CN115176014B - Cmv抗性赋予基因 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种修饰的ABCB9基因，其编码赋予葫芦科植物特别是黄瓜植物对CMV的抗性的蛋白质，其中所述蛋白质在所述葫芦科植物特别是黄瓜植物中表达，其特征在于所述基因包含a)编码包含SEQ ID NO：4的蛋白质的核苷酸序列；b)包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列；c)编码通过包含SEQ ID NO：4的蛋白质的一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加而衍生的蛋白质的核苷酸序列；d)编码包含与SEQ ID NO：4至少85％相同的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；e)与SEQ ID NO：3至少85％相同的核苷酸序列；或f)根据c)或d)的核苷酸序列，其中蛋白质在SEQ ID NO：4的位置428或与其对应的位置上包含甲硫氨酸(M)。

Description

CMV抗性赋予基因
技术领域
本发明涉及葫芦科(Cucurbitaceae)中增加植物对CMV的抗性的修饰的植物基因、具有该修饰的基因的植物以及鉴定、选择和开发这种植物的方法。本发明还涉及用于鉴定CMV抗性植物的标记物。
背景技术
黄瓜花叶病病毒(CMV)是一种广泛传播的疾病，它影响多达100个不同植物科的许多植物物种，其中包括瓜类或葫芦科植物。它属于黄瓜病毒属和雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)。CMV主要由蚜虫传播，尽管它也可以由人类物理传播。该病毒于1934年首次在黄瓜中鉴定。受感染的植物组织显示出特征性的病毒包涵体，其可用于诊断病原体。包涵体呈六边形或菱形，可能呈中空状，并且可聚集在一起以形成较大的斑点。其他症状可能是花、叶和果实的叶镶嵌或斑点、黄化、环斑、发育不良和变形。在黄瓜中，感染CMV可导致黄瓜叶片变成花叶、皱缩和畸形，植物生长发育不良，黄瓜果实往往形状奇特、呈灰色且有苦味。
尽管已知存在葫芦科例如黄瓜和甜瓜中CMV抗性的一些来源，但到目前为止，还没有基因被描述为负责CMV抗性的遗传基础。本发明的一个目的是提供一种或多种与CMV抗性相关的基因。
在导致本发明的研究中，发现与包含ABCB9基因的野生型的植物相比，ABCB9基因中修饰的存在赋予植物CMV抗性。ABCB9基因编码一种被称为ABC转运蛋白B家族成员9的蛋白质，并且是编码据称参与ATP酶偶联的跨膜转运蛋白活性的蛋白质的ABC转运蛋白超家族的一部分。
发明内容
本发明提供了一种修饰的ABCB9基因，其编码赋予葫芦科植物特别是黄瓜植物对CMV的抗性的蛋白质，其中所述蛋白质在所述葫芦科植物特别是黄瓜植物中表达，其特征在于所述基因包含选自以下的核苷酸序列：
a)编码包含SEQ ID NO：4的蛋白质的核苷酸序列；
b)包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列；
c)编码通过包含SEQ ID NO：4的蛋白质的一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加而衍生的蛋白质的核苷酸序列；
d)编码包含与SEQ ID NO：4至少85％相同的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
e)与SEQ ID NO：3至少85％相同的核苷酸序列；
f)根据c)或d)的核苷酸序列，其中蛋白质在SEQ ID NO：4的位置428或与其对应的位置上包含甲硫氨酸(M)。
在CMV抗性黄瓜植物的ABCB9基因中鉴定了一个SNP。本发明的ABCB9基因的修饰包括对SEQ ID NO：1的野生型ABCB9基因核苷酸序列中位置1282的核苷酸的取代。
在野生型ABCB9基因核苷酸序列SEQ ID NO：1中的位置1282鉴定了一个SNP，并且它构成了ABCB9基因的CMV易感野生型中的鸟嘌呤(G)和CMV抗性修饰的ABCB9基因中的腺嘌呤(A)。
野生型ABCB9基因核苷酸序列SEQ ID NO：1的修饰导致SEQ ID NO：2的野生型氨基酸序列的变化，如图1所示。
核苷酸序列SEQ ID NO：1的位置1282上的修饰导致野生型氨基酸序列SEQ ID NO：2的位置428上的氨基酸缬氨酸(V)替换为氨基酸蛋氨酸(M)，如在修饰的氨基酸序列SEQ IDNO：4中呈现的，如图1所示。SNP的位置位于所谓的MdlB结构域中。MdlB是保守的蛋白质结构域家族，其参与ABC型多药转运系统、ATP酶和渗透酶组分的活动。
当纯合地存在于葫芦科植物，特别是黄瓜植物中时，本发明的修饰的ABCB9基因赋予CMV抗性。
如本文所用，ABCB9基因是编码ABCB9蛋白的基因。如本文所用，ABCB9基因是包含由SEQ ID NO：1表示的野生型编码序列的基因，或包含与SEQ ID NO：1具有至少85％序列同一性的核苷酸序列的同源基因，或编码包含SEQ ID NO：2的ABCB9蛋白的基因，或编码包含与SEQ ID NO：2具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的同源ABCB9蛋白的基因。
同源ABCB9基因包含与SEQ ID NO：1具有至少85％序列同一性(优选86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列。同源ABCB9蛋白包含与SEQ ID NO：2具有至少85％序列同一性(优选86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的氨基酸序列。
如本文所用，序列同一性是两个序列之间在比对这些序列之后相同的核苷酸或氨基酸的百分比。本领域技术人员知道如何比对序列，例如通过使用序列比对工具如BLAST。
如本文所用，修饰的ABCB9基因是指与ABCB9基因的野生型核苷酸序列相比，ABCB9基因的修饰的核苷酸序列。改变或修饰可以是任何改变或修饰，包括但不限于核苷酸取代。
本发明还提供了一种蛋白质，它赋予葫芦科植物，特别是黄瓜植物对CMV的抗性，其中所述蛋白质在所述葫芦科植物特别是黄瓜植物中表达并且所述蛋白质由所述的修饰的ABCB9基因编码。
在导致本发明的研究中，发现除了修饰的ABCB9基因外，当纯合地存在于黄瓜植物的基因组中时，修饰的EF1-α基因也赋予CMV抗性。EF1-α基因编码一种被称为延伸转录因子1-α的蛋白质，并且是据称参与蛋白质合成和发育控制的基因的GTP结合延伸因子家族的一部分。在野生型EF1-α基因核苷酸序列SEQ ID NO：5中的位置1115鉴定了一个SNP，并且它构成了EF1-α基因的CMV易感野生型中的胞嘧啶(C)和CMV抗性修饰的EF1-α基因中的鸟嘌呤(G)。本发明的SNP的位置位于翻译延伸因子1(TEF-1)蛋白结构域家族中。延伸因子1在蛋白质合成中发挥作用，并作为宿主因子与潜在的病原体相互作用。
修饰的EF1-α基因包含SEQ ID NO：7。野生型EF1-α基因核苷酸序列SEQ ID NO：5的修饰导致SEQ ID NO：6的野生型氨基酸序列的变化。SEQ ID NO：6的野生型氨基酸序列的修饰导致修饰的氨基酸序列SEQ ID NO：8，均显示在图2中。
在核苷酸序列SEQ ID NO：5的位置1115上的修饰导致在SEQ ID NO：6的野生型氨基酸序列的位置372上的氨基酸丙氨酸(A)被替换为氨基酸甘氨酸(G)，如在SEQ ID NO：8所示的修饰的氨基酸序列中。
本发明提供了一种修饰的EF1-α基因，其编码赋予葫芦科植物特别是黄瓜植物对CMV的抗性的蛋白质，其中所述蛋白质在所述葫芦科植物特别是黄瓜植物中表达，其特征在于所述基因包含选自以下的核苷酸序列：
a)编码包含SEQ ID NO：8的蛋白质的核苷酸序列；
b)包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列；
c)编码通过包含SEQ ID NO：8的蛋白质的一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加而衍生的蛋白质的核苷酸序列，
d)编码包含与SEQ ID NO：8至少95％相同的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
e)与SEQ ID NO：7至少95％相同的核苷酸序列；
f)根据c)或d)的核苷酸序列，其中蛋白质在SEQ ID NO：8的位置372或与其对应的位置上包含甘氨酸(G)。
当纯合地存在于葫芦科植物，特别是黄瓜植物中时，所述修饰的EF1-α基因赋予CMV抗性。如本文所用，修饰的EF1-α基因是指与EF1-α基因的野生型核苷酸序列相比EF1-α基因的修饰的核苷酸序列。改变或修饰可以是任何改变或修饰，包括但不限于核苷酸取代。EF1-α基因的野生型核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，EF1-α基因的修饰的核苷酸序列如SEQID NO：7所示，参见图2。
如本文所用，EF1-α基因是编码EF1-α蛋白的基因。如本文所用，EF1-α基因是包含由SEQ ID NO：5表示的野生型编码序列的基因，或包含与SEQ ID NO：5具有至少95％序列同一性的序列的同源基因，或编码包含SEQ ID NO：6的EF1-α蛋白的基因，或编码包含与SEQID NO：6具有至少95％序列同一性的序列的同源EF1-α蛋白的基因。
同源EF1-α基因包含与SEQ ID NO：5具有至少95％序列同一性(优选96％、97％、98％或99％)的序列。同源EF1-α蛋白包含与SEQ ID NO：6具有至少95％序列同一性(优选96％、97％、98％或99％)的序列。
本发明还涉及一种蛋白质，其赋予葫芦科植物特别是黄瓜植物对CMV的抗性，其中所述蛋白质在所述葫芦科植物特别是黄瓜植物中表达并且所述蛋白质由所述的修饰的EF1-a基因编码。
本发明的EF1-α蛋白不包含以下一种或多种：位置259的异亮氨酸、位置293的缬氨酸、位置405的丝氨酸。编码该蛋白质的核苷酸序列不具有编码该蛋白质的位置259的异亮氨酸、位置293的缬氨酸、位置405的丝氨酸的密码子。
本发明还涉及一种葫芦科植物，特别是黄瓜植物或其部分，其包含如本申请中所述的修饰的ABCB9基因。
本发明的植物是葫芦科植物，特别是黄瓜植物(Cucumis sativus)，最优选农艺上优良的黄瓜植物。
在本发明的上下文中，农艺上优良的植物是具有(作为通过人为干预的定向杂交和选择的结果)包括可区分的和期望的农艺性状的积累的基因型的植物，这使得产生者能够收获具有商业化意义的产品。
本发明的植物可以是近交系、杂种、双单倍体的植物或分离群体的植物。如本文所用，近交系的植物是作为三轮或多轮自交或回交的结果的植物群体中的植物；或者该植物是双单倍体。例如，近交系可以是用于产生商业杂种的亲本系。
本发明的植物，葫芦科植物，特别是黄瓜植物，优选地纯合地包含修饰的ABCB9基因。当植物纯合地包含修饰的ABCB9基因时，它表现出对CMV的抗性。当本发明的植物杂合地包含修饰的ABCB9基因时，它可以杂交或自交以产生纯合地包含修饰的ABCB9基因并显示出对CMV的抗性的植物。
本发明还涉及葫芦科植物，特别是黄瓜植物，或其部分，其包含如本文所述的修饰的EF1-α基因。
本发明还提供一种葫芦科植物，特别是黄瓜植物，或其一部分，其包含修饰的ABCB9基因和修饰的EF1-α基因。只要其纯合地存在于基因组中，本发明的每个修饰的基因独自地产生对CMV的抗性。然而，与仅纯合地包含所述修饰的基因之一的植物相比，纯合地包含本发明的两种修饰的基因的植物显示出对CMV的更高抗性。这在实施例1中进行了说明。
如本文所用，对CMV的抗性定义为对黄瓜花叶病病毒(也缩写为CMV)的抗性。如本文所用，CMV抗性的存在可以通过进行生物测定来确定。
对于生物测定，播种黄瓜种子并在发芽后使幼苗在温室中生长6天。播种后第7天，对于每个品系接种至少20株个体植物。播种后第9天，重复接种。就在接种前，用金刚砂粉撒在植物上。制备接种物，将感染CMV的新鲜叶子研磨并悬浮在磷酸盐缓冲液中，使用每克植物材料3ml缓冲液的比例。在制备接种物期间，缓冲液和接种物正在冷却。
接种本身是通过用浸入由受感染的植物材料制成的悬浮液中的海绵擦拭叶子来完成的。接种后立即用大量水冲洗植物。使用的测试CMV分离物被称为CU-CMV-UK6，并且可从Wageningen的PRI-WUR获得。
根据表2中所示的等级1至6评估植物的CMV感染症状，第一次是在播种后第21天，第二次是在播种后第28天。评估每株个体植物的第二片叶子的症状。对于每个组/品系，收集所有个体植物的评分并取平均值。
生物测定的更多细节可以在实施例1中找到。作为所述的生物测定中的CMV易感对照，使用Ventura RZ品种的植物。在表2中描述了对于CMV抗性的每个评分或等级，植物叶片应表现出哪些表型症状才能获得这样的评分。表2中给出的CMV抗性评分范围为1到6，低分表示对CMV的抗性，高分表示对CMV的易感性。具有低于3.0的CMV抗性评分的黄瓜植物被定义为对CMV具有抗性，3或更高的CMV抗性评分被定义为易感。
纯合地包含野生型ABCB9基因和野生型EF1-α基因的黄瓜植物显示3.0或更高的平均CMV抗性评分。纯合地包含修饰的EF1-α基因的黄瓜植物显示低于3.0，优选低于2.5的平均CMV抗性评分，纯合地包含修饰的ABCB9基因的黄瓜植物显示低于2.5，优选低于2.0的平均CMV抗性评分。如果修饰的基因ABCB9和EF1-α均纯合存在，则平均CMV抗性评分低于2.0，优选低于1.5。结果如表3所示。
正如不同研究表明的那样，在一种作物中使用两种或更多种抗性基因来管理植物病害(也称为“基因堆叠”)通常比仅使用一种抗性基因或使用两种单基因抗性品种更持久。
本发明的植物优选是纯合地包含修饰的ABCB9基因和任选纯合地包含修饰的EF1-α基因的植物，其中黄瓜植物对CMV具有抗性。
本发明还涉及葫芦科植物的一部分，优选黄瓜植物的一部分，该植物部分包含本发明的修饰的ABCB9基因，和任选本发明的修饰的EF1-α基因。优选地，植物部分纯合地包含修饰的ABCB9基因并且任选纯合地包含修饰的EF1-α基因，其中可以从植物部分生长的黄瓜植物对CMV具有抗性。
本发明还涉及包含本发明的修饰的ABCB9基因和/或本发明的修饰的EF1-α基因的黄瓜种子，优选纯合地包含所述一种或多种修饰的基因的种子。如本文所述的种子也称为“本发明的种子”。从该种子生长的黄瓜植物包含本发明的修饰的ABCB9基因和/或修饰的EF1-α基因，因此是本发明的植物。
本发明还涵盖由本发明的植物产生的种子。这些种子包含修饰的ABCB9基因和/或修饰的EF1-α基因，因此从所述种子生长的植物是本发明的植物。如果从本发明的种子生长的本发明的植物纯合地包含修饰的ABCB9基因和/或纯合地包含修饰的EF1-α基因，则该植物将显示出对CMV的抗性。
本发明还涉及衍生自本发明的植物、植物材料或种子并且包含本发明的修饰的ABCB9基因和/或修饰的EF1-α基因的繁殖材料。繁殖材料选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚、胚囊、卵细胞、插条、根、下胚轴、子叶、茎、叶、花、花药、种子、分生细胞、原生质体或其细胞或组织培养物。繁殖材料可以杂合或纯合地包含修饰的ABCB9基因和/或修饰的EF1-α基因。
本发明还涉及本发明的植物的细胞。所述细胞可以是处于分离状态的细胞或作为完整植物或其植物部分的一部分的细胞。本发明的植物的细胞包含遗传信息，其在本发明中是如本文定义的当纯合地存在于细胞的基因组中时导致本发明的植物中的CMV抗性的修饰的ABCB9基因和/或修饰的EF1-α基因的存在。本发明的细胞也可以是可以再生为本发明的新植物的细胞。
本发明进一步涉及本发明的植物的植物组织，其包含如本文所述的本发明的修饰的ABCB9和/或修饰的EF1-α基因。组织可以是未分化的组织或已经分化的组织。未分化的组织可以是例如茎尖、花药、花瓣或花粉，并且可以用于微体繁殖以获得生长成本发明的新植物的新苗木。该组织也可以从本发明的细胞生长。
黄瓜植物作为作物的用途被认为是本发明的一部分，该黄瓜植物包含本发明的修饰的ABCB9基因和/或修饰的EF1-α基因(优选纯合地)。
此外，包含本发明的修饰的ABCB9基因和/或修饰的EF1-α基因(优选纯合地)的黄瓜植物作为种子来源或作为繁殖材料来源的用途被认为是本发明的一部分。
本发明还涉及黄瓜果实用于消费的用途，该黄瓜果实包含本发明的修饰的ABCB9基因和/或修饰的EF1-α基因(优选纯合地)。
包含具有本发明的修饰的ABCB9基因和/或修饰的EF1-α基因的黄瓜果实或其部分的食品或加工食品也被认为是本发明的一部分。食品可能已经经历了一个或多个加工步骤。这样的加工步骤可以包括但不限于任何以下处理或其任何组合：去皮、切割、洗涤、榨汁、烹饪、冷却。可以获得的加工形式也是本发明的一部分。
本发明还提供了一种用于鉴定包含修饰的ABCB9基因的黄瓜植物的标记物，其中该标记物检测与SEQ ID NO：1的野生型ABCB9基因核苷酸序列相比在位置1282上的修饰的核苷酸。优选地，本发明的标记物检测SEQ ID NO：3的位置1282上的腺嘌呤(A)。最优选本发明的标记物包含SEQ ID NO：11，如表1所示。
表1.ABCB9基因和EF1-α基因的标记物的序列。
本发明还提供了一种用于鉴定包含修饰的EF1-α基因的黄瓜植物的标记物，其中该标记物检测与SEQ ID NO：5的野生型EF1-α基因核苷酸序列相比在位置1115上的修饰的核苷酸。优选地，用于鉴定包含修饰的EF1-α基因的植物的标记物检测SEQ ID NO：7的位置1115上的鸟嘌呤(G)。最优选地，标记物包含SEQ ID NO：12，如表1所示。
如本文所述的修饰的ABCB9基因和/或修饰的EF1-α基因的标记物用于鉴定对CMV具有抗性的植物的用途也是本发明的一部分。
本发明还涉及通过将修饰的ABCB9基因和任选地将修饰的EF1-α基因引入植物基因组中来产生CMV抗性植物的方法。引入(修饰的)基因可以通过基因渗入、化学或物理诱导的诱变以及所谓的基因编辑方法来完成。
ABCB9基因和/或修饰的EF1-α基因的修饰或突变可以通过一种或多种化合物(例如甲磺酸乙酯(EMS)、亚硝基甲基脲、羟胺、原黄素、N-甲基-N-亚硝基胍、N-乙基-N-亚硝基脲、N-甲基-N-硝基-亚硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亚胺、叠氮化钠、福尔马林、氨基甲酸乙酯、苯酚和环氧乙烷)和/或通过物理手段例如紫外线照射，快速中子暴露、X射线、γ辐射和/或通过插入遗传元件例如转座子、T-DNA、逆转录病毒元件随机引入。
ABCB9基因和/或修饰的EF1-α基因的修饰也可以通过更特异性的靶向方法(例如同源重组、基于寡核苷酸的突变引入、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或成簇的规则间隔短回文重复(CRISPR)系统)引入。
可以在需要CMV抗性的感兴趣的植物的种子中引入修饰。通过诱变(例如EMS处理)、通过辐射或通过特异性的靶向方法(例如CRISPR)引入修饰。本领域技术人员熟悉用于将修饰引入植物基因组的这些方法。使诱变的种子发芽，将所得的植物自交或杂交以产生M2种子。
随后，基于与该植物物种的ABCB9基因和/或EF1-α基因的野生型序列的比较，进行植物筛选以鉴定ABCB9和/或EF1-α基因中的修饰。
例如，对于黄瓜，可以对ABCB9基因与SEQ ID NO：1进行比较，对EF1-α基因与SEQID NO：5进行比较。此外，应检查在核苷酸中发现的突变是否会导致核苷酸编码的氨基酸发生变化。本领域技术人员熟悉鉴定特定基因的突变的TILLING((McCallum等人(2000)Nature Biotechnology,18:455-457)，以及鉴定核苷酸变化的技术，例如DNA测序等。具有修饰的ABCB9和/或EF1-α基因的植物是纯合的或通过自交、杂交或使用本领域技术人员熟悉的双单倍体技术制成纯合的。
然后可以针对表达对CMV的抗性测试基于ABCB9和/或EF1-α基因的修饰鉴定和选择的植物。因此，可以确认以这种方式产生、鉴定和选择的植物由于ABCB9和/或EF1-α基因中的一种或多种修饰而具有其病毒抗性。
此外，本发明涉及选择CMV抗性植物的方法，其包括：
a)鉴定修饰的ABCB9基因的存在和/或修饰的EF-1α基因的存在，
b)选择包含至少一种所述修饰的基因的植物，
c)任选地测试所选植物的CMV抗性，
d)如果该植物表现出CMV抗性，则选择该植物作为CMV抗性植物。
修饰的ABCB9基因的存在和/或修饰的EF1-α基因的存在的鉴定通过使用如本文定义的一种或多种本发明的标记物来进行。
本发明还包括产生包含本发明的修饰的ABCB9基因的植物的方法，所述方法包括：
a)将包含修饰的ABCB9基因的第一亲本植物与第二亲本植物杂交以获得F1群体，
b)任选地进行一轮或多轮自交和/或与来自所述F1群体的植物的杂交以获得更远世代的群体，
c)选择包含修饰的ABCB9基因的植物。
产生包含修饰的ABCB9基因的植物的方法还可以包括以下步骤：
d)测试所选植物的CMV抗性；
e)如果植物是CMV抗性的，则选择所述植物。
如在产生包含如本文所述的修饰的ABCB9基因的植物的方法的步骤a)中所述的第二亲本植物也可以包含修饰的ABCB9基因。
本发明还涉及产生包含本发明的修饰的EF1-α基因的植物的方法，所述方法包括：
a)将包含本发明的修饰的EF1-α基因的第一亲本植物与第二亲本植物杂交以获得F1群体，
b)任选地进行一轮或多轮自交和/或与来自所述F1群体的植物的杂交以获得更远世代的群体，
c)选择包含修饰的EF1-α基因的植物。
产生包含本发明的修饰的EF1-α基因的植物的方法还可以进一步包括以下步骤：
d)测试所选植物的CMV抗性；
e)如果植物是CMV抗性的，则选择所述植物。
如在产生包含如本文所述的修饰的EF1-α基因的植物的方法的步骤a)中所述的第二亲本植物也可以包含修饰的EF1-α基因。
本发明还涵盖了产生包含如本文所述的本发明的修饰的ABCB9基因的植物的方法，其中第一和/或第二亲本植物也包含本发明的修饰的EF1-α基因。
本发明还涉及用于选择包含本发明的修饰的ABCB9基因的植物的方法，所述方法包括：
a)测定植物核酸中本发明的修饰的ABCB9基因的存在，
b)鉴定包含修饰的ABCB9基因的植物，并选择所述植物。
选择包含本发明的修饰的ABCB9基因的植物的方法还可以进一步包括：
c)测试所选植物的CMV抗性，
d)如果植物显示CMV抗性，则选择所述植物。
如本文所用，测定植物的核酸包括从植物分离核酸并用选择的方法分析分离的样品以检测感兴趣的修饰的基因。该方法可以选自本领域熟知的一组方法，例如PCR、RT-PCR、抗体测定、测序测定、基因分型测定或这些方法的任何组合。
本发明还涉及用于选择包含本发明的修饰的EF1-α基因的植物的方法，所述方法包括：
a)测定植物核酸中本发明的修饰的EF1-α基因的存在，
b)鉴定包含修饰的EF1-α基因的植物，并选择所述植物。
选择包含本发明的修饰的EF1-α基因的植物的方法还可以进一步包括：
c)测试所选植物的CMV抗性，
d)如果植物显示CMV抗性，则选择所述植物。
本发明将在以下实施例中进一步说明，这些实施例仅用于说明目的。这些实施例不旨在以任何方式限制本发明。在此参考以下附图。
附图说明
图1：ABCB9基因的核苷酸序列、ABCB9基因编码的蛋白质序列、野生型和修饰的形式。(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4)。
图2：EF1-α基因的核苷酸序列、EF1-α基因编码的蛋白质序列、野生型和修饰的形式。(SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：8)。
实施例
实施例1
黄瓜中CMV抗性的生物测定
针对显示对CMV的抗性在生物测定中测试了包含修饰的ABCB9基因和修饰的EF1-α基因的不同组合的几种内部黄瓜植物品系。
播种黄瓜种子，并在发芽后使幼苗在温室隔间中在24℃的连续温度下生长6天。播种后第7天，对于每个品系接种24个植物。就在接种前，用金刚砂粉撒在植物上。制备接种物，将感染CMV的新鲜叶子研磨并悬浮在磷酸盐缓冲液中，使用每克植物材料3ml缓冲液的比例。在制备接种物期间，缓冲液和接种物正在冷却。接种本身是通过用浸入由受感染的植物材料制成的悬浮液中的海绵擦拭叶子来完成的。接种后立即用大量水冲洗植物。使用的测试CMV分离物被称为CU-CMV-UK6，可从Wageningen的PRI-WUR获得。播种后第9天，重复接种。接种后，植物在18℃/20℃(夜间/白天)的温度条件下生长。在播种后第21天评估每个品系的一半植物的CMV感染症状，并在播种后第28天评估另一半植物。如表2所示，根据等级1至6对植物表现出CMV感染症状进行评分。对于每个品系，通过评估第二片叶子的症状对24株个体植物进行评分。收集每行的所有评分并取平均值。
表2.CMV抗性等级和相关对照的评分。较低的CMV抗性评分意味着对CMV的抗性更强。
对CMV抗性的生物测定的结果示于表3。示出了不同组的黄瓜植物的结果。
表3.平均CMV评分和EF1-α基因和ABCB9基因SNP的存在。注意，较低的CMV抗性评分意味着对CMV的抗性更强，还参见表2中对CMV抗性等级的评分的描述。
实施例2
黄瓜中ABCB9基因修饰的鉴定
在调查CMV抗性的遗传原因的研究中，开发了内部黄瓜杂交群体。对这个杂交群体进行的分析揭示了导致CMV抗性的在6号染色体上QTL的存在。使用F3群体和其他标记物的精细定位将QTL缩小到更小的区域。
在这个大约71Kb的较小区域中，发现了在2个亲本品系之间具有多态性的12个突变。在这12个突变中，只有2个被发现位于基因内并影响基因功能。突变中的一个不能预测CMV抗性的存在。另一个突变位于ABCB9基因中，并导致编码的蛋白质的氨基酸变化。该突变是SNP并且在野生型ABCB9基因核苷酸序列SEQ ID NO：1中的位置1282被鉴定并且构成了ABCB9基因的CMV易感野生型中的鸟嘌呤(G)和CMV抗性修饰的ABCB9基因中的腺嘌呤(A)。该突变导致在SEQ ID NO：2的氨基酸序列的位置428上氨基酸缬氨酸(V)被氨基酸甲硫氨酸(M)取代。SNP的位置位于所谓的MdlB结构域中。对于具有不同CMV抗性评分的各种品系，ABCB9基因的基因组序列可在内部获得并进行比较。序列比较表明，在表现出对CMV的抗性的所有测试的黄瓜品系中，都存在ABCB9中的特异性突变。
图1显示了ABCB9基因的编码序列和伴随的蛋白质序列，包括CMV易感野生型和CMV抗性修饰的形式。
实施例3
黄瓜中EF1-α基因修饰的鉴定
在与实施例1所述相同的研究中，发现了2号染色体上的另一个QTL，其赋予了对CMV的抗性。对杂交群体进行的分析揭示了导致CMV抗性的在2号染色体上QTL的存在。使用F3群体和其他标记物的精细定位将QTL缩小到更小的区域。在大约41Kb的较小区域中，发现了5个突变，其中一个位于基因中并与CMV抗性相关。
延伸因子1-α(EF1-α)基因中的这种突变导致氨基酸变化。该突变被鉴定为野生型EF1-α基因核苷酸序列SEQ ID NO：5中位置1115的SNP并且构成了EF1-α基因的CMV易感野生型中的胞嘧啶(C)和CMV抗性修饰的EF1-α基因中鸟嘌呤(G)。该突变导致在SEQ ID NO：5的位置372上氨基酸丙氨酸(A)被氨基酸甘氨酸(G)取代。本发明的SNP的位置位于翻译延伸因子1(TEF-1)蛋白结构域家族中。对于具有不同CMV抗性评分的各种品系，基因组序列可在内部获得并进行比较。序列比较表明，在表现出对CMV的抗性的所有测试的黄瓜品系中，都存在EF1-α中的特异性突变。图2显示了EF1-α基因的编码序列和伴随的蛋白质序列，包括野生型和修饰的形式。

Claims (13)

1.一种修饰的ABCB9基因，其编码赋予黄瓜植物对CMV的抗性的蛋白质，其中所述蛋白质在所述黄瓜植物中表达，其特征在于所述基因选自以下的核苷酸序列：
a)编码SEQ ID NO：4的蛋白质的核苷酸序列；
b)SEQ ID NO：3的编码序列。
2.一种蛋白质，其赋予黄瓜植物对CMV的抗性，其中所述蛋白质在所述黄瓜植物中表达并且所述蛋白质由如权利要求1所述的基因编码。
3.一种用于鉴定包含修饰的ABCB9基因的黄瓜植物的标记物，其中所述标记物检测SEQID NO：3的位置1282上的腺嘌呤(A)，并且其中所述标记物包含SEQ ID NO：11。
4.如权利要求3所述的标记物用于鉴定包含修饰的ABCB9基因的黄瓜植物的用途。
5.如权利要求3所述的标记物用于鉴定对CMV具有抗性的植物的用途。
6.一种通过将如权利要求1所述的修饰的ABCB9基因引入植物基因组来产生CMV抗性植物的方法。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述植物纯合地包含修饰的ABCB9基因。
8.一种选择CMV抗性植物的方法，其包括：
a)鉴定如权利要求1所述的修饰的ABCB9基因的存在，
b)选择包含所述修饰的基因的植物；
c)任选地测试所选植物的CMV抗性，和
d)如果植物表现出CMV抗性，则选择所述植物作为CMV抗性植物。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述鉴定是通过使用如权利要求3所定义的标记物来执行的。
10.一种产生包含如权利要求1所述的修饰的ABCB9基因的植物的方法，所述方法包括：
a)将包含如权利要求1所述的修饰的ABCB9基因的第一亲本植物与第二亲本植物杂交以获得F1群体，
b)任选地进行一轮或多轮自交和/或与来自所述F1群体的植物的杂交以获得更远世代的群体，
c)选择包含修饰的ABCB9基因的植物。
11.如权利要求10所述的方法，其还包括以下步骤：
d)测试所选植物的CMV抗性；
e)如果植物是CMV抗性的，则选择所述植物。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述第二亲本植物还包含如权利要求1所述的修饰的ABCB9基因。
13.一种选择包含如权利要求1所述的修饰的ABCB9基因的植物的方法，所述方法包括：
a)测定植物核酸中如权利要求1所述的修饰的ABCB9基因的存在；
b)鉴定包含修饰的ABCB9基因的植物，并选择所述植物。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230404003A1 (en) * 2022-06-21 2023-12-21 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Novel qtls conferring resistance to cucumber mosaic virus

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1128048A (zh) * 1993-06-04 1996-07-31 山道士有限公司 抗病毒植物
WO2014031770A2 (en) * 2012-08-23 2014-02-27 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Multiple-virus-resistant melon
CN106232819A (zh) * 2014-04-04 2016-12-14 瑞克斯旺种苗集团公司 赋予病毒抗性的修饰的基因

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR122020015325B1 (pt) * 2012-12-25 2022-05-24 Evogene Ltd Métodos para aumentar a eficiência do uso de nitrogênio, rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, capacidade fotossintética e / ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, para produzir uma cultura, e, para selecionar uma planta transformada

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1128048A (zh) * 1993-06-04 1996-07-31 山道士有限公司 抗病毒植物
WO2014031770A2 (en) * 2012-08-23 2014-02-27 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Multiple-virus-resistant melon
CN106232819A (zh) * 2014-04-04 2016-12-14 瑞克斯旺种苗集团公司 赋予病毒抗性的修饰的基因

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Slavomíra Nováková, et al..Cucumber mosaic virus resistance: Comparative proteomics of contrasting Cucumis sativus cultivars after long-term infection.J Proteomics.2019,第214卷103626. *
无.Genbank accession number：XP_004134559.1.Genbank.2019,1. *
无.Genbank accession number:XP_008457229.Genbank.2016,1. *
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