CN112359134B

CN112359134B - 一种提高水稻单倍体诱导效率的分子标记引物及其应用

Info

Publication number: CN112359134B
Application number: CN202011457155.XA
Authority: CN
Inventors: 郭涛; 文钦; 贾思思; 王加峰; 陈淳; 黄翠红; 周丹华; 杨瑰丽; 王慧; 陈志强
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2040-12-10
Also published as: CN112359134A

Abstract

本发明公开了一种提高水稻单倍体诱导效率的分子标记引物及其应用，属于生物技术领域。本发明利用CRISPR/Cas9定向编辑水稻Os03g0393900基因第3外显子特定序列，获得该序列缺失若干碱基的突变体，该突变体自交或杂交后代产生较高频率单倍体，针对突变序列开发出功能性分子标记引物并应用于水稻单倍体诱导性状的改良。与传统花药培养获得单倍体相比，本发明在产生单倍体时，不受籼粳花药培养力基因型的影响，操作过程更为简便，提高了单倍体产生效率。

Description

一种提高水稻单倍体诱导效率的分子标记引物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种提高水稻单倍体诱导效率的分子标记引物及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国重要的粮食作物之一，水稻的产量和品质直接影响着我国粮食安全与人民生活品质。水稻品种的高效选育是提高水稻产量、品质和抗性的关键环节。传统育种中需要6～8个世代连续自交和不断选择才能获得相对稳定的材料，周期较长，难以满足水稻育种需求。双单倍体育种(double haploid,DH技术)只需2个世代就能获得纯系，大大缩短了育种进程，是纯系选育的一次技术革命。单倍体的产生是双单倍体育种的第一步，自然发生单倍体的频率很低，仅为0.1％，无法满足育种的大量需求。在水稻中，利用花药进行离体培养，诱导花药产生愈伤组织再分化成单倍体植株，是产生水稻单倍体的主要方法。但是，水稻的花药培养具有严格的基因型依赖且操作复杂，如籼稻的花药培养能力显著弱于粳稻。因此，水稻单倍体的产生一直是制约着水稻双单倍体育种的瓶颈。

近年来，在玉米中以生物诱导为基础的DH技术已被国内外种业公司及育种单位广泛的应用，成为了与分子标记辅助育种和转基因技术并称的现代玉米三大育种技术。生物诱导产生孤雌生殖单倍体是利用单倍体诱导系作父本，与目标选系基础材料进行杂交，在杂交当代的籽粒上就能获得一定比例的母本血缘单倍体。利用诱导系产生单倍体具有不受基因型依赖、诱导过程简单、成本低廉等优势。在玉米中，诱导单倍体产生的性状受主效QTL控制，其中qhir1能够解释66％遗传变异。2017年美国、中国和法国科学家几乎同时克隆qhir1位点的花粉特异性磷脂酶A基因MTL/ZmPLA1/NLD(GRMZM2G471240)。在玉米单倍体诱导系中，该基因在第4外显子1572～1573之间有个4bp(CGAG)插入，造成20个氨基酸移码突变，导致翻译提前终止，产生单倍体诱导功能。

MTL在作物中高度保守，水稻中MTL同源基因为(Os03g0393900)。玉米中MTL基因不同位点突变后单倍体产生比率不同，水稻中Os03g0393900基因不同位点的突变是否会影响单倍体产生还有待探索。鉴于传统水稻单倍体产生难度较大，提供一种基于Os03g0393900基因生物诱导的单倍体产生方法对水稻双单倍体育种有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种提高水稻单倍体诱导效率的分子标记引物，该分子标记引物序列如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示。

本发明的目的之二在于提供所述分子标记引物在提高水稻单倍体诱导效率中的应用。

进一步的，所述应用包括以下步骤：

(1)以水稻Os03g0393900基因第三外显子为基础设计靶序列；

(2)构建靶序列的CRISPR/Cas9编辑载体，利用农杆菌转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织；

(3)通过潮霉素抗性筛选及测序获得Os03g0393900基因第三外显子靶位点纯合突变体；

(4)对纯合突变体利用分子标记引物SEQ ID No.21和SEQ ID No.22进行筛选。

更进一步的，所述步骤(1)中靶序列为Os03g0393900第三外显子115-147位置，具体序列为：5’-CGTCGATGAGGTCGAACTCGCGGACCTTGCCGG-3’。

更进一步的，所述步骤(2)中水稻品种为籼稻纯系品种华航48。

更进一步的，所述步骤(3)中靶位点纯合突变体为：Os03g0393900第三外显子115-147位置为CGTCGATGAGGT-----TCGCGGACCTTGCCGG纯合突变，该突变序列相比原始序列缺失5个碱基。

更进一步的，所述步骤(4)中利用引物SEQ ID No.21和SEQ ID No.22进行筛选的步骤为：扩增靶序列，利用凝胶电泳比较片段差异，突变型与野生型具有5个碱基的差异。

进一步的，所述应用步骤如下：利用100Gy碳离子束辐照水稻，在诱变二代对每个单株利用SEQ ID No.21和SEQ ID No.22扩增目的片段，找出目的片段比对照减少5个碱基的突变体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明基于特定基因突变和生物诱导获得单倍体，与传统花药培养获得单倍体相比，本发明在产生单倍体时，不受籼粳花药培养力基因型的影响，操作过程更为简便，提高了单倍体产生效率。

附图说明

图1为实施例1中OsMATL基因靶点序列及位置图。

图2为实施例1中CRISPR/Cas9载体构建示意图。

图3为实施例1中野生型和突变体OsMATL基因蛋白三级结构预测图。

图4为实施例1中启动子区293bp缺失突变体OsMATL基因相对表达量图。

图5为实施例1中野生型和OsMATL突变体的结实率图。

图6为实施例1中野生型和OsMATL突变体的败育率图。

图7为实施例1中结实表型及不同类型败育籽粒表型图。

图8为实施例1中OsMATL3突变体及其诱发的单倍体表型。

具体实施方式

以下实施例中材料为粳稻日本晴和籼稻华航48，日本晴是典型的粳型纯系品种，华航48是国家植物航天育种工程技术研究中心选育的综合性状优良的籼型纯系品种。试验材料水培种植于人工气候室(温度28℃,光照10h,黑暗14h)，所有材料常规管理。

实施例1

1.Os03g0393900生物信息学分析

利用Ensembl数据库(https://plants.ensembl.org/index)获取MTL的基因序列及氨基酸序列。通过NCBI数据库中Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在线分析，搜索MTL在谷物和模式作物拟南芥中的同源基因，并下载同源基因的氨基酸序列。利用Clustl Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对氨基酸序列进行多序列比对；利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)和UniProt(https://www.uniprot.org/)预测Os03g0393900基因蛋白结构域。选取Os03g0393900基因ATG上游2000bp作为启动子区域，利用顺式作用元件在线分析网站PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析启动子序列，预测顺式作用元件。利用SWISS MODEL网站(https://swissmodel.expasy.org/)进行蛋白三级结构预测。

对玉米MTL基因与水稻、高粱、小麦、大麦、小米和拟南芥中的MTL同源基因进行氨基酸序列多重比对。结果显示，MTL在谷类作物中的同源性较高，达到70％以上，玉米中MTL基因与水稻中同源基因Os03g0393900 OsMATL氨基酸序列相似性为79％，粳稻和籼稻中OsMATL基因氨基酸序列相似性高达99％。保守的氨基酸序列暗示MTL在谷类作物中具有相似的功能。水稻中OsMATL基因位于第3号染色体上，含有4个外显子，编码432个氨基酸。该基因编码花粉特异性磷脂酶，有1个类磷脂酶A2结构域、1个酰基转移酶/酰基水解酶/溶血磷脂酶结构域、1个聚乳酸结构域、3个Motif(GXGXXG、GXSXG和DGA/G)，在C430处有S-棕榈酰化或S-法尼酰化位点，具有脂类分解代谢和植物防御的功能。

OsMATL启动子与其他真核启动子相似，包含了典型的基础转录调控的顺式作用元件，有47个TATA-box和36个CAAT-box，其中TATA-box主要集中在0至-1000bp处，CAAT-box分散分布在启动子区，还有4种逆境响应元件，分别为厌氧诱导的ARE元件、GC-motif元件、低温胁迫相关的LTR元件和应激胁迫相关的TC-richrepeats元件，这些元件可能参与了植物防御。5种(8个)光响应元件，如Box4、G-box、MRE、TCT-motif和TCCC-motif，此外还有4种(6个)激素响应元件、1种(2个)生理调控相关元件、1种(2个)蛋白结合位点相关元件和若干功能未知的顺式作用元件。

2.靶点及引物设计

利用CRISP-GE网站(http://skl.scau.edu.cn/)设计靶点，在Os03g0393900编码区第1外显子、第3外显子和第4外显子处设计单靶点；在启动子区设计双靶点对顺式作用元件进行敲除，靶点序列及位置如图1所示，其中黑色加粗字母为PAM序列；三角形指向玉米MTL天然突变位点。根据选择的靶点设计引物(如表1所示)，由金唯智(广州)生物科技有限公司合成。为了获得不同位点的突变体，在OsMATL基因编码区设计3个单靶点(图1)，第1外显子上的靶点距陈绍江团队报道的CRISPR/Cas9靶点下游11bp，较为彻底的破坏OsMATL的功能；第3外显子上的靶点在DGA/G motif处；第4外显子上的靶点距玉米天然突变位点上游8bp处，此靶点能够减少非预期的影响，获得具有单倍体诱导功能的突变体。在启动子区域-1200bp到-1500bp设计双靶点敲除多个顺式作用元件，2个靶点之间距离293bp(图1)，预期获得OsMATL基因表达量具有差异的等位突变。

表1本研究所用引物

3.CRISPR/Cas9载体构建

利用TPG系统构建CRISPR/Cas9载体的方法。试验步骤如下：(1)初级片段获取。以pGTR质粒为模板，PCR扩增出含有靶点和PTG载体的片段；(2)PTG片段组装。利用GoldenGate克隆方式将初级片段连接起来；(3)pRGEB32载体酶切。利用Bsa1限制性内切酶酶切pRGEB32载体，获得与PTG相同的粘性末端；(4)重组载体构建。将PTG片段插入到酶切后pRGEB32载体中Bas1克隆位点；(5)重组载体转化。用热激法将重组的载体转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中；(6)阳性克隆检测。挑取单个菌落接种培养，通过测序验证载体正确性。CRISPR/Cas9载体构建如图2所示。

4.农杆菌介导遗传转化

将构建好的CRISPR/Cas9载体通过电击转化农杆菌EHA105中，3个编码区的单靶点载体分别转化日本晴和华航48成熟胚诱导的愈伤组织中，1个启动子区的双靶点载体转化到华航48成熟胚诱导的愈伤组织中，通过潮霉素抗性筛选T₀代组培苗。

5.靶点检测

所有转化均成功获得T₀代转基因苗，对T₀代转基因苗进行测序，筛选OsMATL编码区纯合突变的植株和OsMATL启动子区大片段缺失的植株。OsMATL编码区上一共获得了56种纯合突变体，如表2所示，纯合突变率为19％。在第1外显子的靶点位置，日本晴中获得4种纯合突变，分别为单碱基A和T的插入、8个碱基的缺失、3个碱基的替换和10个碱基的缺失；华航48中只获得了单碱基A插入的纯合突变。这些突变类型均导致了移码突变，其中10个碱基的缺失使得翻译在第112个氨基酸处提前终止，截短了303个氨基酸。对比蛋白质预测的结构，如图3所示(其中，A：野生型OsMATL基因蛋白三级结构；B：第1外显子上突变体OsMATL基因蛋白三级结构；C：第3外显子上突变体OsMATL基因蛋白三级结构；D：第4外显子上突变体OsMATL基因蛋白三级结构)，发现第1外显子上突变体的三级结构与野生型的完全不同，蛋白结构更简单。启动子区293bp缺失突变体OsMATL基因相对表达量如图4所示，其中WT为野生型，MT为突变体。

表2 T₀代编码区纯合突变及启动子区大片段缺失突变类型

破折号表示碱基缺失；“–”和“+”分别表示缺失和插入所指示的核苷酸数。

在第3外显子靶点位置，获得了单碱基A和T的插入、单碱基和多个碱基缺失的纯合突变。在日本晴中获得6种类型的纯合突变，其中6个碱基和9个碱基的缺失导致该位点编码氨基酸的缺失，而其他突变类型均引起移码突变，使得DGA/Gmotif丧失，蛋白翻译出现不同程度的提前终止。对比蛋白质预测的结构(图3)，第2外显子上突变体的蛋白结构较野生型简单，但比第1外显子上突变体的蛋白结构复杂。

在第4外显子靶点位置，日本晴和华航48中均获得了单碱基A和T的插入以及2个碱基缺失的纯合突变。此外，在日本晴中获得了单个碱基缺失的纯合突变，华航48中获得了20个碱基缺失的纯合突变。这些突变类型均导致了移码突变，其中单个碱基的缺失导致翻译在第378个氨基酸处提前终止，其他的移码突变均未导致翻译提前终止。第4外显子上的突变只有少量C端氨基酸改变，蛋白三级结构与野生型相似(图3)，突变后的蛋白结构细微的差异可能导致催化位点的丧失，使得蛋白失去了原有的功能。

启动子区获得了7种含有大片段缺失的突变体(表2)，占33.33％，主要为300bp左右的大片段缺失，敲除了多个顺式作用元件，分别为3个TATA-box、2个CAAT-box、4个光响应元件和1个激素响应元件。此外，还有1个缺失722bp的突变体，删除了多个TATA-box和多种顺式作用元件。进一步对启动子区大片段缺失突变体OsMATL基因进行实时荧光定量PCR分析(图4)，结果显示启动子区域293bp的缺失显著降低了OsMATL基因表达量，该种类型的突变可能影响OsMATL基因的功能。

6.OsMATL突变体结实情况分析

对OsMATL突变体结实情况进行调查，其中图5为野生型和OsMATL突变体的结实率，图6为野生型和OsMATL突变体的败育率，由图5和图6可知，日本晴和华航48中OsMATL编码区突变体结实率分别为2.87％～6.92％和12.46％～15.26％，均极显著低于野生型，OsMATL编码区突变后对籼稻结实的影响比粳稻小，暗示籼稻更能忍OsMATL基因的功能缺失；日本晴中OsMATL编码区突变体败育率极显著增加，高达51％以上；华航48中OsMATL编码区突变体败育率为11％～18％，其中第4外显子上突变体败育率极显著高于野生型。在日本晴和华航48编码区突变体的后代中均发现不同程度的败育籽粒，大部分只剩薄薄的种皮内部无内含物，小部分胚乳出现不同程度的皱缩，如图7中C和D所示。华航48启动子区域大片段的缺失对植株的结实几乎没有影响，暗示OsMATL基因表达量的改变与编码氨基酸的改变调控双受精的机制可能不同。

7.OsMATL突变体后代单倍体产生比率统计

对获得的纯合突变体进行套袋自交，同时去雄后与野生型进行杂交。收获种子并种植，统计后代单倍体出现频率。粳稻日本晴该基因外显子突变后单倍体产生比率介于0-2.22％；而籼稻华航48该基因外显子突变后单倍体产生比率介于0-11.5％；两者启动子区域的突变均未产生单倍体。

值得注意的是，籼稻华航48该基因第三外显子115-147位置缺失5个碱基后产生的纯合突变体具有最高的单倍体诱导率，达11.54％，显著高于玉米中该基因突变后平均单倍体诱导率4.32％。该突变体基因型为CGTCGATGAGGT-----TCGCGGACCTTGCCGG纯合突变(表3-M15所示)。上述结果表明，该序列突变可诱导高频单倍体产生，在双单倍体育种中具有很高价值，这也是首次发现该基因第三外显子DGA/Gmotif丧失导致的高频单倍体产生，将该种类型突变定义为OsMATL3。OsMATL3突变体及其诱发的单倍体表型如图8所示。

表3不同类型纯合突变体诱发单倍体比例统计

8.利用碳离子辐射创制OsMATL3突变体并利用分子标记进行定向筛选

上述实验利用基因定向编辑证明了OsMATL3为高频单倍体诱导系。目前遗传转化方法获得的新材料无法直接应用于育种计划，本研究进一步利用物理辐射的方法获得该基因同类突变体。

针对OsMATL3为Os03g0393900第三外显子115-147位置为CGTCGATGAGGT-----TCGCGGACCTTGCCGG纯合突变，设计引物3F:5’-GCGTTGATTCCATCCGCATT-3’，3R：5’-GCTCCTCCTTGTCCTTCACC-3’扩增靶序列，利用凝胶电泳比较片段差异，突变型与野生型具有5个碱基的差异。

OsMATL3为小片段缺失类型，而重离子辐射可有效诱发小片段缺失。因此，本研究利用100Gy碳离子束辐照水稻纯系品种华航48种子共20000粒，在诱变二代种植15000份个体，抽穗期对每个单株进行编号和DNA提取，利用3F、3R引物扩增目的片段，找出目的片段比对照减少5个碱基的突变体。最终发现OsMATL3-1至OsMATL3-5共5个突变体，利用自交和杂交同步比较了5个突变体诱发单倍体的效率，发现其诱发单倍体效率介于11.1-15.2％。上述结果表明利用开发的分子标记可获得该基因的定向突变，并且突变体具有较高的单倍体诱导率。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种提高水稻单倍体诱导效率的分子标记引物及其应用

<130> 2020.12.09

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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gcatccatgt gttcctgatc c 21

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ggtcccatta agtttggcgg 20

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gggagagttg ggaacgttga 20

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agaagatggt tggctggagc 20

Claims

1.一种分子标记引物在筛选水稻纯合突变体中的应用，其特征在于，所述分子标记引物序列如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示；所述水稻为籼稻纯系品种华航48；所述分子标记的野生型序列为Os03g0393900第三外显子115-147位置，具体序列为：5’-CGTCGATGAGGTCGAACTCGCGGACCTTG CCG G -3’；所述纯合突变体为：Os03g0393900第三外显子115-147位置为CGTCGATGAGGT-----TCGCGGACCTTGCC GG纯合突变，该突变序列相比野生型序列缺失5个碱基。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以水稻Os03g0393900基因第三外显子为基础设计靶序列；

（2）构建靶序列的CRISPR/Cas9编辑载体，利用农杆菌转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织；

（3）通过潮霉素抗性筛选及测序获得Os03g0393900基因第三外显子靶位点纯合突变体；

（4）对纯合突变体利用分子标记引物SEQ ID No.21和SEQ ID No.22进行筛选。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）中利用引物SEQ ID No.21和SEQ ID No.22进行筛选的步骤为：扩增靶序列，利用凝胶电泳比较片段差异，突变型与野生型具有5个碱基的差异。