KR20200061380A - 오이 모자이크 바이러스 저항성 고추류 식물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (rbCMV) 계열에 대한 증가된 저항성을 전시하는 고추 (Capsicum annuum) 식물을 제공한다. 이런 식물은 염색체 8 상에서 질환 저항성과 연관된 신규한 유전자 이입된 유전체 영역을 포함한다. 일정한 양상에서, 증가된 질환 저항성 표현형을 갖는 식물 또는 생식질을 생산하고, 육종하고, 확인하고, 선별하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
Description
관련된 출원에 대한 참조
본 출원은 2017년 9월 29일자 제출된 미국 특허가출원 번호 62/566,310에 우선권을 주장하고, 이것은 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다.
서열 목록의 편입
Microsoft Windows 운영 체제에서 계측될 때 8 킬로바이트이고 2018년 9월 27일자 작성된, "SEMB030WO_ST25.txt"로 명명된 파일에서 내포되는 서열 목록이 전자적으로 함께 제출되고 본원에서 참조로서 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 농업의 분야 및 더욱 특정하게는, 넓은 범위의 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 향상된 저항성, 그리고 특히, cmr-1로서 종종 지칭되는, 염색체 2 상에서 지배적인 CMV 저항성 좌위를 갖는 고추류 계통에서 감염성인 저항성-파괴 CMV (rbCMV) 균주에 대항하여 향상된 저항성을 전시하는 고추류 식물을 생산하기 위한 방법 및 조성물에 관계한다.
발명의 배경
질환 저항성은 농업에서, 특히 식용 작물의 생산을 위해 중요한 형질이다. 비록 질환 저항성 대립유전자가 고추류 식물에서 확인되긴 했지만, 이들 대립유전자를 재배된 계통 내로 도입하는 노력은 상기 대립유전자에 연계된 특정한 마커의 결여, 받아들일 수 없는 식물 품질을 야기하는 연관 지체, 그리고 광역 저항성의 결여에 의해 방해를 받는다. 식물 육종 방법에서 마커-보조된 선별 (MAS)의 이용은 관심되는 형질에 연계된 유전자 마커에 근거하여 식물을 선별하는 것을 가능하게 만들었다. 하지만, 식물에서 바람직한 형질을 확인하거나 또는 추적하기 위한 정확한 마커는 비록 상기 형질과 연관된 유전자가 특징화되었다 하더라도, 빈번하게 가용하지 않다. 이들 어려움은 다유전자 유전 또는 정량적 유전, 상위, 그리고 원하는 표현형의 유전적 배경 기초 발현에 관한 종종 불완전한 이해와 같은 인자에 의해 더욱 복잡해진다.
발명의 요약
본 발명은 유전자 이입을 결여하는 식물에 비하여 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 증가된 저항성을 부여하는, 염색체 8 상에서 유전자 이입된 대립유전자를 포함하는 고추 (Capsicum annuum) 식물의 재배된 품종을 제공한다. 일정한 구체예에서 유전자 이입된 대립유전자는 상기 식물에서 마커1 (서열 번호:5) 및 마커4 (서열 번호:16)와 측면에서 접한다. 추가 구체예에서 유전자 이입된 대립유전자는 공개 고추류 유전체 서열 Pepper.CM334v1.55에서 염색체 8의 32,904,383 bp 및 2,992,472 bp 사이에 위치된다. 다른 구체예에서 저항성은 CMV 분리주 "Bucheon"에 대한 저항성을 포함한다. 특정한 구체예에서 상기 식물은 유전자 이입된 대립유전자에 동형접합성이다. 추가 구체예에서 유전자 이입된 대립유전자는 HAS-ZF17-4448의 저항성 일배체형을 포함하는데, 여기서 상기 저항성 일배체형을 포함하는 종자의 표본은 ATCC 수탁 번호 PTA-124434 하에 기탁되었다.
본 발명은 또한, 유전자 이입을 결여하는 식물에 비하여 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 증가된 저항성을 부여하는, 염색체 8 상에서 유전자 이입된 대립유전자를 포함하는 고추 (Capsicum annuum) 식물의 재배된 품종을 생산하는 종자를 제공한다.
추가적으로, 본 발명은 유전자 이입을 결여하는 식물에 비하여 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 증가된 저항성을 부여하는, 염색체 8 상에서 유전자 이입된 대립유전자를 포함하는 고추 (Capsicum annuum) 식물의 재배된 품종의 식물 부분을 제공한다. 일정한 구체예에서 식물 부분은 세포, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 열매, 꽃, 또는 화분이다.
본 발명은 유전자 이입을 결여하는 식물에 비하여 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 저항성을 부여하는, 염색체 8로부터 염색체 분절을 식물 내로 유전자 이입하는 것을 포함하는, 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 향상된 저항성을 갖는 고추 (Capsicum annuum) 식물의 재배된 품종을 생산하기 위한 방법을 더욱 제공한다. 일부 구체예에서 유전자 이입은 상기 염색체 분절을 포함하는 식물을 그 자체와 또는 상이한 유전자형의 두 번째 고추 (Capsicum annuum) 식물과 교배하여 한 가지 또는 그 이상의 자손 식물을 생산하고, 그리고 상기 염색체 분절을 포함하는 자손 식물을 선별하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서 자손 식물을 선별하는 것은 염색체 8 상에서 마커1 (서열 번호:5) 및 마커4 (서열 번호:16)와 측면에서 접하는 최소한 하나의 대립유전자를 검출하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서 선별하는 것은 마커1 (서열 번호:5) 또는 마커4 (서열 번호:16)를 검출하는 것을 포함한다. 추가 구체예에서 자손 식물은 F2-F6 자손 식물이다. 특정한 구체예에서 교배는 역교배를 포함하는데, 이것은 일정한 구체예에서, 2-7 세대의 역교배를 포함한다. 선별된 구체예에서 유전자 이입된 대립유전자는 HAS-ZF17-4448의 저항성 일배체형을 포함하는데, 여기서 상기 저항성 일배체형을 포함하는 종자의 표본은 ATCC 수탁 번호 PTA-124434 하에 기탁되었다.
본 발명은 유전자 이입을 결여하는 식물에 비하여 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 저항성을 부여하는, 염색체 8로부터 염색체 분절을 식물 내로 유전자 이입하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된 고추 (Capsicum annuum) 식물을 부가적으로 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한, 유전자 이입을 결여하는 식물, 또는 이의 부분에 비하여 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 증가된 저항성을 부여하는, 염색체 8 상에서 유전자 이입된 대립유전자를 포함하는 고추 (Capsicum annuum) 식물의 재배된 품종을 획득하고, 그리고 상기 식물 또는 이의 부분으로부터 식품 또는 사료를 생산하는 것을 포함하는, 식품 또는 사료를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열 대립유전자에 대한 저항성을 식물 내로 유전자 이입하는 단계를 포함하는 방법에 의해 획득가능한 고추 (Capsicum annuum) 식물을 더욱 제공하고, 여기서 저항성 대립유전자는 염색체 8 상에서 마커1 (서열 번호:5) 및 마커4 (서열 번호:16)와 측면에서 접하는 유전체 영역에서 위치되는 것으로 규정된다. 일정한 구체예에서 유전자 이입은 역교배를 포함한다. 다른 구체예에서 유전자 이입은 마커-보조된 선별을 포함한다. 또 다른 구체예에서 유전자 이입은 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 저항성을 검정하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한, 유전자 이입을 결여하는 식물에 비하여 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 증가된 저항성을 부여하는, 염색체 8 상에서 유전자 이입된 대립유전자를 포함하는 고추 (Capsicum annuum) 식물의 재배된 품종을 그 자체와 또는 상이한 유전자형의 두 번째 고추 (Capsicum annuum) 식물과 교배하여 한 가지 또는 그 이상의 자손 식물을 생산하고, 그리고 상기 유전자 이입된 대립유전자를 포함하는 자손 식물을 선별하는 것을 포함하는, 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 저항성을 전시하는 고추 (Capsicum annuum) 식물을 선별하는 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서 자손 식물을 선별하는 것은 유전자 이입에 유전적으로 연계된 유전자 마커를 확인하는 것을 포함한다. 추가 구체예에서 자손 식물을 선별하는 것은 염색체 8 상에서 마커1 (서열 번호:5) 및 마커4 (서열 번호:16)에 의해, 식물의 유전체에서 측면에서 접하는 유전체 영역 내에서 또는 상기 영역에 유전적으로 연계된 유전자 마커를 확인하는 것을 포함한다. 특정한 구체예에서 선별하는 것은 마커1 (서열 번호:5) 또는 마커4 (서열 번호:16)를 검출하는 것을 포함한다. 추가 구체예에서 자손 식물은 F2-F6 자손 식물이다. 다른 추가 구체예에서 자손 식물을 생산하는 것은 역교배를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1: rbCMV에 대한 저항성을 제공하는 유전체 영역이 염색체 8의 근위 단부에 지도화되었다.
도 2: 변하는 유전적 배경을 갖고 상이한 CMV 분리주에 대하여 검사된 생식질 사이에 질환 점수 비교. 상기 질환 점수는 1-9의 규모에서 계측되는데, 여기서 1은 완전히 저항성이고, 그리고 9는 완전히 감수성이다. 도 2A. 염색체 8 상에서 저항성 QTL의 존재는 염색체 2 상에서 저항성 좌위를 파괴하는 CMV 분리주에 대하여 검사될 때, 상기 질환 점수를 중간 저항성까지 유의미하게 감소시킨다. 도 2B. 염색체 8 상에서 저항성 QTL의 존재는 염색체 2 상에서 저항성 좌위를 파괴할 수 없는 것에 대하여 검사될 때, 상기 질환 점수를 높은 저항성까지 유의미하게 감소시킨다. 도 2C. 염색체 8의 QTL이 첫 번째 내부 rbCMV 감수성 육성 계통 내로 유전자 이입될 때, 부가적인 저항성이 관찰된다. 도 2D. 염색체 8의 QTL이 두 번째 내부 rbCMV 감수성 육성 계통 내로 유전자 이입될 때, 부가적인 저항성이 관찰된다.
도 3: 미세 지도화 결과에 근거하여, 염색체 8 상에서 rbCMV 저항성을 부여하는 마커 위치 및 염색체 영역의 개요.
도 1: rbCMV에 대한 저항성을 제공하는 유전체 영역이 염색체 8의 근위 단부에 지도화되었다.
도 2: 변하는 유전적 배경을 갖고 상이한 CMV 분리주에 대하여 검사된 생식질 사이에 질환 점수 비교. 상기 질환 점수는 1-9의 규모에서 계측되는데, 여기서 1은 완전히 저항성이고, 그리고 9는 완전히 감수성이다. 도 2A. 염색체 8 상에서 저항성 QTL의 존재는 염색체 2 상에서 저항성 좌위를 파괴하는 CMV 분리주에 대하여 검사될 때, 상기 질환 점수를 중간 저항성까지 유의미하게 감소시킨다. 도 2B. 염색체 8 상에서 저항성 QTL의 존재는 염색체 2 상에서 저항성 좌위를 파괴할 수 없는 것에 대하여 검사될 때, 상기 질환 점수를 높은 저항성까지 유의미하게 감소시킨다. 도 2C. 염색체 8의 QTL이 첫 번째 내부 rbCMV 감수성 육성 계통 내로 유전자 이입될 때, 부가적인 저항성이 관찰된다. 도 2D. 염색체 8의 QTL이 두 번째 내부 rbCMV 감수성 육성 계통 내로 유전자 이입될 때, 부가적인 저항성이 관찰된다.
도 3: 미세 지도화 결과에 근거하여, 염색체 8 상에서 rbCMV 저항성을 부여하는 마커 위치 및 염색체 영역의 개요.
상세한 설명
오이 모자이크 바이러스 (CMV)는 지구상의 온대 지역 전역에서 임의의 바이러스의 가장 광범위한 숙주 범위 중에서 한 가지를 갖는다. 800가지보다 많은 종의 식물이 감염될 수 있고, 그리고 60가지보다 많은 진딧물 종이 이러한 바이러스에 대한 벡터이다. CMV는 쿠쿠모바이러스 군의 구성원이고 고도로 다양하다. CMV의 60가지보다 많은 계열이 확인되었다. CMV는 경제적으로 중요한 식물, 예를 들면, 토마토, 오이, 감자, 담배 및 고추를 감염시키는 것으로 알려져 있다.
이전에, CMV 저항성 공급원이 고추에서 확인되었다. 여러 연구가 이들 저항성 공급원에 대한 유전학을 타개하려 시도하였다. 상기 공급원에 따라서, 좌위는 복수 연관군에서 위치되는 것으로 보고된다. 이들 좌위의 유전적 조절은 다르고 고도로 공급원 의존성이다. 공급원 BJ0747의 경우에 좌위가 연관군 4, 7, 8 및 16 에서 확인되었지만, CMV 저항성의 조절은 단일 좌위에 기인할 수 없었는데, 이것은 CMV 저항성이 복합적인 다유전자 형질이라는 결론을 야기하였다. 유사하게, 고추류 계통 'Perennial'의 CMV 저항성은 복수 좌위에 의해 제어되긴 하지만, 이들 좌위는 상이한 연관군, 다시 말하면, LG4, 6 및 11에 지도화되었다. 대조적으로, 단일 좌위 우성 저항성의 단지 한 가지 사례만 알려져 있다. 이러한 좌위는 염색체 2 상에 위치된다. cmr-1로서 종종 지칭되는, 염색체 2 상에서 좌위는 물질에 대한 CMV 저항성을 담보하기 위해 육종 회사에 의해 폭넓게 이용된다. 하지만, 최근 연구는 염색체 2 상에서 지배적인 좌위가 새로 발견된 CMV 분리주에 대한 불완전한 저항성을 제공한다는 것을 보여준다. CMVP1 또는 CMVP1로서 종종 지칭되는 이들 저항성-파괴 (rbCMV) 계열은 한국에서 지배적이고, 인도에서 풍부하고, 그리고 아마도 아시아의 다른 지역에서 발생한다. 하지만, CMV는 전 세계적인 문제이고, 그리고 이들 저항성-파괴 계열이 전 세계의 다른 지역에서 지배적으로 될 수도 있다는 것이 배제될 수 없다. 특히, 저항성 고추 품종이 재배되는 지역에서는 아마도 육종가에 의해 이용되는 현재 저항성 유전자를 극복하는 CMV 계열에 대한 강한 선택이 존재한다. 이들 새로운 저항성-파괴 CMV (rbCMV) 분리주에 대항하여 적절한 저항성을 제공하는 공급원을 확인하기 위한 많은 노력이 이루어졌지만, 이것은 일부 연구자가 저항성 고추 품종을 개발하기 위해 유전적 변형에 의존해야 할 정도로 어려운 것으로 입증되었다. 한 가지 rbCMV 분리주에 대한 저항성을 제공하는, cmr-2로 불리는 단일 열성 유전자가 염색체 1 상에서 확인되었다. 이에 더하여, 동일한 rbCMV 분리주에 대항하여 2개의 저항성 좌위가 확인되었고 고추의 LG4에 지도화되었다.
본 발명은 이것이 염색체 2 좌위 cmr-1 및 '규칙적인 비-파괴 CMV' 분리주의 CMV 저항성을 극복하는 CMV의 분리주에 대한 저항성을 비롯하여, CMV에 대한 광역 저항성을 제공하는 단일 QTL을 내포하는 것으로 확인된 내부 육성 계통 ("내부 저항성 육성 계통")을 제공한다는 점에서 유의미한 진전을 나타낸다. QTL은 염색체 8의 근위 단부에서 마커1 및 마커4 사이에 위치된다. QTL의 저항성은 부가 효과를 갖는 것으로 결정되었는데, 이것은 동형접합성 배치가 이형접합성 배치보다 우수하다는 것을 지시한다.
I.
저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 증가된 저항성과 연관된 유전체 영역, 대립유전자 및 다형성
본 발명자들은 염색체 2 상에서 CMV 저항성 좌위를 갖는 품종을 감염시킬 수 있는 rbCMV의 분리주, 예를 들면, rbCMV 분리주 "Bucheon," 또는 CMVP1에 대한 저항성뿐만 아니라 '규칙적인 CMV' (비-저항성 파괴) 분리주에 대한 저항성을 제공하는 내부 저항성 육성 계통으로부터 염색체 8 상에서 신규한 QTL을 확인하였다. 최고 결과는 QTL이 동형접합성 형질로서 존재할 때 관찰된다.
염색체 8 상에서 새로 확인된 QTL은 약 18 cM의 영역을 커버한다. 염색체 8 상에서 새로 확인된 QTL은 solgenomics.net로부터 가용한, 고추 CM334v.1.55 유전체의 공개 유전체 상에서 32,904,383 bp에서 SNP 변화 [A/G]인 마커1 (서열 번호:5), 그리고 고추 CM334v.1.55의 공개 유전체 상에서 2,992,472 bp에서 SNP 변화 [C/T]인 마커4 (서열 번호:16)와 측면에서 접한다. 따라서, 본 발명은 rbCMV에 대한 저항성을 전시하는, 마커1 및 마커4와 측면에서 접하는 내부 저항성 육성 계통의 염색체 8 상에서 유전자 이입된 대립유전자를 포함하는 엘리트 또는 재배된 고추류 식물을 제공한다.
II. 질환 저항성과 연관된 유전체 영역의 유전자 이입
마커-보조된 유전자 이입은 첫 번째로부터 두 번째 유전적 배경으로, 하나 또는 그 이상의 마커에 의해 규정된 염색체 영역의 전달을 수반한다. 유전자 이입된 유전체 영역을 내포하는 교배의 자손은 첫 번째 유전적 배경으로부터 원하는 유전자 이입된 유전체 영역에 특유한 마커 및 두 번째 유전적 배경에 특유한 연계된 마커와 연계되지 않은 마커 둘 모두의 조합에 의해 확인될 수 있다.
본 발명은 임의의 고추류 식물, 예를 들면, 본원에서 이용된 내부 저항성 육성 계통일 수 있는 저항성 공급원으로부터 유전체 영역 중에서 하나 또는 그 이상의 재배된 고추류 식물 계통 내로의 유전자 이입을 확인하고 추적하기 위한 신규한 마커를 제공한다. 본원에서 이용된 내부 저항성 육성 계통으로부터 유래된 저항성 좌위를 내포하는 계통, HAS-ZF17-4448은 ATCC에 기탁되었다 (참조: 아래의 섹션 V). 본 발명은 식물 육종 동안 본원에서 개시된 신규한 유전자 이입을 확인하고 추적하기 위한 마커를 더욱 제공한다.
본 발명은 저항성-파괴 CMV (rbCMV) 분리주에 대한 저항성을 제공하는 새로 확인된 QTL을 제공한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "rbCMV 분리주"는 염색체 2 상에서 폭넓게 이용되는 CMV 저항성 대립유전자를 갖는 고추류 식물, 예를 들면, "Bukang"에서 질환을 유발할 수 있는 CMV 분리주를 지칭한다.
본 발명의 임의의 유전체 간격 이내에 또는 이들에 연계된 마커는 질환 저항성과 연관된 유전체 영역의 원하는 유전적 배경 내로의 유전자 이입을 포함하는 다양한 육성 노력에서 이용될 수 있다. 가령, 본원에서 설명된 질환 저항성과 연관된 마커의 30 cM, 25 cM, 20 cM, 16 cM, 15 cM, 10 cM, 5 cM, 2 cM, 또는 1 cM 이내에 마커가 질환 저항성 표현형과 연관된 유전체 영역의 마커-보조된 유전자 이입에 이용될 수 있다.
나머지 유전체 서열 중에서 최소한 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 또는 99%가 생식질에 특유한 마커를 운반하는 원하는 표현형과 연관된 하나 또는 그 이상의 유전자 이입된 영역을 포함하는 고추류 식물 역시 제공된다. 본원에서 제공된 유전체 영역 및 마커에 가깝게 연결되거나 또는 인접하고, 그리고 염색체 2 상에서 지배적인 CMV 저항성 좌위를 갖는 품종, 예를 들면, 품종 "Bukang"을 감염시킬 수 있는 CMV의 분리주 및 '규칙적인 비-파괴 CMV' 분리주에 대한 저항성과 연관된 영역을 포함하는 유전자 이입된 영역을 포함하는 고추류 식물 역시 제공된다.
III. 질환 저항성 고추 (
Capsicum annuum
) 품종의 개발
대부분의 육종 목적을 위해, 상업적인 육종가는 "재배된 유형," 또는 "엘리트"인 생식질 내에서 작업한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "엘리트" 또는 "재배된" 품종은 농업에서 이용을 위한 우수한 원예 성과를 위한 육종 및 선별로부터 발생한 품종을 의미한다. 이러한 생식질은 육종하기가 더욱 쉬운데, 그 이유는 이것이 원예 성과에 대해 평가될 때, 일반적으로 좋은 성과를 내기 때문이다. 다수의 재배된 고추 유형이 개발되었는데, 이들은 작물학적으로 엘리트이고 상업적인 재배에 적합하다. 하지만, 재배된 생식질이 제공하는 성과 이점은 대립유전자 다양성의 결여에 의해 상쇄될 수 있다. 육종가는 일반적으로, 이러한 교환을 수용하는데, 그 이유는 유전적으로 다양한 공급원으로 육종할 때보다 재배된 재료로 작업할 때 진행이 더욱 빠르기 때문이다.
대조적으로, 재배된 생식질이 비-재배된 생식질과 교배될 때, 육종가는 비-재배된 유형으로부터 신규한 대립유전자에 접근할 수 있다. 하지만, 이러한 접근법은 다양한 계통 사이에 교배와 연관된 임성 문제 및 비-재배된 부모로부터 부정적인 연관 지체로 인해 유의미한 어려움에 직면한다. 가령, 비-재배된 고추류 계통은 질환 저항성과 연관된 대립유전자를 제공할 수 있다. 하지만, 이러한 비-배양된 유형은 불량한 원예 품질, 예를 들면, 괴사에 대한 취약성 또는 낮은 열매 생산을 가질 수 있다.
연관 지체 또는 낮은 형질 유전율에 문제를 방지하면서, 바람직한 저항성 대립유전자를 비-배양된 계통으로부터 엘리트 재배된 계통 내로 유전자 이입하는 과정은 길고 종종 고된 과정이다. 야생 연관식물로부터 유래된 대립유전자를 성공적으로 배치하는 것은 이런 이유로, 유해한 효과를 결여하는 최소 또는 생략된 유전자 이입 및 표현형 스크린을 대체하는 신뢰할 만한 마커 검정에 강하게 의존한다. 성공은 핵심 속성에 대한 유전학을 단순화하여 양적 형질, 예를 들면, 질환 저항성에 대한 유전적 획득에 집중하는 것을 허용함으로써 더욱 규정된다. 게다가, 비-재배된 계통으로부터 유전체 영역을 유전자 이입하는 과정은 유익한 마커의 이용가능성에 의해 크게 용이해질 수 있다.
당업자는 이런 이유로, 본 발명에 의해 제공된 대립유전자, 다형성 및 마커가 본원에서 확인된 유전체 영역 중에서 어느 것의 추적 및 이것의 임의의 유전적 배경 내로의 도입을 허용한다는 것을 이해할 것이다. 이에 더하여, 본원에서 개시된 질환 저항성과 연관된 유전체 영역은 한 유전자형으로부터 다른 유전자형으로 유전자 이입되고 표현형적으로 또는 유전적으로 추적될 수 있다. 따라서, 출원인의 질환 저항성과 연관된 정확한 마커의 발견은 유익한 표현형을 갖는 고추류 식물의 개발을 용이하게 할 것이다. 가령, 식물 및 종자는 원하는 질환 저항성을 포함하는 품종을 개발하기 위해 본 발명의 마커를 이용하여 유전자형분석될 수 있다. 게다가, 마커-보조된 선별 (MAS)은 원하는 유전자 이입에 동형접합성 또는 이형접합성인 식물의 확인을 허용한다.
감수분열 재조합이 식물 육종에 필수적인데, 그 이유는 이것이 유전적 배경의 전역에서 우호적인 대립유전자의 전달, 유해한 유전체학 단편의 제거, 그리고 유전적으로 밀착하여 연계되는 형질의 피라미드화를 가능하게 하기 때문이다. 한정된 재조합은 육종가가 자손 스크린을 위한 분리 개체군을 확대하도록 강제한다. 마커의 부재에서 육종가는 표현형 평가에 의존해야 하는데, 이것은 시간 소모적이고, 자원-집중적이고, 그리고 특히, 질환 저항성과 같은 형질에 대해 모든 환경에서 재현 가능하지는 않다. 대조적으로, 마커는 육종가가 전체 개체군을 표현형 평가에 노출시킬 필요 없이 관심되는 개체를 선별하는 것을 허용한다. 본 발명에 의해 제공된 마커는 효과적인 대안을 제공하고, 그리고 이런 이유로, 당해 분야에서 유의미한 진전을 나타낸다.
큰 개체군의 표현형 평가는 시간 소모적이고, 자원-집중적이고, 그리고 모든 환경에서 재현 가능하지는 않다. 마커-보조된 선별은 실현가능한 대안을 제공한다. 독특한 다형성, 예를 들면, SNPs를 검출하도록 설계되는 분자 검정은 다능하다. 하지만, 이들은 단일 검정에서 고추 종 내에서 및 사이에서 대립유전자를 구별하는데 실패할 수도 있는데, 이로 인해 마커 검정, 예를 들면, 일배체형 검정의 조합으로 작업하는 것이 필요하다. 염색체의 구조적 재배열, 예를 들면, 결실은 합성적으로 표지화된 올리고뉴클레오티드의 혼성화 및 연장을 손상시킨다. 중복 사건의 경우에, 복수 사본이 차이 없이 단일 반응에서 증폭된다. 이런 이유로, 정확하고 고도로 예측적인 마커의 개발 및 검증이 성공적인 MAS 육종 프로그램에 필수적이다.
IV. 분자 보조된 육성 기술
본 발명의 실시에서 이용될 수 있는 유전자 마커는 제한 단편 길이 다형성 (RFLPs), 증폭된 단편 길이 다형성 (AFLPs), 단순한 서열 반복 (SSRs), 단순한 서열 길이 다형성 (SSLPs), 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNPs), 삽입/결실 다형성 (Indels), 가변적 숫자 일렬 반복 (VNTRs), 그리고 무작위 증폭된 다형성 DNA (RAPD), 동질효소, 그리고 당업자에게 공지된 다른 마커를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 식물 육종가는 표현형 차이보다는 유전적 차이에 근거하여 작물의 유전체를 규문하고 재료를 분류하는데 분자 마커를 이용한다. 진전된 마커 기술은 종 내에서 상이한, 다형성 유전자형의 뉴클레오티드 순서인 유전체 서열에 근거된다. 이런 플랫폼은 유전체 전역에서 무작위로 분포된 마커를 이용한 생식질의 조직화에 더하여, 우호적인 대립유전자에 연계된 마커로 원예 형질에 대한 선별을 가능하게 한다. 과거에는, 유전체에 관한 선험적인 지식이 현재 염기서열결정된 주요 채소 작물에 대해 결여되었다. 과학자들은 마커 플랫폼을 개발하기 위해, 공지된 다형성보다는 서열 상동성을 활용하였다. DNA 중합효소 효소의 존재에서 쌍별로 혼성화될 때, 인공 DNA 분자가 유전체 단편의 복제를 초회감작하는데 이용된다. 이러한 합성은 각 프라이머 쌍 사이에 거리에 의존하는 길이의 DNA 단편을 증폭하기 위한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에서 DNA 가닥의 혼성화 및 복제를 조절하는 열 주기 조건에 의해 조절된다. 이들 단편은 이후, 마커로서 검출되고, 그리고 통상적으로 공지된 실례는 AFLP 및 RAPD를 포함한다. 세 번째 기술, RFLP는 DNA 증폭 단계를 포함하지 않는다. 증폭된 단편 길이 다형성 (AFLP) 기술은 유전체의 복잡성을 감소시킨다. 첫 번째, DNA 가닥을 서열 특이적 방식으로 개열하는 소화 효소를 통해. 단편은 이후, 그들의 크기에 대해 선별되고, 그리고 최종적으로, 유전체 단편의 부분집합과 각각 상동한 선택적 올리고뉴클레오티드를 이용하여 복제된다. 결과적으로, AFLP 기술은 유전자형, 실험 및 실험실의 전역에서 DNA 단편을 일관되게 증폭한다.
적게는 단일 뉴클레오티드 변화를 포함하는 다형성은 다수의 방식으로 검정될 수 있다. 가령, 검출은 단일 가닥 입체형태적 다형성 (Orita, et al., Genomics 8:271-278, 1989), 변성 구배 겔 전기이동 (Myers, EP 0273085), 또는 개열 단편 길이 다형성 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)을 포함하는 전기이동 기술에 의해 이루어질 수 있지만, DNA 염기서열결정의 광범위한 이용가능성은 종종, 증폭된 산물을 직접적으로 간단히 염기서열결정하는 것을 더욱 쉽게 만든다. 일단 다형성 서열 차이가 알려지면, 자손 검사를 위한 신속한 검정이 설계될 수 있는데, 특정한 대립유전자의 PCR 증폭 (PASA; Sommer, et al., Biotechniques 12:82-87, 1992), 또는 복수의 특정한 대립유전자의 PCR 증폭 (PAMSA; Dutton and Sommer, Biotechniques 11:700-702, 1991)의 일부 버전을 전형적으로 수반한다.
다형성 마커는 계통 또는 품종의 동일성 정도를 결정하기 위해 식물을 검정하기 위한 유용한 도구로서 역할을 한다 (U.S. 특허 번호 6,207,367). 이들 마커는 표현형과의 연관을 결정하기 위한 기초를 형성하고, 그리고 유전적 획득을 주도하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법의 일정한 구체예에서, 다형성 핵산은 고추 (Capsicum annuum) 식물에서 질환 저항성과 연관된 유전자형을 검출하고, 질환 저항성과 연관된 유전자형을 갖는 고추 (Capsicum annuum) 식물을 확인하고, 그리고 질환 저항성과 연관된 유전자형을 갖는 고추 (Capsicum annuum) 식물을 선별하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법의 일정한 구체예에서, 다형성 핵산은 자신의 유전체 내에 질환 저항성과 연관된 유전자 이입된 좌위를 포함하는 고추 (Capsicum annuum) 식물을 생산하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 일정한 구체예에서, 다형성 핵산은 질환 저항성과 연관된 좌위를 포함하는 자손 고추 (Capsicum annuum) 식물을 육종하는데 이용될 수 있다.
유전자 마커는 "우성" 또는 "공동우성" 마커를 포함할 수 있다. "공동우성" 마커는 2개 또는 그 이상의 대립유전자 (이배수체 개체마다 2개)의 존재를 드러낸다. "우성" 마커는 오로지 단일 대립유전자의 존재만을 드러낸다. 마커는 가급적이면, 이배수체 좌위에서 양쪽 대립유전자, 또는 삼배체 또는 사배수체 좌위에서 복대립유전자의 존재가 쉽게 검출가능하고, 그리고 이들이 환경적 변이를 갖지 않도록, 다시 말하면, 이들의 유전율이 1이도록 공동우성 방식으로 유전된다. 마커 유전자형은 전형적으로, 이배수체 생물체 내에 각 좌위에서 2개의 마커 대립유전자를 포함한다. 각 좌위의 마커 대립유전자 조성은 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 동형접합성은 하나의 좌위에서 양쪽 대립유전자가 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 특징화되는 상태이다. 이형접합성은 하나의 좌위에서 대립유전자의 상이한 상태를 지칭한다.
유전적 다형성의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 (다시 말하면, 유전자형분석을 위한) 핵산-기초된 분석은 확인, 선별, 유전자 이입 등을 위한 육종 프로그램에서 이용될 수 있다. 유전적 다형성의 분석을 위한 매우 다양한 유전자 마커가 가용하고 당업자에게 공지된다. 상기 분석은 고추 (Capsicum annuum) 식물에서 질환 저항성에 연계되거나 또는 이와 연관된 유전자 마커를 포함하거나 또는 이것에 연결되는 유전자, 유전자의 부분, QTL, 대립유전자, 또는 유전체 영역을 선별하는데 이용될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 핵산 분석 방법은 PCR-기초된 검출 방법 (가령, TaqMan 검정), 마이크로어레이 방법, 질량 분광분석법-기초된 방법 및/또는 전체 유전체 염기서열결정을 비롯한 핵산 염기서열결정 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 구체예에서, DNA, RNA 또는 cDNA의 표본에서 다형성 부위의 검출은 핵산 증폭 방법의 이용을 통해 용이해질 수 있다. 이런 방법은 다형성 부위에 걸쳐 있거나, 또는 이것의 원위 또는 근위에 위치된 부위와 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 농도를 특이적으로 증가시킨다. 이런 증폭된 분자는 겔 전기이동, 형광 검출 방법, 또는 다른 수단에 의해 쉽게 검출될 수 있다.
이런 증폭을 달성하는 한 가지 방법은 이중 가닥 형태에서 다형성을 규정하는 근위 서열에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍을 이용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR) (Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273, 1986; 유럽 특허 50,424; 유럽 특허 84,796; 유럽 특허 258,017; 유럽 특허 237,362; 유럽 특허 201,184; U.S. 특허 4,683,202; U.S. 특허 4,582,788; 및 U.S. 특허 4,683,194)을 이용한다. 질량 분광분석법에 근거하여 DNA를 형결정하기 위한 방법 역시 이용될 수 있다. 이런 방법은 US 특허 번호 6,613,509 및 6,503,710, 그리고 그 안에서 발견되는 참고문헌에서 개시된다.
DNA 서열에서 다형성은 U.S. 특허 번호 5,468,613, 5,217,863; 5,210,015; 5,876,930; 6,030,787; 6,004,744; 6,013,431; 5,595,890; 5,762,876; 5,945,283; 5,468,613; 6,090,558; 5,800,944; 5,616,464; 7,312,039; 7,238,476; 7,297,485; 7,282,355; 7,270,981 및 7,250,252에서 개시된 것들을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 효과적인 방법에 의해 검출되거나 또는 형결정될 수 있는데, 이들 모두 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다. 하지만, 본 발명의 조성물과 방법은 유전체 DNA 표본에서 다형성을 형결정하기 위한 임의의 다형성 형결정 방법과 함께 이용될 수 있다. 이용되는 이들 유전체 DNA 표본은 식물로부터 직접적으로 단리된 유전체 DNA, 클로닝된 유전체 DNA, 또는 증폭된 유전체 DNA를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
가령, DNA 서열에서 다형성은 U.S. 특허 번호 5,468,613 및 5,217,863에서 개시된 바와 같이, 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO) 프로브에 혼성화에 의해 검출될 수 있다. U.S. 특허 번호 5,468,613은 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화를 개시하는데, 여기서 핵산 서열에서 단일 또는 복수 뉴클레오티드 변이는 뉴클레오티드 변이를 내포하는 서열이 증폭되고, 막 위에 점재되고, 그리고 표지화된 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브로 처리되는 과정에 의해 핵산에서 검출될 수 있다.
표적 핵산 서열은 또한, 예로서 U.S. 특허 번호 5,800,944에서 개시된 바와 같이, 프로브 결찰 방법에 의해 검출될 수 있는데, 여기서 관심되는 서열은 증폭되고, 프로브에 혼성화되고, 그 이후에 결찰되어 상기 프로브의 표지화된 부분이 검출된다.
마이크로어레이 또한 다형성 검출에 이용될 수 있는데, 여기서 한 포인트에서 표적 서열에서 차이가 부분적인 프로브 혼성화를 유발하도록 올리고뉴클레오티드 프로브 세트가 단일 서열을 나타내는 중첩 방식으로 조립된다 (Borevitz, et al., Genome Res. 13:513-523, 2003; Cui, et al., Bioinformatics 21:3852-3858, 2005). 임의의 하나의 마이크로어레이 상에서, 유전자 및/또는 비코딩 영역을 나타낼 수 있는 복수의 표적 서열이 있을 것으로 예상되는데, 여기서 각 표적 서열은 단일 프로브에 의하기 보다는, 일련의 중첩 올리고뉴클레오티드에 의해 나타내진다. 이러한 플랫폼은 복수 다형성의 고처리량 선별검사를 제공한다. 마이크로어레이-기초된 방법에 의한 표적 서열의 형결정은 US 특허 번호 6,799,122; 6,913,879; 및 6,996,476에서 개시된다.
SNPs 및 Indels를 검출하기 위한 다른 방법은 단일 염기 연장 (SBE) 방법을 포함한다. SBE 방법의 실례는 U.S. 특허 번호 6,004,744; 6,013,431; 5,595,890; 5,762,876; 및 5,945,283에서 개시된 것들을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
다형성을 검출하기 위한 다른 방법에서, SNPs 및 Indels는 U.S. 특허 번호 5,210,015; 5,876,930; 및 6,030,787에서 개시된 방법에 의해 검출될 수 있는데, 여기서 올리고뉴클레오티드 프로브는 상기 프로브의 5'와 3' 단부에 공유 연결된 5' 형광 리포터 염료 및 3' 퀀처 염료를 갖는다. 프로브가 무손상일 때, 퀀처 염료에 리포터 염료의 근접은 예로서, Forster-유형 에너지 전달에 의한 리포터 염료 형광의 억제를 유발한다. PCR 동안, 정방향과 역방향 프라이머는 다형성과 측면에서 접하는 표적 DNA의 특정한 서열에 혼성화하고, 반면 혼성화 프로브는 증폭된 PCR 산물 내에 다형성-내포 서열에 혼성화한다. 차후 PCR 주기에서 5'→ 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소가 프로브를 개열하고 리포터 염료를 퀀처 염료로부터 분리하여 상기 리포터의 증가된 형광을 유발한다.
다른 구체예에서, 관심되는 좌위 또는 좌위들은 핵산 염기서열결정 기술을 이용하여 직접적으로 염기서열결정될 수 있다. 핵산 염기서열결정을 위한 방법은 당해 분야에서 공지되고, 그리고 454 Life Sciences (Branford, CT), Agencourt Bioscience (Beverly, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA), LI-COR Biosciences (Lincoln, NE), NimbleGen Systems (Madison, WI), Illumina (San Diego, CA) 및 VisiGen Biotechnologies (Houston, TX)에 의해 제공된 기술을 포함한다. 이런 핵산 염기서열결정 기술은 병렬 비드 어레이, 결찰에 의한 염기서열결정, 모세관 전기이동, 전자 마이크로칩, "바이오칩," 마이크로어레이, 병렬 마이크로칩, 그리고 단일-분자 어레이와 같은 형식을 포함한다.
정의
본 발명을 더욱 충실하게 규정하고 본 발명의 실시에서 당업자를 보도하기 위해 다음의 정의가 제공된다. 별도로 언급되지 않으면, 용어는 유관한 분야에서 당업자에 의한 전통적인 용법에 따르는 것으로 이해된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "식물"은 식물 세포, 식물 원형질체, 고추 (Capsicum annuum) 식물이 재생될 수 있는 조직 배양의 식물 세포, 식물 캘러스, 식물 클럼프, 그리고 식물에서 무손상인 식물 세포 또는 식물의 부분, 예를 들면, 화분, 꽃, 종자, 잎, 줄기 등을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "개체군"은 공통 부모 기원을 공유하는 식물의 유전적으로 이질성 집합을 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "품종" 및 "재배종"은 유전 계보 및 성과에 의해, 동일한 종 내에 다른 품종으로부터 식별될 수 있는 유사한 식물의 군을 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "대립유전자"는 염색체에서 소정의 좌위에서 유전체 서열의 2개 또는 그 이상의 대안적 형태 중에서 한 가지를 지칭한다.
"양적 형질 좌위" (QTL)는 표현형의 표현도에 영향을 주는 최소한 첫 번째 대립유전자를 인코딩하는 염색체 위치이다.
본원에서 이용된 바와 같이, "마커"는 생물체를 구별하는데 이용될 수 있는 검출가능한 특징을 의미한다. 이런 특징의 실례는 유전자 마커, 생화학적 마커, 대사산물, 형태학적 특징 및 작물학적 특징을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "표현형"은 유전자 발현에 의해 영향을 받을 수 있는 세포 또는 생물체의 검출가능한 특징을 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "유전자형"은 식물의 특정한 대립유전자 구성을 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "엘리트 계통" 또는 "재배된 계통"은 우수한 작물학적 성과를 위한 육종 및 선별로부터 발생한 임의의 계통을 의미한다. "엘리트 식물"은 엘리트 계통에 속하는 식물을 지칭한다. 다양한 엘리트 계통이 가용하고 고추 (Capsicum annuum) 육종의 분야에서 당업자에게 공지된다. "엘리트 개체군"은 소정의 작물 종, 예를 들면, 고추 (Capsicum annuum) 계통의 작물학적으로 우수한 유전자형의 면에서 최신 기술을 대표하는데 이용될 수 있는 엘리트 개체 또는 계통의 모음이다. 유사하게, "엘리트 생식질" 또는 생식질의 엘리트 계통은 작물학적으로 우수한 생식질이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "유전자 이입된"은 유전자 좌위와 관련하여 이용될 때, 예로서 역교배를 통해 새로운 유전적 배경 내로 도입된 유전자 좌위를 지칭한다. 유전자 좌위의 유전자 이입은 식물 육종 방법을 통해 및/또는 분자 유전학적 방법에 의해 달성될 수 있다. 이런 분자 유전학적 방법은 마커 보조된 선별, 다양한 식물 형질전환 기술 및/또는 상동성 재조합, 비상동성 재조합, 부위 특이적 재조합 및/또는 좌위 치환 또는 좌위 전환을 제공하는 유전체 변형을 제공하는 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "연계된"은 핵산 마커 및/또는 유전체 영역의 맥락에서 이용될 때, 이들 마커 및/또는 유전체 영역이 감수분열에서 함께 분리되는 경향이 있도록 이들이 동일한 연관군 또는 염색체 상에 위치된다는 것을 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "저항성 좌위"는 질환에 대한 저항성 또는 내성과 연관된 좌위를 의미한다. 가령, 본 발명에 따른 저항성 좌위는 한 구체예에서, rbCMV 및 규칙적인 비-파괴 CMV 분리주에 대한 저항성 또는 감수성을 제어할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "저항성 대립유전자"는 질환에 대한 저항성 또는 내성과 연관된 핵산 서열을 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 식물에서 질환 상태에 대한 "저항성" 또는 "향상된 저항성"은 식물이 더욱 적은 저항성, 더욱 "감수성" 식물과 비교하여, 수율, 생존 가능성 및/또는 다른 유관한 작물학적 척도에 대하여 질환 상태에 의해 더욱 적은 영향을 받는다는 지시이다. 저항성은 "저항성" 식물이 유사한 질환 상태에서 성장된 상이한 (더욱 적은 저항성) 식물과 비교하여 질환 상태에서 생존하고 및/또는 더욱 우수한 수율을 생산한다는 것을 지시하는 상대적 용어이다. 당해 분야에서 이용된 바와 같이, 질환 "내성"은 때때로, 질환 "저항성"과 교체가능하게 이용된다. 당업자는 질환 상태에 대한 식물 저항성이 폭넓게 변하고, 그리고 더욱 많은 저항성 또는 더욱 적은 저항성 표현형의 스펙트럼을 나타낼 수 있다는 것을 인지할 것이다. 하지만, 단순한 관찰에 의해, 당업자는 일반적으로, 질환 상태 하에 상이한 식물, 식물 계통 또는 식물 패밀리의 상대적 저항성 또는 감수성을 결정할 수 있고, 그리고 더 나아가, "저항성"의 표현형적 단계적 차이를 또한 인식할 것이다.
용어 "약"은 값이 상기 값을 결정하는데 이용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함한다는 것을 지시하는데 이용된다. 청구항에서 용어 "또는"의 이용은 비록 본 발명이 오로지 대안만을 지칭하는 정의 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 뒷받침하긴 하지만, 오로지 대안만을 지칭하거나 또는 이들 대안이 상호간에 배타적이라고 명시적으로 지시되지 않으면, "및/또는"을 의미하는데 이용된다. 청구항에서 단어 "포함하는" 또는 다른 개방 언어와 함께 이용될 때, 단어 "a" 및 "an"은 구체적으로 언급되지 않으면, "하나 또는 그 이상"을 표시한다. 용어 "포함한다," "갖는다" 및 "포괄한다"는 개방형 연결 동사이다. 이들 동사 중에서 하나 또는 그 이상의 임의의 형태 또는 시제, 예를 들면, "포함한다," "포함하는," "갖는다," "갖는," "포괄한다" 및 "포괄하는" 역시 개방형이다. 가령, 하나 또는 그 이상의 단계를 "포함하는," "갖는" 또는 "포괄하는" 임의의 방법은 오로지 이들 하나 또는 그 이상의 단계만을 소유하는 것에 한정되지 않고, 그리고 다른 열거되지 않은 단계를 또한 커버한다. 유사하게, 한 가지 또는 그 이상의 형질을 "포함하는," "갖는" 또는 "포괄하는" 임의의 식물은 오로지 이들 한 가지 또는 그 이상의 형질만을 소유하는 것에 한정되지 않고, 그리고 다른 열거되지 않은 형질을 커버한다.
V. 기탁 정보
기탁물은 본원에서 설명된 바와 같이, 내부 저항성 육성 계통으로부터 염색체 8 상에서 증가된 질환 저항성 좌위를 포함하는 HAS-ZF17-4448의 최소한 2500개 종자로 이루어졌다. 기탁은 American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA에 이루어졌다. 상기 기탁물은 ATCC 수탁 번호 PTA-124434가 배정되었고, 그리고 기탁 일자는 2017년 8월 30일이었다. 기탁물에 대한 접근은 권리가 있는 자가 요청하는 경우에, 출원의 계류 동안 가능할 것이다. 기탁물은 30 년, 또는 가장 최근 요청 후 5 년의 기간 동안, 또는 특허의 실행가능 기간 동안 (어느 쪽이든 더욱 긴 쪽) 공공 보관소인 ATCC 보관소에서 유지될 것이고, 그리고 만약 상기 기간 동안 생존불가능하면 교체될 것이다. 출원인은 이러한 특허, 또는 식물 품종 보호법 (7 U.S.C. 2321 et seq.)을 비롯한 임의의 다른 형태의 품종 보호 하에 승인된 그들의 권리의 어떤 침해도 용납하지 않는다.
실시예 1
고추에서 CMV 저항성에 대한 선별검사
표현형적으로, CMV에 대한 저항성은 CMV가 기계적으로 접종되는 묘목 검정을 이용하여 결정될 수 있다. 접종물은 CMV 감염이 2-3 주 동안 발달하도록 허용된 감수성 숙주 식물로부터 산출될 수 있다. 접종물을 만들기 위해, 증후성 잎을 수확하고, 그리고 예로서, 차가운 막자 및 막자사발, 또는 pH 7.0에 세팅된 0.05M 인산염 완충액을 내포하는 더욱 많은 양을 위한 냉각된 블렌더를 이용하여 이들 잎을 간다. 잎 재료의 나머지 비트는 4개 층의 무명을 통해 현탁액을 여과함으로써 제거된다. 접종물은 또한, 접종 동안 얼음 위에 유지된다. 1% 규조토가 기계적 접종에 대한 연마재로서 접종물에 첨가된다. 검정을 위해 2-3-주령 묘목이 이용된다. 태반엽 및 제2본엽이 접종된다. 접종 전에, 묘목은 6-8 시간 동안 그늘에서 유지되어야 한다 (50% 일광). 묘목은 접종물에 담가진 면봉을 태반엽 및 제2본엽 상에 문지름으로써 접종된다. 잎은 접종 후 물로 즉시 헹굼된다. 접종 이후에, 이들 식물은 일광으로부터 손상을 예방하고 감염 빈도를 증가시키기 위해 추가로 하루 동안 그늘에서 유지된다. 나머지 실험을 위해, 묘목은 낮 동안 25-35℃ 및 밤 동안 22-28℃를 갖는 온실에서 유지된다. 비료는 주 1회 적용되고, 그리고 식물은 필요하면 살충제로 처리될 수 있다. 증상은 10-14 일 이내에 발달할 것인데, 이들은 녹색 잎맥 농록, 잎 상에서 모자이크 또는 반점, 기형 및 때때로 왜화를 포함한다. 질환 반응은 접종 후 3 주에 계측되고 1-2 일 이내에 완결되어야 한다. 잎 증상은 1-9 규모에서 채점되는데, 여기서 1은 식물 상에서 증상 없음을 의미하고, 그리고 9는 왜화 및/또는 괴사를 동반한 높은 수준의 전신 증상을 나타낸다. 중간 점수는 3 (이것은 하엽 상에서 경미한 증상을 갖는 식물에 제공된다), 5 (이것은 하엽 및 중엽 상에서 더욱 많은 증상을 갖는 식물에 제공된다), 7 (이것은 전신 증상 및 왜화를 갖는 식물에 제공된다)이다. 1-3으로 채점되는 식물은 저항성인 것으로 고려되고, 반면 7-9로 채점되는 식물은 감수성인 것으로 고려되고, 중간으로 채점되는 식물은 중간 저항성인 것으로 고려된다. 유전자형의 저항성 수준을 결정하기 위해, 실험에서 유전자형마다 최소한 20개의 식물을 포함하는 것이 필요하다. 대조 계통의 경우에, 하지만, 대조마다 5개의 식물을 포함하는 것으로 충분하다. 각 실험은 최소한 하나의 감수성 식물, 이상적으로는 모든 CMV에 감수성인 한 가지 식물 및 염색체 2 저항성 좌위를 내포하는 식물, 그리고 감염 절차가 성공적이었음을 담보하기 위한 저항성 대조를 내포해야 한다. 저항성 대조는 예로서 HAS-ZF17-4448이고, 반면 예로서, Bukang 또는 California Wonder은 감수성 대조로서 이용될 수 있다. 주목할 것은 이들이 대조 계통의 실례이고, 그리고 다른 식물 계통이 만약 일정한 점수 군의 범위에 일관되게 들어가면, 대조로서 이용될 수 있다는 점이다.
실시예 2
염색체 8 상에서 저항성 좌위의 확인
29개 고추류 계통의 세트가 rbCMV에 대한 저항성에 대해 검사되었는데, 이것은 내부 저항성 육성 계통의 확인을 유발하였다. 이러한 계통은 차후에, rbCMV 저항성을 부여하는 QTL을 확인하고 다른 유전적 배경에서 저항성의 효력을 검사하기 위해 CMV 민감성 고추류 계통과 교배되었다.
초기 지도화 개체군은 첫 번째 내부 감수성 육성 계통 및 내부 저항성 육성 계통 사이에 교배를 이용하여 창출되었다. F2:F3 개체군이 저항성 QTLs를 지도화하는데 이용되었다. F3 개체군은 저항성 파괴 CMV 분리주 "Bucheon"에 노출되었고, 그리고 주요 QTL이 염색체 8 상에서 발견되었다. 저항성의 위치를 검증하기 위해, DH 개체군이 세 번째 내부 감수성 육성 계통 (CMV 민감성)을 내부 저항성 육성 계통에 교배함으로써 창출되었다. 이들 DH 계통은 넓은 범위의 마커를 이용하여 유전자형분석되고 rbCMV "Bucheon" 분리주에 대한 저항성에 대해 채점되었다. LOD 점수 값 (Y 축)이 염색체의 길이 (X 축)를 따라서 플롯팅된 그래프에서 가시화될 수 있는 바와 같이, 이번에도, 유의미한 QTL (도 1)이 염색체 8의 근위 단부에서 발견되었다.
저항성 QTL의 검사는 대립유전자를 유전자 이입하는 것이 rbCMV 분리주에 의한 감염의 유의미하게 감소된 수준을 야기 (도 2A)할 뿐만 아니라, "정상적인" CMV 분리주의 감염을 유의미하게 감소 (도 2B)시킨다는 것을 드러냈다. 최종적으로, 여러 감수성 배경 (내부 감수성 육성 계통 1과 2)에서, 염색체 8 상에서 저항성 QTL은 부가적인 것으로 확증되었다 (도 2C 및 도 2D).
저항성 좌위의 지도화는 문제가 많았는데, 그 이유는 QTL이 위치되는 염색체 8의 첨단부가 감소된 재조합률을 갖는 것으로 밝혀졌기 때문이다. 물리적 및 유전적 분석은 상기 첨단부가 작은 유전자 영역, 하지만 매우 큰 물리적 영역을 내포한다는 것을 드러냈는데, 이것은 상기 좌위가 염색체 8의 동원체에 근접한다는 것을 암시한다. 그럼에도 불구하고, QTL과 연관된 SNP 마커를 발견하는 것이 가능하였다.
상기 좌위의 더욱 미세한 지도화를 위해, 마커의 추가 세트가 고추의 공개 유전체 (고추 CM334v.1.55)에 기초하여 개발되었다. 5개의 새로운 마커, 마커4, 마커5, 마커6, 마커7 및 마커8이 고추류 유전체 서열에 근거하여, 마커3 및 미지의 원위 염색체 단부 사이에 위치되었다. 이에 더하여, 저항성에 대해 분리되는 BC4F2 지도화 개체군이 154개 재조합 패밀리를 이용하여 개발되었다. 이러한 개체군은 감수성 대조로서 반복친 및 저항성 대조로서 저항성 공여자를 이용한 완전한 블록 설계를 이용하여 복수 위치에서 rbCMV 저항성의 수준에 근거하여 평가되었다. 동시에, 이들 식물은 새로운 마커 세트를 이용하여 유전자형분석되었다. 놀랍게도, 공개 유전체 서열에 근거된, 마커의 예상된 순서는 분리 개체군으로부터 산출된 유전자 지도에 상응하지 하지 않는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 고추류 유전체의 현재 버전이 염색체 8의 이러한 영역에서 정확하지 않다는 것을 보여주는데, 이것은 신뢰할 수 있는 마커 개발을 극히 어렵게 만든다. 그럼에도 불구하고, 마커1 및 마커4 사이에 위치되는 CMV 저항성 좌위를 더욱 정확하게 규정하는 것이 가능하였다 (도 3). 이러한 영역은 지시된 초기 분석보다 염색체의 원위 단부에 더 가깝게 위치되는데, 이것은 아마도, 본래 분석에서 염색체 단부에서 마커의 부재에 기인한다. 지도화 연구를 위해 개발된 선별된 마커는 표 1에서 도시된다.
표 1. 고추 염색체 8 상에서 CMV 저항성 좌위를 확인하기 위한 마커.
| 마커 | 위치 (cM) | SNP 변화 | 공개 유전체 상에서 SNP 위치 (bp) | 마커 서열 (서열 번호) | 정방향 프라이머 (서열 번호) | 역방향 프라이머 (서열 번호) |
프로브 1
(서열 번호) |
프로브 2
(서열 번호) |
| 마커4 | 0.5 | [C/T] | 2,992,472 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 |
| 마커1 | 19.29999924 | [A/G] | 32,904,383 | 5 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 마커2 | 29.79999924 | [G/A] | 123,493,570 | 10 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 마커3 | 47.63867188 | [C/T] | 130,014,877 | 15 | 11 | 12 | 13 | 14 |
정방향 프라이머 GGTTGGTTTGCTAAATGTTGAGGGTTA (서열 번호:1), 역방향 프라이머 CCCAGGCTTAATGAAACCTTCTTC (서열 번호:2), 프로브 1 CTTTGCTTACACTATTTGAC (서열 번호:3) 및 프로브 2 TTGCTTACACTGTTTGAC (서열 번호:4)가 마커1과 함께 이용된다. 마커1의 경우에, 마커 서열은 서열 번호:5에서 도시된다. 정방향 프라이머 TCAGTTGGATCTCATTTAAATGCACTAG (서열 번호:6), 역방향 프라이머 TTCTGAAGAGCGGTGTTGCT (서열 번호:7), 프로브 1 AATTGGCAAGTACTACTATTA (서열 번호:8) 및 프로브 2 TGGCAAGTACTGCTATTA (서열 번호:9)가 마커2와 함께 이용된다. 마커2의 경우에, 마커 서열은 서열 번호:10에서 도시된다. 정방향 프라이머 GGAATAGCATCAGAAATTATCAAGGCAAA (서열 번호:11), 역방향 프라이머 CCGCTGCGCTACTCTGATTT (서열 번호:12), 프로브 1 AGCCAACATTTGGTATCAGA (서열 번호:13) 및 프로브 2 AGCCAACATTTGATATCAGA (서열 번호:14)가 마커3과 함께 이용된다. 마커3의 경우에, 마커 서열은 서열 번호:15에서 도시된다. 정방향 프라이머 CCTACTTCTTCCACCTTCCCTGAT (서열 번호:17), 역방향 프라이머 CAGTTAACTAAACCAATCTAGTCACCGA (서열 번호:18), 프로브 1 TGATTGTTCCTCAATATGTT (서열 번호:19) 및 프로브 2 ATTGTTCCTCGATATGTT (서열 번호:20)가 마커4와 함께 이용된다. 마커4의 경우에, 마커 서열은 서열 번호:16에서 도시된다.
* * * * * * * * * * * * *
본원에서 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 발명에 비추어 과도한 실험 없이 만들어지고 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물과 방법이 바람직한 구체예의 면에서 설명되긴 했지만, 변이가 본 발명의 개념, 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 이들 조성물 및/또는 방법에, 그리고 본원에서 설명된 방법의 단계에서 또는 단계의 순서에서 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 더욱 특정하게는, 화학적으로 및 생리학적으로 관련되는 일정한 작용제가 본원에서 설명된 작용제를 대체하더라도, 동일한 또는 유사한 결과가 달성될 것이라는 것은 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이와 같은 모든 유사한 대체재 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 규정된 바와 같은 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Seminis Vegetable Seeds, Inc.
<120> CUCUMBER MOSAIC VIRUS RESISTANT PEPPER PLANTS
<130> SEMB:030WO
<150> US 62/566,310
<151> 2017-09-29
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 1
ggttggtttg ctaaatgttg agggtta 27
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 2
cccaggctta atgaaacctt cttc 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 3
ctttgcttac actatttgac 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 4
ttgcttacac tgtttgac 18
<210> 5
<211> 149
<212> DNA
<213> Capsicum annuum
<400> 5
ggttggtttg ctaaatgttg agggttatta caactctttg cttacactrt ttgacaatgg 60
tgttgaagaa ggtttcatta agcctggggc tcgtgacatt gttcttgctg ctcctacagc 120
cagagagctt ttaagcaaga tggaggtac 149
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 6
tcagttggat ctcatttaaa tgcactag 28
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 7
ttctgaagag cggtgttgct 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 8
aattggcaag tactactatt a 21
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 9
tggcaagtac tgctatta 18
<210> 10
<211> 201
<212> DNA
<213> Capsicum annuum
<400> 10
actaagacaa tgggctgcag caaagttgaa gacattttta tcagttggat ctcatttaaa 60
tgcactagat tttctaaccg tcggccaatt ggcaagtact rctattaagc aacaccgctc 120
ttcagaaggt atcaataaaa gatgcagaaa agaccacttt gagctacttg taatacttta 180
cccagtacaa gaagtattac a 201
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 11
ggaatagcat cagaaattat caaggcaaa 29
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 12
ccgctgcgct actctgattt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 13
agccaacatt tggtatcaga 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 14
agccaacatt tgatatcaga 20
<210> 15
<211> 201
<212> DNA
<213> Capsicum annuum
<400> 15
aaaaattcat aaatctgaaa atcggaattc catatttttt tttttaacaa atggaatagc 60
atcagaaatt atcaaggcaa atgtattgat ggctctgata ycaaatgttg gctgaaaaat 120
cagagtagcg cagcggaaat atggaataca catacctcca gccattgttg aggatctgta 180
gttgatgtcg gagtcaacta a 201
<210> 16
<211> 301
<212> DNA
<213> Zea mays
<220>
<221> misc_feature
<222> (166)..(166)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 16
gagagtttgt actatcattt atacttgaaa cttgtttact cacttgaatt tccctaattc 60
tgtcgctgat gaaaccagcg ttcctctccg ctctgatgat ttccttttct gtcaattcac 120
ctacttcttc caccttccct gataacatat ygaggaacaa tcagcnatcg gtgactagat 180
tggtttagtt aactgataca tattctatcg atactctaaa gggccggggt tatacgacat 240
atccggtgtg gaagtttagg cctaccatat ctcttttgca tcttcatgag caagggtcca 300
a 301
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 17
cctacttctt ccaccttccc tgat 24
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 18
cagttaacta aaccaatcta gtcaccga 28
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 19
tgattgttcc tcaatatgtt 20
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 20
attgttcctc gatatgtt 18
Claims (26)
- 유전자 이입을 결여하는 식물에 비하여 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 증가된 저항성을 부여하는, 염색체 8 상에서 유전자 이입된 대립유전자를 포함하는 고추 (Capsicum annuum) 식물의 재배된 품종.
- 청구항 1에 있어서, 상기 유전자 이입된 대립유전자는 하기와 같이 더욱 규정되는 것을 특징으로 하는 식물:
a) 상기 식물에서 마커1 (서열 번호:5) 및 마커4 (서열 번호:16)와 측면에서 접함; 또는
b) 공개 고추류 유전체 서열 Pepper.CM334v1.55에서 염색체 8의 32,904,383 bp 및 2,992,472 bp 사이에 위치됨. - 청구항 1에 있어서, 상기 저항성은 CMV 분리주 "Bucheon"에 대한 저항성을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물.
- 청구항 1에 있어서, 식물은 상기 유전자 이입된 대립유전자에 동형접합성인 것을 특징으로 하는 식물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 유전자 이입된 대립유전자는 HAS-ZF17-4448의 저항성 일배체형을 포함하고, 여기서 상기 저항성 일배체형을 포함하는 종자의 표본은 ATCC 수탁 번호 PTA-124434 하에 기탁된 것을 특징으로 하는 고추 (Capsicum annuum) 식물.
- 청구항 1의 식물을 생산하는 종자.
- 청구항 1의 식물의 식물 부분.
- 청구항 7에 있어서, 식물 부분은 세포, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 열매, 꽃, 또는 화분인 것을 특징으로 하는 식물 부분.
- 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 향상된 저항성을 갖는 고추 (Capsicum annuum) 식물의 재배된 품종을 생산하기 위한 방법에 있어서, 유전자 이입을 결여하는 식물에 비하여 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 저항성을 부여하는 염색체 8로부터 염색체 분절을 상기 식물 내로 유전자 이입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 유전자 이입은 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 상기 염색체 분절을 포함하는 식물을 그 자체와 또는 상이한 유전자형의 두 번째 고추 (Capsicum annuum) 식물과 교배하여 한 가지 또는 그 이상의 자손 식물을 생산하고; 그리고
b) 상기 염색체 분절을 포함하는 자손 식물을 선별함. - 청구항 9에 있어서, 자손 식물을 선별하는 것은 염색체 8 상에서 마커1 (서열 번호:5) 및 마커4 (서열 번호:16)와 측면에서 접하는 최소한 하나의 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 9에 있어서, 선별하는 것은 마커1 (서열 번호:5) 또는 마커4 (서열 번호:16)를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 10에 있어서, 자손 식물은 F2-F6 자손 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 10에 있어서, 상기 교배는 역교배를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 역교배는 2-7 세대의 역교배를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 유전자 이입된 대립유전자는 HAS-ZF17-4448의 저항성 일배체형을 포함하고, 여기서 상기 저항성 일배체형을 포함하는 종자의 표본은 ATCC 수탁 번호 PTA-124434 하에 기탁된 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 9의 방법에 의해 생산된 고추 (Capsicum annuum) 식물.
- 식품 또는 사료를 생산하는 방법에 있어서, 청구항 1 또는 17에 따른 식물, 또는 이의 부분을 획득하고, 그리고 상기 식물 또는 이의 부분으로부터 상기 식품 또는 사료를 생산하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열 대립유전자에 대한 저항성을 식물 내로 유전자 이입하는 단계를 포함하는 방법에 의해 획득가능한 고추 (Capsicum annuum) 식물, 여기서 상기 저항성 대립유전자는 염색체 8 상에서 마커1 (서열 번호:5) 및 마커4 (서열 번호:16)와 측면에서 접하는 유전체 영역에서 위치되는 것으로 규정됨.
- 청구항 19에 있어서, 상기 유전자 이입은 역교배, 마커-보조된 선별, 또는 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 상기 저항성 검정을 포함하는 것을 특징으로 하는 고추 (Capsicum annuum) 식물.
- 저항성-파괴 오이 모자이크 바이러스 (CMV) 계열에 대한 저항성을 전시하는 고추 (Capsicum annuum) 식물을 선별하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 청구항 1의 고추 (Capsicum annuum) 식물을 그 자체와 또는 상이한 유전자형의 두 번째 고추 (Capsicum annuum) 식물과 교배하여 한 가지 또는 그 이상의 자손 식물을 생산하고; 그리고
b) 상기 유전자 이입된 대립유전자를 포함하는 자손 식물을 선별함. - 청구항 21에 있어서, 상기 자손 식물을 선별하는 것은 상기 유전자 이입에 유전적으로 연계된 유전자 마커를 확인하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 21에 있어서, 상기 자손 식물을 선별하는 것은 염색체 8 상에서 마커1 (서열 번호:5) 및 마커4 (서열 번호:16)에 의해 상기 식물의 유전체에서 측면에서 접하는 유전체 영역 내에서 또는 상기 영역에 유전적으로 연계된 유전자 마커를 확인하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 21에 있어서, 선별하는 것은 마커1 (서열 번호:5) 또는 마커4 (서열 번호:16)를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 21에 있어서, 상기 자손 식물은 F2-F6 자손 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 21에 있어서, 상기 자손 식물을 생산하는 것은 역교배를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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