CN116064653B - 番茄SlBBX17基因在促进番茄低温抗性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了番茄SlBBX17基因在促进番茄低温抗性中的应用，通过基因过表达技术使得所述番茄SlBBX17基因的表达水平上升；所述番茄SlBBX17基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。结果发现，过表达SlBBX17可以显著提高番茄的低温抗性。
Description
技术领域
本申请涉及基因工程、分子生物学及生理学等领域，具体地说，尤其涉及番茄SlBBX17基因在促进番茄低温抗性中的应用。
背景技术
温度是影响植物生长发育的重要环境因素之一。近年来，随着经济社会的不断发展，极端天气的出现也越加频繁，由此产生的温度逆境给蔬菜种植与生产造成了巨大的挑战。
番茄是一种栽培广泛的喜温蔬菜，当其遭受低温胁迫时，其生长发育会受到严重的影响，特别是在生殖生长时期，低温会导致番茄落花落果，使得番茄的产量及品质大大降低。同时，作为一种模式作物，番茄的全基因组精细序列分析已经完成。因此研究番茄低温响应机制，并通过生物技术手段提高番茄低温抗性具有非常重要的意义。B-box家族是一类具有一个或两个B-BOX结构域的转录因子，被报道参与植物光形态建成、光周期信号传递以及逆境抗性等多种生理过程。近年来，关于BBX蛋白在植物响应非生物胁迫中的研究逐渐深入。拟南芥中的AtBBX18和AtBBX23能够通过影响ELF3蛋白稳定性，进而影响转录因子PIF4的活性，促进植物的热形态建成。苹果中的MdBBX37能够介导茉莉酸通过CBF途径正向调控植物低温抗性。同时，许多BBX家族成员被报道参与到了植物对开花的调控过程中，BBX1(CO)是调控植物开花的关键因子，同时能在干旱条件下介导ABA对FT的调控进而促进植物开花。BBX28和BBX29能通过调控FT基因促进植物开花，这些证据说明BBX蛋白在植物生殖生长过程中发挥重要作用。但是BBX17蛋白在调控植物花粉数量及低温抗性中的作用还鲜有报道。
发明内容
鉴于此，本申请实施例提供一种番茄SlBBX17基因在促进番茄低温抗性中的应用。
根据本申请实施例的番茄SlBBX17基因在促进番茄低温抗性中的应用，通过基因过表达技术使得所述番茄SlBBX17基因的表达水平上升；所述番茄SlBBX17基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
可选的，所述基因过表达技术具体如下：
提取番茄总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，扩增SlBBX17基因，将扩增产物构建到植物过表达载体上；所述引物F和R的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和4所示；
将植物过表达载体及基因编辑载体导入宿主细胞中，再利用其侵染目的植株，筛选阳性转基因植株，获得转基因植株。
可选的，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。
可选的，所述农杆菌细胞为GV3101。
可选的，所述植物表达载体为具有35S启动子的表达载体。
可选的，所述过表达载体为pFGC1008-HA，基因编辑载体为pCAMBIA1301。
本申请的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
通过基因手段构建番茄SlBBX17过表达植株和基因敲除植株，调控所述基因SlBBX17的表达水平来研究其对番茄花粉数量以及番茄低温抗性的影响。结果发现，过表达SlBBX17可以显著提高番茄的低温抗性；而将SlBBX17基因敲除之后，番茄植株在低温下的抗性显著降低，同时发现BBX17基因敲除植株的花粉数量明显减少。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
图1为本发明实施例1中SlBBX17基因过表达番茄株系的植物蛋白Western Blot检测结果。
图2为本发明实施例2中SlBBX17基因敲除番茄株系的sgRNA序列的测序结果。
图3为本发明实施例4中在常温与低温条件下，转基因番茄SlBBX17-OE#2、SlBBX17-OE#3、bbx17#2、bbx17#7及野生型番茄植株表现耐低温的表型。
图4为本发明实施例4中在常温与低温条件下，转基因番茄SlBBX17-OE#2、SlBBX17-OE#3、bbx17#2、bbx17#7及野生型番茄植株的电导率变化。
图5为本发明实施例4中在常温与低温条件下，转基因番茄SlBBX17-OE#2、SlBBX17-OE#3、bbx17#2、bbx17#7及野生型番茄植株的PSII最大光化学量子产量(Fv/Fm)变化。
图6为本发明实施例3中转基因番茄SlBBX17-OE#2、SlBBX17-OE#3、bbx17#2bbx17#7及野生型番茄植株的花粉数量。。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：SlBBX17过表达载体的构建
从番茄基因组中克隆了SlBBX17基因。根据编码区序列分析，设计特异性引物SlBBX17-F和SlBBX17-R，并在引物上分别加上限制性酶切位点(Asc I和Kpn I)，序列如SEQID NO:3和4所示。用KOD高保真酶PCR扩增SlBBX17片段，然后对载体进行酶切，将SlBBX17片段同源重组到pFGC1008-HA上，得到过表达载体pFGC1008::SlBBX17-HA。将上述重组质粒送到尚亚公司测序确认，所得的基因SlBBX17的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。结果表明所克隆的序列与Solgenomics中公布的序列(Solyc07g052620)一致。
实施例2：SlBBX17基因突变载体的构建
SlBBX17基因靶序列通过CRISPR-P网站设计，具体序列如SEQ ID NO:5所示，合成的靶序列退火后连接到AtU6-sgRNA-AtUBQ-Cas9载体的Bbs I位点，然后将新得到的AtU6-sgRNA-AtUBQ-Cas9片段连接到pCAMBIA1301载体的Hind III/Kpn I位点，构建出番茄SlBBX17基因CRISPR表达载体。将上述重组质粒送到尚亚公司测序确认。
实施例3：番茄SlBBX17转基因材料的构建与检测
将过表达载体pFGC1008::SlBBX17-HA和基因编辑载体pCAMBIA1301::AtU6-sgRNA(BBX17)-AtUBQ-Cas9。转化农杆菌GV3101，并进行番茄子叶侵染，通过诱导愈伤，抗性诱导分化以及生根培养，获得组培苗，将T1代突变体种子和过表达种子分别进行卡那霉素抗性和氯霉素抗性的测试，选择3/4具有抗性而其余1/4没有抗性的株系，说明在该株系中连有目的基因的过表达载体以单拷贝形式插入。将这些植株移除，再进行单株收种。利用Western Blot验证SlBBX17过表达阳性转基因植株，结果显示野生型没有蛋白条带，而过表达株系有SlBBX17-HA的条带(图1)。对T0代的SlBBX17基因编辑植株进行人工自交授粉，获得T1代突变体种子。T1代突变体利用KOD高保真酶PCR扩增，引物序列如SEQ ID NO:6和7所示，产物送到尚亚公司测序确认，得到T1代杂合植株(图2)。
实施例4：番茄SlBBX17转基因材料耐低温能力的检测
将五叶一心的野生型番茄幼苗和实施例3中所得的SlBBX17基因过表达株系和突变体株系在人工培养箱内进行25℃和4℃处理，低温处理7天后，将低温胁迫处理组与相同条件下未进行低温处理的对照组进行比较，观察野生型、过表达株系和突变体株系番茄植株的表型(图3)、电导率(图4)、PSII最大光化学量子产量(Fv/Fm，图5)。结果显示，过表达番茄植株能够显著提高番茄的耐低温性(图3)，电导率显著低于野生型(WT)和bbx17突变株系(图4)。此外，过表达植株的Fv/Fm(图5)均高于野生型番茄(WT)，而突变体株系最低。由此可见，番茄SlBBX17正调控植物的耐低温能力。
实施例5：番茄SlBBX17转基因材料花粉数量的统计
采集番茄的大蕾期花蕾，取出完整未开裂的花药10枚，放入1.5ml离心管中，65℃恒温培养箱中烘干过夜，使花药完全开裂；散出花粉后加入50μl 5％吐温20，并利用超声仪进行超声处理，并充分振荡，使花粉粒均匀分布于溶液中，然后取10μl溶液滴于血球计数板上，显微镜观察统计花粉粒数，重复3次。结果显示，bbx17突变体两个株系的花粉数量与野生型相比显著减少，而过表达植株的花粉数量与野生型相比没有明显差异(图6)。说明突变SlBBX17基因会明显降低番茄的花粉数量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但本专利不限于以上实施例，还可以有许多变形或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本专利精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本专利要求保护的范围。
Claims (6)
1.番茄SlBBX17基因在促进番茄低温抗性中的应用，通过基因过表达技术使得所述番茄SlBBX17基因的表达水平上升；所述番茄SlBBX17基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因过表达技术具体如下：
提取番茄总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，扩增SlBBX17基因，将扩增产物构建到植物过表达载体上；所述引物F和R的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和4所示；
将植物过表达载体导入宿主细胞中，再利用其侵染目的植株，筛选阳性转基因植株，获得转基因植株。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为农杆菌细胞。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述农杆菌细胞为GV3101。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物过表达载体为具有35S启动子的表达载体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物过表达载体为pFGC1008-HA。
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Citations (6)
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| CN109456394A (zh) * | 2018-11-19 | 2019-03-12 | 浙江大学 | 番茄SlPIF4基因、蛋白及其在提高植物耐低温性中的应用 |
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-
2022
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Patent Citations (7)
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| CN105734076A (zh) * | 2006-06-29 | 2016-07-06 | 孟德尔生物科技有限公司 | 改善的转基因植物产量和胁迫耐受性 |
| WO2015002318A1 (ja) * | 2013-07-05 | 2015-01-08 | タキイ種苗株式会社 | トマト植物のネコブセンチュウ抵抗性マーカー、ネコブセンチュウ抵抗性トマト植物、ネコブセンチュウ抵抗性トマト植物の製造方法、およびネコブセンチュウ抵抗性トマト植物のスクリーニング方法 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BBX17 Interacts with CO and Negatively Regulates Flowering Time in Arabidopsis thaliana;Xiaorui Xu等;Plant Cell Physiol;第63卷(第3期);参见全文 * |
| 登录号XM_004243785;GenBank;GenBank;参见序列和信息 * |
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