CN113186200B

CN113186200B - 一对控制西瓜卷须有无和侧枝多少的基因ClTFL/Cltfl1及用途

Info

Publication number: CN113186200B
Application number: CN202110640806.7A
Authority: CN
Inventors: 杨路明; 豆峻岭; 杨森; 朱华玉
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2021-06-07
Filing date: 2021-06-07
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2041-06-07
Also published as: CN113186200A

Abstract

本发明公开了一对控制西瓜卷须有无和侧枝多少的基因ClTFL1/Cltfl1及用途，控制西瓜无卷须、少侧枝性状的基因Cltfl1，该基因全长1365bp，在无卷须、少侧枝西瓜材料中为隐性纯合，具体碱基序列SEQ ID NO.1所示；控制西瓜有卷须、多侧枝性状的基因ClTFL1，该基因全长1365bp，在有卷须、多侧枝西瓜材料中为显性纯合或杂合，具体碱基序列SEQ ID NO.3所示。本发明为研究西瓜卷须和侧枝形成的分子机制、西瓜侧枝多少表型的分子鉴定和分子标记辅助育种及培育适合轻简化和机械化栽培的少侧枝新品种提供扎实的基础。对于通过转基因和基因编辑技术，为今后获得无卷须、少侧枝西瓜品种选育具有十分重要的意义。

Description

一对控制西瓜卷须有无和侧枝多少的基因ClTFL/Cltfl1及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一对控制西瓜卷须有无和侧枝多少的基因ClTFL/Cltfl1及其用途。

背景技术

西瓜(Citrullus lanatus)属于葫芦科(Cucurbitaceae)西瓜属，是一种世界性的园艺作物，栽培历史悠久。中国是世界西瓜生产和消费第一大国，在世界西瓜生产中中国占主导地位。据FAO(2019)(http：//www.fao.org/faostat/zh/#home)联合国粮食和农业组织数据显示，中国的西瓜产量在最近十年已经达到的全世界西瓜产量的60％以上，已经成为了世界上最大的西瓜生产国。

近年来，随着国内设施栽培面积的逐步提高，设施栽培已经成为西瓜的一种主要栽培模式之一。卷须可以使植物获得向高处攀援的能力，是葫芦科植物特有的运动器官。但是在设施栽培条件下，西瓜主要通过人工绑蔓进行精细化管理，在这种情况下并不需要卷须的攀援能力，所以为了减少生物量的浪费，需要人工摘除卷须。此外，西瓜植株几乎每个节间都会产生侧枝，而设施栽培中通常采用单蔓或双蔓的种植模式，因此栽培过程中需要耗费大量的劳动力进行整枝打杈，不仅大大增加了人工成本，同时过多的侧枝也占据了较多的空间，降低了种植密度，不仅影响植株间的通风透光性能，而且容易造成病虫害的发生和蔓延，最终影响西瓜的产量和品质。合理的株型是培育高产品种的基础特征，株型改良是作物品种改良的一个重要途径。有卷须、多侧枝性状已经成为当前制约西瓜产业化和规模化发展的一个瓶颈，而培育无卷须、少侧枝甚至无侧枝西瓜新品种，可以增加种植密度、提高单位面积产量、降低人力成本及提高产品品质。因此，选育少侧枝西瓜新品种，探索西瓜轻简化栽培模式，必将有力的促进西瓜及其他葫芦科作物产业标准化和和规模化发展。

卷须是植株在进化过程中形成的运动器官，有关学者研究发现葡萄的花序是卷须的同源器官(Boss P K，et al..Association of dwarfism and floral induction witha grape‘green revolution’mutation.Nature，2002，416：847-850.)，豌豆的变态叶是其卷须的同源器官(Hofer J，et al.Tendrilless regulates tendril formation in pealeaves.Plant Cell，2009，21：420-428.)，南瓜茎上的侧枝或叶的变态组织可能是其卷须(吴清韩，赵庆芳，马瑞君.植物卷须形态解剖研究.广东农业科学，2011，38，11：71-72.)，黄瓜的侧枝是卷须的同源器官(Shenghao Wang，et al.A Rare SNP Identified a TCPTranscription Factor Essential for Tendril Development in Cucumber.MoleculerPlant，2015，8：1795-1808.)。

迄今为止，在水稻、玉米、高粱等单子叶植株和拟南芥、番茄、豌豆等双子叶植株上，与侧枝发育有关的基因已被克隆，关于西瓜侧枝的研究始于上世纪八十年代，我国科学家育成一个少侧枝西瓜品种‘无杈早’，该品种第三片至第五片真叶的腋芽能正常生长侧枝，第一和第二片真叶的腋芽处于隐芽状态，从第六片真叶开始，茎蔓上所有的侧枝退化，叶腋间不再生长侧枝(黎盛显.无杈短蔓有限生长新类型西瓜‘无杈早’的选育.园艺学报，1986，01：64-67.)。后续研究人员又利用60Coγ照射西瓜种子进行诱变育种，获得了一个无侧枝材料(黄学森，张学炜，焦定量，等.西瓜辐射诱变获无杈、轻抗枯萎病新种质.中国西瓜甜瓜，1995，3：10-11.)，该材料为隐性遗传，当时并未引起重视，之后关于西瓜侧枝发育的研究鲜有报道，西瓜少侧枝的基因克隆及其形成机制研究更是停滞不前。

发明人的初步研究表明，西瓜的卷须有无与侧枝多少这两个性状由同一对ClBL/Clbl基因控制(其中无卷须、少侧枝性状连锁；有卷须、多侧枝性状连锁)。我们以正常侧枝材料WT20和少侧枝材料WCZ为研究材料，通过构建六世代分离群体，明确了西瓜少侧枝性状的遗传规律，对控制西瓜卷须与侧枝发育的基因进行精细定位，最终证明了控制西瓜卷须有无和侧枝多少的基因为TERMINAL FLOWER 1基因，即ClTFL1/Cltfl1为进一步研究侧枝形成的分子机制及少侧枝品种选育奠定了坚实的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种控制西瓜卷须和侧枝多少的等位基因ClTFL/Cltfl1，为研究西瓜卷须和侧枝形成的分子机制、西瓜表型的分子鉴定、西瓜种质资源的筛选、分子标记辅助育种及培育适合轻简化和机械化栽培的品种提供扎实的基础。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一个控制西瓜无卷须和/或少侧枝性状的基因Cltfl1，该基因在无卷须、少侧枝材料中表现为隐性纯合(Cltfl1/Cltfl1)，抑制西瓜卷须和六节以上侧枝的形成，该基因全长1365bp，具体碱基序列SEQ ID NO.1所示。

上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述的序列由174个氨基酸残基组成。

含有上述基因的表达盒、转基因细胞系、重组菌、重组病毒、重组载体、表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞及其构建方法也落入本发明的保护范围之内。

所述重组表达载体具体可为在载体pCAMBIA3301的多克隆位点插入GmPCBER4基因得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为将载体pCAMBIA3301的BamH I和Xba I两个酶切位点之间的小片段取代为GmPCBER4基因得到的重组质粒。

一个控制西瓜有卷须、多侧枝性状的基因ClTFL1，该基因在有卷须、多侧枝材料中表现为显性纯合(ClTFL1/ClTFL1)或杂合(ClTFL1L/Cltfl1)，含有该基因的西瓜其卷须和侧枝发育正常，该基因全长1365bp，具体碱基序列SEQ ID NO.3所示。

上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。所述的序列由174个氨基酸残基组成。

需要说明的是，本申请中，无卷须、少侧枝基因Cltfl1与有卷须、多侧枝基因ClTFL1基因为等位基因，其中基因ClTFL1为显性，即含有该基因的西瓜植株表型为有卷须、多侧枝(基因型为ClTFL1/ClTFL1或ClTFL1/Cltfl1)；基因Cltfl1为隐性控制，即该基因的纯合西瓜植株表型为无卷须、少侧枝(基因型为Cltfl1/Cltfl1)。

基因Cltfl1在培育无卷须和/或少侧枝性状的植物中的用途以及抑制基因ClTFL1的功能、水平表达、活性或其组合在培育无卷须和/或少侧枝性状的植物中的用途。其中，抑制基因ClTFL1的功能、水平表达、活性可以通过敲除或敲低所述基因来实现。

本发明还公开了一种培育转基因植物的方法，破坏基因ClTFL1得到转基因植物，所述转基因植物满足如下(1)～(3)中的至少一种表型：

(1)无卷须；

(2)少卷须；

(3)少侧枝；

或将基因ClTFL1导入目的植物，所述基因植物满足如下(1)～(2)中的至少一种表型：

(1)侧枝数量增多；

(2)株高增加。

具体地，本发明破坏基因ClTFL1的具体方式为将所述基因ClTFL1的第983位碱基T用C取代，将所述基因的第1334位碱基C用A取代。

具体地，ClTFL1基因可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

具体地，为了提高植物的优良性状，本发明还保护一种新的植物育种方法，包括如下步骤(1)和/或(2)：

(1)通过增加目的植物中Cltfl1蛋白的活性，获得株型优良的目的植物，株型优良包括无卷须和/或少侧枝性状；

(2)通过促进目的植物中Cltfl1基因的表达，获得具有如下性状的植物：无卷须和/或少侧枝性状；

“促进目的植物中Cltfl1基因的表达″的实现方式可为如”下(1)或(2)或(3)：

(1)将Cltfl1基因导入目的植物；

(2)引入强启动子和/或增强子；

(3)本领域内的其它常见方法。

或者是破坏其等位基因ClTFL1来获取无卷须和/或少侧枝性状。

所述破坏基因ClTFL1包括破坏所述基因的功能、水平表达、活性或其组合，具体地可以采用基因编辑的方法来操作，更加具体地可以通过敲除或敲低所述基因来实现。

本发明具有如下优点：

本申请以西瓜无卷须、少侧枝材料WCZ和有卷须、多侧枝材料WT20为种质材料基础，首次对西瓜无卷须、少侧枝性状相关基因进行了精细定位，有利于从分子机制上阐明Cltfl1基因在植物株型培育(无卷须、少侧枝)作用，为植物分子育种提供理论基础和基因资源。

本发明提供了控制西瓜无卷须和少侧枝性状的基因Cltfl1，该基因是控制西瓜有卷须和多侧枝性状的基因ClTFL1的等位基因，为研究西瓜卷须和侧枝形成的分子机制、西瓜表型的分子鉴定、西瓜种质资源的筛选、分子标记辅助育种及培育适合轻简化和机械化栽培的品种提供扎实的基础。通过转基因技术，为今后获得无卷须、少侧枝的目的植物具有十分重要的意义。

对于一些需要无卷须和少侧枝性状的植物培育，可以通过破坏有卷须和多侧枝性状的基因ClTFL1或同源基因的方式，可以采用基因编辑的方法来操作，更加具体地可以通过敲除或敲低所述基因来实现，对于植物育种具有重大的应用价值。

附图说明

图1是有卷须、多侧枝材料WT20和无卷须、少侧枝材料WCZ实物图对比；

图2是西瓜无卷须、少侧枝基因Clbl精细定位的流程图；其中Clbl代表西瓜无卷须、少侧枝基因；

图3是WT20和WCZ不同组织部位荧光定量分析；

图4是Clbl在两亲本不同组织间的表达量分析；

图5是ClTFL1基因的拟南芥异源转化；

图中，a为拟南芥tfl1突变体与ClTFL1基因转化入拟南芥tfl1突变体中的表型比较；b为拟南芥野生型Col与ClTFL1基因转化入拟南芥野生型Col中的表型比较；c为平均侧枝数量统计；d为平均株高统计。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、系统发育树的构建、多态性分析等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

一、生物材料：

无卷须、少侧枝西瓜材料WCZ表型性状：主蔓较短、粗壮、叶片肥大、主蔓长弯曲、5片真叶以后侧蔓及卷须退化、生长后期生长点“自封顶”。有卷须、多侧枝正常西瓜材料WT20，表型性状：主蔓每一节间均分布有侧枝、生长正常、无“自封顶”现象(图1)。

上述无卷须、少侧枝西瓜材料WCZ与公开号为CN110938706A的中国发明专利“与西瓜植株无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记及应用”中采用的西瓜植株无卷须材料“无杈早”是一致的。

实验过程中，西瓜亲本及群体种植与河南农业大学毛庄科教园区日光温室内，种植过程中，催芽后进行穴盘育苗，采用正常的西瓜栽培管理方式，定植后15天、30天和45天对卷须及侧枝分布情况等表型性状进行调查统计。

二、实验试剂：

实验过程中，PCR扩增用PCR MagicMix 3.0购于北京天恩泽基因科技有限公司；其他电泳与银染相关试剂如丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、AgNO₃、NaOH和甲醛试剂购于北京索莱宝科技有限公司；PCR扩增引物及基因组测序工作，由北京诺赛基因组研究中心有限公司提供完成。

三、实验设备：

PCR仪为珠海黑马医学仪器有限公司HEMA9600基因扩增仪；电泳仪为JY300HC通用型电泳仪，由北京君意东方电泳设备有限责任公司生产；电泳槽为HT-SCZ04高通量垂直电泳槽，由北京鸿涛基业科技发展有限责任生产。

实施例1

本申请中对于西瓜卷须有无、侧枝多少基因的分析过程，包括遗传分离群体的构建、初步定位、精细定位等过程，定位结果如图2所示，相关实验过程简要介绍如下：

一、遗传分离群体的构建

以西瓜无卷须、少侧枝材料WCZ作母本，以有卷须、多侧枝材料WT20作父本(需要解释的是，实验期间，从材料易得性及操作方便考虑，发明人以WT20作父本，如果采用其他纯合有卷须、多侧枝材料时(比如采用“与西瓜植株无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记及应用”公开的WT2)，同样可以进行相关实验，并且结果不受材料本身的限制)，利用这两个亲本配置杂交组合，结果表明，获得的F₁代植株全部表现为有卷须、多侧枝。

从F₁代植株中选择10个单株，自交获得F₂代种子。然后随机选取1406粒F₂代种子，用于遗传分析及基因定位。对F₂代个体卷须有无、侧枝多少表现性状进行鉴定，并用卡方检测进行验证。结果表明：在1406株F₂代群体中，无卷须、少侧枝单株359个，有卷须、多侧枝单株1047个，χ² _C＝0.16(χ² _0.05＝3.84)，符合3∶1的分离比。这一结果表明，西瓜无卷须、少侧枝性状由一对隐性单基因控制，将该基因命名为Clbl，有卷须、多侧枝(ClBL)对无卷须、少侧枝(Clbl)为完全显性。

二、采用BSA法进行基因的初步定位

(1)首先制备基因池，具体为：

在上述步骤(一)的F₂群体中随机选取20个无卷须、少侧枝单株与20个有卷须、多侧枝单株，在三叶一心时期采取每个单株的幼嫩叶片，利用CTAB法提取基因组DNA，分别制成无卷须、少侧枝基因池和有卷须、多侧枝基因池(无卷须、少侧枝单株混合，有卷须、多侧枝单株混合)

(2)多态性筛选分析，具体为：

根据本实验室前期从西瓜全基因组开发出的960对SSR标记，对步骤(1)中所制备两个基因池进行多态性筛选，将在两个基因池中获得的不同带型的标记称为多态性标记。

进一步，将筛选出的多态性SSR标记对518株F₂群体(步骤一中初步定位时所选择)进行基因型分析，将所获得的与无卷须、少侧枝亲本相同带型的记作2，与有卷须、多侧枝亲本带型相同的记作1，杂合带型的记作3。

多态性筛选分析过程中，PCR扩增时，10μL扩增体系设计如表1：

表1 10μL扩增体系

扩增程序为：94℃、5min；94℃、30s，55℃30s，72℃、30s，35个循环；72℃、5min。

需要解释的是，上述960对SSR引物与本申请保护主体并不直接关联，为简明起见，不再详细说明。

对PCR扩增产物进行8％非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳检测时，聚丙烯酰胺电泳缓冲液为0.6×TBE，200V恒压电泳1～1.5h。电泳结束后进行银染，以便观察和检测，银染方法为：

A、将带胶的玻璃板放入固定液中，在摇床上轻轻摇动直至指示剂退去颜色，其中固定液的组成为，冰醋酸∶无水乙醇∶蒸馏水的体积比为0.5∶10∶100；

B、用超纯水洗1～3min；

C、将冲洗后的胶板放入染色液中摇动10min，染色液为0.2％硝酸银水溶液；

D、将染色后的胶板放入超纯水中漂洗30s，放入装有显影液的塑料盒中，轻轻摇动直至条带清晰呈现，显影液是在1L蒸馏水中加入15g NaOH和3mL甲醛混匀得到的；

E、最后放入自来水反复漂洗几次；

F、室温下干燥，然后拍照。

(3)基因初步定位，具体为：结合初步定位群体表型调查数据和步骤(2)中最终SSR标记的分型结果，利用JoinMap 4.0软件，对控制西瓜无卷须、少侧枝性状的基因进行定位，最终将Clbl基因定位在CLSSR11306和CLSSR11289之间(相关编码为研究过程中发明人自行编码，并不具有特殊含义)，这两个标记分别与Clbl基因相距0.7cM和0.1cM(如图2B所示)。

三、Clbl基因的精细定位

在步骤二初步定位的基础上，发明人进一步对西瓜无卷须、少侧枝基因Clbl进行了精细定位，具体过程简要介绍如下：

(1)作图群体的扩大：在初步定位的基础上，我们进一步将F₂作图群体增加到1406株，然后选择CLSSR11280、CLSSR11280、CLSSR11289、CLSSR11306、CLSSR11314、CLSSR11323这六个标记进行基因型分析，确定目的基因是定位在CLSSR11306和CLSSR11289之间，遗传距离分别与Clbl基因相距1.1cM和0.3cM(如图2C所示)，一共筛选到37个重组单株。

(2)亲本重测序和基因型比对

利用Illumina Hi-seq2000高通量测序平台对两亲本材料进行重测序，控制测序深度＞20倍；根据已公布的西瓜全基因组序列(http：//cucurbitgenomics.org/)，以候选区段的基因组序列作为参考序列，利用网上公布的免费软件BWA(http：//biobwa.sourceorge.net/)，分布将两个亲本的重测序序列和候选区段进行比对，找到两个亲本在候选区段的差异位点。

根据亲本WT20和WCZ基因组重测序的结果，将其与西瓜的参考基因组‘97103’v1进行比对，在初步定位的区间找出符合条件的SNP/Indel，进一步开发标记对重组单株进行基因分型。开发出9个dCAPS标记和1个Indel标记，首先将开发的dCAPS标记在亲本之间进行多态性检测，然后再将具有多态性的标记在37个重组单株中进行基因分型。通过多态性分析，Clbl基因被定位在dCAPS12和Indel1之间，各自和目的基因之间含有1个重组单株。根据标记的位置信息，Clbl基因最终被定位到第4染色体21,582,521bp至21,591,532bp的9011bp区域(图2D)。

根据西瓜参考基因组“97103”注释数据库，该9011bp区间内只有一个候选基因(Cla018392)。进一步设计该候选基因的特异性引物，扩增了Cla018392的DNA和CDS序列，并对其进行了同源比对。Cla018392的DNA序列全长为1365bp，有4个外显子，CDS序列为525bp。其中Cla018392在两个亲本中有两个SNP的差异，第一个SNP在基因的第983位碱基，处于基因第二个内含子处，该SNP在WT20中为T，在WCZ中为C；第二个SNP在基因的1334位碱基，处于基因的第四个外显子处(CDS的第494位)，该SNP在WT20中为C，在WCZ中为A，该突变造成了丙氨酸(GCA)突变为谷氨酸(GAA)。我们推测Cla018392可能是西瓜少侧枝基因的候选基因Clbl。通过BLAST比对拟南芥数据库Tair(https：//www.arabidopsis.org/)发现，Cla018392与AtTFL1基因序列高度一致，为西瓜ClTFL1基因。据Cla018392的SNP位点设计dCAPS10标记，将其在37个重组单株中进行验证，结果表明，这37个重组单株的表型与基因型共分离。所以我们进一步断定Cla018392是控制西瓜侧枝多少的候选基因。

为了进一步验证上述基因控制西瓜卷须有无、侧枝多少，进行了如下进一步的实验。

实施例3

在上述实施例基础上，发明人以所收集的来自世界各地的西瓜种质材料为基础，随机选择61份材料为例(需要解释的是，这些自然群体的西瓜种质材料都为有卷须、多侧枝材料，而所述西瓜种质材料均为发明人工作过程中收集所得，相关种质材料在国内及国外部分专业种质库中亦有保藏，加上下述工作仅为实验验证，相关种质材料与本申请保护主题并不具有直接关联性，因而不再提供这些种质材料的信息)。

根据基因Clbl的SNP位点设计dCAPS10标记，dCAPS10分子标记的引物序列设计为：

dCAPS10-F：5’-CTTGCAGCAGTTTCTCTTTGA-3’，

dCAPS10-R：5’-TGGGTGATGAGACAGGAAAAG-3’；

具体过程简要介绍如下：

(1)提取基因组DNA

育苗后，于三叶一心时期采取幼嫩叶片(包括无卷须、少侧枝材料WCZ、有卷须、多侧枝材料WT20和61份自然群体)，CTAB法提取其基因组DNA；

(2)PCR扩增体系

10μL扩增体系设计如表2：

表2 10μL扩增体系

(3)对PCR产物进行酶切

对步骤(2)中的PCR扩增产物进行BclI酶切，并对酶切产物进行8％非变形聚丙烯酰胺电泳检测；10μl酶切体系设计如表3，50℃酶切6-8h。

表3 10μl酶切体系

(4)利用RNA提取试剂盒，提取双亲不同组织部位的RNA进行实时荧光定量检测。

电泳结果如图3所示。从图3中可以看出，对PCR产物酶切后，除WCZ无卷须、少侧枝材料WCZ(P2)外，其他所有材料的条带与WT20(P1)一致，说明其他材料都为ClBL/ClBL基因型，与材料表型一致。并且该标记在两亲本的扩增序列存在一个SNP差异，无卷须、少侧枝亲本序列有一个C-A的突变，基于该SNP位点设计的dCAPS10标记，可用于识别无卷须、少侧枝和有卷须、多侧枝性状。可见，基因定位准确。

荧光定量结果如图4所示，从图4可以看出，ClTFL1基因在侧枝生长点中的表达量最高，且在WT20(P1)中的表达量明显高于WCZ(P2)，这进一步说明ClTFL1基因在侧枝发育中起着重要的作用。

实施例4 ClTFL1基因的异源转化验证

为了验证ClTFL1基因的功能，我们构建了ClTFL1基因的过表达载体pFGC5941-ClTFL1，分别将其转化入拟南芥野生型Col和tfl1突变体中。具体过程如下：

(1)PCR扩增ClTFL1基因；

(2)将植物表达载体pFGC5941经过AscI和PacI进行双酶切反应，酶切温度为37℃，酶切时间8小时，之后利用诺唯赞无缝连接试剂盒(ClonExpress II One Step CloningKit)，按照说明将纯化后的目的基因和pFGC5941载体进行同源重组连接，构建过表达载体pFGC5941-ClTFL1；

(3)将过表达载体pFGC5941-ClTFL1转化入农杆菌感受态细胞AgL0；

(4)采用花序侵染法侵染拟南芥；

(5)筛选出拟南芥T1代阳性植株，观察植株表型。

如图5所示，将ClTFL1基因转化入拟南芥野生型Col和tfl1突变体后，转基因株系均表现出侧枝数量增多，株高增加的表型。进一步证明了ClTFL1在调控侧枝侧枝数量方面起着重要的作用。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 一对控制西瓜卷须有无和侧枝多少的基因ClTFL1/Cltfl1及用途

<130> 2021

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1365

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 1

atggcaagaa aaatagcaga acagcctctt gttcttggaa gagtgattgg agatgttgtg 60

gatcccttca ttccaaccat taaaatgtca gtcagtttta gcaacaagca agttctcaat 120

ggccatgaat tcttcccttc ttcgcttacc ttcaaaccta gggttcatat tcaaggagaa 180

gacatgagat ccttgttcac tctggtaaac taaatcattt ctctttttaa tttctttcaa 240

cccttttttt tccttctaaa tttgattttt tttatctttt tttttttttg gttaggttat 300

gattgaccca gatgttcctg gccctagtga tccatacttg agggaacacc ttcactggta 360

atttcaacaa taataatgct aaaattagaa cttttattga tttcaaaata ttgaggtcta 420

gagctgaaaa aaatataaac tttgaagaaa acccatttcc aaaatagcaa tttctttgtt 480

agggttaaaa ttgagagctt gtttggaatg attttttaaa tgtttcaaga taggtatgtt 540

tttttcattt aaaattgcaa aattgaaaat ccattaccaa aatagtaatt cctttctcta 600

gagttgaatt taaagccttt tggtatgatt ttctagatgc ttaaaaatat ttttttcatt 660

taaatgatac aaaattgaaa acacatttct agtcacatag ctcaatttga catacaatca 720

tgttcgtaac cagatttatg ctttgtatcc ccttacaccc aactatattt aaaaaaaaaa 780

aattaaatta aaagaaaaaa acaccaaaat aataatttct ttctctaggg ttaaatttaa 840

agcctatctg gtataatttt ctcgatgaaa acccatgacc aaaacaataa tttgtttatc 900

tagtgttaaa tttatttagg tttaggaaaa agaaaagaat ttgttaaaaa aggaatttct 960

atcaacaaat tcgagatgtt tacctaattt ttggccttta tttggatctc tttttcaggt 1020

tggtgacaga cattccagga actactgatg ctacttttgg tataggttat tccttttttt 1080

gaaaaataat aataataata acaatgataa attgtttttt aattttaaaa tttgggtgat 1140

gagacaggaa aagaagaaat gagctatgaa attccaaagc caacaatagg aattcacagg 1200

tttgtgtttg ttctgttcaa acaaaaacgg cgtcgttcag tgaaccctcc ttcatcaagg 1260

gatcgtttca acactcgaag attttcgggt gagaatgatt tgggtcttcc tgttgctgct 1320

gtctatttca atgaacaaag agaaactgct gcaaggaggc gatag 1365

<210> 2

<211> 174

<212> PRT

<213> Citrullus lanatus

<400> 2

Met Ala Arg Lys Ile Ala Glu Gln Pro Leu Val Leu Gly Arg Val Ile

1 5 10 15

Gly Asp Val Val Asp Pro Phe Ile Pro Thr Ile Lys Met Ser Val Ser

20 25 30

Phe Ser Asn Lys Gln Val Leu Asn Gly His Glu Phe Phe Pro Ser Ser

35 40 45

Leu Thr Phe Lys Pro Arg Val His Ile Gln Gly Glu Asp Met Arg Ser

50 55 60

Leu Phe Thr Leu Val Met Ile Asp Pro Asp Val Pro Gly Pro Ser Asp

65 70 75 80

Pro Tyr Leu Arg Glu His Leu His Trp Leu Val Thr Asp Ile Pro Gly

85 90 95

Thr Thr Asp Ala Thr Phe Gly Lys Glu Glu Met Ser Tyr Glu Ile Pro

100 105 110

Lys Pro Thr Ile Gly Ile His Arg Phe Val Phe Val Leu Phe Lys Gln

115 120 125

Lys Arg Arg Arg Ser Val Asn Pro Pro Ser Ser Arg Asp Arg Phe Asn

130 135 140

Thr Arg Arg Phe Ser Gly Glu Asn Asp Leu Gly Leu Pro Val Ala Ala

145 150 155 160

Val Tyr Phe Asn Glu Gln Arg Glu Thr Ala Ala Arg Arg Arg

165 170

<210> 3

<211> 1365

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 3

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gacatgagat ccttgttcac tctggtaaac taaatcattt ctctttttaa tttctttcaa 240

cccttttttt tccttctaaa tttgattttt tttatctttt tttttttttg gttaggttat 300

gattgaccca gatgttcctg gccctagtga tccatacttg agggaacacc ttcactggta 360

atttcaacaa taataatgct aaaattagaa cttttattga tttcaaaata ttgaggtcta 420

gagctgaaaa aaatataaac tttgaagaaa acccatttcc aaaatagcaa tttctttgtt 480

agggttaaaa ttgagagctt gtttggaatg attttttaaa tgtttcaaga taggtatgtt 540

tttttcattt aaaattgcaa aattgaaaat ccattaccaa aatagtaatt cctttctcta 600

gagttgaatt taaagccttt tggtatgatt ttctagatgc ttaaaaatat ttttttcatt 660

taaatgatac aaaattgaaa acacatttct agtcacatag ctcaatttga catacaatca 720

tgttcgtaac cagatttatg ctttgtatcc ccttacaccc aactatattt aaaaaaaaaa 780

aattaaatta aaagaaaaaa acaccaaaat aataatttct ttctctaggg ttaaatttaa 840

agcctatctg gtataatttt ctcgatgaaa acccatgacc aaaacaataa tttgtttatc 900

tagtgttaaa tttatttagg tttaggaaaa agaaaagaat ttgttaaaaa aggaatttct 960

atcaacaaat tcgagatgtt tatctaattt ttggccttta tttggatctc tttttcaggt 1020

tggtgacaga cattccagga actactgatg ctacttttgg tataggttat tccttttttt 1080

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Val Tyr Phe Asn Ala Gln Arg Glu Thr Ala Ala Arg Arg Arg

165 170

Claims

1.一对等位基因，其特征在于，该等位基因为ClTFL1/Cltfl1，其控制西瓜卷须有无、侧枝多少，其中控制西瓜无卷须和少侧枝性状的基因Cltfl1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，控制西瓜有卷须和多侧枝性状的基因ClTFL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.基因ClTFL1在培育有卷须和多侧枝性状的西瓜中的用途，其特征在于，所述基因ClTFL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种培育转基因西瓜的方法，其特征在于，将权利要求1中所述基因ClTFL1的第983位碱基T用C取代，将所述基因ClTFL1的第1334位碱基C用A取代，得到转基因西瓜，所述转基因西瓜满足如下（1）-（3）中的至少一种表型：

（1）无卷须；

（2）少卷须；

（3）少侧枝。

4.一种培育转基因植物的方法，其特征在于，将权利要求1所述的基因ClTFL1导入目的植物，所述目的植物满足如下（1）-（2）中的至少一种表型：

（1）侧枝数量增多；

（2）株高增加；

所述目的植物为拟南芥。