CN111979233A - 一种增大水稻粒型的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种增大水稻粒型的方法及其应用，属于水稻分子育种技术领域。本发明所述方法包括以下步骤：构建GS3基因的打靶载体，以野生型水稻的愈伤组织为受体，将所述打靶载体导入所述受体中，得增大水稻粒型的水稻；所述打靶载体包含Cas9蛋白的基因表达盒和靶向GS3基因的gRNA，所述gRNA包括第一gRNA和第二gRNA，所述第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述方法可获得粒长和粒重增大的GS3基因突变体，具有操作简单、周期短、节约成本等优点。

Description

一种增大水稻粒型的方法及其应用
技术领域
本发明属于水稻分子育种技术领域，具体涉及一种增大水稻粒型的方法及其应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，世界上60％以上的居民以水稻为主食。中国则是世界上最大的稻米生产国和消费国，水稻年种植面积4.5亿亩左右，占全球水稻种植面积的1/5，年产稻谷1.95亿吨左右，占世界稻谷总产量的1/3，全国粮食总产的40％左右。2014年中央一号文件提出依靠科技支撑的国家粮食安全战略，加强以分子育种为重点的基础研究，确保我国的粮食安全。水稻的穗数、穗粒数、结实率和粒重是水稻产量构成的四大要素，其中穗数、穗粒数受栽培条件调控的空间很大，而粒重主要受遗传因素控制。粒重由籽粒形态(粒长、粒宽、粒厚)决定，目前许多水稻的粒形调控基因已经被克隆，如GS3、qGL3、GW8、GS5、GW2、GW5、qSW5等(朱业宝等，福建农林大学学报，2015，44:1-8)，这些粒型基因对于指导水稻高产育种具有重要意义。
GS3是第一个被鉴定和克隆的调控水稻粒长和粒重相关的主效QTL，其编码蛋白为G蛋白γ亚基，是通过G蛋白偶联信号转导途径调控水稻籽粒的生长发育，主要参与到赤霉素调控信号途径以及油菜素内酯(BR)介导的信号响应途径(Hu et al.,PLOS Genetics,2013,9(3):1-13)。野生型GS3蛋白是一个跨膜蛋白，位于N端的OSR结构域是控制籽粒长短的重要结构，但是表现为负调控水稻籽粒长度，OSR结构域突变会造成水稻籽粒的拉长。位于C末端的TNFR/NGFR和VWFC结构域对OSR的功能具有一定的抑制作用，其缺失突变会产生更短的籽粒。研究表明将野生型GS3基因导入到大粒型品种明恢63后，水稻籽粒长度显著下降，表明GS3基因对水稻的籽粒长度和粒重起负调节作用(Mao et al.,Proc Natl AcadSci,2010,107:19579-19584)。
GS3基因组序列在水稻种质资源中存在广泛等位变异，通过对不同粒形品种水稻的GS3基因组序列比对发现，带有完整的GS3蛋白的粳稻品种都均表现为中等粒型，籼稻品种中GS3蛋白无功能的品种大多表现为中长粒型。杨梯丰等(分子植物育种，2010，8:59-66)利用携带GS3长粒基因型的籼稻品种“华粳籼74”的单片段代换系为材料，与携带其它优良基因的单片段代换系杂交进行分子聚合育种，在F4获得了含GS3和其它优良基因的纯合聚合系，聚合系都达到了目标籽粒长度表型，表明利用GS3基因可以实现籽粒粒长的设计育种。但是目前获得长粒形水稻的方法步骤复杂，需要经过多年时间才能完成育种。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种增大水稻粒型的方法及其应用，可利用CRISPR/Cas9基因编辑技术简便、快速、高效的得到增大粒长和粒重的粳稻品种，为不同粒形性状的水稻新种质创制提供一种快速、高效地分子育种方式。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种增大水稻粒型的方法，包括以下步骤：构建GS3基因的打靶载体，以野生型水稻的愈伤组织为受体，将所述打靶载体导入所述受体中，得增大水稻粒型的水稻；所述打靶载体包含Cas9蛋白的基因表达盒和靶向GS3基因的gRNA，所述gRNA包括第一gRNA和第二gRNA，所述第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述打靶载体的打靶位点为GS3基因的第一外显子。
优选的，所述打靶载体通过CRISPR/Cas9系统实现对水稻中GS3基因的编辑。
优选的，所述编辑包括使GS3基因的编码框发生碱基缺失和/或插入和/或替换，造成GS3蛋白1个或多个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代。
优选的，所述GS3基因为具有如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的DNA分子，或与所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列杂交且编码GS3蛋白的DNA分子，或与所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列至少具有70％以上同源性且编码所述GS3功能蛋白的DNA分子。
优选的，所述GS3蛋白为具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白质，或将所述SEQ ID NO.4所示氨基酸序列经过1个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入后形成的蛋白质。
本发明还提供了所述的方法在创制水稻大粒型种质资源中的应用。
本发明提供了一种增大水稻粒型的方法，包括以下步骤：构建GS3基因的打靶载体，以野生型水稻的愈伤组织为受体，将所述打靶载体导入所述受体中，得增大水稻粒型的水稻；所述打靶载体包含Cas9蛋白的基因表达盒和靶向GS3基因的gRNA，所述gRNA包括第一gRNA和第二gRNA，所述第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述方法简单易行、成本低、周期短、效率高。在本发明实施例中，对小粒型南粳5055进行粒型的改良，所得改良材料的粒形明显增大，南粳5055粒长为7.08mm，改良材料粒长变幅为7.32～7.74mm，均值为7.51mm，增加了6.07％；南粳5055粒宽为3.75mm，改良材料粒宽变幅为3.65～3.90mm，均值为3.76mm，总体变异不大；南粳5055长宽比为1.89，改良材料长宽比变幅为1.95～2.09，均值为2.00，增加了2.75％；南粳5055千粒重为21.84g，改良材料千粒重变幅为25.24～26.50g，均值为25.72g，增加了17.77％；改良材料与南粳5055每穗粒数无显著差异，均在170粒左右。
附图说明
图1为本发明实施例中长粒型水稻品种9311和小粒型南粳5055中GS3基因序列比对；
图2为本发明实施例中GS3基因编辑的靶位点；
图3为本发明实施例中打靶载体构建及转基因植株靶区域序列分析；
图4为本发明实施例中基因编辑材料的粒形性状考察结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种增大水稻粒型的方法，包括以下步骤：构建GS3基因的打靶载体，以野生型水稻的愈伤组织为受体，将所述打靶载体导入所述受体中，得增大水稻粒型的水稻；所述打靶载体包含Cas9蛋白的基因表达盒和靶向GS3基因的gRNA，所述gRNA包括第一gRNA和第二gRNA，所述第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述方法通过对水稻GS3基因进行基因编辑实现的，所述基因编辑是借助CRISPR/Cas9系统实现的。在本发明实施例中，所述GS3基因的打靶载体优选为pYLCRISPR/Cas9-gRNA1/2，结构如图3中a所示：包括Cas9酶的基因表达盒、靶向GS3基因的gRNA，优选还包括驱动Cas9基因的Ubiquitin启动子，驱动gRNA的OsU3和OsU6a启动子。本发明所述表达载体中包括第一gRNA(以gRNA1表示)和第二gRNA(以gRNA2表示)，所述第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：TCGGAGTGACATGGCAATGG，所述第二gRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示：CCGCGAGATCGGATTCCTCG。本发明所述第一gRNA处于GS3基因第-10至+10位核苷酸处，所述的第二gRNA处于GS3基因中第95至115位核苷酸处。本发明所述的两个gRNA都可产生核苷酸删除或插入突变，从而产生不同类型的突变基因型，获得基因编辑突变体。本发明所述编辑优选包括使GS3基因的编码框发生碱基缺失和/或插入和/或替换，造成GS3蛋白1个或多个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代。在本发明实施例中，对得到的所有基因编辑突变体进行测序分析，结果显示所有基因编辑株系都发生了移码突变，使GS3基因功能丧失，因而都能使粒形增大。未检测到仅3个核苷酸倍数缺失或插入的株系，因为往往这种变异使氨基酸发生1个或几个缺失而不会造成移码突变，GS3基因功能可保留。
本发明所述GS3基因的结构如图1所示，该基因含有5个外显子，在所述GS3基因的第一外显子处设计打靶位点。本发明所述GS3基因优选为具有如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的DNA分子，或与所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列杂交且编码GS3蛋白的DNA分子，或与所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列至少具有70％以上同源性且编码所述GS3功能蛋白的DNA分子。本发明所述GS3蛋白为具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白质，或将所述SEQ ID NO.4所示氨基酸序列经过1个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入后形成的蛋白质。
本发明对所述打靶载体的构建方法以及愈伤组织的来源都没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。本发明对所述打靶载体导入所述受体的方法也没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。
本发明还提供了所述的方法在创制水稻大粒型种质资源中的应用。
本发明所述创制水稻大粒型种质资源的方法优选与所述增大水稻粒型的方法相同，在此不再赘述。本发明在得到所述增大水稻粒型的水稻后，优选还包括对得到的转基因植株的基因型进行检测，并选取基因编辑突变体进行表型考察，查看功能效果。
下面结合实施例对本发明提供的增大水稻粒型的方法及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
南粳5055中粒型基因GS3的序列分析及基因编辑靶点设计
水稻GS3基因的基因结构如图1所示，该基因含有5个外显子。长粒型籼稻品种9311和短粒型粳稻品种南粳5055中GS3基因序列比对，表明两品种间的基因序列存在差异，南粳5055为野生型的GS3基因，而9311品种位于第2外显子处有C/A单碱基替换，形成TGA终止密码子，导致9311中GS3蛋白翻译提前结束。因此在第一外显子上设计两个靶点，对南粳5055的GS3基因进行打靶敲除。第一个靶点设置在起始密码子ATG处，第二个靶点设置在与内含子的剪切处，具体如图2所示，靶序列分别为：(第一gRNA，图中以gRNA1表示)tcggagtgacatggcaatgg和(第二gRNA，图中以gRNA2表示)ccgcgagatcggattcctcg。
实施例2
打靶载体构建及水稻遗传转化
以华南农业大学刘耀光教授友情赠送的pYLCRISPR/Cas9-MT载体(Ma et al,Molecular Plant,2015,8:1274-1284)作为用于基因编辑的gRNA载体和植物转化载体。本发明在GS3基因第一外显子上设计两个打靶位点(图2)，将gRNA1和gRNA2通过DNA连接酶分别连接到OsU3启动子驱动的pYL-U3-gRNA和OsU6a启动子驱动的pYL-U6a-gRNA载体骨架上，通过载体位置引物引导的PCR扩增，将已与启动子连接的靶点OsU3-gRNA1和OsU6a-gRNA2进行串联，然后通过DNA连接酶与植物转化载体pYLCRISPR/Cas9-MT连接，构建成GS3基因的打靶载体pYLCRISPR/Cas9-gRNA1/2(图3a)。
将含有打靶载体pYLCRISPR/Cas9-gRNA1/2的农杆菌转化南粳5055的成熟胚愈伤组织，经过抗性愈伤的选择、组培苗分化和生根获得转基因材料，具体步骤如下：
1.取水稻成熟种子脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子用75％酒精消毒2min，倒去酒精，加入30％NaClO溶液，浸泡30min；倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍后，将消毒好种子放在无菌滤纸上吸干；无菌种子置于诱导培养基中，在28℃光照培养箱中培养4周；待胚性愈伤组织(淡黄色，致密呈球状)长出将其移到新的诱导培养基中，继代培养10d。
2.挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100μL于4mL YEP(含50mg/L Kan和50mg/L Str链霉素)培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8～1.0。取培养好的菌液500μL于1.5mL离心管中，4℃，4000rmp，离心2min，去上清。用含200μmol/L乙酰丁香酮(As)的30mLAAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.01；将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染30min后将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干40min；再将愈伤组织置于共培养基上(NB培养基+2,4-D 2mg/L+乙酰丁香酮100μM/L，pH 5.8)。28℃暗培养3d。
3.将愈伤组织取出，用无菌水清洗6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/L羧苄青霉素(Car)的无菌水浸泡30min，最后置于无菌滤纸上沥干2h。沥干后的愈伤转入含Car(250mg/L)和潮霉素(50mg/L)的选择培养基上进行第一轮选择，30℃光照培养14d。将获得的抗性愈伤转到含Car(250mg/L)和潮霉素(80mg/L)的培养基上进行第二轮选择，30℃光照培养14d，即可获得淡黄色抗性愈伤。
4.挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入装有分化培养基的分化罐中，放入28℃恒温培养室中等待分化成苗(30-60d)。苗长至2cm左右，放入生根培养基中壮苗。炼苗一周左右，洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长。
实施例3
基因编辑材料的基因型检测
用DNA提取液(100mM Tris-HCl，10mM EDTA，1M KCl，pH 8.0)，提取转基因幼苗叶片DNA，先用Cas9引物Cas9-F(SEQ ID NO.5:5’-GATCCTTACTTTCCGTATTCCTTACTACG-3’)和Cas9-R(SEQ ID NO.6:5’-ATACCCTCCTCAATCCTCTTCATG-3’)进行PCR扩增，鉴定转基因阳性植株。25株转基因苗中鉴定到22株为阳性(图3中b)，转基因植株阳性率达88％。进一步以阳性植株DNA为模版，用GS3基因序列引物GS3-PCR-F(SEQ ID NO.7：5’-ATTTCCCTTGGCTTGCTTCCG-3’)和GS3-PCR-R(SEQ ID NO.8：5’-CATCAGTTCAACTTGCTCGTTT-3’)，进行PCR扩增GS3基因的打靶区域(图3中c)，扩增区段同时包含两个靶点。扩增产物电泳检测后，送至公司测序。
以南粳5055序列为对照，对不同转基因植株的测序序列进行比对，发现22株阳性转基因植株中仅1个株系的序列为野生型、未被编辑，其余21个株系均发生序列变异，编辑效率为95.5％。序列分析表明21个GS3基因编辑植株中有2个株系表现为打靶区段基因组纯合，如图3中d所示dGS3-3株系中两靶点之间发生133bp区段的敲除，dGS3-14株系中靶点1发生6bp敲除、靶点2发生C碱基插入，其余19个株系均为双峰，表现为杂合型。通过序列解码分析，这些杂合株系的序列变异表现为或靶1纯合/靶2杂合或靶1杂合/靶2纯合或双靶点杂合或一条链多碱基敲除另一链少数碱基敲除或插入。图3中d所示的dGS3-18和dGS3-20为在T1植株中分离到的纯合株系。
南粳5055及GS3基因编辑改良材料的粒形及千粒重具体数据如表1所示。
表1南粳5055及GS3基因编辑改良材料的粒形及千粒重
Figure BDA0002068488740000071
注：表1中*和**代表在0.05和0.01水平上的差异显著性
由表1可知，与南粳5055相比，GS3基因编辑植株的粒形明显增大(表1、图4)，籽粒长度变异幅度为7.32～7.74mm，均值为7.51mm，增加了6.07％(图4中a、图4中b、图4中c)；籽粒宽度在少数株系上表现增大，变异幅度为3.65～3.90mm，均值为3.76mm，总体变异不大(图4中a、图4中b、图4中d)；长比在多数株系上显著提高，变异幅度为1.88～2.09，均值为2.00，增加了2.75％，(图4中e)；千粒重显著增加，变异幅度为25.24～26.50g，均值为25.72g，增加了17.77％(图4中f)。
本发明提供了一种增大水稻粒型的方法及其应用，所述方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了粒长和粒重增大的GS3基因突变体，相比化学或物理诱变和TALEN、ZFN分子技术等方法，具有操作简单、周期短、节约成本等优点，是一种快速获得粒形改良水稻品系的分子育种方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种增大水稻粒型的方法及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcggagtgac atggcaatgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgcgagatc ggattcctcg 20
<210> 3
<211> 699
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 3
atggcaatgg cggcggcgcc ccggcccaag tcgccgccgg cgccgcccga cccatgcggc 60
cgccaccgcc tccagctcgc cgtcgacgcg ctccaccgcg agatcggatt cctcgagggt 120
gaaataaatt caatcgaagg gatccacgct gcctccagat gctgcagaga ggttgacgaa 180
ttcatcggaa gaactcctga tccattcata acgatttcat cggagaagcg aagtcatgat 240
cattctcacc acttcttgaa gaagtttcgc tgtttgtgca gagcaagtgc gtgctgcctc 300
agctacctct cctggatctg ctgctgcagc agcgccgccg gcggctgctc atcctcctcc 360
tcctcctcct tcaacctcaa gaggccgagc tgctgctgca actgcaactg caactgctgc 420
tcctcctcct cctcctcatg tggggcggcg ttaacgaaga gtccgtgtcg ctgccgccgc 480
cgcagctgct gctgccgtcg ctgctgctgc ggcggcgtcg gcgtccgcgc gtgcgcgagc 540
tgcagctgct ccccgccgtg cgcgtgctgc gcgccgccgt gcgcgggatg ctcgtgccgc 600
tgcacctgcc cgtgcccgtg ccccggcggc tgctcctgcg cgtgcccggc gtgcaggtgc 660
tgctgcggcg tccctcgttg ctgccccccc tgcttgtga 699
<210> 4
<211> 232
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 4
Met Ala Met Ala Ala Ala Pro Arg Pro Lys Ser Pro Pro Ala Pro Pro
1 5 10 15
Asp Pro Cys Gly Arg His Arg Leu Gln Leu Ala Val Asp Ala Leu His
20 25 30
Arg Glu Ile Gly Phe Leu Glu Gly Glu Ile Asn Ser Ile Glu Gly Ile
35 40 45
His Ala Ala Ser Arg Cys Cys Arg Glu Val Asp Glu Phe Ile Gly Arg
50 55 60
Thr Pro Asp Pro Phe Ile Thr Ile Ser Ser Glu Lys Arg Ser His Asp
65 70 75 80
His Ser His His Phe Leu Lys Lys Phe Arg Cys Leu Cys Arg Ala Ser
85 90 95
Ala Cys Cys Leu Ser Tyr Leu Ser Trp Ile Cys Cys Cys Ser Ser Ala
100 105 110
Ala Gly Gly Cys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe Asn Leu Lys Arg
115 120 125
Pro Ser Cys Cys Cys Asn Cys Asn Cys Asn Cys Cys Ser Ser Ser Ser
130 135 140
Ser Ser Cys Gly Ala Ala Leu Thr Lys Ser Pro Cys Arg Cys Arg Arg
145 150 155 160
Arg Ser Cys Cys Cys Arg Arg Cys Cys Cys Gly Gly Val Gly Val Arg
165 170 175
Ala Cys Ala Ser Cys Ser Cys Ser Pro Pro Cys Ala Cys Cys Ala Pro
180 185 190
Pro Cys Ala Gly Cys Ser Cys Arg Cys Thr Cys Pro Cys Pro Cys Pro
195 200 205
Gly Gly Cys Ser Cys Ala Cys Pro Ala Cys Arg Cys Cys Cys Gly Val
210 215 220
Pro Arg Cys Cys Pro Pro Cys Leu
225 230
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatccttact ttccgtattc cttactacg 29
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ataccctcct caatcctctt catg 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atttcccttg gcttgcttcc g 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
catcagttca acttgctcgt tt 22

Claims (7)

1.一种增大水稻粒型的方法，其特征在于，包括以下步骤：构建GS3基因的打靶载体，以野生型水稻的愈伤组织为受体，将所述打靶载体导入所述受体中，得增大水稻粒型的水稻；所述打靶载体包含Cas9蛋白的基因表达盒和靶向GS3基因的gRNA，所述gRNA包括第一gRNA和第二gRNA，所述第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述打靶载体的打靶位点为GS3基因的第一外显子。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述打靶载体通过CRISPR/Cas9系统实现对水稻中GS3基因的编辑。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述编辑包括使GS3基因的编码框发生碱基缺失和/或插入和/或替换，造成GS3蛋白1个或多个氨基酸残基的缺失和/或插入和/或取代。
5.根据权利要求1～4任一项所述方法，其特征在于，所述GS3基因为具有如SEQ IDNO.3所示核苷酸序列的DNA分子，或与所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列杂交且编码GS3蛋白的DNA分子，或与所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列至少具有70％以上同源性且编码所述GS3功能蛋白的DNA分子。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述GS3蛋白为具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白质，或将所述SEQ ID NO.4所示氨基酸序列经过1个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入后形成的蛋白质。
7.权利要求1～6任一项所述的方法在创制水稻大粒型种质资源中的应用。
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