CN113862265A

CN113862265A - 一种改良水稻粒型和外观品质的方法

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Publication number: CN113862265A
Application number: CN202111084132.3A
Authority: CN
Inventors: 周勇; 梁国华; 谭文琛; 缪军; 吴书俊; 周楚婷; 杨泽峰; 龚志云; 裔传灯
Original assignee: Yangzhou University; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Yangzhou University; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-09-15
Filing date: 2021-09-15
Publication date: 2021-12-31

Abstract

本发明公开了一种改良水稻粒型和外观品质的方法。本发明具体地公开了一种使用CRISPR/Cas9技术编辑现有优良粳稻的SLG7基因启动子区创制新的等位变异，灵活调控水稻粒型的方法，并公开了编辑靶位点T3及获得的三种新等位变异体。实验证明，与野生型相比，这三种突变类型均引起SLG7基因表达量增加并使得水稻籽粒变长，同时降低垩白，使外观品质显著改善。通过本发明提供的方法，可以免去杂交选育的工作，大大缩短长粒粳稻品种选育的周期，快速获得不同粒型的粳稻材料，进而满足消费者对稻米籽粒外观的不同要求。可为现有的高产粳稻品种提供一种高效的改善粒型和外观品质的方法，在农业生产上具有十分重要的应用。

Description

一种改良水稻粒型和外观品质的方法

技术领域

本发明属于植物转基因技术及作物遗传育种领域，涉及一种改良水稻粒型和外观品质的方法。具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术编辑水稻SLG7基因启动子调控水稻粒型和外观品质的方法。

背景技术

水稻是最重要的粮食作物之一，为世界一半左右的人口提供食物来源。我国是水稻生产和消费大国，培育优良的水稻新品种是保证国家粮食安全的重要基础。水稻分为籼稻与粳稻两个亚种。与籼稻相比，粳稻品种通常长宽比较小，垩白较多，透明度低，外观品质较差。而外观品质代表了稻米吸引消费者的能力，是稻米品质改良的重要目标。稻米外观品质的优劣直接影响着稻米的价格和商品流通。近年来，来自国际市场的泰国香米等细长粒大米具有较好的外观品质，颇受消费者青睐。为了满足市场消费需求，在不降低粳稻食味品质的情况下，改善粳稻外观品质具有重要意义。

前期研究利用数量性状基因(Quantitative Trait Loci，QTL)定位方法在水稻7号染色体克隆到一个控制粒型的主效QTL SLG7(Yong zhou et al.Natural Variationsin SLG7 Regulate Grain Shape in Rice.[J].Genetics,2015,201(4):1591-1599.)。该基因编码了一个由940个氨基酸组成的未知蛋白，与拟南芥中的LONGIFOLIA蛋白同源。进一步研究表明，该基因会促进细胞纵向伸长，进而使得籽粒变得细长，长宽比增加。不仅如此，该基因还会改善粳米的外观品质，主要表现为垩白粒率和垩白度减少，透明度增加。

优异的显性SLG7等位基因主要存在少数籼稻和热带粳稻中，尽管利用传统的杂交和回交手段可以将显性SLG7基因导入常规粳稻品种，但这些育种方法通常较繁琐，成本高且所需年份长。近年来发展起来的基因编辑技术是研究植物基因功能和农作物品种改良强有力的手段之一，利用基因编辑技术育种具有精准、高效、省时、省力和安全等特点。其中CRISPR/Cas9基因组编辑技术已被用于创造定向的敲除、敲入来沉默或微调靶基因的表达，可以通过对植物自身基因的快速、定点改变，实现对作物性状的精准改良。通过该技术可以促进商业化粳稻育种进程，克服传统育种的短板，具有缩短育种周期和不影响其他性状等优点，对粳稻的遗传育种具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控水稻粒型和/或改善水稻外观品质。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种调控水稻粒型的方法，所述方法包括对水稻SLG7基因启动子进行基因编辑。

所述调控水稻粒型可为调控籽粒变长和/或调控籽粒变短，所述调控水稻粒型还可为增加或降低籽粒长宽比。

所述水稻SLG7基因为水稻粒型基因SLG7。

上述方法中，所述水稻SLG7基因启动子的核苷酸序列可为SEQ ID No.1。

上述方法中，所述基因编辑可为利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述水稻SLG7基因启动子的sgRNA的载体。

所述表达靶向所述水稻SLG7基因启动子的sgRNA的载体可为载体SK-gRNA和/或载体pC1300-Cas9。

上述方法中，所述sgRNA的靶序列可为SEQ ID No.1的第736-755位。

进一步地，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向SEQ ID No.1所示水稻SLG7基因启动子的sgRNA的载体。

进一步地，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向SEQ ID No.1的第736-755位的sgRNA的载体。

上述方法中，所述水稻可为粳稻(Oryza sativa subsp.geng)。

进一步地，上述方法可包括如下步骤：

(1)在水稻SLG7基因启动子区选取靶位点；

(2)根据靶位点的靶序列设计引物，合成编码gRNA的DNA分子；

(3)构建基因编辑载体；

(4)转化受体水稻，获得突变植株。

本发明还提供了DNA分子，所述DNA分子可为下述任一种：

A1)核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

A2)核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；

A3)核苷酸序列是SEQ ID No.4所示的DNA分子。进一步地，所述DNA分子可为启动水稻SLG7基因表达的启动子。

进一步地，SEQ ID No.2所示的DNA分子可为水稻SLG7基因启动子(SEQ ID No.1)的等位变异，即T3编辑系T3-1的启动子；

SEQ ID No.3所示的DNA分子可为水稻SLG7基因启动子区(SEQ ID No.1)的等位变异，即T3编辑系T3-2的启动子；

SEQ ID No.4所示的DNA分子可为水稻SLG7基因启动子区(SEQ ID No.1)的等位变异，即T3编辑系T3-3的启动子；

本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

B1)特异性靶向所述水稻SLG7基因启动子的sgRNA；

B2)特异性靶向所述靶序列的sgRNA；

B3)编码B1)或B2)所述sgRNA的DNA分子；

B4)含有B3)所述DNA分子的表达盒；

B5)含有B3)所述DNA分子的重组载体、或含有B4)所述表达盒的重组载体；

B6)含有B1)或B2)所述sgRNA或B3)所述DNA分子的重组微生物、或含有B4)所述表达盒的重组微生物、或含有B5)所述重组载体的重组微生物；

B7)含有B1)或B2)所述sgRNA或B3)所述DNA分子的转基因植物细胞系、或含有B4)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B5)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。

上述生物材料中，所述重组载体具体可为CRISPR/Cas9打靶载体，包括中间载体SK-gRNA和/或最终载体pC1300-Cas9但不限于此。

本发明还提供了一种制备稻米品质改善的水稻的方法，所述方法包括如下步骤:用SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的DNA分子替换水稻基因组DNA中的SEQID No.1所示的DNA分子，得到稻米品质(包括稻米外观品质)改善的水稻。

上述方法中，所述改善稻米品质可为下述至少一种：

1)精米长宽比增加；

2)籽粒长宽比增加；

3)垩白粒率下降；

4)垩白度下降；

本发明还提供了所述调控水稻粒型的方法，和/或，所述DNA分子，和/或，所述生物材料在创制SLG7基因等位变异体和/或水稻育种中的应用。

直接敲除SLG7基因外显子区，通常会直接导致水稻无法正常合成SLG7蛋白，并使得籽粒变短变宽，外观品质降低。基因启动子区含有诸多调控原件，它们共同调控基因的表达模式和表达水平。通过CRISPR/Cas9系统直接对现有优良粳稻的SLG7基因启动子区多个位点进行定点编辑，影响某些转录激活或转录抑制原件的功能，进而微调SLG7基因的表达，从而产生并筛选表达量明显提高的突变类型，缩短育种周期，有望改善现有优良粳型水稻品种的外观品质。

本发明目的在于提供一种改善现有粳稻品种粒型的方法，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点编辑水稻SLG7基因启动子区，提高SLG7基因表达量，微调粒型，改善现有粳稻稻米外观品质。

本发明的另一目的在于创制SLG7新等位基因及利用。

在本发明的一个实施方案中，提供了使用CRISPR/Cas9技术靶向编辑水稻粒型基因SLG7的方法，包含以下步骤：

1)在武运粳30品种SLG7基因启动子区选取5个位置作为靶位点(T1-T5)，

靶位点T1靶序列为:SLG7基因起始密码子ATG前第607至588核酸序列：

5’-AAAACGCCGTTTAGCTATCC-3’；(SEQ ID No.1的第394-413位)

靶位点T2靶序列为:起始密码子ATG前第504至485核酸序列：

5’-CAGCGGGTTGGACAATATGG-3’；(SEQ ID No.1的第520-539位)

靶位点T3靶序列为:起始密码子ATG前第265至246核酸序列：

5’-CACACCCCCCACCCCACCAA-3’；(SEQ ID No.1的第736-755位)

靶位点T4靶序列为:起始密码子ATG前第147至128核酸序列：

5’-TCACCATACCACATCTCATC-3’；(SEQ ID No.1的第854-873位)

靶位点T5靶序列为:起始密码子ATG前第116至97核酸序列：

5’-AAAGAAAGTGATAGTGTACG-3’；(SEQ ID No.1的第885-904位)

2)根据每个靶序列分别设计两条单核苷酸引物：

SLG7-T1-gRNA-F:ggcaGGATAGCTAAACGGCGTTTT；

SLG7-T1-gRNA-R:aaacAAAACGCCGTTTAGCTATCC；

SLG7-T2-gRNA-F:ggcaCCATATTGTCCAACCCGCTG；

SLG7-T2-gRNA-R:aaacCAGCGGGTTGGACAATATGG；

SLG7-T3-gRNA-F:ggcaTTGGTGGGGTGGGGGGTGTG；

SLG7-T3-gRNA-R:aaacCACACCCCCCACCCCACCAA；

SLG7-T4-gRNA-F:ggcaGATGAGATGTGGTATGGTGA；

SLG7-T4-gRNA-R:aaacTCACCATACCACATCTCATC；

SLG7-T5-gRNA-F:ggcaCGTACACTATCACTTTCTTT；

SLG7-T5-gRNA-R:aaacAAAGAAAGTGATAGTGTACG；

3)参照CRISPR/Cas9编辑技术，构建5个靶位点的pC1300-Cas9-SLG7基因编辑载体，分别为pC1300-Cas9-SLG7-T1、pC1300-Cas9-SLG7-T2、pC1300-Cas9-SLG7-T3、pC1300-Cas9-SLG7-T4、pC1300-Cas9-SLG7-T5基因编辑载体。

4)采用农杆菌介导的遗传转化方法，将pC1300-Cas9-SLG7-T1、pC1300-Cas9-SLG7-T2、pC1300-Cas9-SLG7-T3、pC1300-Cas9-SLG7-T4、pC1300-Cas9-SLG7-T5基因编辑载体转入粳稻品种武运粳30中，获得突变植株。

5)参照所述sgRNA靶向的SLG7基因启动子序列，依据PCR引物设计原理，在所述sgRNA靶位点处上下游150-300bp处设计SLG7基因特异性引物，引物碱基序列如下:

SLG7-1F:5’-TATGAAACGGAAGAAGTA-3’

SLG7-1R:5’-AAGGCGTGTCGATGGT-3’

SLG7-2F:5’-TCACATGCGTGGCCGGCTC-3’

SLG7-2R:5’-CATCTCCTCCTCCGACTCC-3’

6)利用SLG7-1F和SLG7-1R引物PCR扩增靶位点T1、T2株系SLG7基因的基因组片段并进行测序鉴定，利用SLG7-2F和SLG7-2R引物PCR扩增靶位点T3、T4、T5株系SLG7基因的基因组片段并进行测序鉴定筛选SLG7启动子区有碱基插入或缺失的纯和突变株。

7)对各突变株穗部农艺性状进行考察鉴定，获得粒型改变的突变株，繁殖突变株系。

8)进一步对粒型产生影响的靶位点编辑株系稻米品质进行考察鉴定，具体包括垩白粒率、垩白度、表观直链淀粉含量、胶稠度和食味值等品质指标。

本发明通过所述pC1300-Cas9-SLG7基因编辑载体，在SLG7启动子区域5个靶位点共造成了12种新型等位变异。其中在靶位点T3编辑所产生的三种等位变异(T3编辑系T3-1、T3编辑系T3-2、T3编辑系T3-3)，分别是ATG前280到260的21个碱基被替换34个碱基的T3-1，缺失了ATG前265到252共14个碱基的T3-2和缺失了ATG前269到234共36个碱基的T3-3。这三个突变株系均导致籽粒长宽比增加，并显著改善稻米外观品质，其他株系无显著差异。

具体地，T3编辑系T3-1是SEQ ID No.1第721-741位的21个碱基(ACACGCCTTGACCCACACACC)被替换为34个碱基(GCCGTGGGTGCCGGGAGCTGGACATGGACATGGA)；

T3编辑系T3-2是SEQ ID No.1缺失了第736-749位的14个碱基(CACACCCCCCACCC)；

T3编辑系T3-3是SEQ ID No.1缺失了第732-767位的36个碱基(CCCACACACCCCCCACCCCACCAATCCCCCATCCCT)。

所述SLG7野生型及T3编辑系T3-1、T3-2、T3-3启动子区的核苷酸序列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。可利用所述SLG7新等位基因所具有的可增加籽粒长宽比、显著增加粒长、改善稻米外观品质的功能，培育外观品质更好的优质粳稻品种。

本发明利用SLG7基因参与水稻粒型调控的特点及CRISPR/Cas9系统的基因组靶向编辑，通过定点突变该基因靶位点T3，上调SLG7基因的表达，可显著增加籽粒长宽比，使籽粒更纤细，改善稻米外观品质，可以免去杂交选育的工作，大大缩短长粒粳稻品种选育的周期，在农业生产上具有十分重要的应用。

附图说明

图1为水稻SLG7基因示意图、基因编辑靶位点示意图。

图2为野生型水稻(武运粳30)和突变株系的SLG7靶序列核苷酸示意图，符号“+”、“/”、“-”分别表示基因组序列发生了插入、替换和缺失。符号后面的数字表示变化的核苷酸数量。

图3为野生型水稻(武运粳30)和突变株系的SLG7靶序列测序图。

图4为野生型水稻(武运粳30)和突变株系稻谷粒型对比图及长宽比的统计比较。

图5为野生型水稻(武运粳30)和T3编辑系SLG7基因表达量和穗部农艺性状的统计比较，图5中(a)-(d)分别为突变株系与野生型武运粳30的SLG7基因表达量、粒长、粒宽、粒厚的比较。

图6为野生型(武运粳30)和T3编辑系精米外观对比图。

图7为野生型(武运粳30)和T3编辑系品质指标的统计比较，图7中(a)-(f)分别为T3编辑系与野生型武运粳30整精米长宽比、垩白粒率、垩白度、表观直链淀粉含量(％)、胶稠度和食味值比较。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例采用Excel统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Student's test检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。以下实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例所使用的中间载体SK-gRNA和载体pC1300-Cas9由中国水稻研究所王克剑课题组提供，记载于如下文献中：Chun Wang，Lan Shen，Yaping Fu，Changjie Yan，Kejian Wang.A Simple CRISPR/Cas9 System for Multiplex Genome Editing in Rice[J].Journal of Genetics and Genomics，2015，42(12):703-706。

实施例1、制备籽粒变长和/或稻米品质改善的水稻

1、SLG7基因编辑CRISPR/Cas9载体的构建

本实施例所使用的基因编辑方法是中国农科院水稻所王克剑课题组所提供的CRISPR/Csa9系统(Chun Wang，Lan Shen，Yaping Fu，Changjie Yan，Kejian Wang.ASimple CRISPR/Cas9 System for Multiplex Genome Editing in Rice[J].Journal ofGenetics and Genomics，2015，42(12):703-706.)

1.1、在水稻SLG7基因启动子区选取靶位点

在粳稻(Oryza sativa subsp.geng)品种武运粳30的SLG7基因启动子区选取5个位置作为靶位点(T1-T5)(SLG7基因启动子特异的靶序列)：

5’-AAAACGCCGTTTAGCTATCC-3’；(SEQ ID No.1的第394-413位)

靶位点T2靶序列为:起始密码子ATG前第504至485核酸序列：

5’-CAGCGGGTTGGACAATATGG-3’；(SEQ ID No.1的第520-539位)

靶位点T3靶序列为:起始密码子ATG前第265至246核酸序列：

5’-CACACCCCCCACCCCACCAA-3’；(SEQ ID No.1的第736-755位)

靶位点T4靶序列为:起始密码子ATG前第147至128核酸序列：

5’-TCACCATACCACATCTCATC-3’；(SEQ ID No.1的第854-873位)

靶位点T5靶序列为:起始密码子ATG前第116至97核酸序列：

5’-AAAGAAAGTGATAGTGTACG-3’；(SEQ ID No.1的第885-904位)

1.2、根据靶位点的靶序列设计引物，合成编码gRNA的DNA分子

根据gRNA引物设计原则，根据每个靶序列分别设计两条单核苷酸引物如下：

SLG7-T1-gRNA-F:ggcaGGATAGCTAAACGGCGTTTT；

SLG7-T1-gRNA-R:aaacAAAACGCCGTTTAGCTATCC；

SLG7-T2-gRNA-F:ggcaCCATATTGTCCAACCCGCTG；

SLG7-T2-gRNA-R:aaacCAGCGGGTTGGACAATATGG；

SLG7-T3-gRNA-F:ggcaTTGGTGGGGTGGGGGGTGTG；

SLG7-T3-gRNA-R:aaacCACACCCCCCACCCCACCAA；

SLG7-T4-gRNA-F:ggcaGATGAGATGTGGTATGGTGA；

SLG7-T4-gRNA-R:aaacTCACCATACCACATCTCATC；

SLG7-T5-gRNA-F:ggcaCGTACACTATCACTTTCTTT；

SLG7-T5-gRNA-R:aaacAAAGAAAGTGATAGTGTACG；

在F向引物和R向引物两端加上Aar I酶切连接碱基，将合成的每对F向引物和R向引物均用ddH₂O稀释成100μM的溶液，在每个靶序列的退火体系中分别添加相应的F向引物和R向引物溶液各4.5μL，T₄连接酶Buffer 1μL，混匀。将上述退火体系放入PCR仪中：95℃，5min；以-5℃/s的速度降至25℃，随后置于冰上，令退火体系中的F和R引物互补配对，形成含有黏性末端的双链寡核苷酸(oligo)。将中间载体SK-gRNA载体用限制性内切酶Aar I酶切并回收纯化，得到酶切后的线性骨架载体，并在每个连接体系中添加100ng酶切后的线性骨架载体；在每个连接体系中加入5μL oligo、1μL T₄连接酶Buffer、1μL T₄连接酶，并用ddH₂O补足至10μL，混匀，置于16℃过夜反应。通过常规转化法进行转化、涂板。得到5个含有靶向于靶序列的gRNA的编码DNA重组载体：pSK-SLG7-T1-gRNA(含有靶向于靶位点T1的gRNA的编码DNA)、pSK-SLG7-T2-gRNA(含有靶向于靶位点T2的gRNA的编码DNA)、pSK-SLG7-T3-gRNA(含有靶向于靶位点T3的gRNA的编码DNA)、pSK-SLG7-T4-gRNA(含有靶向于靶位点T4的gRNA的编码DNA)和pSK-SLG7-T5-gRNA(含有靶向于靶位点T5的gRNA的编码DNA)。

1.3、构建基因编辑载体

分别用Kpn I和BglⅡ酶切pSK-SLG7-T1-gRNA、pSK-SLG7-T2-gRNA、pSK-SLG7-T3-gRNA、pSK-SLG7-T4-gRNA和pSK-SLG7-T5-gRNA，回收包含靶向于靶位点的gRNA的编码DNA片段，连入载体pC1300-Cas9(Kpn I和Bamh I酶切并回收)，构建5个靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑载体(pC1300-Cas9-SLG7基因编辑载体，表达Cas9和靶向于靶位点的gRNA)，分别为pC1300-Cas9-SLG7-T1、pC1300-Cas9-SLG7-T2、pC1300-Cas9-SLG7-T3、pC1300-Cas9-SLG7-T4、pC1300-Cas9-SLG7-T5。

2、转化受体水稻，获得突变植株。

步骤3中的pC1300-Cas9-SLG7基因编辑载体测序无误后用农杆菌介导的遗传转化方法(刘巧泉,张景六,王宗阳,洪孟民,顾铭洪.根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立[J].植物生理学报,1998(03):259-271.)将重组载体(pC1300-Cas9-SLG7-T1、pC1300-Cas9-SLG7-T2、pC1300-Cas9-SLG7-T3、pC1300-Cas9-SLG7-T4、pC1300-Cas9-SLG7-T5)转入受体水稻武运粳30中，获得突变植株，分别为T1-1编辑系(转入pC1300-Cas9-SLG7-T1的突变植株)、T1-2编辑系(转入pC1300-Cas9-SLG7-T1的突变植株)、T2-1编辑系(转入pC1300-Cas9-SLG7-T2的突变植株)、T2-2编辑系(转入pC1300-Cas9-SLG7-T2的突变植株)、T3-1编辑系(转入pC1300-Cas9-SLG7-T3的突变植株)、T3-2编辑系(转入pC1300-Cas9-SLG7-T3的突变植株)、T3-3编辑系(转入pC1300-Cas9-SLG7-T3的突变植株)、T4-1编辑系(转入pC1300-Cas9-SLG7-T4的突变植株)、T4-2编辑系(转入pC1300-Cas9-SLG7-T4的突变植株)、T5-1编辑系(转入pC1300-Cas9-SLG7-T5的突变植株)、T5-2编辑系(转入pC1300-Cas9-SLG7-T5的突变植株)和T5-3编辑系(转入pC1300-Cas9-SLG7-T5的突变植株)。

3、转基因苗及突变体的鉴定(编辑5个靶点产生的新等位变异及穗部农艺性状调查)

获得的突变植株移栽成活后，从水稻叶片中快速提取基因组DNA后，用测序引物PCR扩增突变植株启动子序列，并进行测序鉴定筛选SLG7基因启动子区有碱基插入或缺失的纯和突变株。用SLG7-1F/R测序检测编辑靶点靠近的T1、T2编辑系，用SLG7-2F/R测序检测编辑靶点靠近的T3、T4、T5编辑系编辑靶点，鉴定结果如图3所示。参照所述sgRNA靶向的SLG7基因启动子序列，依据PCR引物设计原理，在所述sgRNA靶位点处上下游150-300bp处设计SLG7基因特异性引物，鉴定所使用引物序列具体为：

SLG7-1F:5’-TATGAAACGGAAGAAGTA-3’，

SLG7-1R:5’-AAGGCGTGTCGATGGT-3’，

SLG7-2F:5’-TCACATGCGTGGCCGGCTC-3’，

SLG7-2R:5’-CATCTCCTCCTCCGACTCC-3’。

收获各突变植株和武运粳30的种子，考察籽粒粒型，每个突变植株和武运粳30调查20粒种子。

对各突变株穗部农艺性状进行考察鉴定，获得粒型改变的突变株，繁殖突变株系。

本次试验通过所述pC1300-Cas9-SLG7-T1、pC1300-Cas9-SLG7-T2、pC1300-Cas9-SLG7-T3、pC1300-Cas9-SLG7-T4、pC1300-Cas9-SLG7-T5基因编辑载体编辑了SLG7基因启动子区，获得12种不同类型新等位变异(图2，图3)。T1、T2、T4、T5编辑系的籽粒长度与野生型没有显著差异(图4)。与野生型水稻武运粳30启动子区ATG前1kb序列(SEQ ID No.1)相比，编辑T3靶位点所产生的T3-1、T3-2和T3-3的核酸序列均有较大差异，分别是：

T3-1编辑系：ATG前280到260的21个碱基被替换34个碱基(SEQ ID No.2)

T3-2编辑系：缺失了ATG前265到252共14个碱基(SEQ ID No.3)

T3-3编辑系：缺失了ATG前269到234共36个碱基的T3-3(SEQ ID No.4)。

具体地，T3-1编辑系与武运粳30相比，对于水稻SLG7基因启动子，两条同源染色体中的水稻SLG7基因启动子均突变为pSLG7+34，pSLG7+34将序列表中SEQ ID No.1的第721-741位的21个核苷酸(ACACGCCTTGACCCACACACC)替换为34个核苷酸(5’-GCCGTGGGTGCCGGGAGCTGGACATGGACATGGA-3’)，保持SEQ ID No.1的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子，pSLG7+34是核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

T3-2编辑系与武运粳30相比，对于水稻SLG7基因启动子，两条同源染色体中的水稻SLG7基因启动子均突变为pSLG7-14，pSLG7-14是将序列表中SEQ ID No.1的第736-749位的14个核苷酸(CACACCCCCCACCC)缺失，保持SEQ ID No.1的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子，pSLG7-14是核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子。

T3-3编辑系与武运粳30相比，对于水稻SLG7基因启动子，两条同源染色体中的水稻SLG7基因启动子均突变为pSLG7-36，pSLG7-36是将序列表中SEQ ID No.1的第736-749位的36个核苷酸(CCCACACACCCCCCACCCCACCAATCCCCCATCCCT)缺失，保持SEQ ID No.1的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子，pSLG7-36是核苷酸序列是SEQ ID No.4的DNA分子。

田间农艺性状观察表明，与野生型水稻武运粳30相比，T3-1编辑系粒长增加2.36％，长宽比增加3.05％，T3-2编辑系粒长增加4.3％，长宽比增加4.7％，T3-3编辑系粒长增加5.61％，长宽比增加9.25％，此外，T3-3编辑系粒宽减少3.26％，粒厚无显著差异，而T3-1和T3-2编辑系的粒宽、粒厚性状无显著差异(图5)。这三个突变株系(T3-1编辑系、T3-2编辑系、T3-3编辑系)均导致籽粒变长、长宽比增加。

4、SLG7基因新等位变异体稻米品质鉴定

分别将含有野生型水稻武运粳30、T3-1编辑系、T3-2编辑系、T3-3编辑系的成熟谷粒用砻谷机(Model SY88-TH，Korea)出糙(除去谷壳)，然后用Kett精米机(Tokyo，Japan)磨成精米。对比发现，T3-1编辑系、T3-2编辑系、T3-3编辑系的垩白明显少于野生型水稻武运粳30(图6)。随后，测量了它们的整精米长宽比、垩白粒率和垩白度，统计结果显示T3-1编辑系、T3-2编辑系、T3-3编辑系整精米长宽比分别比对照(野生型水稻武运粳30)增加了2.2％、3.5％和14.8％，垩白粒率分别下降了17.7％、35.7％和62.9％，垩白度分别下降了28.2％、37.7％和53.5％(图7中(a)-(c))。

精米通过FOSS旋风式磨粉机(FOSS，Sweden)磨成粉，米粉过筛后在37℃烘箱中放置3天，再在室温下平衡3天后用于进一步测量。测定结果表明，在夏季扬州正常播种条件下，各T3编辑系水稻种子中表观直链淀粉含量相比野生型水稻武运粳30略有增加，胶稠度长度减短，米质稍硬(图7中(d)、(e))。进一步的使用食味仪对大米食味品质进行预测，结果表明T3编辑系的大米与野生型水稻武运粳30在食味值打分上无显著差异(图7中(f))。

综上所述，通过本发明提供的方法，对武运粳30SLG7基因启动子区进行定向编辑共获得三种新等位变异，分别是ATG前280到260的21个碱基被替换34个碱基的T3-1(SEQ IDNo.2)，缺失了ATG前265到252共14个碱基的T3-2(SEQ ID No.3)和缺失了ATG前269到234共36个碱基的T3-3(SEQ ID No.4)。经过农艺性状考察，T3-1、T3-2和T3-3三个新等位变异均使得籽粒变长、长宽比增加，结果如图4、图5所示。不仅如此，对稻米出精后发现，相比于野生型水稻武运粳30，三种新等位变异的精米垩白粒率和垩白度显著降低，外观品质更优，结果如图6、图7所示。因此，通过编辑本发明提供的靶点会增加籽粒长宽比，增加稻米粒长，可以免除杂交选育工作，快速选育长粒粳稻品种，缩短育种周期。同时，可利用所述新等位基因，在不降低粳稻食味品质的情况下，选育外观品质更优的温带粳稻品种。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种改良水稻粒型和外观品质的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1000

<212> DNA

<213> 粳稻（Oryza sativa subsp. geng）

<400> 1

tttcattaaa tttagtattg aatatatttt gatacaatac ttgttttcta ctggaaatgt 60

tactatattt ttaataaact taaataactt ttcctaaaag tcagacgaat tatgatatga 120

aacggaagaa gtatctagca aattactact ctctctgtcc ctctctaaat tcatagaatt 180

atgacgtgtc acatctacgt acggagggaa taaaacgtaa gtgaggtgtt tgaatcttct 240

taagatgaag atgaagataa agattaagtg ttccacgcaa aacgaggtgg taataacgtg 300

tgattaattg ggttttactt attataaact tgaataatgg attaaactga tattaatatc 360

agagcaactt tcatatagaa agtattcaca ccaaaaacgc cgtttagcta tccaaaattt 420

catctctcgt tggagaaacg aacgcagcag ccagaacgta atccaaaccc gtcaagagga 480

acctaatcga aaccatatac ccccgttgcg gccgagccgc agcgggttgg acaatatggt 540

attgtggccg tggtagggag aggtggtggt gcgcgcgcgg taacatgccc aaccccgcaa 600

caatgaccga agcccccccc cccccccccc ccccccctca catgcgtggc cggctcgcgt 660

cgcgggcagc gcagcagcag cattcggccg tgggtgccgg gagctggaca tggaccatcg 720

acacgccttg acccacacac cccccacccc accaatcccc catccctccc gcttatttca 780

accccccctc tccctctcct cacgacaccc tgcatggcat tcgcacgcca ttgacacata 840

tctcatcata ccatcaccat accacatctc atctcacgcg tcccaaagaa agtgatagtg 900

tacgtacctc tgcttgctcc ttggctttct gagctgagct gctctgcagt tggatgtgcg 960

tgagctggtg atctgggagg agtcggagtc ggaggaggag 1000

<210> 2

<211> 1013

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

tttcattaaa tttagtattg aatatatttt gatacaatac ttgttttcta ctggaaatgt 60

tactatattt ttaataaact taaataactt ttcctaaaag tcagacgaat tatgatatga 120

aacggaagaa gtatctagca aattactact ctctctgtcc ctctctaaat tcatagaatt 180

atgacgtgtc acatctacgt acggagggaa taaaacgtaa gtgaggtgtt tgaatcttct 240

taagatgaag atgaagataa agattaagtg ttccacgcaa aacgaggtgg taataacgtg 300

tgattaattg ggttttactt attataaact tgaataatgg attaaactga tattaatatc 360

agagcaactt tcatatagaa agtattcaca ccaaaaacgc cgtttagcta tccaaaattt 420

catctctcgt tggagaaacg aacgcagcag ccagaacgta atccaaaccc gtcaagagga 480

acctaatcga aaccatatac ccccgttgcg gccgagccgc agcgggttgg acaatatggt 540

attgtggccg tggtagggag aggtggtggt gcgcgcgcgg taacatgccc aaccccgcaa 600

caatgaccga agcccccccc cccccccccc ccccccctca catgcgtggc cggctcgcgt 660

cgcgggcagc gcagcagcag cattcggccg tgggtgccgg gagctggaca tggaccatcg 720

gccgtgggtg ccgggagctg gacatggaca tggaccccac cccaccaatc ccccatccct 780

cccgcttatt tcaacccccc ctctccctct cctcacgaca ccctgcatgg cattcgcacg 840

ccattgacac atatctcatc ataccatcac cataccacat ctcatctcac gcgtcccaaa 900

gaaagtgata gtgtacgtac ctctgcttgc tccttggctt tctgagctga gctgctctgc 960

agttggatgt gcgtgagctg gtgatctggg aggagtcgga gtcggaggag gag 1013

<210> 3

<211> 986

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

tttcattaaa tttagtattg aatatatttt gatacaatac ttgttttcta ctggaaatgt 60

tactatattt ttaataaact taaataactt ttcctaaaag tcagacgaat tatgatatga 120

aacggaagaa gtatctagca aattactact ctctctgtcc ctctctaaat tcatagaatt 180

atgacgtgtc acatctacgt acggagggaa taaaacgtaa gtgaggtgtt tgaatcttct 240

taagatgaag atgaagataa agattaagtg ttccacgcaa aacgaggtgg taataacgtg 300

tgattaattg ggttttactt attataaact tgaataatgg attaaactga tattaatatc 360

agagcaactt tcatatagaa agtattcaca ccaaaaacgc cgtttagcta tccaaaattt 420

catctctcgt tggagaaacg aacgcagcag ccagaacgta atccaaaccc gtcaagagga 480

acctaatcga aaccatatac ccccgttgcg gccgagccgc agcgggttgg acaatatggt 540

attgtggccg tggtagggag aggtggtggt gcgcgcgcgg taacatgccc aaccccgcaa 600

caatgaccga agcccccccc cccccccccc ccccccctca catgcgtggc cggctcgcgt 660

cgcgggcagc gcagcagcag cattcggccg tgggtgccgg gagctggaca tggaccatcg 720

acacgccttg acccacacca atcccccatc cctcccgctt atttcaaccc cccctctccc 780

tctcctcacg acaccctgca tggcattcgc acgccattga cacatatctc atcataccat 840

caccatacca catctcatct cacgcgtccc aaagaaagtg atagtgtacg tacctctgct 900

tgctccttgg ctttctgagc tgagctgctc tgcagttgga tgtgcgtgag ctggtgatct 960

gggaggagtc ggagtcggag gaggag 986

<210> 4

<211> 964

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

tttcattaaa tttagtattg aatatatttt gatacaatac ttgttttcta ctggaaatgt 60

tactatattt ttaataaact taaataactt ttcctaaaag tcagacgaat tatgatatga 120

aacggaagaa gtatctagca aattactact ctctctgtcc ctctctaaat tcatagaatt 180

atgacgtgtc acatctacgt acggagggaa taaaacgtaa gtgaggtgtt tgaatcttct 240

taagatgaag atgaagataa agattaagtg ttccacgcaa aacgaggtgg taataacgtg 300

tgattaattg ggttttactt attataaact tgaataatgg attaaactga tattaatatc 360

agagcaactt tcatatagaa agtattcaca ccaaaaacgc cgtttagcta tccaaaattt 420

catctctcgt tggagaaacg aacgcagcag ccagaacgta atccaaaccc gtcaagagga 480

acctaatcga aaccatatac ccccgttgcg gccgagccgc agcgggttgg acaatatggt 540

attgtggccg tggtagggag aggtggtggt gcgcgcgcgg taacatgccc aaccccgcaa 600

caatgaccga agcccccccc cccccccccc ccccccctca catgcgtggc cggctcgcgt 660

cgcgggcagc gcagcagcag cattcggccg tgggtgccgg gagctggaca tggaccatcg 720

acacgccttg acccgcttat ttcaaccccc cctctccctc tcctcacgac accctgcatg 780

gcattcgcac gccattgaca catatctcat cataccatca ccataccaca tctcatctca 840

cgcgtcccaa agaaagtgat agtgtacgta cctctgcttg ctccttggct ttctgagctg 900

agctgctctg cagttggatg tgcgtgagct ggtgatctgg gaggagtcgg agtcggagga 960

ggag 964

Claims

1.一种调控水稻粒型的方法，其特征在于，所述方法包括对水稻SLG7基因启动子进行基因编辑。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻SLG7基因启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因编辑为利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述水稻SLG7基因启动子的sgRNA的载体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.1的第736-755位。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于，所述水稻为粳稻。

6.DNA分子，其特征在于，所述DNA分子为下述任一种：

A1)核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

A2)核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；

A3)核苷酸序列是SEQ ID No.4所示的DNA分子。

7.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：

B1)特异性靶向权利要求1-4中任一所述水稻SLG7基因启动子的sgRNA；

B2)特异性靶向权利要求4中所述靶序列的sgRNA；

B3)编码B1)或B2)所述sgRNA的DNA分子；

B4)含有B3)所述DNA分子的表达盒；

8.一种制备稻米品质改善的水稻的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:用SEQID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的DNA分子替换水稻基因组DNA中的SEQ ID No.1所示的DNA分子，得到稻米品质改善的水稻。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述改善稻米品质为下述至少一种：

1)精米长宽比增加；

2)籽粒长宽比增加；

3)垩白粒率下降；

4)垩白度下降。

10.权利要求1-5中任一所述的方法，和/或，权利要求6所述的DNA分子，和/或，权利要求7所述的生物材料在创制SLG7基因等位变异体和/或水稻育种中的应用。