,683,202; 미국 특허 4,582,788; 및 미국 특허 4,683,194)을 이용한다. 질량 분광분석법에 기반하여 DNA를 형결정하는 방법이 또한 사용될 수 있다. 이러한 방법은 미국 특허 6,613,509 및 6,503,710, 및 그에서 발견된 참고문헌에 개시된다.
DNA 서열에서의 다형성은 미국 특허 번호 5,468,613, 5,217,863; 5,210,015; 5,876,930; 6,030,787; 6,004,744; 6,013,431; 5,595,890; 5,762,876; 5,945,283; 5,468,613; 6,090,558; 5,800,944; 5,616,464; 7,312,039; 7,238,476; 7,297,485; 7,282,355; 7,270,981 및 7,250,252에 개시된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 효과적인 방법에 의해 검출되거나 또는 형결정될 수 있으며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 그러나, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 게놈 DNA 샘플에서의 다형성을 검출하는 임의의 다형성 형결정 방법과 함께 사용될 수 있다. 사용된 이들 게놈 DNA 샘플은 식물로부터 직접적으로 단리된 게놈 DNA, 클로닝된 게놈 DNA, 또는 증폭된 게놈 DNA를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, DNA 서열에서의 다형성은 미국 특허 번호 5,468,613 및 5,217,863에 개시된 바와 같이 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO) 프로브에의 혼성화에 의해 검출될 수 있다. 미국 특허 번호 5,468,613은 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 개시하며 여기서 핵산 서열에서의 단일 또는 다중 뉴클레오티드 변이는 뉴클레오티드 변이를 함유하는 서열이 증폭되고, 막 상에 점재되고 표지된 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브로 처리되는 공정에 의해 핵산에서 검출될 수 있다.
표적 핵산 서열은 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 5,800,944에 개시된 바와 같이 프로브 라이게이션 방법에 의해 검출될 수 있으며 여기서 관심 서열은 증폭되고, 프로브에 혼성화되고 이어서 프로브의 표지된 부분을 검출하기 위해 라이게이션된다.
마이크로어레이는 또한 다형성 검출에 사용될 수 있으며, 여기서 올리고뉴클레오티드 프로브 세트는 하나의 포인트에서 표적 서열에서의 차이가 부분적인 프로브 혼성화를 초래하도록 단일 서열을 나타내는 중첩 방식으로 조립된다 (Borevitz et al., Genome Res. 13:513-523 (2003); Cui et al., Bioinformatics 21:3852-3858 (2005)). 임의의 하나의 마이크로어레이 상에서, 유전자 및/또는 비코딩 영역을 나타낼 수 있는 복수의 표적 서열이 있을 것으로 예상되며, 여기서 각각의 표적 서열은 단일 프로브에 의한 것보다는 일련의 중첩 올리고뉴클레오티드에 의해 표시된다. 이 플랫폼은 복수의 다형성의 고처리량 스크리닝을 제공한다. 마이크로어레이-기반 방법에 의한 표적 서열의 형결정은 미국 특허 6,799,122; 6,913,879; 및 6,996,476에 기재되어 있다.
SNP 및 Indel을 검출하는 다른 방법은 단일 염기 연장 (SBE) 방법을 포함한다. SBE 방법의 예는 미국 특허 번호 6,004,744; 6,013,431; 5,595,890; 5,762,876; 및 5,945,283에 개시된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
다형성을 검출하는 또 다른 방법에서, SNP 및 Indel은 미국 특허 번호 5,210,015; 5,876,930; 및 6,030,787에 개시된 방법에 의해 검출될 수 있으며 여기서 올리고뉴클레오티드 프로브는 프로브의 5' 및 3' 단부에 공유 연결된 5' 형광 리포터 염료 및 3' 켄처 염료를 갖는다. 프로브가 무손상일 때, 켄처 염료에 대한 리포터 염료의 근접은, 예를 들어 포스터-유형 에너지 전달에 의한 리포터 염료 형광의 억제를 초래한다. PCR 동안, 정방향 및 역방향 프라이머는 다형성에 플랭킹하는 표적 DNA의 특이적 서열에 혼성화하지만 혼성화 프로브는 증폭된 PCR 산물 내에 다형성-함유 서열에 혼성화한다. 후속 PCR 사이클에서 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제는 프로브를 절단하고 리포터 염료를 켄처 염료로부터 분리하여 리포터의 증가된 형광을 초래한다.
또 다른 실시양태에서, 관심 로커스 또는 로커스들은 핵산 시퀀싱 기술을 사용하여 직접적으로 시퀀싱될 수 있다. 핵산 시퀀싱 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고 454 라이프 사이언시스(454 Life Sciences) (코네티컷주 브랜포드), 에이젠코트 바이오사이언스(Agencourt Bioscience) (매사추세츠주 베벌리), 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) (캘리포니아주 포스터 시티), 리-코 바이오사이언시스(LI-COR Biosciences) (네브래스카주 링컨), 님블젠 시스템즈(NimbleGen Systems) (위스콘신주 매디슨), 일루미나(Illumina) (캘리포니아주 샌 디에고), 및 비시젠 바이오테크놀로지스(VisiGen Biotechnologies) (텍사스주 휴스턴)에 의해 제공된 기술을 포함한다. 이러한 핵산 시퀀싱 기술은 포맷 예컨대 병렬 비드 어레이, 라이게이션에 의한 시퀀싱, 모세관 전기영동, 전자 마이크로칩, "바이오칩", 마이크로어레이, 병렬 마이크로칩, 및 단일-분자 어레이를 포함한다.
다양한 유전자 조작 기술이 개발되어 왔고 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 식물에 형질을 도입하는 데 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 형질은 단일 유전적 로커스 또는 트랜스진을 변경하거나 또는 그를 그의 품종 또는 조상의 게놈으로 도입함으로써 오이 식물로 도입된다. 유전자 및 폴리뉴클레오티드를 변형시키거나, 결실시키거나, 또는 그를 식물의 게놈 DNA 내로 삽입하기 위한 유전자 조작 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 개선된 오이 계통은 식물 게놈의 부위-특이적 변형을 통해 생성될 수 있다. 유전자 조작 방법은, 예를 들어, 서열-특이적 뉴클레아제 예컨대 아연-핑거 뉴클레아제 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2011-0203012 참조); 조작된 또는 천연 메가뉴클레아제; TALE-엔도뉴클레아제 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,586,363 및 9,181,535 참조); 및 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제, 예컨대 CRISPR/Cas 시스템의 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,697,359 및 8,771,945 및 미국 특허 출원 공개 번호 2014-0068797 참조)를 이용하는 것을 포함한다. 본 개시내용의 하나의 실시양태는 따라서 게놈 변형을 수행하기 위해 뉴클레아제 또는 임의의 연관된 단백질을 이용하는 것에 관한 것이다. 이 뉴클레아제는 주형-게놈 편집을 위한 공여자 주형 DNA 내에서 또는 별개의 분자 또는 벡터에서 이종성으로 제공될 수 있다. 재조합체 DNA 구축물은 또한 뉴클레아제를 변형될 식물 게놈 내 부위로 지시하는 1개 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 단일 유전적 로커스를 변경하거나 또는 도입하는 추가 방법은, 예를 들어, 오이 식물 게놈에 염기 쌍 변형을 도입하는 데 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 이용하는 것을 포함한다 (예를 들어 문헌 [Sauer et al., Plant Physiol, 170(4):1917-1928, 2016] 참조).
단일 유전적 로커스의 부위-지정 변경 또는 도입 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 서열-특이적 뉴클레아제, 예컨대 상기 언급된, 또는 게놈 DNA를 절단하여 유전적 로커스에서 이중-가닥 파단 (DSB) 또는 닉을 생산하는 단백질 및 가이드-RNA의 복합체를 이용하는 것을 포함한다. 관련 기술분야에 널리 이해된 바와 같이, 뉴클레아제 효소에 의해 도입된 DSB 또는 닉을 복구하는 공정 동안, 공여자 주형, 트랜스진, 또는 발현 카세트 폴리뉴클레오티드는 DSB 또는 닉의 부위에서 게놈 내로 통합될 수 있다. 통합될 DNA에서의 상동성 아암의 존재는 상동성 재조합 또는 비-상동성 단부 연결 (NHEJ)을 통해 복구 공정 동안 식물 게놈 내로의 삽입 서열의 채택 및 표적화를 촉진할 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 유전적 형질전환은 식물 내로 선택된 트랜스진을 삽입하는 데 사용될 수 있거나 또는, 대안적으로, 역교배에 의해 도입될 수 있는 트랜스진의 제조에 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되고 많은 작물 종에 적용가능한 식물의 형질전환 방법은 전기천공, 미세발사체 충격, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환, 및 원형질체에 의한 직접적인 DNA 흡수를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
전기천공에 의해 형질전환을 성취하기 위해, 부서지기 쉬운 조직, 예컨대 세포 또는 배발성 캘러스의 현탁 배양물을 이용할 수 있거나, 또는 대안적으로 미성숙 배아 또는 다른 유기적인 조직을 직접적으로 형질전환시킬 수 있다. 이 기술에서, 선택된 세포의 세포벽을 제어된 방식으로 펙틴-분해 효소 (펙토리아제) 또는 기계적으로 상처입은 조직에 이들을 노출시킴으로써 부분적으로 분해할 것이다.
형질전환 DNA 분절을 식물 세포로 전달하는 효율적인 방법은 미세발사체 충격이다. 이 방법에서, 입자는 핵산으로 코팅되고 추진력에 의해 세포 내로 전달된다. 예시적인 입자는 텅스텐, 백금, 및 바람직하게는 금으로 구성된 것을 포함한다. 충격을 위해, 현탁액 중 세포는 필터 또는 고체 배양 배지 상에서 농축될 수 있다. 대안적으로, 미성숙 배아 또는 다른 표적 세포는 고체 배양 배지 상에 배열될 수 있다. 충격이 가해질 세포는 거대발사체 스토핑 플레이트 아래 적절한 거리에 위치된다.
가속에 의해 DNA를 식물 세포 내로 전달하는 방법의 예시적인 실시양태는 유전자총 입자 전달 시스템이며, 이는 DNA 또는 세포로 코팅된 입자를 스크린, 예컨대 스테인리스 스틸 또는 나이텍스(Nytex) 스크린을 통해 표적 세포로 덮힌 표면 상으로 추진하는 데 사용될 수 있다. 스크린은 이들이 큰 응집체로 수용자 세포로 전달되지 않도록 입자를 분산시킨다. 미세발사체 충격 기술은 널리 적용가능하고, 사실상 임의의 식물 종을 형질전환시키기는 데 사용될 수 있다.
아그로박테리움-매개 전달은 유전자 로커스를 식물 세포로 도입하기 위한 또 다른 널리 적용가능한 시스템이다. 기술의 이점은 DNA가 전체 식물 조직으로 도입되어, 이로써 원형질체로부터 무손상 식물의 재생에 대한 필요를 우회할 수 있다는 것이다. 현대 아그로박테리움 형질전환 벡터는 이. 콜라이(E. coli) 뿐만 아니라 아그로박테리움에서 복제할 수 있으며, 이는 편리한 조작을 허용한다 (Klee et al., Nat. Biotechnol., 3(7):637-642, 1985). 게다가, 아그로박테리움-매개 유전자 전달을 위한 벡터에서의 최근 기술적 발전은 벡터에서의 유전자 및 제한 부위의 배열을 개선시켜 다양한 폴리펩티드 코딩 유전자를 발현할 수 있는 벡터의 구축을 용이하게 하였다. 기재된 벡터는 삽입된 폴리펩티드 코딩 유전자의 직접적인 발현을 위한 폴리아데닐화 부위 및 프로모터에 의해 플랭킹된 편리한 다중-링커 영역을 갖는다. 추가적으로, 무장한 및 무장해제한 Ti 유전자 둘 다를 함유하는 아그로박테리움이 형질전환에 사용될 수 있다.
아그로박테리움-매개 형질전환이 효율적인 이들 식물 균주에서 이는 유전자 로커스 전달의 손쉽고 정의된 특성 때문에 선택된 방법이다. DNA를 식물 세포로 도입하기 위한 아그로박테리움-매개 식물 통합 벡터의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (Fraley et al., Nat. Biotechnol., 3:629-635, 1985; 미국 특허 번호 5,563,055).
식물 원형질체의 형질전환은 또한 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌 글리콜 처리, 전기천공, 및 이들 처리의 조합에 기반하는 방법을 사용하여 달성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199:183-188, 1985; Omirulleh et al., Plant Mol. Biol., 21(3):415-428, 1993; Fromm et al., Nature, 312:791-793, 1986; Uchimiya et al., Mol. Gen. Genet., 204:204, 1986; Marcotte et al., Nature, 335:454, 1988] 참조). 식물의 형질전환 및 외래 유전적 요소의 발현은 문헌 [Choi et al. (Plant Cell Rep., 13:344-348, 1994), and Ellul et al. (Theor. Appl. Genet., 107:462-469, 2003)]에 예시된다.
V. 정의
하기 정의는 본 발명을 보다 잘 정의하고 본 발명의 실시에서 관련 기술분야의 통상의 기술자를 안내하기 위해 제공된다. 달리 나타내지 않는 한, 용어는 관련 분야의 통상의 기술자에 의한 전통적인 용법에 따라 이해되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "식물"은 식물 세포, 식물 원형질체, 오이 식물이 재생될 수 있는 조직 배양물의 식물 세포, 식물 캘러스, 식물 클럼프 및 식물에서 무손상인 식물 세포 또는 식물의 부분 예컨대 화분, 꽃, 종자, 잎, 줄기 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "집단"은 공통 양친 기원을 공유하는 식물의 유전적으로 불균질 집합을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "품종" 및 "재배종"은 이들의 유전적 계보 및 성능에 의해 동일한 종 내 다른 품종으로부터 확인될 수 있는 유사한 식물의 그룹을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "대립유전자"는 염색체 상의 주어진 로커스에서 게놈 서열의 2개 이상의 대안적인 형태 중 하나를 지칭한다.
"정량적 형질 로커스" (QTL)는 표현형의 발현도에 영향을 미치는 적어도 제1 대립유전자를 코딩하는 염색체 위치이다.
본원에 사용된 바와 같은, "마커"는 유기체 사이를 구별하는 데 사용될 수 있는 검출가능한 특징을 의미한다. 이러한 특징의 예는 유전적 마커, 생화학적 마커, 대사물, 형태학적 특징, 및 농경학적 특징을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "표현형"은 유전자 발현에 의해 영향을 받을 수 있는 세포 또는 유기체의 검출가능한 특징을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유전자형"은 식물의 특정 대립유전자 구성을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "엘리트" 또는 "재배된" 품종은 우수한 농경학적 성능을 위한 육종 및 선택으로부터 생성된 임의의 품종을 의미한다. "엘리트 식물"은 엘리트 품종에 속하는 식물을 지칭한다. 수많은 엘리트 품종이 이용가능하고 오이 육종의 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. "엘리트 집단"은 주어진 작물 종, 예컨대 오이의 농경학적으로 우수한 유전자형의 측면에서 최신 기술을 나타내는 데 사용될 수 있는 엘리트 개체 또는 품종의 모음이다. 유사하게, "엘리트 생식질" 또는 생식질의 엘리트 균주는 농경학적으로 우수한 생식질이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이입된"은, 유전적 로커스와 관련하여 사용될 때, 예컨대 역교배를 통해 새로운 유전적 배경으로 도입된 유전적 로커스를 지칭한다. 유전적 로커스의 이입은 식물 육종 방법을 통해 및/또는 분자 유전학 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 분자 유전학 방법은 상동성 재조합, 비-상동성 재조합, 부위-특이적 재조합, 및/또는 로커스 치환 또는 로커스 전환을 제공하는 게놈 변형을 제공하는 다양한 식물 형질전환 기술 및/또는 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 염색체 분절의 맥락에서 용어 "재조합체" 또는 "재조합된"은, 예를 들어 감수분열 동안 상동성 염색체 사이에 재조합 사건의 결과로서, 천연에서 발견되지 않는 입체형태에서 1개 이상의 유전적 로커스를 포함하는 재조합체 DNA 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "연결된"은, 핵산 마커 및/또는 게놈 영역의 맥락에서 사용될 때, 마커 및/또는 게놈 영역이 감수분열에서 함께 분리되는 경향이 있도록 동일한 연관 그룹 또는 염색체 상에 위치된다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "내성 로커스"는 질병에 대한 내성 또는 저항성과 연관된 로커스를 의미한다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 내성 로커스는, 하나의 실시양태에서, CMV에 대한 내성 또는 감수성을 제어할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 식물에서의 "내성" 또는 "개선된 내성"은, 예를 들어, 질병 상태 하에, 수확율을 유지함으로써 잘 수행하는 식물의 능력을 지칭한다. 내성은 또한 질병 상태 하에 식물 활력 표현형을 유지하는 식물의 능력을 지칭할 수 있다. 내성은 "내성" 식물이 유사한 질병 상태에서 성장된 상이한 (보다 적은 내성) 식물 (예를 들어 상이한 식물 품종)과 비교하여 성능을 보다 유지할 수 있다는 것을 나타내는 상대적인 용어이다. 통상의 기술자는 질병 상태에 대한 식물 내성이 광범위하게 달라지고, 보다 많은 내성 또는 보다 적은 내성 표현형의 스펙트럼을 나타낼 수 있다는 것을 인식할 것이다. 그러나, 단순한 관찰에 의해, 통상의 기술자는 일반적으로 질병 상태 하에 상이한 식물, 식물 품종, 또는 식물 패밀리의 상대적인 내성을 결정할 수 있고, 더욱이, 또한 "내성"의 표현형 그라데이션을 인식할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 질병 상태에 대한 식물에서의 "저항성" 또는 "개선된 저항성"은 식물이 비-저항성 또는 보다 적은 저항성 식물보다 질병 부담을 더 감소시킬 수 있다는 표시이다. 저항성은 "저항성" 식물이 유사한 질병 상태에서 성장된 상이한 (보다 적은 저항성) 식물 (예를 들어, 상이한 식물 품종)과 비교하여 질병 부담을 더 감소시킬 수 있다는 것을 나타내는 상대적인 용어이다. 통상의 기술자는 질병 상태에 대한 식물 저항성이 광범위하게 달라지고, 보다 많은 저항성 또는 보다 적은 저항성 표현형의 스펙트럼을 나타낼 수 있다는 것을 인식할 것이다. 그러나, 단순한 관찰에 의해, 통상의 기술자는 일반적으로 질병 상태 하에 상이한 식물, 식물 품종, 또는 식물 패밀리의 상대적인 저항성을 결정할 수 있고, 더욱이, 또한 "저항성"의 표현형 그라데이션을 인식할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "저항성 대립유전자"는 질병에 대한 내성 또는 저항성과 연관된 핵산 서열을 의미한다. 용어 "저항성 대립유전자"의 사용은 1개 초과의 유전자 또는 다른 유전적 인자를 포함하는 게놈 영역을 배제하지 않는다. 구체적으로, "질병 저항성 대립유전자"는 일배체형 윈도우 또는 게놈 영역 내 일배체형 대립유전자를 나타낼 수 있으며 여기서 일배체형 대립유전자와 연관된 표현형은 질병 저항성일 수 있다. 일배체형 윈도우는 1개 이상의 다형성 마커의 세트로 정의되고, 추적될 수 있는 인접한 게놈 영역이며 여기서 다형성은 유전에 의한 동일성을 나타낸다. 해당 윈도우 내 일배체형은 각각의 마커에서의 대립유전자의 고유한 지문에 의해 정의될 수 있다. 염색체 상의 주어진 로커스에 존재하는 모든 대립유전자가 동일할 때, 해당 식물은 해당 로커스에서 동형접합이다. 염색체 상의 주어진 로커스에 존재하는 대립유전자가 상이한 경우에, 해당 식물은 해당 로커스에서 이형접합이다. 식물은 임의의 특정한 저항성 로커스에서 또는 특정한 다형성 마커에 대해 동형접합 또는 이형접합일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "다형성"은 1개 이상의 개체의 집단의 1개 이상의 로커스에서의 핵산 서열의 1개 이상의 변이의 존재를 의미한다. 변이는 1개 이상의 염기 변화, 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입 또는 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 다형성은 핵산 복제의 무작위 공정으로부터, 돌연변이유발을 통해, 이동 게놈 요소의 결과로서, 카피 수 변이로부터 및 감수분열의 공정 동안, 예컨대 불균등 교차, 게놈 복제 및 염색체 파단 및 융합에 의해 발생할 수 있다. 변이는 집단 내에서 공통적으로 발견될 수 있거나 또는 낮은 빈도로 존재할 수 있고, 전자는 일반적인 식물 육종에서 보다 큰 유용성을 갖고 후자는 드물지만 중요한 표현형 변이와 연관될 수 있다. 유용한 다형성은 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), DNA 서열의 삽입 또는 결실 (Indel), DNA 서열의 단순 서열 반복부 (SSR) 제한 단편 길이 다형성, 및 태그 SNP를 포함할 수 있다. 유전적 마커, 유전자, DNA-유래 서열, 일배체형, RNA-유래 서열, 프로모터, 유전자의 5' 비번역 영역, 유전자의 3' 비번역 영역, 마이크로RNA, siRNA, QTL, 위성 마커, 트랜스진, mRNA, ds mRNA, 전사 프로파일, 및 메틸화 패턴은 다형성을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "일배체형"은 적어도 1개의 다형성 분자 마커에 의해 정의된 일배체형 윈도우 내 염색체 영역을 의미한다. 각각의 일배체형 윈도우에서의 고유한 마커 지문 조합은 해당 윈도우에 대한 개별 일배체형을 정의한다. 추가로, 예를 들어 재조합에 의해 유발된 일배체형에서의 변화는 그가 오직, 예를 들어, 유전자, QTL, 또는 트랜스진에 대한 물리적 연관을 통해 형질에 작동가능하게 연결된 원래의 (양친) 일배체형의 일부만을 포함하도록 일배체형의 변형을 초래할 수 있다. 일배체형에서의 임의의 이러한 변화는 해당 게놈 영역의 기능적 온전성이 비변화되거나 또는 개선되는 한 일배체형을 구성하는 것의 정의에 포함될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "일배체형 윈도우"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통계적 분석에 의해 확립되고 연관 불평형에 있는 염색체 영역을 의미한다. 따라서, 이 영역 내에 위치된 1개 이상의 분자 마커 로커스에서 2개의 근친교배 개체 (또는 2개의 배우자) 사이의 상태에 의한 동일성은 전체 영역의 유전에 의한 동일성의 증거로서 취급된다. 각각의 일배체형 윈도우는 적어도 1개의 다형성 분자 마커를 포함한다. 일배체형 윈도우는 게놈에서 각각의 염색체에 따라 맵핑될 수 있다. 일배체형 윈도우는 그 자체로 고정되지 않고, 분자 마커의 계속-증가하는 밀도를 고려하면, 이 개시내용은 일배체형 윈도우의 수 및 크기가 진화하는 것을 기대하며, 윈도우의 수는 증가하고 이들의 각각의 크기는 감소하고, 따라서 마커 로커스에서의 상태에 의한 동일성에 기반하는 유전에 의한 동일성을 확인하는 데 있어 계속-증가하는 신뢰도를 초래한다.
용어 "약"은 값이 값을 결정하는 데 이용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함한다는 것을 나타내는 데 사용된다. 청구범위에서의 용어 "또는"의 사용은, 비록 본 개시내용이 단지 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지하지만, 단지 대안을 지칭하거나 또는 대안이 상호간에 배타적인 것으로 달리 명시적으로 지시되지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 데 사용된다. 청구범위에서 단어 "포함하는" 또는 다른 개방 언어와 함께 사용될 때, 단수 단어는 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, "하나 이상"을 나타낸다. 용어 "포함한다", "갖는다" 및 "포함한다"는 개방형 연결 동사이다. 이들 동사 중 하나 이상의 임의의 형태 또는 시제, 예컨대 "포함한다", "포함하는", "갖는다", "갖는", "포함한다" 및 "포함하는"은 또한 개방형이다. 예를 들어, 1개 이상의 단계를 "포함하는", "갖는" 또는 "포함하는" 임의의 방법은 오직 이들 1개 이상의 단계만을 소유하는 것에 제한되지 않고 또한 다른 열거되지 않은 단계를 포함한다. 유사하게, 1개 이상의 형질을 "포함하는", "갖는" 또는 "포함하는" 임의의 식물은 오직 이들 1개 이상의 형질을 소유하는 것에 제한되지 않고 다른 열거되지 않은 형질을 포함한다.
VI. 기탁 정보
기탁은 본원에 기재된 바와 같은 염색체 2, 5, 및 6 상의 염색체 분절을 포함하는 오이 계통 APDM3130438MO의 적어도 2500개의 종자로 이루어졌다. 기탁은 20110-2209 버지니아주 매너서스 유니버시티 블러버드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)으로 이루어졌다. 기탁은 ATCC 수탁 번호 PTA-122638로 지정되고, 기탁일은 2015년 10월 22일이었다. 기탁에 대한 접근은 그에 대한 권리가 있는 자가 요청 시 출원의 계류 동안 이용가능할 것이다. 기탁은 부다페스트 조약 하에 수탁되었고, 30년, 또는 가장 최근 요청 후 5년, 또는 특허의 실시가능 기간 중 가장 긴 기간 동안 공공 기탁소인 ATCC 기탁소에 유지될 것이고, 해당 기간 동안 생존불가능할 경우 대체될 것이다. 출원인은 이 특허 또는 식물 품종 보호법 (7 U.S.C. 2321 et seq.)을 포함하는 임의의 다른 형태의 품종 보호 하에 승인된 이들의 권리의 어떠한 침해도 용납하지 않는다.
기탁은 본원에 기재된 바와 같은 염색체 2, 5, 및 6 상의 염색체 분절을 포함하는 오이 계통 APDM3130430MO의 적어도 2500개의 종자로 이루어졌다. 기탁은 20110-2209 버지니아주 매너서스 유니버시티 블러버드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)으로 이루어졌다. 기탁은 ATCC 수탁 번호 PTA-122639로 지정되고, 기탁일은 2015년 10월 22일이었다. 기탁에 대한 접근은 그에 대한 권리가 있는 자가 요청 시 출원의 계류 동안 이용가능할 것이다. 기탁은 부다페스트 조약 하에 수탁되었고, 30년, 또는 가장 최근 요청 후 5년, 또는 특허의 실시가능 기간 중 가장 긴 기간 동안 공공 기탁소인 ATCC 기탁소에 유지될 것이고, 해당 기간 동안 생존불가능할 경우 대체될 것이다. 출원인은 이 특허 또는 식물 품종 보호법 (7 U.S.C. 2321 et seq.)을 포함하는 임의의 다른 형태의 품종 보호 하에 승인된 이들의 권리의 어떠한 침해도 용납하지 않는다.
실시예
실시예 1. 전장 게놈 연관 분석에 대한 오이 패널의 선택, 접종, 및 점수화
본원에 기재된 바와 같이, 전장 게놈 연관 분석 (GWAS)을 유전적 변이체를 표현형 변이와 연관시킴으로써 QTL을 맵핑하기 위해 수행하였다. 대략 200개의 엘리트 계통, 50개의 원시품종, 및 20개의 잡종 (저항성 대조군을 포함함)을 포함하는 큰 다양성 패널을 본원에 기재된 바와 같이 평가하였다 (도 2에 요약됨).
연구에 사용된 CMV 접종물을 생산하기 위해, CMV 단리물을 다양성 패널 접종 10일 전 '코로나(Corona)' 오이 품종의 식물에 개별적으로 및 기계적으로 접종하였다. 2개의 단리물 (1:1 농도)을 공동-접종하였고, 증상 관찰을 보장하기 위해 1개의 균주는 차가운 조건에서 다른 하나는 따듯한 조건에서 증상을 발생시켰다. 자엽이 완전히 확장되었을 때, 접종-후 1-주 즈음에, 10g의 코로나 잎을 50 ml의 포스페이트 완충제 Na2HPO4-0.03M + 소듐 디에틸디티오카르바메이트 0.2%, 및 2.5g의 숯 및 카르보런덤 중에 혼합하였다. 접종물을 얼음에서 접종 동안 유지시켰고 (4℃), 접종 탈출을 피하기 위해 2명의 상이한 조작자가 자엽을 2회 손으로-문질렀다. 접종물은 각각의 유전자형 사이에 리프레쉬되었다.
다양성 패널에 네덜란드 베르허스켄훅의 단일 온실 구획에서 CMV를 접종하였다. 바이러스에 대한 표현형 반응을 수탁물당 5개의 식물의 3개의 무작위화된 완전한 블록으로 평가하였다. 식물 반응을 9개의 정렬된 등급으로 점수화하였다. 증상 중증도 (SS)를 중간 및 감수성 체크가 예상되는 증상을 전시하였을 때 접종-후 14일 (DPI) 즈음에 개별적으로 점수화하였다. 본 발명자들은 하기 표기 규모를 사용하였다: 1 - 증상 없음, 3 - 1 내지 3개의 증상이 1개의 잎 상에 점재함, 5 - 어린 잎 상의 제한된 증상 영역, 7 - 어린 및 늙은잎 상의 보다 수많은 증상, 9 - 중단된 식물 성장, 명백한 중증 증상 (바이러스에 따라 잎 모자이크, 잎맥 황화, 변형, 버블링)의 발생. 짝수 점수는 식물이 홀수 점수 사이의 중간 증상을 전시하였을 때 기인하였다. 각각의 수탁물 내 2 표준 편차보다 높거나 또는 낮은 모든 점수는 이상치로서 간주되고 표현형 데이터세트로부터 폐기되었다.
각각의 수탁물에 대한 집계된 점수를 표현형 불연속성을 다루고 푸아송 BLUP (PoP)로 불리는 일반화된 선형 모델을 사용하여 수득하였다. 잡종 대조군은 예상되는 표현형을 제공하였다.
실시예 2. 오이 패널의 전장 게놈 연관 분석
3개의 식물로부터의 잎 샘플을 각각의 엘리트 계통 및 원시품종에 대해 대량으로 수확하고 일루미나 150 쌍-말단에 의해 유전자형결정하였다. 긴-판독 서열로부터 SMRT를 통해 조립된 (Li et al. 2019) CCL 공개 게놈을 서열 정렬 및 변이체 추출에 사용하였다. 변이체 발견을, 먼저 개별 샘플 SNP를 추출하고, 이어서 집단 상에서 공동 유전자형결정함으로써, GATK4 베스트 실시를 사용하여 (Van der Auwera et O'Connor 2020) 수행하였다. 각각의 계통에 대해 20X 이상의 깊이 및 20 초과의 프레드(phred) 점수를 갖는 모든 이중대립유전자 및 다중대립유전자 SNP, 뿐만 아니라 InDel을 수집하여, 2,081,122개의 이중대립유전자 SNP, 28,162개의 다중대립유전자 SNP 및 30,557개의 InDel의 유전적 데이터세트를 생성하였다. 이어서 SNP를 QD (변이체 신뢰도/깊이별 품질) >18에 대해 필터링하였다. 10% 초과의 손실률, 15% 초과의 이형접합률 및 3.125% 미만의 소수 대립유전자 빈도 (MAF) (~8개의 동형접합 유전자형)를 나타내는 SNP를 폐기하였다. InDel 및 다중-대립유전자 SNP를 또한 폐기하였다. 30% 초과의 손실 데이터 및 30% 이형접합률을 나타내는, 3개의 원시품종을 포함하는 4개의 계통을 다양성 패널로부터 폐기하였다.
기재된 유전자형결정 프로토콜, SNP 추출, 및 필터링은 250개의 계통 및 1,271,848개 SNP를 함유한 MNA10으로 불리는 SNP 매트릭스를 생성하였다. 본 발명자들은 LD 정도를 각각의 염색체 상의 10K SNP를 무작위로 선택함으로써 추정하였다. 본 발명자들은 1 Mb 윈도우에서 모든 SNP 사이의 r2를 계산하고 0.2의 스판으로 loess 회귀를 수행하였다. LD 정도를 r2 =0.2가 도달되었을 때 평가하였다. 집단 유전적 구조 매트릭스를 문헌 [Frichot et al. 2014]에 기재된 바와 같은 희소 비음수 매트릭스 인수분해 (sNMF) 알고리즘을 통해 설계하였다.
MNA10의 경우, 유전자형 매트릭스는 적어도 1개의 NA 및 MAF< 3.1%를 갖는 SNP를 제거함으로써 유래되어, 총 376,151개 SNP를 함유하는 MNA00으로 불리는 매트릭스를 생성하였다. 이전에 기재되고 (Segura et al. 2012) R 패키지 mlmm에서 시행된 MLMM 모델을 376,151개 SNP에 대해 GWAS를 수행하는 데 사용하였다. MLMM은 다중단계 접근법이며, 각각의 단계는 하기 기재된 MLM을 사용하나 고정 효과로서 모델에 포함된, 이전 단계의 각각의 상위 SNP로 보완된 GWAS이다. 5개의 모델을, 예를 들어, 친족 (K), 유전적 구조 (Q5), 유전적 구조 (Q9), 친족 + 유전적 구조 (KQ5), 친족 + 유전적 구조 (KQ9)를 시험하였다. 마지막 MLMM 단계는 추가 SNP가 본페로니 임계치 미만에서 발견되지 않았을 때 또는 유전적에 의해 설명된 표현형 분산이 남지 않았을 때 정의되었다. 본페로니 유의성 임계치는 독립적 SNP의 수에 의해 보정된 전장 게놈 오류 위험 α=0.05로 설정되었다 (Gao 2011). 본 발명자들은 100kb의 슬라이딩 윈도우를 사용하는 가오(Gao)의 방법으로 115,391개의 독립적 SNP를 검출하였다. 이는 GWAS 분석을 위해 α=0.05의 경우 4.3x10-7 (-log10 = 6,4)에서 및 α=0.01의 경우 8.7x10-7 (-log10 = 7,1)에서 본페로니 임계치를 설정한다. 시행된 상이한 모델을 qqman R 패키지로부터 생성된 QQ 플롯을 통해 위양성 및 음성률을 균형맞추는 이들의 능력에 대해 비교하였다 (Turner 2014). 오직 구조 효과만을 갖는 널 모델을 또한 유전적 그룹에 의해 설명된 표현형 분산의 부분을 추정하기 위해 시험하였다.
평가된 패널 내 수탁물은 적어도 5개의 원예 그룹에 속하였다. 이들의 유전적 구조를 'snmf' 알고리즘으로 조사하였다 (Frichot et al. 2014). 5개의 그룹은 원예 그룹과 매치하지만 (도 3) 9개의 그룹은 육종 프로그램과 매치하였다 (도 4). 9개의 그룹에 대해 (도 4), 원시품종을 2개의 유전적 그룹으로 풀링하였으며, 1개는 아시아로부터의 수탁물을 갖고 다른 하나는 유럽 및 아메리카로부터의 수탁물을 갖는다. 7개의 다른 그룹은 상이한 원예 그룹으로부터의 엘리트 계통을 다뤘다: 롱-더치(Long-Dutch) (그룹 1), 피클스(pickles) (그룹 4 및 5), 슬라이서스(slicers) (그룹 6 및 7) 및 바이트-알파(Beit-alpha) (그룹 8 및 9). 친족 매트릭스의 계층적 클러스터링은 9-그룹 유전적 구조를 확인하였다. 유전적 그룹 2, 즉, 아시아 원시품종으로부터의 수탁물은 이 그룹에서의 특이적 대립유전자의 존재를 강조하는 집단의 나머지와 비교하여 이들의 그룹 내 강한 친족 계수 (~3)를 나타냈다. 이 그룹은 또한 그룹 1 (롱-더치)로부터의 일부 수탁물과 낮은 친족 계수 (~-1)를 가졌으며, 이는 이들 엘리트 계통과의 이들의 유전적 거리를 강조한다.
9-그룹 유전적 구조는 49%의 표현형 분산을 설명하였다 (도 5에서 회색으로 제시됨). 표현형 분산은 9개의 유전적 그룹 중에서 불균질이었고 그가 GWAS 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문에 저항성 수탁물의 분포를 분석하였다 (도 3C). 그룹 2로부터의 원시품종은 CMV에 대해 고도로 저항성이었지만, 그룹 3으로부터의 원시품종은 CMV에 대해 고도로 감수성이었다. 현저하게, 엘리트-계통 유전적 그룹은 그룹 3보다 그룹 2로부터의 원시품종과 혼합된 더 많은 개체를 전시하였으며 (도 3C), 이는 그룹 2로부터의 원시품종이 저항성 공여자로서 사용되었다는 것을 시사한다. 이어서, 그룹 2로부터의 저항성 대립유전자는 패널에서 MAF 임계치에 도달하기에 충분히 빈번할 수 있다. 유전적 그룹 4, 5, 6, 및 9로부터의 엘리트 계통은 CMV에 대해 고도로 저항성이었지만 다른 군으로부터의 수탁물은 표현형 분산을 전시하였다.
간단하게, 고정 효과로서 이전 단계로부터 가장 유의한 SNP를 도입한 반복 GWAS (MLMM)를 사용하였다. 집계된 표현형으로서 PoP를 사용하여 시험된 5개의 모델 (Q5, Q9, K, KQ5 및 KQ9) 중에서, MLMM 제1 단계에서 수집된 친족 및 9개의 유전적 그룹 (KQ9) 둘 다를 포함하는 모델은 qq플롯 상의 이등분선에 가장 잘 맞는 p-값 곡선을 생성하였다. 이 모델은 단지 몇몇의 마커만이 QTL에 연관될 가능성이 있다는 가설 하에 예상된 바와 같이, 가장 많은 SNP에 대한 p-값의 준-균일한 분포를 반영하였다.
GWAS로부터 직접적으로 수득된 출력은 염색체 5 상의 상위 SNP 및 염색체 2 및 6 상의 QTL 구간을 정의하였다. 특히, chr5 상의 상위 SNP는 7,197,002 bp에 위치되었고; chr2 상에 위치된 구간은 9,183,788 bp 내지 9,417,996 bp에 걸쳤고; chr6 상에 위치된 구간은 30,018,048 bp 내지 30,084,128 bp에 걸쳤고; 각각의 위치는 공개 오이 게놈 맵 버전 오이 차이니즈 롱 (CCL)의 원시품종을 참조하여 만들어졌다. 확인된 피크의 연관 불평형을 고려하는 MNA10 (1,271,848개 SNP) 상에 수행된 후속 GWAS-후 분석은 CMV 저항성에 대해 3개의 QTL을 검출하였고 (도 6), 모두 상위 SNP MAF>0.4를 갖는다. 이들은 7 내지 11%의 PV를 설명하였다 (도 5; 중간 회색 음영). 더욱이, 75%의 표현형 분산은 염색체 2, 5, 및 6 상의 SNP를 조합함으로써 설명될 수 있다. chr2 상에 위치된 QTL은 1.9 Mb 너비였고, chr5 상의 QTL은 1.1 Mb이었고, chr6의 1개의 단부 상에 위치된 QTL은 1.6 Mb QTL 너비였다. 기재된 CMV 저항성 QTL과 연관된 추가적인 마커 (M1-M27)가 또한 확인되었고 하기 표 1에 제공된다.
실시예 3. 저항성 및 CMV 저항성 일배체형의 전장 게놈 연관 분석 맵 2개의 클러스터
지역 친족의 계층적 클러스터링을 또한 chr2, chr5, 및 chr6에서의 CMV 저항성에 대해 QTL 상에서 시행하였다. 이는 유전적 구조 그룹 중에서 불균등하게 분포된 여러 저항성 일배체형을 밝혀냈다 (도 7-9). 2개의 저항성 일배체형이 chr2 상의 QTL에서 발견되었으며, 1개는 참조 게놈 CCL, CMV 저항성 공급원으로부터의 큰 분절이고, 1개는 그룹 4에 특이적이다 (도 7). chr6 상의 QTL에서의 여러 일배체형이 또한 관찰되었다 (도 8). 일배체형 2는 주로 그룹 2, 4로부터의 저항성 수탁물 및 혼합된 수탁물에 존재하였다.
실시예 4. 오이 모자이크 바이러스 저항성 로커스의 이입
염색체 2 및 6 상의 QTL은 추가로 실시예 1에 기재된 다양성 패널과 유사한 오이 계통 및 잡종의 큰 패널을 사용하여 검증될 것이다. 각각의 QTL 뿐만 아니라 본원에 기재된 QTL의 조합의 효과는 CMV에 대한 저항성에 대한 표현형 및 QTL에서의 유전자형을 사용하여 검증될 것이다.
추가적으로, 개시된 마커는 CMV에 대한 저항성에 대한 마커 보조 선택 (MAS)을 수행하는 데 사용될 것이다. 예를 들어, 오이 육종가는 본원에 기재된 유리한 대립유전자(들)를 선택함으로써 CMV에 대한 계통 저항성을 생성하는 데 이들 분자 마커를 사용할 것이다. 염색체 2, 6, 및 5 상의 CMV QTL을 쌓는 것이 CMV 저항성에 대한 QTL 중 단지 1개 또는 2개를 보유하는 계통을 능가하는 계통을 생성하기 위해 수행될 것이다.
Claims (29)
- 오이 모자이크 바이러스 (CMV: Cucumber mosaic virus)에 대한 저항성을 나타내는 오이 식물을 생산하는 방법으로서, 상기 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20); 또는 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 오이 모자이크 바이러스 저항성 대립유전자를 식물 내로 이입하는 것을 포함하며; 여기서 상기 이입된 CMV 저항성 대립유전자는 상기 식물에게 상기 대립유전자를 포함하지 않는 식물과 비교하여 CMV에 대한 증가된 저항성을 부여하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 이입이 하기를 포함하는 것인 방법:
a) 상기 염색체 분절을 포함하는 오이 식물을 그 자신과 또는 제2 오이 식물과 교배시켜 1개 이상의 자손 식물을 생산하는 것; 및
b) 상기 염색체 분절을 포함하는 자손 식물을 선택하는 것. - 제2항에 있어서, 상기 오이 식물이 염색체 2 상의 상기 염색체 분절을 포함하고, 상기 염색체 분절을 포함하는 종자의 대표적인 샘플이 ATCC 수탁 번호 PTA-122638 하에 기탁된 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 오이 식물이 염색체 6 상의 상기 염색체 분절을 포함하고, 상기 염색체 분절을 포함하는 종자의 대표적인 샘플이 ATCC 수탁 번호 PTA-122638 하에 기탁된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 오이 모자이크 바이러스 저항성 대립유전자가 추가로 하기로 정의되는 것인 방법:
a) 상기 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M24 (서열식별번호: 32) 및 마커 로커스 M25 (서열식별번호: 33)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내에 위치된 것; 또는
b) 상기 식물의 게놈에서 염색체 6 상의 마커 로커스 M26 (서열식별번호: 34) 및 마커 로커스 M27 (서열식별번호: 35)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내에 위치된 것. - 제1항에 있어서, 상기 염색체 분절이 마커 로커스 M5 (서열식별번호: 12), 마커 로커스 M6 (서열식별번호: 13), 마커 로커스 M7 (서열식별번호: 14), 마커 로커스 M8 (서열식별번호: 15), 마커 로커스 M9 (서열식별번호: 16), 마커 로커스 M10 (서열식별번호: 17), 마커 로커스 M11 (서열식별번호: 18), 및 마커 로커스 M12 (서열식별번호: 19)로 이루어진 군으로부터 선택된 염색체 2 상의 마커 로커스를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 염색체 분절이 마커 로커스 M13 (서열식별번호: 2), 마커 로커스 M14 (서열식별번호: 3), 마커 로커스 M15 (서열식별번호: 4), 마커 로커스 M16 (서열식별번호: 5), 마커 로커스 M17 (서열식별번호: 6), 마커 로커스 M18 (서열식별번호: 7), 마커 로커스 M19 (서열식별번호: 8), 및 마커 로커스 M20 (서열식별번호: 9)으로 이루어진 군으로부터 선택된 염색체 6 상의 마커 로커스를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 식물의 게놈에서 하기에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 CMV 저항성 대립유전자를 식물 내로 이입하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법:
염색체 5 상의 마커 로커스 M21 (서열식별번호: 29) 및 마커 로커스 M22 (서열식별번호: 30);
염색체 5 상의 마커 로커스 KT316424 및 마커 로커스 KT316425; 또는
염색체 6 상의 마커 로커스 SSR9-56 및 마커 로커스 SSR11-177. - 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 CMV 저항성 대립유전자 및 상기 식물의 게놈에서 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 CMV 저항성 대립유전자를 식물 내로 이입하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 이입이 역교배, 마커-보조 선택, 또는 상기 CMV 저항성에 대한 검정을 포함하는 것인 방법.
- 제1항의 방법에 의해 생산된 오이 식물로서, 여기서 상기 식물은 상기 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 상기 CMV 저항성 대립유전자, 및 상기 식물의 게놈에서 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 상기 CMV 저항성 대립유전자를 포함하고, 여기서 식물은 상기 식물의 게놈에서 하기에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 CMV 저항성 대립유전자를 추가로 포함하는 것인 오이 식물:
염색체 5 상의 마커 로커스 M21 (서열식별번호: 29) 및 마커 로커스 M22 (서열식별번호: 30); 또는
염색체 5 상의 마커 로커스 KT316424 및 마커 로커스 KT316425. - 하기를 포함하는, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)에 대한 증가된 저항성을 갖는 오이 식물을 선택하는 방법으로서:
(a) CMV 저항성 대립유전자를 포함하는 오이 식물을 제2 오이 식물과 교배시켜 자손 식물의 집단을 생산하는 것; 및
(b) 상기 CMV 저항성 대립유전자를 포함하는 자손 식물을 선택하는 것;
여기서 상기 자손 식물을 선택하는 것은 상기 식물의 게놈에서 하기에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 또는 그에 유전적으로 연결된 마커 로커스를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법:
염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20); 또는
염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10). - 제12항에 있어서, 상기 자손 식물을 선택하는 것이 상기 식물의 게놈에서 하기에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 또는 그에 유전적으로 연결된 마커 로커스를 검출하는 것으로 추가로 정의되는 것인 방법:
a) 염색체 2 상의 마커 로커스 M24 (서열식별번호: 32) 및 마커 로커스 M25 (서열식별번호: 33); 또는
b) 염색체 6 상의 마커 로커스 M26 (서열식별번호: 34) 및 마커 로커스 M27 (서열식별번호: 35). - 제12항에 있어서, 자손 식물을 선택하는 것이 마커 로커스 M5 (서열식별번호: 12), 마커 로커스 M6 (서열식별번호: 13), 마커 로커스 M7 (서열식별번호: 14), 마커 로커스 M8 (서열식별번호: 15), 마커 로커스 M9 (서열식별번호: 16), 마커 로커스 M10 (서열식별번호: 17), 마커 로커스 M11 (서열식별번호: 18), 마커 로커스 M12 (서열식별번호: 19), 마커 로커스 M13 (서열식별번호: 2), 마커 로커스 M14 (서열식별번호: 3), 마커 로커스 M15 (서열식별번호: 4), 마커 로커스 M16 (서열식별번호: 5), 마커 로커스 M17 (서열식별번호: 6), 마커 로커스 M18 (서열식별번호: 7), 마커 로커스 M19 (서열식별번호: 8), 또는 마커 로커스 M20 (서열식별번호: 9)을 포함하는 핵산을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 자손 식물이 F2-F6 자손 식물인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 자손 식물을 생산하는 것이 역교배를 포함하는 것인 방법.
- 하기를 포함하는, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)에 대한 저항성을 나타내는 오이 식물을 선택하는 방법:
a) CMV에 대한 저항성을 포함하는 양친을 갖는 자손 식물의 집단을 수득하는 것;
b) 상기 집단을 적어도 1개의 핵산 마커로 스크리닝하여 CMV 저항성에 유전적으로 연결된 다형성을 검출하는 것; 및
c) 상기 집단으로부터 CMV 저항성과 연관된 일배체형을 포함하는 1개 이상의 자손 식물을 선택하는 것, 여기서 일배체형은 상기 식물의 게놈에서 하기에 의해 플랭킹된 CMV 저항성 대립유전자를 포함함:
염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20); 또는
염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10). - 제17항에 있어서, 상기 자손 식물을 선택하는 것이 하기를 포함하는 것인 방법:
(a) 상기 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 또는 그에 유전적으로 연결된 마커 로커스를 검출하는 것;
(b) 상기 식물의 게놈에서 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 또는 그에 유전적으로 연결된 마커 로커스를 검출하는 것; 또는
(c) 마커 로커스 M5 (서열식별번호: 12), 마커 로커스 M6 (서열식별번호: 13), 마커 로커스 M7 (서열식별번호: 14), 마커 로커스 M8 (서열식별번호: 15), 마커 로커스 M9 (서열식별번호: 16), 마커 로커스 M10 (서열식별번호: 17), 마커 로커스 M11 (서열식별번호: 18), 마커 로커스 M12 (서열식별번호: 19), 마커 로커스 M13 (서열식별번호: 2), 마커 로커스 M14 (서열식별번호: 3), 마커 로커스 M15 (서열식별번호: 4), 마커 로커스 M16 (서열식별번호: 5), 마커 로커스 M17 (서열식별번호: 6), 마커 로커스 M18 (서열식별번호: 7), 마커 로커스 M19 (서열식별번호: 8), 및 마커 로커스 M20 (서열식별번호: 9)으로 이루어진 군으로부터 선택된 로커스에서 적어도 1개의 다형성을 검출하는 것. - 제17항에 있어서, 상기 자손 식물이 F2-F6 자손 식물인 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 자손 식물을 생산하는 것이 역교배를 포함하는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 집단을 스크리닝하는 것이 PCR, 단일 가닥 입체형태적 다형성 분석, 변성 구배 겔 전기영동, 절단 단편 길이 다형성 분석, TAQMAN 검정, 및/또는 DNA 시퀀싱을 포함하는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, CMV 저항성 오이 식물이 염색체 2 상에 CMV 저항성 대립유전자를 포함하고, 상기 대립유전자를 포함하는 종자의 대표적인 샘플이 ATCC 수탁 번호 PTA-122638 하에 기탁된 것인 방법.
- 제17항에 있어서, CMV 저항성 오이 식물이 염색체 6 상에 CMV 저항성 대립유전자를 포함하고, 상기 대립유전자를 포함하는 종자의 대표적인 샘플이 ATCC 수탁 번호 PTA-122638 하에 기탁된 것인 방법.
- 하기를 포함하는, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)에 대한 저항성을 나타내는 오이 식물을 선택하는 방법:
a) 1개 이상의 식물을 적어도 1개의 핵산 마커로 스크리닝하여 CMV 저항성에 유전적으로 연결된 다형성을 검출하는 것; 및
b) CMV 저항성과 연관된 일배체형을 포함하는 1개 이상의 식물을 선택하는 것, 여기서 일배체형은 상기 식물의 게놈에서 하기에 의해 플랭킹된 CMV 저항성 대립유전자를 포함함:
염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20); 또는
염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10). - 제24항에 있어서, CMV 저항성 대립유전자가 추가로 하기로 정의되는 것인 방법:
a) 상기 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M24 (서열식별번호: 32) 및 마커 로커스 M25 (서열식별번호: 33)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내에 위치된 것; 또는
b) 상기 식물의 게놈에서 염색체 6 상의 마커 로커스 M26 (서열식별번호: 34) 및 마커 로커스 M27 (서열식별번호: 35)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내에 위치된 것. - 제24항에 있어서, 1개 이상의 식물을 선택하는 것이 하기를 포함하는 것인 방법:
(a) 상기 식물의 게놈에서 염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 또는 그에 유전적으로 연결된 마커 로커스를 검출하는 것;
(b) 상기 식물의 게놈에서 염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10)에 의해 플랭킹된 염색체 분절 내 또는 그에 유전적으로 연결된 마커 로커스를 검출하는 것; 또는
(c) 마커 로커스 M5 (서열식별번호: 12), 마커 로커스 M6 (서열식별번호: 13), 마커 로커스 M7 (서열식별번호: 14), 마커 로커스 M8 (서열식별번호: 15), 마커 로커스 M9 (서열식별번호: 16), 마커 로커스 M10 (서열식별번호: 17), 마커 로커스 M11 (서열식별번호: 18), 마커 로커스 M12 (서열식별번호: 19), 마커 로커스 M13 (서열식별번호: 2), 마커 로커스 M14 (서열식별번호: 3), 마커 로커스 M15 (서열식별번호: 4), 마커 로커스 M16 (서열식별번호: 5), 마커 로커스 M17 (서열식별번호: 6), 마커 로커스 M18 (서열식별번호: 7), 마커 로커스 M19 (서열식별번호: 8), 및 마커 로커스 M20 (서열식별번호: 9)으로 이루어진 군으로부터 선택된 로커스에서 적어도 1개의 다형성을 검출하는 것. - 제24항에 있어서, 1개 이상의 식물을 스크리닝하는 것이 PCR, 단일 가닥 입체형태적 다형성 분석, 변성 구배 겔 전기영동, 절단 단편 길이 다형성 분석, TAQMAN 검정, 및/또는 DNA 시퀀싱을 포함하는 것인 방법.
- 하기를 포함하는, 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 저항성 대립유전자를 포함하는 오이 식물을 확인하는 방법으로서:
(a) 적어도 제1 오이 식물로부터 핵산을 수득하는 것; 및
(b) 상기 핵산에서 상기 식물의 게놈에서 하기에 의해 플랭킹된 염색체 분절의 존재를 나타내는 적어도 제1 유전적 마커의 존재를 확인하는 것:
염색체 2 상의 마커 로커스 M1 (서열식별번호: 11) 및 마커 로커스 M2 (서열식별번호: 20); 또는
염색체 6 상의 마커 로커스 M3 (서열식별번호: 1) 및 마커 로커스 M4 (서열식별번호: 10);
여기서 상기 CMV 저항성 대립유전자는 상기 식물에게 상기 대립유전자를 포함하지 않는 식물과 비교하여 CMV에 대한 증가된 저항성을 부여하는 것인 방법. - 제28항에 있어서, 상기 확인이 하기에 유전적으로 연결된 마커를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법:
(a) 마커 로커스 M5 (서열식별번호: 12), 마커 로커스 M6 (서열식별번호: 13), 마커 로커스 M7 (서열식별번호: 14), 마커 로커스 M8 (서열식별번호: 15), 마커 로커스 M9 (서열식별번호: 16), 마커 로커스 M10 (서열식별번호: 17), 마커 로커스 M11 (서열식별번호: 18), 및 마커 로커스 M12 (서열식별번호: 19); 또는
(b) 마커 로커스 M13 (서열식별번호: 2), 마커 로커스 M14 (서열식별번호: 3), 마커 로커스 M15 (서열식별번호: 4), 마커 로커스 M16 (서열식별번호: 5), 마커 로커스 M17 (서열식별번호: 6), 마커 로커스 M18 (서열식별번호: 7), 마커 로커스 M19 (서열식별번호: 8), 및 마커 로커스 M20 (서열식별번호: 9).
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