CN105734076A - 改善的转基因植物产量和胁迫耐受性 - Google Patents

Abstract

本发明涉及插入表达载体的多核苷酸和多肽被引入植物并异位表达。已显示本发明多肽赋予至少一种调节活性，并且赋予与对照植物相比增加的产量、更高的高度、增加的次生生根作用、更快的萌发、更强的耐寒性、更强的对水剥夺的耐受性、降低的气孔导度、改变的C/N敏感、增加的低氮耐受性、增加的低磷耐受性、或增加的对高渗胁迫的耐受性。

Description

改善的转基因植物产量和胁迫耐受性

本申请是申请日为2007年6月22日、发明名称为“改善的转基因植物产量和胁迫耐受性”的中国发明专利申请No.200780024118.6的分案申请。

发明领域

本发明涉及植物基因组学和植物改良。

背景技术

各种因素对植物产量的影响。

由于植物经常生长于不利的条件，如不适温度或土壤养分、光、或可用水量供应受限，所以具有商业价值的物种在自然环境中的产量可能不是最理想的。例如，氮(N)和磷(P)是植物重要的限制营养素。磷作为大量元素对植物生长的重要性和其对作物产量的影响仅次于氮。植物已进化出包括代谢以及发育适应的多种策略来帮助应对P和N剥夺。几乎绝大多数这些策略都具有在转录水平受到调控，进而易受转录因子操纵的组件。代谢适应包括通过：通过(though)诱导高亲和力和低亲和力转运蛋白增加P和N从土壤的吸收，和/或增加其在植物中的活化来增加其有效性。发育适应包括增加原生根和次生根、增加根毛数量和长度，和与菌根真菌结合(Bates和Lynch(1996)；Harrison(1999))。

氮和碳代谢在植物的几乎每个生化途径都是紧密联系的。碳代谢物调节参与N获得和代谢的基因，并且已知其影响萌发和光合基因的表达(Coruzzi等(2001))，从而影响生长。对硝酸还原酶(NR)的早期研究(1976)显示Glc/Suc可以影响NR活性(Crawford(1995)；Daniel-Vedele等(1996))。这些观察得到了后来实验的支持，所述后来实验显示在暗适应的、绿色幼苗中，糖诱导NRmRNA(Cheng等(1992))。作为信号转导分子，C和N可能具有拮抗作用；在烟草中，C代谢物可以模仿光对NR活性和mRNA水平的诱导，而N-代谢物引起NR诱导的抑制(Vincentz等(1992))。已证实C/N(碳-氮平衡)状态对许多N-代谢基因具有基因调节作用(Stitt1999))；Coruzzi等(2001))。因此，C/N敏感发生改变的植物在限氮条件下可显示出改善的萌发和/或生长。

水分亏缺是作物产量的主要限制。在限水环境中，作物产量是水分利用、水分利用效率(WUE；定义为空气生物质产量(aerialbiomassyield)/水分利用)和收获指数(HI；收获时生物质产量与累积的总生物质的比率)的函数。WUE是包括水分和CO₂吸收、运输和在叶表面处的交换(蒸腾)的复合性状。改良的WUE已被提议为干旱情况下产量改良的标准。水分亏缺还可具有不利效应，

表现为对病虫害的易感性增加、植物生长减慢和繁殖失败。在水分亏缺过程中特异性表达的有用基因是促进植物生长或受精方面的基因、赋予疾病抗性的基因、赋予抗虫性的基因，及类似的基因。这些缺陷可以延迟生长和发育、降低产量，并且在极端情况下可造成植物死亡。对这些胁迫的增强的抗性将导致常规品种的产量增加和杂交品种产量变动的减小。

影响产量的另一个因素是每英亩种植的植物的数量。对于作物物种，种植或群体密度随作物种类、种植区域和年份而变化。

提高产量或增强对各种非生物胁迫的抗性的植物的性状，包括其生物化学、发育或表型特性，可通过多个细胞过程进行控制。操纵该控制的一个重要途径是通过转录因子-影响特定基因或成组基因的表达的蛋白。包含具有改变的例如至少一个选定的转录因子的水平的细胞的转化和转基因植物具有有利的或需要的性状。因此，通过改变植物细胞的转录因子水平而操纵性状的策略可以得到具有商业价值的特性的植物和作物。

发明概述

本发明的一个目标是提供可以表达基因以增加商业重要的植物的产量，以及改善水分或营养亏缺的不利效应的植物。

因此本发明涉及新的重组多核苷酸、表达载体、包含它们的宿主植物细胞和转基因植物和生产所述转基因植物的方法。

所述重组多核苷酸可包括下述任意序列：

(a)序列表中给出的核苷酸序列；

(b)编码序列表中给出的多肽的核苷酸序列；

(c)与(a)或(b)的任一项核苷酸序列具有至少30％序列同一性的序列变体；

(d)其氨基酸序列与SEQIDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24的任一项具有至少30％同一性，或至少32％、至少33％、至少36％、至少40％、至少45％或至少67％同一性的多肽序列；

(e)与(a)或(b)的任一项核苷酸序列具有至少40％同一性的直系同源和旁系同源核苷酸序列；

(e)在严格条件下与(a)或(b)的任一项核苷酸序列杂交的核苷酸序列，所述严格条件可包括例如具有每步均使用6xSSC和65℃漂洗10至30分钟的漂洗步骤的杂交；和

(f)具有调节转录和改变转基因植物的性状功能所需的B-盒锌指保守结构域的多肽和编码其的核苷酸序列，

所述保守结构域的氨基酸残基序列与SEQIDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24(即，序列表中列出的多肽或由上述任一核苷酸序列编码的多肽，其保守结构域分别用SEQIDNO：45-56表示)的B-盒锌指(ZF)保守结构域具有至少约56％序列同一性，或至少约58％序列同一性，或至少约60％序列同一性，或至少约65％、或至少约67％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％同一性。表1列出的本发明的保守结构域包含调节转录和改变转基因植物的性状功能所需的结构域，所述性状选自由与对照植物相比，增加的产量、增加的高度、改变的C/N敏感、增加的低氮耐受性、增加的低磷耐受性、增加的对水剥夺的耐受性、降低的气孔导度和增加的对高渗胁迫的耐受性组成的组。此外，本发明多肽可包含比所述B-盒结构域更靠近C-末端的若干个特征性残基(signatureresidues)。这些残基包含，按从N到C末端的顺序：

W-X₃-G(SEQIDNO：62，其中X代表任何氨基酸；见图4D)

R-X₃-A-X₃-W(SEQIDNO：57，其中X代表任何氨基酸，见图4D)

和

EGWXE(SEQIDNO：58；其中X代表任何氨基酸；见图4E)

本发明表达载体以及由此所述的转基因植物包含推定的转录因子多核苷酸序列和特别地，B-盒锌指序列。当在植物中过表达本发明的这些多肽中的任何一种时，所述多肽赋予该植物至少一种调节活性，所述调节活性进而表现为选自由下述组成的组的性状：与对照植物相比增加的产量、更高的高度、增加的次生生根作用、更强的耐寒性、更强的对水剥夺的耐受性、降低的气孔导度、改变的C/N敏感、增加的低氮耐受性、增加的低磷耐受性和增加的对高渗胁迫的耐受性。

本发明还涉及由本发明任何转基因植物生产的转基因种子和制备本发明转基因植物和转基因种子的方法。

序列表和附图简述

序列表提供本发明示例性多核苷酸和多肽序列。与使用所述序列相关的性状包括在实施例中。

序列表的CD-ROM拷贝1和拷贝2，和根据CFR部分1.821(e)的CRF拷贝是只读型计算机可读光盘。每个拷贝包含一份ASCII文本格式的序列表。序列表命名为“MBI0076.ST25.txt”，每份CD-ROM上包含的所述序列表的电子文件创建于2007年6月12日，大小为83千字节。CD-ROM盘上的序列表拷贝通过引用整体整合入本文。

图1显示显花植物在目级水平上的系统发育关系的保守估计性(根据Soltis等(1997)修改)。具有单子叶的植物(单子叶植物)是一个单系支，该支镶嵌在至少两个双子叶植物的谱系内；真双子叶植物进一步分为蔷薇分支和菊分支。拟南芥(Arabidopsis)是属于十字花目(Brassicales)的蔷薇分支真双子叶植物；水稻是单子叶植物禾本目(Poales)的成员。图1是根据Daly等(2001)进行的改编。

图2显示描述高等植物类群，包括包含番茄和拟南芥的进化枝的系统发育关系的系统发生树状图(dendogram)；根据Ku等(2000)；和Chase等(1993)改编。

在图3中，使用ClustalW(CLUSTALW多序列比对程序，1.83版，2003)构建了G1988和相关全长蛋白的系统发育树和多序列比对。ClustalW多重比对参数如下：

开放缺口(GapOpening)罚分：10.00

延伸缺口(GapExtension)罚分：0.20

延迟分化序列(Delaydivergentsequence)：30％

DNA转换权重：0.50

蛋白权重矩阵：Gonnet系列

DNA权重矩阵：IUB

使用负矩阵：关闭

然后在MEGA2软件(MEGA2(http://www.megasoftware.net)中使用邻接算法(neighborjoiningalgorithm)和p-距离(p-distance)模型，使用FastA格式化的比对生成系统发育树。通过使用1000份复制引导和将随机种子(RandomSeed)设为默认，测试系统发生。引导树的阈(cutoff)值设为50％。G1988的近缘(Closely-related)同源序列被认为是那些位于引导值74之下的树节点(边界为G4011和G4009，用围绕这些序列的框指示)内的蛋白。祖先序列用图3中箭头指示的引导值为74的树节点表示。缩略词：At-拟南芥(Arabidopsisthaliana)；Ct-甜橙(Citrussinensis)；Gm-大豆(Glycinemax)；Os-水稻(Oryzasativa)；Pt-毛果杨(Populustrichocarpa)；Zm-玉米(Zeamays)。

图4A-4F显示G1988进化枝和相关蛋白的ClustalW比对。每个基因标识符(GeneIDentifier，GID)后的括号内显示SEQIDNO。G1988进化枝的一些成员在图4A-4F的每个图中均显示为大型盒。在图4A-4B中，高度保守的B-盒锌指(ZF)保守结构域(B结构域)用比对下面的水平线标出。图4D和4E中，位于C末端之外并且比所述B结构域更加靠近C末端的特性基序内的多个特性或特征性残基用小暗三角表示。

图5显示在G1988拟南芥过表达系(OE系10、12和8-2；横轴)中测量的叶SPAD叶绿素水平(SPAD或“土壤-植物分析模式(SoilPlantAnalysisDevelopment)”，使用MinoltaSPAD-502叶叶绿素测量仪测量，纵轴)的平均测量值。同时还显示了所述三个实验系的对照植物(Cntl)的测量值。植物在10小时光、0.1mMNH₄NO₃、前抽薹(pre-bolting)下生长，种植7.5周后进行分析。误差条代表所述平均值的标准偏差。三个G1988系在低氮条件下具有比对照更高的叶绿素含量。10和12系获得的结果在p<0.01下显著。

图6比较了在2004年和2005年的田间试验中，过表达G1988(35S::G1988)在转基因大豆的各个系(横轴)中对产量的影响(纵轴：产量百分比的变化)。数据取多个位置的平均，观察到，与含有空构建体的对照相比，产量存在一致性增加。在2005年的分析中，G1988显著增加了19个位置中17个位置的产量。如果从所述分析中除去系4，其与此图中显示的其它系不同，则显示很少或不显示G1988在叶组织中的表达，2005年的平均产量增加为约6.7％。

图7显示2005年获得的实验数据，种子来自加利福尼亚州的田间试验，比较了野生型对照大豆系和大豆的许多35S::G1988过表达系。点线代表野生型萌发百分比线。其上的短划线代表最终生产的产量比对照略有增加的低过表达子。所述低过表达子之上的更深的实线代表与对照相比，在寒冷条件下显示出更高的表达程度，最终生产显著更高的产量和改善的萌发的其它35S::G1988过表达子。使用同一年从一个在堪萨斯州执行的田间试验和两个在伊利诺斯州执行的田间试验中产生的种子获得了相似的结果。这些数据证实G1988过表达造成大豆改善的冷萌发。

图8比较了来自所述加利福尼亚州田间试验的大豆的总萌发。对照(点线)的萌发较差，并且注意到，所述种子中有高百分比的种子为“硬实种子”，一种胁迫诱导的产生在标准条件下对抗吸胀的种子的现象。对照点线下方的短划线代表低表达子，所述低表达子显示为与对照具有相似的硬实种子百分比，即相同百分比在不同时间点均不萌发的种子。

对照和低表达子下方的较深的实线代表具有比对照更低的硬实种子百分比，最终生产更高的产量的其它35S::G1988过表达系。

图9显示在过表达许多序列的各种大豆系中观察到的，相对于“0”系代表的亲本对照系，含荚的主茎节的平均数。阴影条指示G1988过表达系，其一般产生显著高于对照植物的荷荚节数。

图10证实了为什么大豆株高的增加主要是因为该植物上部节间长度的增加，所述株高的增加是G1988过表达在短日周期(10小时光照，14小时黑暗)的特性。转基因系和对照系之间最容易观察到的差异观察于第8至第12节间。因此G1988转基因植物和对照的株高差异在生长期后期得到加强。这些实验中使用的对照未转化系用空白条表示。阴影条显示过表达子系178的节间长度(单位：厘米)。

图11显示种植密度田间试验的结果。如此图所示，相对于不过表达G1988的对照植物(空心圆圈)或G1988的表达程度低于高产量转基因系(实心圆圈)(约低40％)的系217转基因植物，过表达G1988的大豆在一系列种植密度下显示出可观察的产量增加。植株密度计数(Plantstandcount)对可收获产量贡献不大。过表达子系178植物用空心三角表示。过表达子系189植物用实心三角表示。过表达子系209植物用空心方块表示。过表达子系200植物用实心方块表示。过表达子系213植物用星形表示。

图12说明大豆中G1988(SEQIDNO：2)的组成型过表达促进萌发。已显示增加大豆产量的(系218，空心菱形；和系178，空心三角)过表达G1988的转基因植物一般展示出高于系217的萌发百分比，系217的G1988表达程度低于高产量转基因系(实心圆圈)和未转化的对照植物(空心圆圈)。在这些实验中，种子在1.0μM赤霉酸中萌发。

详细说明

本发明涉及用于修饰植物表型，特别是那些与相对于对照植物(例如，野生型植物)增加的非生物胁迫耐受性和增加的产量有关的表型的多核苷酸和多肽。在本说明书全文中，涉及和/或特异性结合了各种信息来源。所述信息来源包括学术期刊论文、专利文件、教科书和万维网浏览器非活动性页面地址。虽然对这些信息来源的引用清楚地表明它们可为本领域技术人员使用，但是无论是否指出“通过引用结合”的具体说法，本文引用的各种各样的信息来源均整体特异性结合入本文。

可依赖和使用所述各种各样的信息来源的内容和教义来制备和使用本发明的实施方案。

如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数含义，除非文中明确指示其它。因此，例如，“宿主细胞”的含义包括多个所述宿主细胞，“胁迫”的含义是指一种或多种胁迫和本领域技术人员已知的其相等物等。

定义

“多核苷酸”是包含多个聚合的核苷酸，例如，至少约15个连续的聚合核苷酸的核酸分子。多核苷酸可以是核酸、寡核苷酸、核苷酸或其任何片段。在许多情况下，多核苷酸包含编码多肽(或蛋白)或其结构域或片段的核苷酸序列。此外，所述多核苷酸可包含启动子、内含子、增强子区域、多聚腺苷酸化位点、翻译起始位点、5'或3'非翻译区、报告基因、选择标记或类似物。所述多核苷酸可以是单链或双链DNA或RNA。任选地，所述多核苷酸包含修饰的碱基或修饰的主链。所述多核苷酸可以是，例如，基因组DNA或RNA、转录子(如mRNA)、cDNA、PCR产物、克隆的DNA、合成的DNA或RNA或类似物。所述多核苷酸可以与糖、脂、蛋白或其它物质联合以执行特定活性如转化或形成有用的组合物如肽核酸(PNA)。所述多核苷酸可包含有义或反义方向的序列。“寡核苷酸”与术语扩增子、引物、寡聚体、元件、靶和探针大致相当，并且优选为单链。

“重组多核苷酸”是未处于其天然状态的多核苷酸，例如，所述多核苷酸包含自然界中不存在的核苷酸序列，或所述多核苷酸处于其天然存在环境之外的环境，例如，与其天然状态下通常接近的核苷酸序列分开或与其通常不接近的相邻(或邻近)的核苷酸序列分开。例如，所述序列可以克隆至载体或以其它方式与一个或多个其它核酸重组。

“分离的多核苷酸”是存在于天然发现其的细胞之外的，纯化或未纯化的，天然存在的或重组的多核苷酸。任选地，分离的多核苷酸经过一个或多个富集或纯化方案，例如，细胞裂解、提取、离心、沉淀或类似方案。

“基因”或“基因序列”指基因的部分或完整编码序列、其互补序列和其5'或3'非翻译区。基因还是遗传的功能单位，并且在物理学术语上是沿参与生产多肽链的DNA(或对于RNA病毒，为RNA)分子的特定核苷酸片段或序列。后者可经后续加工如化学修饰或折叠以获得功能性蛋白或多肽。基因可以是分离的、部分分离的或存在于生物体的基因组中。

作为实例，转录因子基因编码转录因子多肽，所述转录因子多肽可以是功能性的或需要加工才能行使引发转录的功能。

可操作地，基因可通过顺反测试确定，所述顺反测试是确定两个突变是否发生在同一基因并可用于确定最小遗传活性单位的遗传测试(Rieger等(1976))。基因一般包括位于编码区之前(“前导区”；上游)和之后(“尾随区”；下游)的区域。基因还可包括位于单独的编码区段(称为“外显子”)之间的插入的非编码序列(称作“内含子”)。大多数基因具有相关的启动子区域，其是位于转录起始密码子5'的调节序列(一些基因没有可鉴定的启动子)。基因的功能还可受增强子、操纵子和其它调节元件的调节。

“多肽”是包含多个连续的聚合氨基酸残基例如，至少约15个连续的聚合氨基酸残基的氨基酸序列。在许多情况下，多肽包含为转录因子或其结构域或部分或片段的聚合氨基酸残基序列。此外，所述多肽可包含：(i)定位结构域；(ii)活化结构域；(iii)抑制结构域；(iv)寡聚结构域；(v)蛋白-蛋白相互作用结构域；(vi)DNA-结合结构域；或类似物。所述多肽任选地包含修饰的氨基酸残基、天然存在的非密码子编码的氨基酸残基、非天然存在的氨基酸残基。

“蛋白”指天然存在的或合成的氨基酸序列、寡肽、肽、多肽或其部分。

如本文所用，“部分”指蛋白用于任何用途，但是尤其是用于筛选与所述部分特异性结合的分子文库或用于生产抗体的任何部分。

“重组多肽”是通过翻译重组多核苷酸生产的多肽。“合成的多肽”是通过使用本领域公知的方法连续聚合分离的氨基酸残基生成的多肽。“分离的多肽”(天然存在的或重组的多肽)是在细胞中(或细胞外)比其在野生型细胞中的天然状态下更富集的多肽，例如，大于约5％富集、大于约10％富集或大于约20％或大于约50％或更高富集，即，可选地表示：相对于归一化为100％的野生型为105％、110％、120％、150％或更多富集。此富集不是野生型植物天然响应的结果。可选地，或此外，所述分离的多肽与其通常结合在一起的其它细胞组分分开，例如通过本文所述各种蛋白纯化方法的任何方法。

“同源性”指参考序列和新测序的克隆插入物或其编码的氨基酸序列的至少一个片段之间的序列相似性。

“同一性”或“相似性”指两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性，而同一性的比较更加严格。术语“同一性百分比”和“％同一性”指比较两个或多个多核苷酸序列或两个或多个多肽序列时得到的序列相似性百分比。

“序列相似性”指两个或多个多核苷酸序列之间碱基配对序列的相似性百分比(通过任何适用方法确定)。两个或多个序列可以具有0-100％或其间的任何整数值的相似性。同一性或相似性可通过比较各个序列中的位置来确定，所述各个序列可出于比较目的而排列。当被比序列中的位置被相同的核苷酸碱基或氨基酸占据时，则所述分子在该位置处是相同的。多核苷酸序列之间的相似性或同一性程度是所述多核苷酸序列共有的位置处相同、匹配或相应的核苷酸的数量的函数。多肽序列的同一性程度是所述多肽序列共有的相应位置上相同的氨基酸的数量的函数。多肽序列的同源性或相似性程度是所述多肽序列共有的相应位置上的氨基酸的数量的函数。

“比对”指通过纵向比较排列多个核苷酸碱基或氨基酸残基序列，以便可以目测并容易鉴定共有的组成(即相应位置处的核苷酸碱基或氨基酸残基)。共有的组成的分数或百分比与所述序列之间的同源性或同一性有关。如图4A-4F所示比对可用于鉴定保守结构域和这些结构域内的相关性。比对可合适地通过本领域已知的计算机程序，如MACVECTOR软件(1999)(Accelrys.Inc.，SanDiego，CA)确定。

如本文所用，“保守结构域”或“保守区”指异源的多核苷酸或多肽序列中在不同序列之间具有相当高的序列同一性的区域。如在B-盒锌指家族的多肽成员中发现的“B-盒锌指”结构域是保守结构域的一个实例。对于编码本文所公开的多肽的多核苷酸，保守结构域优选地长至少9个碱基对(bp)。本文所公开的多肽的保守结构域指多肽家族内表现出与本发明多肽的保守结构域(例如，SEQIDNO：45-56的任一项)具有较高程度的序列同源性的结构域，所述序列同源性如至少约56％序列同一性、或至少约58％序列同一性、或至少约60％序列同一性、或至少约65％、或至少约67％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％氨基酸残基序列同一性。拥有或编码符合所述同一性百分比标准的保守结构域和具有与本发明多肽序列相当的生物活性，进而是G1988进化枝多肽成员的序列包括在本发明内。可以称片段或结构域位于特定多肽类群、家族或亚家族已知存在或存在的保守结构域、一致性序列或一致性DNA-结合位点之外。

在这种情况下，所述片段或结构域将不包括转录因子类群、家族或亚家族的一致性序列或一致性DNA-结合位点的准确氨基酸、或特定转录因子一致性序列或一致性DNA-结合位点的准确氨基酸。而且，如果多肽或编码多肽的多核苷酸的特定的片段、区域或结构域的所有氨基酸均落在确定的多肽或蛋白的保守结构域之外，则所述片段、区域或结构域可“位于保守结构域之外”。具有较低的同一性程度但是具有相当的生物活性的序列被认为是等效物。

本领域普通技术人员理解，保守结构域可鉴定为与特定一致性序列具有同一性的区域或结构域(例如见Riechmann等(2000a、2000b))。因此，可通过使用本领域公知的比对方法，确定植物多肽，例如B-盒锌指蛋白(Putterill等(1995))的保守结构域。

表1列出了本发明许多多肽序列的保守结构域。此外，表1所述多肽具有用氨基酸同等物起始和终止位点特异性指出的保守结构域。对这些多肽区域的比较允许本领域技术人员(例如见Reeves和Nissen(1990、1995))鉴定本说明书列出或引用的任何多肽的结构域或保守结构域。

“互补”指通过嘌呤和嘧啶之间的碱基配对形成的天然氢键结合。例如，序列A-C-G-T(5'->3')与其互补序列A-C-G-T(5'->3')或A-C-G-U(5'->3')形成氢键。如果仅有一些核苷酸结合，则两个单链分子可被视为部分互补，或如果所有核苷酸均结合则被视为“完全互补”。核酸链之间的互补程度影响杂交和扩增反应的效率和强度。“完全互补”指在一对序列中，每个碱基对和其互补序列均发生结合，并且所述两个序列具有相同数量的核苷酸的情况。

术语“高度严格”或“高度严格条件”指允许序列高度互补的DNA链杂交的条件，其中所述相同条件排斥显著错配的DNA的杂交。能够在严格条件下与本发明所述多核苷酸杂交的多核苷酸序列可以是，例如，所公开的多核苷酸序列的变体，包括等位基因或剪接变体或编码本发明所公开的多肽的直系同源物或旁系同源物的序列。Kashima等(1985)、Sambrook等(1989)和Haymes等(1985)详细公开了核酸杂交方法，这些参考文献通过引用结合入本文。

一般而言，严格性是通过杂交和漂洗方案中使用的温度、离子强度和变性剂的浓度(例如，甲酰胺)确定的(有关建立和确定严格性的更详细的描述，请见下文的“通过杂交鉴定多核苷酸或核酸”一节)。两个核酸在不同严格性条件下的杂交程度与其相似性程度有关。

因此，来自不同来源，如在植物的基因组内(如在旁系同源物的情况下)或来自另一植物(如在直系同源物的情况下)的，可能执行相似功能的相似的核酸序列，可根据它们与已知的相关多核苷酸序列杂交的能力进行分离。执行核酸杂交以分离与本领域已知的序列具有相似性的相关多核苷酸序列的条件和方法可以有许多变化，并且不限于本文明确公开的条件和方法。此方法可用于分离与所公开的多核苷酸序列具有不同程度的相似性的多核苷酸序列，例如，所述多核苷酸序列编码与所公开的序列的保守结构域具有56％或更大的同一性的转录因子。

术语“旁系同源物”和“直系同源物”在下文题为“直系同源物和旁系同源物”一节中定义。简单来说，直系同源物和旁系同源物是具有相似序列和功能的进化相关的基因。直系同源物是不同物种中结构相关的基因，其通过物种形成事件产生。旁系同源物是单个物种内的结构相关基因，其通过复制事件产生。

术语“对等物”描述从其最后共同祖先开始的功能保守的一组同源蛋白的成员。相关蛋白归组为对等物家族，其它则归组为具有其它分级定义的同源性类型的蛋白家族。此定义见基因组研究所(InstituteforGenomicResearch，TIGR)万维网(www)网站“tigr.org”，标题“TermsassociatedwithTIGRFAMs”(TIGRFAM相关术语)。

一般而言，术语“变体”指其碱基或氨基酸序列分别与参考(天然)多核苷酸或多肽相比具有一些合成或天然产生的差异的分子。这些差异包括天然多核苷酸或氨基酸序列的置换、插入、缺失或此类变化的任何需要的组合。

对于多核苷酸变体，本发明所公开的多核苷酸和多核苷酸变体之间的差异具有限制，以便前者与后者的核苷酸序列大体上密切相似并且在许多区域是相同的。由于遗传密码的简并性，前后两个核苷酸序列之间的差异可能是沉默的，即，由所述多核苷酸编码的氨基酸是相同的，所述变体多核苷酸序列与本发明所公开的多核苷酸编码相同的氨基酸序列。变体核苷酸序列可编码不同的氨基酸序列，在这种情况下，所述核苷酸差异将导致相对于所述相似的公开的多核苷酸序列的氨基酸置换、添加、缺失、插入、截断或融合。这些变异可生成编码共有至少一个功能特性的多肽的多核苷酸变体。除了序列表中指出的序列之外，遗传密码的简并性还指示许多不同的变体多核苷酸可以编码相同和/或大致相似的多肽。

本发明还包括序列表中列出的核酸的变体，即与序列表中的多核苷酸序列之一具有不同序列或互补序列的核酸，其编码相等功能的多肽(即，具有一些程度的相等或相似生物活性的多肽)，

但是由于遗传密码的简并性，其序列与序列表中的序列不同。此定义包括可使用特定的所述编码多肽的多核苷酸的寡核苷酸探针容易或不容易检测的多态性和不适当或出乎意料地与等位基因变体的杂交，所述等位基因变体具有与所述编码多肽的多核苷酸序列的正常染色体位点不同的位点。

“等位基因变体”或“多核苷酸等位基因变体”指占据相同的染色体位点的基因的两个或多个可选形式的任一形式。等位基因变异是通过突变自然产生的，并可在群体内造成表型多态性。基因突变可以是“沉默的”或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。“等位基因变体”和“多肽等位基因变体”也可用于指多肽，在这种情况下，该术语指由基因的等位基因变体编码的多肽。

如本文所用，“剪接变体”或“多核苷酸剪接变体”指从基因转录的可选形式的RNA。剪接变异是由于单个转录的RNA分子内或分别转录的RNA分子之间的可选剪接位点而自然发生的，其可生成从同一基因转录的多个不同形式的mRNA。因此，剪接变体可编码具有不同氨基酸序列的多肽，所述多肽在生物体内可具有相似或不相似的功能。“剪接变体”或“多肽剪接变体”也可用于指由转录的mRNA的剪接变体编码的多肽。

如本文所用，“多核苷酸变体”还可指编码本发明所公开的多肽序列的旁系同源物和直系同源物的多核苷酸序列。“多肽变体”可指为本发明所公开的多肽序列的旁系同源物和直系同源物的多肽序列。

本发明所公开的多肽和多肽变体之间的差异有限，以使前者和后者的序列整体密切相似，并且在许多区域相同。本发明所公开的多肽序列和相似的多肽变体的氨基酸序列可存在一个或多个置换、添加、缺失、融合和截断的差异，所述差异可以任何组合存在。这些差异可产生沉默的变化并生成功能相当的多肽。因此，本领域技术人员将容易理解，多核苷酸序列的任何变体均能够编码本发明所述多肽和同源多肽。多肽序列变体可具有“保守的”变化，其中置换的氨基酸具有相似的结构或化学性质。因此，可根据所述残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性方面的相似性进行故意的氨基酸置换，只要保留所述多肽大部分的功能或生物活性。例如，带负电荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸，带正电荷的氨基酸可包括赖氨酸和精氨酸，具有不带电荷的极性头基并具有相似的亲水性值的氨基酸可包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。

较罕见地，变体可具有“非保守的”变化，例如用色氨酸置换甘氨酸。相似的小变异还可包括氨基酸缺失或插入或二者兼有。相关的多肽可包含例如，一个或多个N-连接或O-连接糖基化位点的添加和/或缺失或一个或多个半胱氨酸残基的添加和/或缺失。确定哪些和多少氨基酸残基可被置换、插入或缺失而不消除功能或生物活性的原则可使用本领域公知的计算机程序，例如DNASTAR软件(见USPN5,840,544)找到。

对于多核苷酸，“片段”指保留有用的，有功能的特性的多核苷酸分子的克隆或任何部分。有用的片段包括可用于杂交或扩增技术或调节复制、转录或翻译的寡核苷酸和多核苷酸。“多核苷酸片段”指多核苷酸的任何子序列，所述子序列通常是本文提供的任何序列的至少约9个连续的核苷酸、优选地至少约30个核苷酸、更优选地至少约50个核苷酸。示例性多核苷酸片段是序列表中列出的多核苷酸的前60个连续的核苷酸。示例性片段还包括包含编码多肽的保守结构域的区域的片段。示例性片段还包括包含多肽的保守结构域的片段。示例性片段包括包含多肽的保守结构域的片段，所述保守结构域例如，G1988的第5-50位氨基酸残基(SEQIDNO：2)、G4004的第6-51位氨基酸残基(SEQIDNO：4)或G4005的第6-51位氨基酸残基(SEQIDNO：6)。

片段还可包括多肽和蛋白分子的子序列或所述多肽的子序列。片段可因它们具有抗原潜能而拥有多种用途。在一些情况下，所述片段或结构域是以与所述完整多肽大致相同的方式或相似的程度，执行所述完整多肽的至少一种生物功能的多肽的子序列。例如，多肽片段可包含可识别的结构基序或功能结构域，如与DNA启动子区、激活结构域或蛋白-蛋白相互作用结构域结合并可启动转录的DNA-结合位点或结构域。片段的大小可从少至3个氨基酸残基至所述完整多肽的全长不等，但是优选地至少约30个氨基酸残基长，更优选地至少约60个氨基酸残基长。

本发明还包括完全通过化学合成生产编码多肽和其衍生物或片段的DNA序列。生产之后，可使用本领域公知的试剂将所述合成序列插入许多可用表达载体和细胞系统的任一项中。此外，合成化学可用于向编码多肽或其任何片段的序列引入突变。

“衍生物”指核酸分子或氨基酸序列的化学修饰。化学修饰可包括用烷基、酰基或氨基置换氢，或糖基化、聚乙二醇化或保留或增强所述分子或序列的生物活性或寿命的任何相似过程。

术语“植物”包括完整的植物、茎营养器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞叶、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花粉囊和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟的子房)、植物组织(例如，维管组织、基本组织及类似组织)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞及类似细胞)和后代的相同内容。可用于本发明方法的植物类群一般范围等同于适用于转化技术的高等和低等植物类群，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、马尾(horsetails)、裸蕨植物、石松植物(lycophytes)、苔藓类植物和多细胞藻类(见例如，图1，根据Daly等(2001)改编，图2，根据Ku等(2000)改编；和另请见Tudge(2000))。

如本发明所用，“对照植物”指用于与转基因或遗传修饰植物进行比较，以鉴定所述转基因或遗传修饰植物中增强的表型的植物细胞、种子、植物组分、植物组织、植物器官或完整植物。在一些情况下，对照植物可以是包含空载体或标记基因，但是不包含在待评估的转基因或遗传修饰植物中表达的本发明重组多核苷酸的转基因植物系。一般而言，对照植物是与测试的转基因或遗传修饰植物同系或同品种的植物。合适的对照植物将包括用于生成本文所述转基因植物的亲本系的遗传未改变或非转基因植物。

“转基因植物”指包含同一物种、品种或栽培变种的野生型植物中不存在的遗传物质的植物。所述遗传物质可包括转基因、插入诱变事件(如通过转座子或T-DNA插入诱变)、活化标记序列(activationtaggingsequence)、突变的序列、同源重组事件或通过嵌合修复术(chimeraplasty)修饰的序列。所述外源遗传物质通常是通过人工操作引入所述植物的，但是可以使用本领域技术人员承认的任何方法。

转基因植物可包含表达载体或表达盒。所述表达盒典型地包含可操作地连接至(即，处于其控制之下)适当的诱导型或组成型调节序列的编码多肽的序列，所述调节序列允许控制多肽的表达。所述表达盒可通过转化或通过在转化亲本植物后繁殖而引入植物。植物指完整的植物以及植物的部分，如种子、果实、叶或根、植物组织、植物细胞或任何其它植物材料，例如植物外植体以及其后代和模仿细胞中的生物化学或细胞组成或过程的体外系统。

如本文所用，“野生型”(“Wildtype”或“wild-type”)指未以实验方式进行遗传修饰或处理的植物细胞、种子、植物组分、植物组织、植物器官或完整植物。

野生型细胞、种子、组成、组织、器官或完整植物可用作比较其中多肽的表达发生改变的同一物种的细胞、组织或植物的表达水平和性状修饰的程度和性质的对照，所述改变例如，在所述物种中多肽被敲除、过表达或异位表达。

“性状(trait)”指植物或特定植物材料或细胞的生理、形态、生物化学或物理特性。在一些情况下，此特性为人眼可见的如种子或植物大小，或可通过生物化学技术测量，如检测种子或叶的蛋白、淀粉或脂肪含量，或可以通过观察代谢或生理过程测量，例如通过测量对水剥夺或特定盐或糖浓度的耐受性，或通过观察一个或多个基因的表达水平测量，例如通过利用Northern分析、RT-PCR、微阵列基因表达分析或报告基因表达系统，或通过农业观察如高渗胁迫耐受性或产量测量。不过，可以使用任何技术测量所述转基因植物中任何选择的化合物或大分子的量、相对水平或差异。

“性状修饰”指异位表达本发明多核苷酸或多肽的植物中的特性相对于未异位表达的植物如野生型植物的可检测差异。在一些情况下，所述性状修饰可以定量评估。例如，所述性状修饰可以带来在观察的性状中与对照或野生型植物相比至少约2％增加或降低或甚至更大的差异。已知所述修饰的性状可以是自然变异。因此，观察的性状修饰在所述植物中带来了与对照或野生型植物相比所述性状的正常分布和数量的变化。

当两个或多个植物具有“相似的形态”、“多个大致相似的形态”、“一个大致相似的形态”或是“形态相似的”时，所述植物具有相当的形式或外观，包括相似特征，如整体尺寸、高度、宽度、质量、根重、外形、光泽、颜色、茎直径、叶片大小、叶维度、叶密度、节间距、分枝、根系分枝、花序数量和形式和其它宏观特性，并且根据单独的形态特性不容易区分个体植物。

“调节”指由于分子和核酸分子或蛋白的特异性结合造成的活性(生物、化学或免疫的)或寿命的变化。

术语“转录谱”指处于特定状态的细胞中的一组基因的表达水平，特别是当与处于参考状态的相同类型的细胞中同一组基因的表达水平相比时。例如，悬浮细胞中特定多肽的转录谱是与具有正常水平的所述多肽的悬浮细胞中一组基因的表达水平相比，敲除或过表达所述多肽的细胞中同一组基因的表达水平。转录谱可以呈现为两个处理之间表达水平显著不同的基因及其差比值的列表。还可使用统计和聚类方法评估和计算表达水平的差异和相似度。

对于如本文所用的基因敲除，术语“敲除”指在所述植物或细胞中具有至少一个基因破坏的植物或植物细胞，其中所述破坏造成该基因编码的多肽的表达或活性与对照细胞相比降低。所述敲除可以是例如基因组破坏的结果，所述基因组破坏包括转座子、定向诱导基因组局部突变技术(tilling)和同源重组、反义构建体、有义构建体、RNA沉默构建体或RNA干扰。基因内的T-DNA插入是可消除所述基因的表达的基因型改变的实例。

对于多核苷酸，“异位表达或改变的表达”指在例如转基因植物或植物组织中的表达模式不同于在同一物种的野生型植物或参考植物中的表达模式。所述表达模式还可与同一物种的野生型植物中的参考表达模式进行比较。例如，所述多核苷酸或多肽表达的细胞或组织类型不同于所述序列在野生型植物中表达的细胞或组织类型，或其表达时间不同于所述序列在野生型植物中的表达时间，或其对不同诱导剂如激素或环境信号的响应或其表达水平不同于(更高或更低)野生型植物。该术语还指通过将表达水平降低至检测水平之下或完全消除表达产生的改变的表达模式。所得的表达模式可以是瞬时的或稳定的、组成的或诱导的。对于多肽，术语“异位表达或改变的表达”进一步涉及由所述多肽与外源或内源调节子的相互作用或与因子的相互作用或由于所述多肽的化学修饰造成的改变的活性水平。

如本文所用，术语“过表达”指与在野生型植物、细胞或组织中的表达相比，基因在植物、植物细胞或植物组织中，在所述基因的任何发育或时间阶段具有更大的表达水平。过表达可发生于例如，所述基因编码一个或多个处于强启动子(例如，花椰菜花叶病毒35S转录起始区)控制之下的多肽时。过表达还可处于诱导型或组织特异性启动子控制之下。因此，依赖于所用的启动子，过表达可发生于整个植物内、所述植物的特定组织中或无论是否存在特定的环境信号。

过表达可发生于正常情况下缺乏与本发明所述多肽功能相当或相同的多肽的表达的植物细胞。过表达可发生于下述植物细胞：虽然其中正常情况下发生本发明所述多肽或具有相当功能的分子的内源表达，但是所述正常表达是在较低的水平。因此，过表达造成所述多肽在植物、细胞或组织中大于正常的生产或“过生产”。

术语“转录调节区”指在植物中调节一个或多个基因的表达的DNA调节序列，所述调节发生于当转录因子具有与所述DNA调节序列结合的一个或多个特异性结合结构域时。转录因子拥有保守结构域。所述转录因子还包含形成转录激活结构域的氨基酸子序列，

当所述转录因子与所述调节区结合时，所述转录激活结构域调节一个或多个非生物胁迫耐受性基因在植物中的表达。

“产量”或“植物产量”指增加的植物生长、增加的作物生长、增加的生物质和/或增加的植物产物生产，并在某种程度上依赖于温度、植物大小、器官大小、种植密度、光、水和营养有效性，和植物如何应对各种胁迫，如通过温度驯化和水或营养利用效率。

“种植密度”指每英亩可以种植的植物的数量。对于作物物种，种植或群体密度随作物种类、种植区域和年份而变化。以玉米为例，在美国密苏里州，2000年的平均优势密度在每英亩20,000-25,000株范围内。理想的更高的群体密度(测量产量)为至少每英亩22,000株，更理想的更高的群体密度为至少每英亩28,000株，更优选地至少每英亩34,000株，和最优选地至少每英亩40,000株。2000年美国的一些其它作物植物的每英亩平均优势密度如下：小麦1,000,000-1,500,000；水稻650,000-900,000；大豆150,000-200,000、油菜260,000-350,000、向日葵17,000-23,000和棉花28,000-55,000株/英亩(Cheikh等(2003)，第20030101479号美国专利申请)。对于所述每个实例以及其它有价值的植物物种，理想的更高的群体密度为比平均优势密度或产量高至少10％。

具体实施方案说明

转录因子修饰内源基因的表达

转录因子可包括但不限于任何可以激活或抑制单个基因或许多基因的转录的多肽。如本领域普通技术人员理解的，可通过与特定一致性序列具有结构相似性或同一性的区域或结构域的存在或特定一致性DNA-结合基序的存在鉴定转录因子(例如见Riechmann等(2000a))。本发明植物转录因子属于B-盒锌指家族(Putterill等(1995))，是推定的转录因子。

一般而言，转录因子参与细胞分化和增殖以及生长的调节。因此，本领域技术人员应理解，通过在植物中表达本发明序列，技术人员可改变自体基因的表达或诱导引入的基因的表达。通过影响植物中具有本发明序列生物活性的相似的自体序列的表达或通过将本发明序列引入植物，技术人员可将植物的表型改变为具有改善的与渗透胁迫相关的性状的表型。本发明序列还可用于转化植物并引入野生型栽培变种或株系中不存在的需要的性状。然后可选择产生最需要的程度的感兴趣的靶基因的过表达或低表达和一致的性状改善的植物。

本发明序列可以天然存在的形式来自任何物种，特别是植物物种或来自任何天然、合成、半合成或重组来源。

本发明序列还可包括本发明氨基酸序列的片段。其中所述“氨基酸序列”指天然存在的蛋白分子的氨基酸序列，“氨基酸序列”和类似术语不意味着将所述氨基酸序列限制为与所述蛋白分子相关的完整天然氨基酸序列。

除了通过利用本文描述的本发明一个或多个多核苷酸和多肽修饰植物表型的方法之外，本发明多核苷酸和多肽还具有多种其它用途。这些用途包括它们在下述方面的使用：蛋白的重组生产(即表达)；作为植物基因表达的调节子、作为检测互补或部分互补核酸的存在(包括用于天然编码核酸的检测)的诊断探针；作为进一步反应，例如突变反应、PCR反应或诸如此类的底物；作为克隆，例如包括消化或连接反应的底物；和用于鉴定所述转录因子的外源或内源调节子。所述多核苷酸可以是例如，基因组DNA或RNA、转录子(如mRNA)、cDNA、PCR产物、克隆的DNA、合成的DNA或RNA或类似物。所述多核苷酸可包含有义或反义方向的序列。

编码修饰内源基因、多核苷酸和蛋白的表达的多肽的基因的表达在本领域为公知。此外，包含分离的编码转录因子的多核苷酸的转基因植物还可修饰内源基因、多核苷酸和蛋白的表达。实例包括Peng等(1997)和Peng等(1999)。此外，许多其它实例已证实在外源植物物种中表达的拟南芥转录因子引起相同或非常相似的表型响应。例如见Fu等(2001)；Nandi等(2000)；Coupland(1995)；和Weigel和Nilsson(1995)。

在另一个实例中，Mandel等(1992b)和Suzuki等(2001)教导在另一植物物种中表达的转录因子引起与内源序列相同或非常相似的表型响应，如在拟南芥中的拟南芥转录因子的早期研究经常预见的一样(见Mandel等(1992a)；Suzuki等(2001))。其它实例包括Müller等(2001)；Kim等(2001)；Kyozuka和Shimamoto(2002)；Boss和Thomas(2002)；He等(2000)；和Robson等(2001)。

在另一个实例中，Gilmour等(1998)教导当在转基因植物中过表达拟南芥AP2转录因子CBF1时，其增加植物的耐冻性。Jaglo等(2001)进一步鉴定了甘蓝型油菜(Brassicanapus)中编码CBF样基因的序列和这些基因的转录子响应低温进行快速积累。还发现编码CBF样蛋白的转录子在小麦以及番茄中响应低温进行快速积累。对来自拟南芥、甘蓝型油菜、小麦、黑麦和番茄的CBF蛋白的比对揭示存在保守的连续氨基酸残基PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR，其将所述蛋白的AP2/EREBPDNA结合结构域括起，从而将它们与AP2/EREBP蛋白家族的其它成员区别开来(Jaglo等(2001))。

转录因子通过改变包含顺式作用核苷酸序列的基因的表达而介导细胞响应和控制性状，所述顺式作用核苷酸序列是引入的转录因子的靶。本领域已达成共识，转录因子对细胞响应或细胞性状的影响是通过特定基因确定的，所述基因的表达直接或间接(例如，通过转录因子结合事件和转录变化的级联反应)受转录因子结合的改变。在比较标准条件下和过表达转录因子条件下的转录的全局分析中，得到的与转录因子过表达相关的转录谱与受该转录因子控制的性状或细胞过程有关。例如，已显示，PAP2基因和MYB家族的其它基因通过调节已知参与花青素生物合成途径的基因的表达而控制花青素生物合成(Bruce等(2000)；和Borevitz等(2000))。此外，全局转录谱已成功用作特定细胞状态(例如，癌与非癌；Bhattacharjee等(2001)；和Xu等(2001))的诊断工具。因此，对本领域技术人员明显的是，过表达不同转录因子的转录谱的相似性将指示转录因子功能的相似性。

本发明多肽和多核苷酸

本发明包括推定的转录因子(TF)和分离的或重组的编码所述多肽的多核苷酸，或新序列变体多肽或编码衍生自序列表中提供的具体序列的多肽的新变体的多核苷酸；本发明重组多核苷酸可结合至表达载体以用于生产转化植物。同时还提供通过控制多个细胞过程改变植物器官或植物的种子的质量、大小或数量进而改变植物产量的方法，和增加植物对非生物胁迫的抗性的方法。这些方法是基于改变在不同的植物物种中可能保守的关键调节分子的表达的能力。相关的保守调节分子可最初发现于模式系统如拟南芥中，然后在其它植物物种中发现同源的功能分子。然后可将后者用于在不同植物物种中赋予增加的产量或非生物胁迫耐受性。

使用可公开获得的序列分析程序和参数在拟南芥(Arabidopsisthaliana)GenBank数据库中鉴定了编码本发明多肽的多核苷酸的示例。然后对初始鉴定的序列进行进一步的特征分析，以鉴定包含与已知多肽的家族中存在的序列基序相对应的指定的序列串的序列。此外，使用可公开获得的序列分析程序和参数进一步在植物GenBank数据库中鉴定了编码本发明多肽的多核苷酸的示例。然后对初始鉴定的序列进行进一步的特征分析，以鉴定包含与已知多肽的家族中存在的序列基序相对应的指定的序列串的序列。

通过使用对应于已知多肽的探针在低严格性杂交条件下筛选拟南芥和/或其它植物cDNA文库鉴定了本发明的其它多核苷酸。然后使用可商业获得的试剂盒根据生产商的说明，通过快速扩增cDNA末端(RACE)方案回收其它序列，包括全长编码序列。如有必要，执行多轮RACE以分离5'和3'末端。然后使用所述分离的5'和3'末端的特异性引物通过常规的末端对末端聚合酶链式反应(PCR)回收全长cDNA。序列表中提供了示例性序列。

序列表中许多衍生自不同植物物种的序列已在过表达植物中进行了异位表达。然后观察所述植物的一个或多个特性或一个或多个性状的变化，发现所述变化赋予增加的产量和/或增加的非生物胁迫耐受性。因此，所述多核苷酸和多肽可用于改善植物的需要的特性。

还在过表达植物细胞中异位表达了本发明多核苷酸，观察到所述植物细胞的许多基因、多核苷酸和/或蛋白的表达水平发生变化。因此，所述多核苷酸和多肽可用于改变植物或植物细胞的基因、多核苷酸和/或蛋白的表达水平。

本文呈现的数据代表在可在植物中进行表达以降低因生物和非生物胁迫而产生的产量损失的多核苷酸和多肽的实验中获得的结果。

G1988、G1988进化枝和相关序列的背景信息

G1988属于锌指蛋白CONSTANS-样家族，锌指蛋白是根据称作B-盒的锌指结构域进行定义的。所述B-盒与在动物转录因子中发现的蛋白-蛋白相互作用结构域(Robson等，2001；Borden，1998；Torok和Etkin，2001)具有同源性，并且G1988的B-结构域和其相近的同源进化枝成员具有相同的蛋白-蛋白相互作用能力。CONSTANS-样蛋白包含一个或两个N-末端B-盒基序(G1988进化枝包含一个N-末端B-盒结构域)。G1988和其来自其它物种的同源序列共有保守的C-末端基序，该基序定义与其它B-盒蛋白不同的清晰的进化枝，并一般包含图4D和4E中用三角和用SEQIDNO：62、57和58鉴定的特征性残基。G1988表达于许多组织。G1988和其同源序列在白天受到调节。

如下文的实施例所公开的，G1988在拟南芥中的组成型表达调节多个植物生长过程，包括与对照植物相比，下胚轴伸长、叶柄和上挺叶延长、提早开花；在磷酸盐限制培养基中增强的根和/或芽生长；对照培养基中更多的次生根、在添加谷氨酰胺的低氮/高蔗糖培养基中增强的生长和减少的花青素、在含盐培养基中增强的根生长和在含聚乙二醇培养基上增强的根生长。

已显示，G1988在大豆植物中的过表达造成田间试验中产量相比亲本系对照具有统计学显著的增加(见图6和下文的实施例)。

G1988进化枝包括从共同祖先序列遗传下来的多个序列，如图3中的系统发育树所示。所述祖先序列用图3中箭头指示的引导值为74的树节点代表。进化枝成员的实例包括图3中边界为G4011和G4009的框内的序列。目前发现的G1988进化枝的多肽成员，包括G1988和来自不同物种的在系统发育上相关的序列，包含多个特性结构特征，包括高度保守的B-结构域，如图4A和4B所示，和位于所述B结构域之外的更靠近C末端的多个特性或特征性残基。特征性残基在图4D和4E中用小暗三角指示。这些残基包含，按从N到C末端的顺序：

W-X₃-G(SEQIDNO：62，其中X代表任何氨基酸；见图4D)

R-X₃-A-X₃-W(SEQIDNO：57，其中X代表任何氨基酸；见图4D)以及：

EGWXE(SEQIDNO：58；其中X代表任何氨基酸；见图4E)。

因此，G1988进化枝序列可定义为具有高度保守的B结构域，所述B结构域的氨基酸序列与SEQIDNO：45具有至少56％的同一性。目前为止发现的G1988进化枝成员可进一步定义为具有下述氨基酸残基，所述氨基酸残基的特征在于在比所述B结构域更靠近C末端的对应于图4D中显示的第一个和第五个残基的位置处具有色氨酸残基和甘氨酸残基，和/或在于具有比所述色氨酸残基更靠近C末端的SEQIDNO：57，和/或在于具有比SEQIDNO：57更靠近C末端的SEQIDNO：58。

很可能是，G1988产物的异位表达可以影响光信号传导或下游的激素途径。根据上文描述的观察，G1988显示出参与光形态发生以及植物生长和发育。因此，其过表达可改善植物活力，进而解释了在35S::G1988大豆植物中观察到的产量增加，如下文所示。

已在其它植物物种中发现许多与G1988近缘的序列。表1显示本发明的许多多肽，并包括SEQIDNO(第1列)、所述序列从其中产生的物种和基因标识符(“GID”；第2列)、第1列中的多肽与全长G1988多肽(SEQIDNO：1)的同一性百分比(通过BLASTp分析(使用字符长(W)3、期望值(E)10和BLOSUM62评分矩阵)确定，Henikoff&Henikoff(1989、1991))(第3列)、每个序列的保守B-盒ZF结构域的氨基酸残基同等物(从n-末端开始的氨基酸同等物，第4列)、相应多肽的保守B-盒ZF结构域序列(第5列)；每个B-盒ZF结构域的SEQIDNO(第6列)，

和第5列中的保守结构域与拟南芥G1988序列的保守结构域SEQIDNO：45的同一性百分比(第7列)。

表1.G1988和近缘序列的保守结构域

表1的物种缩略词：At-拟南芥；Ct-甜橙；Gm-大豆；Le-番茄(Lycopersiconesculentum)；Os-水稻；Pt-毛果杨；Ta-小麦(Triticumaestivum)；Zm-玉米。

¹观察了拟南芥和大豆两种植物中的表型

表2和3列出了在至目前为止执行的实验中，过表达G1988或来自不同植物物种，(包括拟南芥、大豆、玉米(may)、水稻和番茄)的直系同源物赋予拟南芥、大豆或玉米植物的一些形态和生理性状。所有观察均基于未过表达G1988进化枝转录因子的对照植物。

表2.G1988同源序列和具有潜在价值的形态相关性状

*产量可通过形态改善和/或增加的对各种生理胁迫的耐受性而增加

表3.G1988同源序列和具有潜在价值的生理性状

表2和3的物种缩略词：At-拟南芥；Gm-大豆；Os-水稻；Sl-番茄(Solanumlycopersicum)；Zm-玉米

(+)指示阳性分析结果/观察到的表型相对于对照耐受性更强。

(-)指示阴性分析结果/观察到的表型相对于对照耐受性更差

空格-分析结果与对照相似

¹拟南芥植物中观察到的表型

²玉米植物中观察到的表型

³大豆植物中观察到的表型

n/d-尚未执行或完成的分析

N-改变的C/N敏感或低氮耐受性

P-磷

水剥夺耐受性通过基于土壤的干旱或基于平板的干燥分析而指示

高渗胁迫通过比对照具有对9.4％蔗糖的更大的耐受性而指示

增加的耐寒性通过在萌发或生长过程中比对照具有对8℃更大的耐受性而指示

改变的C/N敏感或低氮耐受性分析在减氮加3％蔗糖的基本培养基或减氮加3％蔗糖和1mM谷氨酰胺的基本培养基上执行；对于氮限制分析，80％MS培养基的氮源降低为20mg/LNH₄NO₃。

增加的低P耐受性通过在缺乏磷源的MS培养基上更好的生长而指示

降低的光敏感性表型通过相对于对照植物更长的叶柄、更长的下胚轴和/或朝上的叶指示

n/d－尚未执行或完成的分析

直系同源物和旁系同源物

如上所述的同源序列可包含直系同源或旁系同源序列。本领域技术人员已知多种不同的鉴定和确定这些功能同源序列的方法。本文描述了鉴定直系同源物和旁系同源物的一般方法，包括系统发育方法、序列相似性和杂交方法；可通过下文描述的一个或多个方法鉴定直系同源物或旁系同源物，包括对等物。

如Eisen(1998)GenomeRes.8:163-167所述，进化信息可用于预测基因功能。在序列上同源的基因群组具有不同但是通常相关的功能，这是很常见的。不过，在许多情况下，由于不是所有的同源序列都具有相同的功能，同源序列的鉴定不足以作出具体预测。因此，基于序列相似性的功能相关性的初步分析单独可能无法向技术人员提供确定在哪里相似性结束和功能相关性开始的方法。幸运的是，本领域公知，可以使用组合了相关物种的基因树的系统发育分析对蛋白功能进行分类。通过关注基因如何变得在序列上相似(即通过进化过程)而不是序列相似性本身，可极大地改进功能预测(Eisen，同上)。事实上，存在许多已显示其中基因功能与基因系统发生具有良好相关性的实例(Eisen，同上)。因此，“进行功能预测的第一步是生成代表感兴趣的基因和其同源序列的进化历史的系统发育树。此类树与鉴定序列相似性的聚类和其它方法不同，因为它们是通过帮助将相似性模式转化为进化关系的技术推断的...。推断出基因之后，将各种同源序列的生物学确定的功能覆盖到所述树上。最后，使用所述树的结构和不同功能的基因的相对系统发育位置跟踪功能变化的历史，然后使用该历史预测[目前]尚未鉴定的基因的功能”(Eisen，同上)。

在单个植物物种内，基因复制可产生特定基因的两个拷贝，从而产生两个或多个基因具有相似序列并且经常具有相似功能的基因(称为旁系同源物)。因此，旁系同源物是在同一物种内通过复制形成的相似的基因。

当使用程序如CLUSTAL分析基因家族系统发生时，旁系同源物典型地聚集在一起或在同一进化枝(一组相似的基因)(Thompson等(1994)；Higgins等(1996))。还可使用逐对(pair-wise)BLAST分析鉴定相似基因的群组(Feng和Doolittle(1987))。例如，来自拟南芥的非常相似的MADS结构域转录因子进化枝共有一个开花时间方面的共同功能(Ratcliffe等(2001))，来自拟南芥的一组非常相似的AP2结构域转录因子参与植物的耐冻性(Gilmour等(1998))。对落入同一进化枝的具有相似功能的相似基因的群组的分析可产生所述进化枝的特异性子序列。这些子序列(称为一致性序列)不仅可用于确定每个进化枝内的序列，而且可以确定这些基因的功能；进化枝内的基因可包含旁系同源序列或有相同功能的直系同源序列(例如，另请见Mount(2001))。

转录因子基因序列在不同真核生物种系之间是保守的(Goodrich等(1993)；Lin等(1991)；Sadowski等(1988))。植物不例外；不同植物物种拥有具有相似序列和功能的转录因子。物种形成(从亲本物种产生新物种)产生两个或多个具有相似序列和相似功能的基因。这些基因(称为直系同源物)通常在其宿主植物中具有相同的功能，并且通常可以在物种间交换而不损伤功能。因为植物具有共同的祖先，所以任何植物物种中都有许多基因在另一植物物种中具有相应的直系同源基因。使用程序如CLUSTAL(Thompson等(1994)；Higgins等(1996))构建一个物种的基因家族的系统发生树之后，可以将可能的直系同源序列置于所述系统发育树上，从而可以确定它们与来自感兴趣的物种的基因的关系。还可通过相互BLAST策略鉴定直系同源序列。鉴定直系同源序列之后，可根据参考序列的所鉴定的功能推断直系同源物的功能。

通过使用系统发育分析，本领域技术人员应理解，推断近缘多肽赋予的相似功能的能力是可预测的。此可预测性已得到我们自身的许多研究的证实，在所述研究中，我们发现许多多肽具有与第一个近缘参考序列行使相同功能的直系同源或近缘同源序列。例如，不同的转录因子，包括：

(i)AP2家族拟南芥G47(见第7,135,616号美国专利)，一个来自大豆的在系统发育上相关的序列和两个来自水稻的在系统发育上相关的同源序列均可赋予与对照植物相比更大的干旱耐受性、高渗胁迫耐受性或延迟的开花；

(ii)CAAT家族拟南芥G481(见PCT专利公布WO2004076638)，和许多来自真双子叶植物和单子叶植物的在系统发育上相关的序列可赋予与对照植物相比更大的对干旱相关胁迫的耐受性；

(iii)Myb相关拟南芥G682(见第7,223,904和7,193,129号美国专利)和许多来自真双子叶植物和单子叶植物的在系统发育上相关的序列可赋予与对照植物相比更大的对热、干旱相关胁迫、冷和盐的耐受性；

(iv)WRKY家族拟南芥G1274(见第7,196,245号美国专利)和许多来自真双子叶植物和单子叶植物的近缘序列已显示赋予增加的水剥夺耐受性，和

(v)AT-hook家族大豆序列G3456(见第20040128712A1号美国专利公布)和许多来自真双子叶植物和单子叶植物的在系统发育上相关的序列，当这些序列在植物中过表达时，与对照植物相比增加了生物质。

所述多肽序列属于不同的多肽进化枝，所述进化枝包括来自不同物种的成员。在每种情况下，衍生自真双子叶植物和单子叶植物的大多数或全部进化枝成员序列已显示在过表达时赋予增加的产量或对一种或多种非生物胁迫的耐受性。这些研究均证实来自不同物种的进化上保守的基因很可能具有相似的功能(即，通过调节相似的靶序列和控制相同的性状)，并且来自一个物种的多核苷酸可转化近缘或远缘植物物种以赋予或改善性状。

如表1所示，与本发明多肽在系统发育上相关的多肽可具有共有至少56％、58％、60％、65％、67％或70％、75％、80％、85％、90％或95％氨基酸序列同一性的保守结构域，并具有相似的功能，原因在于本发明多肽在过表达时可赋予与对照植物相比至少一种调节活性，所述调节活性选自由下述内容组成的组：更大的产量、更快的生长、更大的大小、增加的次生生根作用、更强的耐寒性、更强的对水剥夺的耐受性、降低的气孔导度、改变的C/N敏感或增加的低氮耐受性、增加的低磷耐受性、增加的对高渗胁迫的耐受性和/或降低的光敏感性。

在核苷酸水平，本发明序列典型地与一个或多个所列全长序列，或与所列序列但排除编码已知的一致性序列或一致性DNA-结合位点的区域或位于所述区域之外、或位于编码一个或所有保守结构域的区域之外，共有至少约30％或40％核苷酸序列同一性、优选地至少约50％、约60％、约70％或约80％序列同一性和更优选地约85％、约90％、约95％或约97％或更大序列同一性。遗传密码的简并性使得多核苷酸的核苷酸序列发生较大变化但保持所编码的蛋白的氨基酸序列不变成为可能。

同一性百分比可通过电子方法确定，例如，通过使用MEGALIGN程序(DNASTAR,Inc.Madison，Wis.)。MEGALIGN程序可根据不同的方法，例如聚类(clustal)方法(例如见Higgins和Sharp(1988)生成两个或多个序列的比对。聚类算法通过检查所有对之间的距离将序列归组为聚类。所述聚类进行逐对(pairwise)比对，然后进行群组比对。可使用其它比对算法或程序，包括FASTA、BLAST或ENTREZ、FASTA和BLAST和可用于计算相似性百分比的算法或程序。它们可作为GCG序列分析软件包(UniversityofWisconsin，Madison，WI)的一部分获得，并可使用或不使用默认设置。ENTREZ可通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)获得。

在一个实施方案中，两个序列的同一性百分比可通过GCG程序，缺口权重为1，例如每个氨基酸缺口计作两个序列之间的单个氨基酸或核苷酸错配而确定(见USPN6,262,333)。

用于执行BLAST分析的软件可公开获得，例如通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(见互联网网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。此算法包括首先通过在查询序列中鉴定长W的短字符鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字符进行比对时，其匹配或满足一些正值阈值评分T。T指相邻字符评分阈值(Altschul(1990)；Altschul等(1993))。这些起始相邻字符匹配充当开始搜索包含其的更长的HSP的种子。然后沿每个序列向两个方向延伸所述字符匹配，只要累积比对评分可以增加。对于核苷酸序列，累积评分使用参数M(一对匹配残基的奖励评分；始终>0)和N(错配残基的处罚评分；始终<0)计算。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积评分。当出现以下情况时，各个方向的字符匹配的延伸将停止：累积比对评分从其达到的最大值下降量X；累积评分由于累积了一个或多个负评分残基比对而变为零或负值；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用的默认值为：字符长(W)11、期望值(E)10、阈值100、M＝5、N＝-4，和比较双链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认值为：字符长(W)3、期望值(E)10和BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff&Henikoff(1989、1991))。对于预测的多核苷酸的比较，除非另外指明，“序列同一性”指由tblastx，使用该算法的NCBI版本，在默认设置，缺口比对，“关闭”过滤器时生成的％序列同一性(例如见互联网网址http://www.nchi.nlm.nih.gov/)。

其它比对技术见Doolittle(1996)。优选地，利用允许序列中存在缺口的比对程序比对所述序列。Smith-Waterman是一类允许序列比对中存在缺口的算法(见Shpaer(1997)。另外，可以利用使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序比对序列。可选的搜索策略使用MPSRCH软件，该软件在MASPAR计算机上运行。MPSRCH使用Smith-Waterman算法在大规模并行计算机上对序列进行评分。此方法改善了挑选远缘匹配的能力，尤其是能够容忍小缺口和核苷酸序列错误。可使用核酸编码的氨基酸序列搜索蛋白和DNA数据库。

两个多肽序列，例如，序列A和序列B之间的相似性百分比是通过将序列A的长度减去序列A中的缺口残基数，减去序列B中的缺口残基数，然后除以序列A和序列B之间的匹配残基的和，乘以一百计算的。确定相似性百分比时，不包括两个氨基酸序列之间低或无相似性的缺口。

也可通过本领域已知的其它方法，例如JotunHein方法(例如见Hein(1990))计数或计算多核苷酸序列之间的同一性百分比。序列之间的同一性还可通过本领域已知的其它方法，例如，通过改变杂交条件(见第20010010913号美国专利申请)确定。

因此，本发明提供鉴定与本发明一个或多个多核苷酸、或本发明多核苷酸编码的一个或多个靶多肽、或本文以其它方式指出的序列相似或旁系同源或直系同源或同源的序列的方法，所述方法可包括将给定的植物表型或基因功能与序列联系或关联起来。在所述方法中，提供了序列数据库(本地或通过互联网或局域网)，使用本文所述的相关序列查询序列数据库，并关联植物表型或基因功能。

此外，可使用一个或多个多核苷酸序列或一个或多个由所述多核苷酸序列编码的多肽搜索BLOCKS(Bairoch等(1997))、PFAM和其它数据库，所述数据库包含先前鉴定和注释的基序、序列和基因功能。搜索具有二级结构缺口罚分的一级结构模式的方法(Smith等(1992))以及算法，如基本的局部比对搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool，BLAST；Altschul(1990)；Altschul等(1993))、BLOCKS(Henikoff和Henikoff(1991))、HiddenMarkovModels(HMM；Eddy(1996)；Sonnhammer等(1997))等可用于操纵和分析多核苷酸和多核苷酸编码的多肽序列。这些数据库、算法和其它方法在本领域为公知，见Ausubel等(1997)和Meyers(1995)。

鉴定或确认控制相同功能的同源序列的进一步的方法是通过比较过表达或敲除两个或多个相关多肽获得的转录谱。由于转录谱诊断特定的细胞状态，本领域技术人员理解，具有高度相似的转录谱(例如，具有大于50％的共有的调节转录子或具有大于70％的共有的调节转录子或具有大于90％的共有的调节转录子)的基因将具有高度相似的功能。Fowler和Thomashow(2002)已显示三个旁系同源AP2家族基因(CBFl、CBF2和CBF3)受冷处理诱导，其均可调节改善的耐冻性，并且均具有高度相似的转录谱。当多肽已显示提供特定功能时，其转录谱成为确定旁系同源物或直系同源物是否具有相同功能的诊断工具。

此外，使用人工比对与一个或多个多核苷酸序列或由所述多核苷酸序列编码的一个或多个多肽相似或同源的序列的方法可用于鉴定相似性区域和B-盒锌指结构域。所述人工方法对本领域技术人员为公知，并可包括，例如，比较由包含已知功能的多核苷酸编码的多肽序列和由具有尚未确定的功能的多核苷酸序列编码的多肽序列之间的三级结构。

所述三级结构的实例可包含预测的α螺旋、β-片层、两亲螺旋、亮氨酸拉链基序、锌指基序、富含脯氨酸区、半胱氨酸重复基序及类似物。

可使用本发明提供的成分根据本领域公知的方法克隆本发明所公开的多肽的直系同源物和旁系同源物。可使用来自表达本发明序列之一的植物细胞或组织的mRNA克隆cDNA。适当的mRNA来源可通过询问根据本发明序列设计的探针的Northern点杂交鉴定，然后可以从获自阳性细胞或组织的mRNA制备文库。然后使用例如，PCR，使用根据本发明所公开的基因序列设计的引物，或通过使用部分或完整cDNA或使用基于所公开的序列的一组或多组简并探针探寻，分离编码多肽的cDNA。cDNA文库可用于转化植物细胞。使用例如，微阵列、Northern点杂交、定量PCR或任何其它用于监控表达变化的技术检测感兴趣的cDNA的表达。可使用与这些技术相似的技术分离基因组克隆。

表1和序列表中列出了拟南芥多肽序列直系同源物和与其功能相似的直系同源物的实例。除了表1和序列表中的序列之外，本发明还包括在系统发育和结构上与序列表中列出的序列相似，并且当在植物中异位表达时，可通过增加产量和/或和非生物胁迫耐受性而在植物中行使功能的分离的核苷酸序列。

由于许多这些序列在系统发育和序列上彼此相关，并且已显示增加植物的产量和/或非生物胁迫耐受性，本领域技术人员可预测，落入本发明多肽进化枝的其它相似的、在系统发育上相关的序列在异位表达时也会执行相似的功能。

通过杂交鉴定多核苷酸或核酸

可以通过例如，彼此在严格或高度严格条件下杂交鉴定与序列表和表中显示的序列同源的多核苷酸。当单链多核苷酸基于多种已详细阐明的物理化学力量，如氢键结合、溶剂排斥、碱基堆叠及类似力量结合时，它们即杂交。杂交的严格性反映涉及的核酸的序列同一性程度，严格性越高，所述两个多核苷酸链越相似。严格性通过多个因素反映，所述因素包括温度，杂交和漂洗溶液中存在的盐浓度和组成、有机和无机添加剂、溶剂等，和孵育(及其次数)，更加详细的描述见下文引用的参考文献(例如，Sambrook等(1989)；Berger和Kimmel(1987)；和Anderson和Young(1985))。

本发明包括能够在各种严格性条件下(例如见Wahl和Berger(1987)；和Kimmel(1987))与本发明要求保护的多核苷酸序列，包括序列表中的任何多核苷酸，杂交的多核苷酸序列和其片段。除了序列表中列出的核苷酸序列之外，

还可使用公知方法鉴定和分离本发明核苷酸序列的全长cDNA、直系同源物和旁系同源物。可使用杂交方法筛选本发明核苷酸序列的cDNA文库、直系同源物和旁系同源物以确定它们作为杂交靶或扩增探针的用途。

对于杂交，高度严格条件和实现它们的方法在本领域为公知。例如见Sambrook等(1989)；Berger(1987)，第467-469页；和Anderson和Young(1985)。

DNA双链体的稳定性受诸如碱基组成、长度和碱基错配程度之类因素影响。可调整杂交条件以允许不同序列相关性的DNA杂交。解链温度(T_m)定义为50％的双链体分子解离为其组成单链的温度。完全匹配的双链体，其中杂交缓冲液包含甲酰胺作为变性剂，其解链温度可通过下列等式估算：

(I)DNA-DNA：

T_m(℃)＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(％G+C)-0.62(％甲酰胺)-500/L

(II)DNA-RNA：

T_m(℃)＝79.8+18.5(log[Na+])+0.58(％G+C)+0.12(％G+C)²-0.5(％甲酰胺)-820/L

(III)RNA-RNA：

T_m(℃)＝79.8+18.5(log[Na+])+0.58(％G+C)+0.12(％G+C)²-0.35(％甲酰胺)-820/L

其中L是形成的双链体的长度，[Na+]是杂交或漂洗溶液中钠离子的摩尔浓度，％G+C是所述杂种中(鸟嘌呤+胞嘧啶)碱基的百分比。对于非完全匹配的杂种，每1％错配需要将所述解链温度降低大约1℃。

杂交实验一般在pH介于6.8至7.4的缓冲液中执行，虽然在杂交缓冲液可能使用的离子强度下，杂交的速率近似独立于pH(Anderson和Young(1985))。此外，可使用下列一个或多个物质降低非特异性杂交：超声的鲑精DNA或另一非互补DNA、牛血清白蛋白、焦磷酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖(ficoll)和Denhardt氏溶液。硫酸葡聚糖和聚乙二醇6000能够将DNA从溶液中排出，从而提高有效探针DNA浓度和给定的时间单位内的杂交信号。在一些情况下，更大严格性的条件可能更为理想，或者需要所述条件以降低非特异性和/或背景杂交。

这些条件可使用更高的温度、更低的离子强度和更高浓度的变性剂如甲酰胺而生成。

可调节严格性条件以筛选中度相似的片段，如来自远缘生物体的同源序列，或筛选高度相似的片段，如复制来自近缘生物体的功能性酶的基因。可在杂交步骤或在杂交后漂洗过程中调节严格性。盐浓度、甲酰胺浓度、杂交温度和探针长度是可用于改变严格性(如上文的公式所述)的变量。作为一般原则，对于>150碱基对的双链体，高度严格性典型地在T_m-5℃至T_m-20℃下，中严格性在T_m-20℃至T_m-35℃下，低严格性在T_m-35℃至T_m-50℃下执行。杂交可在低至中严格性(比T_m低25-50℃)下执行，然后在增加的严格性下执行杂交后漂洗。通过经验确定溶液中杂交的最大速率发生于T_m-25℃(DNA-DNA双链体)，T_m-15℃(RNA-DNA双链体)。任选地，可在每个漂洗步骤之后评估解离的程度，以确定是否需要后续的更高度严格性的漂洗步骤。

可使用严格性条件选择与所公开的序列具有高度同一性的核酸序列。在基于滤纸的方法如蛋白质或核酸点杂交中获得的严格杂交条件的实例是，对于具有大于100个互补残基的互补核酸的杂交，在确定的离子强度和pH下，比特异性序列的热解链温度(T_m)低约5℃至20℃。使用的杂交条件可包括约0.02M至约0.15M氯化钠、约0.5％至约5％酪蛋白、约0.02％SDS或约0.1％N-十二烷基肌氨酸、约0.001M至约0.03M柠檬酸钠，在约50℃至约70℃的杂交温度下。更优选地，高度严格性条件是约0.02M氯化钠、约0.5％酪蛋白、约0.02％SDS、约0.001M柠檬酸钠、在约50℃温度下。在严格条件下杂交的核酸分子典型地与基于完整DNA分子或选择的部分的探针，例如，与所述DNA的独特子序列杂交。

严格的盐浓度一般低于约750mMNaCl和75mM柠檬酸三钠。可使用低于约500mMNaCl和50mM柠檬酸三钠获得严格性增加的条件，低于约250mMNaCl和25mM柠檬酸三钠获得更大的严格性。缺乏有机溶剂，例如甲酰胺可获得低严格性杂交，而存在至少约35％甲酰胺和更优选地至少约50％甲酰胺可获得高度严格性杂交。严格的温度条件一般包括在存在甲酰胺的条件下，至少约30℃、更优选地至少约37℃和最优选地至少约42℃的温度。改变其它参数，如杂交时间、去污剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)浓度和离子强度，对本领域技术人员为公知。可根据需要，组合这些不同的条件实现不同的严格性水平。

杂交后的漂洗步骤也可具有不同的严格性；杂交后漂洗步骤主要确定杂交特异性，其最关键的因素是温度和最后的漂洗溶液的离子强度。可通过降低盐浓度或通过增加温度增加漂洗严格性。对于漂洗步骤，严格的盐浓度优选地低于约30mMNaCl和3mM柠檬酸三钠和最优选地低于约15mMNaCl和1.5mM柠檬酸三钠。

因此，可用于结合和除去与编码本发明多肽的核酸序列或其互补序列具有低于需要的同源性的多核苷酸的杂交和漂洗条件包括，例如：

6XSSC，65℃；

50％甲酰胺，4XSSC，42℃；或

0.5XSSC，0.1％SDS，65℃；

其中，例如，两个漂洗步骤各10-30分钟。这些条件的有用变化对本领域技术人员是很明显的。

本领域技术人员不希望本发明范围内包括的多核苷酸种类之间具有实质性变化，因为上述公式中规定的高度严格条件将产生结构相似的多核苷酸。

如果需要，技术人员可以采用具有更大的严格性的漂洗步骤，所述步骤包括约0.2xSSC、0.1％SDS，65℃，漂洗两次，每个漂洗步骤约30分钟或约0.1xSSC、0.1％SDS，65℃和漂洗两次，共30分钟。漂洗溶液的温度一般为至少约25℃，对于更大的严格性，至少约42℃。可通过使用与杂交步骤相同的条件，而将漂洗温度升高约3℃至约5℃来进一步增加杂交严格性，可通过使用相同的条件，而将漂洗温度升高约6℃至约9℃来进一步增加严格性。对于鉴定较不近缘的同源序列，漂洗步骤可在更低的温度，例如50℃下执行。

低严格性漂洗步骤的一个实例采用至少25℃，30mMNaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS，30分钟的溶液和条件。更大的严格性可使用42℃，15mMNaCl，1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS，30分钟。更严格的漂洗条件使用65℃-68℃，15mMNaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS的溶液。漂洗方案一般采用至少两个最终漂洗步骤。这些条件的其他变化对本领域技术人员是显然的(例如见第20010010913号美国专利申请)。

可以选择严格性条件，以便与编码寡核苷酸完全互补的寡核苷酸与所述编码寡核苷酸杂交的信噪比比所述完全互补寡核苷酸与编码截至本申请提交日期前已知的多肽的核酸杂交的信噪比高至少约5-10x。对于特定分析，可能需要选择条件以便获得更高的信噪比，即约15x或更多。

因此，与编码寡核苷酸和编码已知多肽的核酸的杂交相比，本发明核酸与独特的编码寡核苷酸的杂交具有至少2x或更大的信噪比。特定的信号依赖于相关分析中使用的标记，例如荧光标记、比色标记、放射性标记或类似物。用于检测相关多核苷酸序列的标记的杂交或PCR探针可通过使用标记的核苷酸的寡聚标记、切口转译、末端标记或PCR扩增而生产。

本发明包括能够在各种严格性条件下(例如见Wahl和Berger(1987)，第399-407页；和Kimmel(1987))与本发明要求保护的多核苷酸序列(包括序列表中的任何多核苷酸)杂交的多核苷酸序列和其片段。除了序列表中列出的核苷酸序列之外，还可使用公知方法鉴定和分离本发明核苷酸序列的全长cDNA、直系同源物和旁系同源物。可使用杂交方法筛选本发明核苷酸序列的cDNA文库、直系同源物和旁系同源物以确定它们作为杂交靶或扩增探针的用途。

实施例

应理解，本发明不限于描述的特定设备、机器、材料和方法。虽然描述了特定的实施方案，但是等效的实施方案可用于实施本发明。

通过参考下列实施例，将更容易理解上文对本发明的泛述，包括所述实施例仅是为了说明本发明某些方面和实施方案，并非意在限制本发明。本领域技术人员应理解，与特定的第一个性状相关的多肽还可与至少一个其它的、无关的和固有的第二个性状相关，所述第二个性状不能通过所述第一个性状预测。

实施例I.项目类型和载体和克隆信息

使用了许多构建体以调节本发明序列的活性。单独的项目定义为对特定构建体系的分析(例如，这可包括组成型过表达本发明序列的G1988系)。在本研究中，全长野生型的基因直接与驱动其在转基因植物中表达的启动子融合。此启动子可以是所述基因的天然启动子或组成型启动子如花椰菜花叶病毒35S启动子。可选地，驱动组织特异性或条件性表达的启动子可用于相似研究中。

在本研究中，给定多核苷酸在特定启动子下的表达是通过直接的启动子融合构建体实现的，其中所述序列直接克隆在感兴趣的启动子后面。直接融合(directfusion)方法的优点是，如果给定的启动子-多核苷酸系稍后要杂交至不同的遗传背景，则允许进行简单的遗传分析。

对于G1988-过表达植物的分析，使用包含G1988cDNA克隆的表达载体P2499(SEQIDNO：59)创建转基因系。此构建体创建了携带卡那霉素抗性标记的35S::G1988直接启动子融合，并被导入拟南芥植物。

G4004(多核苷酸SEQIDNO：3和多肽SEQIDNO：4)是衍生自大豆的序列。根据上述系统发育分析，G4004被鉴定为G1988的近缘同源物。P26748(SEQIDNO：60)包含G4004cDNA克隆，并且是携带卡那霉素抗性标记的35S::G4004直接启动子融合构建体。此构建体用于生成组成型过表达所述G4004多肽的转基因拟南芥植物系。

G4005(多核苷酸SEQIDNO：5和多肽SEQIDNO：6)也衍生自大豆，并且也根据上述系统发育分析被鉴定为G1988的近缘同源物。P26749(SEQIDNO：61)包含G4005cDNA克隆，并且是携带卡那霉素抗性标记的35S::G4005直接启动子融合构建体。此构建体用于生成组成型过表达所述G4005多肽的转基因拟南芥植物系。

创建过表达本发明G1988进化枝成员的植物的构建体(这些表达载体通过在第2列中提供的“PID”进行标识)列表提供于表4和序列表。

表4.用于创建过表达G1988进化枝成员的植物的表达构建体

表4的物种缩略词：At-拟南芥；Gm-大豆；Os-水稻；Sl-番茄；Zm-玉米

实施例II.转化

拟南芥的转化通过农杆菌(Agrobacterium)介导的方案执行，所述方案基于Bechtold和Pelletier(1998)的方法。除非另外指明，所有实验均使用Columbia生态型执行。

植物准备。拟南芥种子播种于覆网盆(meshcoveredpot)。种植10天后对幼苗进行间苗，以便每盆保留6-10株均匀分布的植物。在转化前一周剪去主薹(primarybolt)以打破顶端优势，促进侧芽(auxiliaryshoot)形成。转化典型地在播种4-5周后进行。

细菌培养物准备。接种的农杆菌贮液来自单个克隆平板或来自甘油贮液，然后使用适当的抗生素培养至饱和。在转化当天早上，离心饱和的培养物，将细菌沉淀重悬于渗滤培养基(InfiltrationMedia)(0.5XMS、1XB5维生素、5％蔗糖、1mg/ml苄氨基嘌呤核糖苷(benzylaminopurineriboside)、200μl/LSilwetL77)，直至A600读数达到0.8。

转化和种子收集。将农杆菌溶液倒入浸泡容器。将植物的所有花芽和莲座叶在此溶液中浸30秒。将所述植物侧放，并包裹起来以保持高湿度。所述植物按此方式在4℃保持过夜，然后将盆竖起，除去包裹并移至生长架。

所述植物在生长架上维持24小时光照，直至准备收集种。当转化植物有80％的角果成熟时(初次转化后大约5周)，收集种子。因为此种子获自T0代，所以其被视为T0种子，然后将所述种子涂布于选择平板(卡那霉素或磺胺)。在此选择平板上鉴定的抗性植物包括T1代，可从其获得包含感兴趣的表达载体的转基因种子。

实施例III.形态学分析

执行形态分析以确定多肽水平的变化是否影响植物生长和发育。这主要在T1代进行，需检查至少10-20个独立系。不过，如果需要确认或详细鉴定表型，也分析来自下代的植物。

在含有0.3％蔗糖和50mg/l卡那霉素的MS培养基上选择初始转化株。T2和后代植物使用相同方式进行选择，不过使用35mg/1卡那霉素。如果系携带磺胺标记(如通过超级转化生成的所有系)，则在含有0.3％蔗糖和1.5mg/1磺胺的MS培养基上选择种子。KO系通常在无选择的平板上萌发。种子在平板上在黑暗中冷处理(层化)三天(目的是增加萌发效率)，然后转移至生长柜。最初，平板在22℃、大约100微爱因斯坦光密度下孵育7天。在此阶段，转化株为绿色，拥有前两片真叶，其很容易与变白的卡那霉素或磺胺敏感幼苗区别。

然后将抗性幼苗转移至土壤中(Sunshine盆栽混合土)。转移至土壤之后，用塑料盖覆盖幼苗盘2-3天，以保持幼苗生长期间的湿度。植物在土壤中的生长条件为70-95微爱因斯坦的荧光强度和18-23℃温度。除非另外指明，光照条件由24小时光周期组成。对于开花时间的改变明显的情况，在12小时和24小时两种光条件下再次检查开花时间，以评估所述表型是否依赖于光周期。在我们24小时的光生长条件下，典型的世代时间(generationgtime)(种子至种子)是大约14周。

由于拟南芥发育的许多方面依赖于局部的环境条件，在所有情况下，植物与同一平地中的对照进行比较评估。如下文所述，转基因系的对照是野生型植物或在卡那霉素或磺胺上选择的含有空白转化载体的转基因植物。在下述阶段进行仔细检查：幼苗期(1周)、莲座期(2-3周)、开花期(4-7周)和种子成熟晚期(8-12周)。还检查了种子。幼苗期形态学在选择平板上进行评估。在所有其它阶段，对生长在土壤中的植物进行宏观评估。记录所有显著差异(包括生长速率、大小、叶和花形态学、着色和开花时间的改变)，但是如果没有明显的差异，则不进行常规测量。在某些情况下，对茎段进行染色以揭示木质素分布。在这些情况下，将手动切段的茎置于间苯三酚饱和的2MHCl(其将木质素染为粉红色)，并立即在解剖显微镜下进行观察。

注意，对于给定的项目(基因-启动子组合、GAL4融合系、RNAi系等)，在后续的基于平板的生理学分析中，典型地检查10个系。

实施例IV.生理学实验方法

在后续实施例中，除非另外指明，公开的形态和生理性状均是与野生型对照植物进行比较。即，描述为大和/或耐干旱的转化植物是相对于对照植物大和更耐受干旱，所述对照植物包括野生型植物、亲本系和使用不含目标序列的载体转化的系。当植物被描述为具有比对照植物更好的表现时，其一般是比对照植物更大、具有更大的产量和/或显示较少的胁迫症状。例如，表现更好的系可产生更少的花青素或更大、更绿或在响应特定胁迫时更具活力，如下文所示。更好的表现一般意味着比对照更大的大小或产量或对特定生物或非生物胁迫的耐受性、对ABA更不敏感或更好地从胁迫中恢复(如在基于土壤的干旱处理中)。

平板分析。使用代表各种非生物和水剥夺胁迫相关的条件的，不同的基于平板的生理学分析(如下文所示)作为预筛选以鉴定表现最好的系(即来自使用特定构建体进行转化的系)，然后所述系一般进行后续的基于土壤的分析。典型地，取10个系进行平板分析，

选择其中最好的3个系进行后续的基于土壤的分析。不过，对于在基于平板的分析中未获得显著的胁迫耐受性的项目，对系不进行土壤分析。

此外，对一些项目进行了营养限制研究。营养限制分析旨在发现在氮剥夺情况下允许更多植物生长的基因。氮是影响植物生长和发育，最终影响产量和胁迫耐受性的大量营养元素。这些分析监控了初生根和莲座在氮缺乏培养基上的生长。在所有高等植物中，无机氮首先同化为谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和天冬酰胺，这四种氨基酸用于将来自源(例如叶)的同化的氮运输至库(例如形成的种子)。此过程可受光、以及受植物C/N代谢状态的调节。因此，使用C/N敏感分析寻找植物用来感应内部碳和氮代谢物水平的机制的变化，所述碳和氮代谢物可激活调节N-同化基因的转录的信号转导级联反应。为了确定这些机制是否发生改变，我们利用了在含有高水平蔗糖(3％)而没有氮源的培养基上生长的野生型植物积累高水平的花青素的发现。此蔗糖诱导的花青素积累可通过添加无机或有机氮解除。我们使用谷氨酰胺作为氮源，因为其还充当植物中用来运输N的化合物。

萌发分析。对G1988和近缘序列的拟南芥过表达子执行下列萌发分析：NaCl(150mM)、甘露醇(300mM)、蔗糖(9.4％)、ABA(0.3μM)、冷(8℃)、聚乙二醇(10％，使用Phytogel作为胶凝剂)或C/N敏感或低氮培养基。在下文中，-N指基本培养基减氮加3％蔗糖，-N/+Gln是基本培养基减氮加3％蔗糖和1mM谷氨酰胺。

所有萌发分析均通过组织培养进行。在控制温度和湿度的条件下和无菌培养基中种植植物，得到均匀的尚未受到其它胁迫(如水胁迫)的植物材料，所述其它胁迫可造成获得的结果发生变化。所有分析均设计为检测对特定胁迫条件具有更大或更小耐受性的植物，所述设计的形成参考了下列出版物：Jang等(1997)、Smeekens(1998)、Liu和Zhu(1997)、Saleki等(1993)、Wu等(1996)、Zhu等(1998)、Alia等(1998)、Xin和Browse(1998)、Leon-Kloosterziel等(1996)。如果可能，分析条件最先用具有与所测试的条件相关的表型的对照进行盲实验测试。

涂布平板之前，所有实验的种子均按下列方式进行表面消毒：(1)与70％乙醇混合孵育5分钟，(2)与30％漂白剂、0.01％triton-X100混合孵育20分钟，(3)使用无菌水润洗5次，(4)将种子重悬于0.1％无菌琼脂糖，在4℃层化3-4天。

所有萌发分析均根据同一基本方案进行改编。将无菌种子播种于基本组成为80％MS+维生素的条件培养基。平板在22℃，24小时光照(120-130μEm^-2s^-1)，在生长室中进行孵育。种植5天后评估萌发和幼苗活力。

生长分析。对G1988和近缘序列的拟南芥过表达子执行下列生长分析：重度干燥(一种水剥夺分析)、在8℃冷条件下的生长、根发育(肉眼评估侧根和初生根、根毛和整体生长)和磷限制。对于氮限制分析，植物生长于其中氮源被降低至20mg/LNH₄NO₃的80％Murashige和Skoog(MS)培养基。注意，80％MS正常地具有1.32g/LNH₄NO₃和1.52g/LKNO₃。对于磷限制分析，7日龄幼苗在无磷酸的MS培养基上生长，所述MS培养基中的KH₂PO₄被替换为K₂SO₄。

除非另外指明，所有实验均使用拟南芥生态型Columbia(col-0)、大豆或玉米植物进行。分析通常在非选择性分离的T2群体(为了避免额外的选择胁迫)中执行。用于分析包含直接启动子融合构建体的系的对照植物是转化有空白转化载体(pMEN65)的Col-0植物。双元系(通过超级转化生成)的对照是背景启动子-驱动系(即启动子::LexA-GAL4TA系)，其是最初执行超级转化的系。

方案

对于低温生长分析，种子在MS+维生素+1％蔗糖，22℃下萌发和生长7天，然后转移至8℃低温条件，再过10天和17天后进行评估。

对于重度干燥(基于平板的水剥夺)分析，幼苗在MS+维生素+1％蔗糖，22℃下生长14天。在无菌橱(sterilehood)中将平板打开3小时以进行硬化，然后将幼苗从培养基中取出，在所述橱中干燥2小时。此后将植物转回平板，在22℃孵育以便恢复。然后在5天后评估所述植物。

对于聚乙二醇(PEG)高渗胁迫耐受性筛选，植物种子用氯气灭菌2小时。所述种子涂布于每个含有3％PEG、1/2XMS盐、1％phytagel和10μg/ml草胺磷(BASTA)的平板。每个种子系种植两个重复平板。所述平板在4℃放置3天以层化种子。然后将所述平板竖起来放置另外11天，温度为22℃(白天)和20℃(夜晚)。光周期为16小时，平均光强约120μmol/m2/s。放置平板的架每日在生长室推车的架上旋转。第11天进行根长测量。第14天确定幼苗状态、测量根长、记录生长阶段、评估视觉颜色、测量幼苗的总鲜重并对整个平板拍照。

枯萎筛选分析。转基因和野生型大豆植物种植于5"盆内，在生长室中生长。幼苗达到V1阶段(V1阶段发生于当所述植物具有一个三叶复叶(trifoliolate)，并且其单叶复叶(unifoliolate)和第一片三叶复叶打开时)之后，限水，从而开始干旱处理。记录干旱受伤表型评分，随影响严重程度增加为1-4，1指无明显影响，而4指示植物死亡。当生长室中有一株植物的干旱评分为1.5时，即开始干旱评分。每天连续评分，直至至少90％的野生型植物具有3.5或更大的评分。实验结束后，使用风险评分(RiskScore)和存活分析方法(Glantz(2001)；Hosmer和Lemeshow(1999))对转基因和野生型两种大豆幼苗的评分进行统计分析。

水分利用效率(WUE)。WUE通过利用元素同时以稳定和不稳定(放射性)形式存在的发现进行估计。大多数具有生物效益的元素(包括C、H、O、N和S)具有两种或更多稳定同位素，其中最轻的同位素的丰度远远大于其它同位素。例如，在自然界中，¹²C的丰度大于¹³C(¹²C＝98.89％，¹³C＝1.11％，¹⁴C＝<10-10％)。因为¹³C比¹²C稍大，所以光合成中CO₂的分离有两个步骤：

1.¹²CO₂通过空气扩散，并且更容易进入叶内；

2.¹²CO₂被光合成的第一步中的酶，核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶，优先选择。

已显示在多个C3作物物种中，WUE与光合成过程中的碳同位素鉴别成负相关。碳同位素鉴别还与易旱环境中的干旱耐受性和产量稳定性相关，并且已成功用于鉴定具有更好干旱耐受性的基因型。燃烧植物材料，转换为CO₂，并通过质谱分析，测量¹³C/¹²C含量。通过与已知标准比较，¹³C含量的改变方式表示，G1988或相关序列的过表达改善水分利用效率。

WUE的另一潜在指标是气孔导度，即气孔的开放程度。

数据解释

在评估时，给植物下列评分之一：

(++)与对照相比显著增强的表现。表型非常一致，并且生长显著高于该分析观察到的变异性的正常水平。

(+)与对照相比增强的表现。反应一致，但仅适度高于该分析观察到的变异性的正常水平。

(wt)与野生型对照相比无可检测的差异。

(-)与对照相比削弱的表现。反应一致，但仅适度高于该分析观察到的变异性的正常水平。

(--)与对照相比显著削弱的表现。表型一致，并且生长显著高于该分析观察到的变异性的正常水平。

(n/d)实验失败，未获得数据或未执行分析。

实施例V.土壤干旱(瓦盆)

土壤干旱分析(在瓦盆中执行)是基于Haake等(2002)的描述。

实验方案。

之前我们已对直接播种于土壤的T2分离群体执行了瓦盆分析。不过，在本方案中，幼苗首先在含有卡那霉素或磺胺的选择平板上萌发。

种子通过2分钟乙醇处理，然后20分钟30％漂白剂/0.01％Tween处理和用蒸馏水漂洗5次消毒。种子播种于含0.1％琼脂糖的MS琼脂，在4℃层化3天，然后转移至温度为22℃的生长柜。在选择平板上生长7天之后，将幼苗移植于直径3.5英寸的瓦盆中，所述瓦盆包含80g蛭石:珍珠岩为50:50的混合物，其上部加80gProMix。典型地，每盆包含14棵幼苗，并且测试的转基因系植物与野生型对照位于不同的盆中。包含转基因系的盆和对照盆散布于生长室内，维持24小时光照条件(18-23℃和90-100μEm^-2s^-1)，在14天的时间内浇水。然后停止供水，将盆在吸水纸上放置8-10天以施加干旱处理。此时间过后，指定目测的定性“干旱评分”(0-6)，以记录目测的干旱胁迫症状的程度。评分“6”对应于无可见症状而评分“0”对应于极端枯萎并且叶具有“易碎”质地。干旱期结束后，向盆里重新浇水并在5-6天后评分；统计每盆中存活植物的数量，并计算存活植物占盆中总植物的比例。

结果分析。在给定的实验中，我们典型地将6或更多盆转基因系与6或更多盆适当的对照进行比较。计算所述转基因系和所述野生型盆的平均干旱评分和平均植物存活比例(存活率)。对于每种情况，均计算p-值*，其指示所述两个平均值之间的差异的显著性。然后将特定项目的每次种植的每个转基因系的结果呈现在结果表中。

p-值计算。对于对照和实验植物位于不同的盆中的分析，使用逻辑回归分析存活，以考虑随机变量是介于0和1之间的比例的事实。报告的p-值是实验比例相对于对照的显著性，其基于对逻辑值转化的数据的回归。

干旱评分是没有实际数字含义的有序因子，使用非参数测试分析实验组和对照组的干旱评分。使用Mann-Whitney秩和测试计算p-值。

实施例VI.土壤干旱生理学和生物化学测量

这些实验确定由每个lead赋予的干旱耐受性的生理学基础，并典型地在土壤生长条件下执行。所述实验通常在10小时或12小时光照的光周期条件下执行。如果可能，给定项目(基因/启动子组合或蛋白变体)代表三个独立的系。进行测量时，植物通常处于营养生长晚期/繁殖生长早期阶段。典型地，我们分析了三个不同的状态：浇水良好的状态、轻度干旱状态和适度的严重干旱状态。在每种情况下，我们比较了具有相同程度物理胁迫症状(枯萎)的野生型植物。为了实现这一点，通常需要交叉取样。典型地，对于给定系，每个状态分析10株单独的植物。

常规测量下列生理参数：相对水含量、ABA含量、脯氨酸含量和光合成速率。在一些情况下，还测量叶绿素水平、淀粉水平、类胡萝卜素水平和叶绿素荧光。

结果分析。在给定实验中，对于特定参数，我们典型地在每种干旱状态下比较来自给定转基因系的约10个样品和相应野生型对照的约10个样品。计算所述转基因系和野生型盆每个生理参数的平均值。在每种情况下，确定p-值(通过简单的t-测试计算)，其指示所述两个平均值之间的差异的显著性。

典型的方案如下文所述；这对应于我们在干旱项目开始时的基线研究过程中对野生型植物执行的干旱时间过程实验使用的方法。

方案。种子在4℃，0.1％琼脂糖中层化三天，然后播种于Metromix200，2.25英寸盆(方形或圆形)。植物保持于盘内的单独盆，在短日下生长(10小时光照、14小时黑暗)。幼苗根据需要进行浇水，以维持健康的植物生长和发育。在种植后7至8周，植物用于干旱实验。

将符合相等生长发育(莲座大小)的植物从塑料盘中取出，置于吸水纸上。将包含用作浇水良好的对照的植物的盆置于称重舟内，并将盘置于吸水纸上。称重舟的目的是保留浇水良好的盆可能泄漏的任何水，以免影响包含正在进行干旱胁迫处理的植物的盆。

在采样的每一天，从随机生成的群体(条件是它们通过质量控制标准)中挑选最多18株处于干旱条件的植物和6株浇水良好的对照(来自每个转基因系)。对接下来三片最幼嫩的，展开最完全的叶片执行光合成、ABA和脯氨酸的生物化学分析。使用剩下的莲座组织分析相对水含量。

光合成测量。光合成是使用LICORLI-6400(Li-CorBiosciences，Lincoln，NE)测量的。LI-6400使用红外气体分析仪测量二氧化碳，以生成光合成测量。其是基于CO₂参考(放入测量室的量)和CO₂样品(离开测量室的量)的差异。

由于光合成是将CO₂转化为糖的过程，我们预期会看到CO₂样品量的减少。可从此差异得出光合成速率。在一些情况下，可发生呼吸，并检测到CO₂的增加。为了执行测量，对每个LI-6400标准方向进行LI-6400设置和校准。光合成的测量在最幼嫩的，展开最完全的叶片中进行，测量使用300和1000ppmCO₂，金属卤化物光源。此光源提供约700μEm^-2s^-1。

荧光测量在暗和光适应叶片中进行，根据制造商的说明使用连接叶室荧光计的LI-6400(LICOR)或OS-1(Opti-Sciences，Hudson，NH)。使用LI-6400时，所有操作均在遮光布(darkshadecloth)下进行。将植物放入用此遮光布覆盖的盒中直至使用，让植物进行暗适应。OS-30使用小回形夹生成暗适应叶。

脱落酸和脯氨酸的测量。此实验的目的是测量植物组织中的ABA和脯氨酸。ABA是被认为参与胁迫应答的植物激素，而脯氨酸是渗透保护剂。

采集最幼嫩的、展开最完全的三片成熟叶，在液氮中冷冻，冻干，然后进行干重测量。然后将植物组织在甲醇中匀浆，所述甲醇中已加入500ngd6-ABA作为内标。将匀浆物过滤除去植物材料，然后将滤出液蒸发至较小体积。向此粗提物中加入大约3ml1％乙酸，然后将此提取物进一步蒸发以除去任何残留甲醇。测量剩余水相提取物的体积，并取出一小份(通常200至500μl)用于脯氨酸分析(方案见下文)。剩余提取物用醚分配两次，蒸发除去醚，残留物用醚制重氮甲烷甲基化。除去任何未反应的重氮甲烷后，将残留物溶解于100至200μl乙酸乙酯，并通过气相色谱-质谱进行分析。分析使用偶联至HP5973MSD的HP6890GC进行，使用DB-5ms气体毛细管柱。柱压为20psi。最初炉温为150℃。进样后，按5℃/分钟将炉加热至250℃终温。ABA水平使用同位素稀释公式进行估算，并归一化为组织干重。

游离脯氨酸含量根据Bates(Bates等，1973)测量。上文获得的水相粗提物用蒸馏水扩大至终体积500μl。然后加入500μl冰醋酸，然后加入500μlChinard'sNinhydrin。Chinard'sNinhydrin通过将2.5g茚三酮(水合茚三酮(triketohydrindenehydrate))在70℃溶解于60ml冰醋酸，然后向其加入40ml6M磷酸而制备。

然后将所述样品在95°至100℃加热1小时。此孵育期过后，将样品冷却，然后加入1.5ml甲苯。除去上层甲苯相，在515nm处测量吸光度。

脯氨酸使用标准曲线估算并归一化为组织干重，所述标准曲线是使用L-脯氨酸生成的。

相对水含量的测量。相对水含量(RWC)指示在任何给定时间植物组织内储存的水的量。其是通过莲座的田间重量(fieldweight)减去植物材料的干重然后除以莲座的水饱和重量与植物材料干重的差获得的。所得RWC值可用来比较不同植物，而无需考虑植物大小。

除去用于阵列和ABA/脯氨酸分析的组织之后，用一小剪刀将莲座从根上剪下。将所述莲座称重即得田间重量。然后将所述莲座浸入冷水，然后在黑暗中置于冰水浴中。此操作的目的是允许植物组织吸水而阻止可能改变细胞内的小分子水平的任何代谢。第二天，将莲座小心取出，用薄棉纸印干，然后称重以获得吸胀重量。然后将组织冷冻、冻干和称重以获得干重。

淀粉确定。淀粉使用基于染色方案的简单碘方法估算。在12小时光周期结束或开始的时候采集幼嫩的、完全展开的叶，将其置于含有80％乙醇或100％甲醇的试管中。叶通过下述方法脱色：将试管在70°至80℃水浴中孵育直至除去叶组织中的叶绿素。然后将叶浸入水中以转移所述组织中可能存在的任何残留甲醇。然后按下述方法对淀粉染色：将叶在碘染色液(2gKI，1gI₂溶于100ml水)中孵育1分钟，然后用足量的水漂洗。含有大量淀粉的组织染成深蓝色或黑色；除去淀粉的组织则为无色。

叶绿素/类胡萝卜素确定。对于一些实验，使用Porra等(1989)的方法在甲醇提取物中估算叶绿素。使用2500的A(1％)在450nm处在同一提取物中估算类胡萝卜素。我们使用MinoltaSPAD-502(KonicaMinoltaSensingAmericas,Inc.，Ramsey，NJ)测量叶绿素。当SPAD-502用于测量叶绿素时，可通过HPLC同时确定类胡萝卜素和叶绿素的含量和量。通过将叶在丙酮:乙酸乙酯(3:2)中匀浆而从叶组织中提取色素。然后加水，离心混合物，取上相进行HPLC分析。样品分析使用Zorbax(AgilentTechnologies，PaloAlto，CA)C18(未封端)柱(250x4.6)，梯度为12.5分钟内从乙腈:水(85:15)到乙腈:甲醇(85:15)。在这些条件下保持两分钟后，将溶剂条件在两分钟内更改为甲醇:乙酸乙酯(68:32)。

使用峰面积确定类胡萝卜素和叶绿素的量，使用叶黄素和β-胡萝卜素作为标准计算响应系数。

核和细胞质富集组分。我们开发了在96孔板中制备核和细胞质蛋白提取物的平台，所述平台使用碳化钨珠在温和去污剂中破碎细胞，并使用蔗糖垫层分离细胞质和核组分。我们使用组蛋白抗体证实此方法有效分离细胞质和核富集组分。可选方法(仅旋转)使用相同的破碎方案，但是仅沉淀核以将其与细胞质分开，而无蔗糖垫层的附加纯化。

mRNA水平的定量。每个系典型地采集三个茎和三个根生物重复，如上文的蛋白定量方法部分所述。使用96孔板方案制备RNA，并合成每个样品的cDNA。这些制备物用作RT-PCR实验的模板。对于每个样品，我们使用ABI7900实时RT-PCR仪和Green技术(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)测量了目标基因的转录子相对于18SRNA转录子的水平。

表型分析：开花时间。植物种植于土壤。开花时间基于下述一种或两种方法确定：(i)从种植至第一个可见花芽的天数。(ii)初生芽分生组织产生的叶(莲座叶或莲座叶加茎生叶)的总数。

表型分析：热胁迫。在此报告描述的预实验中，植物在生长室，30℃，24小时光照下萌发11天。让植物在22℃，24小时光照下恢复3天，拍照以记录处理后的健康状况。在第二个实验中，幼苗在22℃，选择培养基上生长4天，然后将所述平板转移至32℃一周。然后让植物在22℃下恢复3天。对每个系，收获来自两个独立平板的40棵植物，测量鲜重和叶绿素含量。

表型分析：暗诱导衰老。在此报告描述的预实验中，植物在土壤，12小时光照，22℃下生长27-30天。然后将其移至22℃暗室，10-13天后目测评估衰老。在一些情况下，我们使用Fv/Fm作为每个植物上最幼嫩的展开最完全的叶的叶绿素的测量值(Pourtau等，2004)。来自每个系的12棵植物的Fv/Fm平均值归一化为12棵相应对照的Fv/Fm平均值。

显微镜观察。执行了光显微镜、电子显微镜和共聚焦显微镜观察。

使用的各种定义/缩略词：

RWC＝相对水含量(田间重量-干重)/(吸胀重量－干重)x100

ABA＝＝脱落酸，μg/gdw

脯氨酸＝脯氨酸，μmole/gdw

ChlSPAD＝通过MinoltaSPAD-502估算的叶绿素，650nm与940nm的比值

A300＝300ppmCO₂时的净同化速率，μmoleCO₂/m²/s

A1000＝1000ppmCO₂时的净同化速率，μmoleCO₂/m²/s

总Chl＝mg/gfw，通过HPLC估算

Carot＝mg/gfw，通过HPLC估算

Fo＝暗适应叶的最小荧光

Fm＝暗适应叶的最大荧光

Fo'＝光适应叶的最小荧光

Fm'＝光适应叶的最大荧光

Fs＝光适应叶的稳定状态荧光

Psilf＝叶的水压(Mpa)

Psip＝叶的膨压(Mpa)

Psipi＝叶的渗透压(Mpa)

Fv/Fm＝(Fm-Fo)/Fm；PSII的最大量子产量

Fv'/Fm'＝(Fm'-Fo')/Fm'；开放的PSII反应中心捕获能量的效率

PhiPS2＝(Fm'-Fs)/Fm'，PSII的实际量子产量

ETR＝PhiPS2x吸收的光强x0.5；我们使用100μE/m²/s作为平均光强，85％作为吸光量

qP＝(Fm'-Fs)/(Fm'-Fo')；光化学猝灭(包括光合成和光呼吸)；开放的PSII的比例

qN＝(Fm-Fm')/(Fm-Fo')；非光化学猝灭(包括诸如散热之类的机制)

NPQ＝(Fm-Fm')/Fm'；非光化学猝灭(包括诸如散热之类的机制)

筛选水分利用效率

本发明的一个方面提供由增强的水分利用效率和/或水剥夺耐受性造成产量增加的转基因植物。

此实施例描述了在温室中选择在水分利用效率方面具有差异的转基因植物和野生型植物(测试为近交系或杂交系)的高通量方法。此选择过程在最初11天的无胁迫生长期之后，在总共15天的时间内对植物施加3个干旱/再浇水循环。每个循环由5天组成，所述循环的前4天不浇水，第5天进行水淬(waterquenching)。通过所述选择方法分析的初始表型是植物生长速率的变化，其通过营养生长期干旱处理过程中的高度和生物质确定。还测量了干旱后芽组织的水合状态。植物高度在三个时间点测量。第一次在植物达11天龄，开始干旱之前测量，其是芽的初始高度(SIH)。植物高度也在整个干旱/再浇水制度过半时，即种植18天后测量，以产生芽干旱中高度(SMH)。在种植后第26天完成最终的干旱循环后，收获植物的芽部分，测量最终的高度，

其为芽枯萎高度(SWH)，并测量芽枯萎生物质(SWM)。将芽在40℃，暗条件下置于水中。3天后确定芽的重量以提供芽吸胀重量(STM)。在炉中干燥4天后，确定芽的重量以提供芽干燥生物质(SDM)。芽平均高度(SAH)是三次高度测量中的平均植物高度。如果需要，上述方案可进行调整，每步+/-～一天。为了校正植物间的轻微差异，从SIH和SWH衍生了大小校正的生长值。这就是相对生长速率(RGR)。使用下式计算每个芽的相对生长速率(RGR)：[RGR％＝(SWH-SIH)/((SWH+SIH)/2)*100]。相对水含量(RWC)测量收获时植物中有多少(％)是水。使用下式计算每个芽的水含量(RWC)：[RWC％＝(SWM-SDM)/(STM-SDM)*100]。例如，此发育阶段充分浇水的玉米植物具有约98％RWC。

实施例VII.G1988和相关序列拟南芥过表达子的形态观察

在我们较早的研究中，在拟南芥中过表达G1988产生了少量早开花的系，并且在多个过表达系中，幼苗生长快于对照幼苗。我们还证实，当在无磷培养基上生长时，在35S启动子调节控制下组成型过表达G1988的所有系的拟南芥幼苗比对照更大并且具有更多的根生长。具有高水平G1988表达的35S::G1988植物产生长下胚轴、长叶柄和上挺叶，这些表型表示此基因在光信号传导中发挥作用，其可能是赋予作物植物产量增加的因素之一。当在长日(16小时光照)或连续光照下生长时，35S::G1988系显示出其它惊人的表型；所述植物矮化并显示未成熟黄化和延迟的发育。此外，还注意到偶尔有水渍化叶。

在本研究中，生成了51个新的35S::G1988直接启动子融合系。其中有9个系在T1代显示长下胚轴表型。对10个在T1代未显示长下胚轴的系进行T2代研究，其中有6个系在至少一些植物中显示长下胚轴和长叶柄，表示此表型的外显率可能受基因量或环境条件的影响。研究的T1系中的大多数显示出上举叶。对开花的影响则不一致；一些T1系再次显示早花，但是仔细鉴定具有高G1988表达水平的两个35S::G1988系未显示开花的差异或稍有延迟，具体依赖于所述植物生长的日长。

G1988和直系同源物赋予的形态相似性

35S::G4000(玉米SEQIDNO：7和8)、35S::G4012(水稻SEQIDNO：15和16)、35S:: G4299(番茄SEQIDNO：21和22)、35S::G4004(大豆SEQIDNO：3和4)和35S::G4005(大豆SEQIDNO：5和6)系显示与35S::G1988系相似的形态学。

许多35S::G4012、35S::G4004和35S::G4005T1幼苗具有延长的子叶叶柄，35S::G4000、35S::G4012、35S::G4299和35S::G4004幼苗在连续光照下还具有比对照更长的下胚轴。当在连续光照下生长时，成年35S::G4004和35S::G4005植物还显示出与高表达35S::G1988植物非常相似。当组成型过表达时，所有这些序列均产生具有上挺叶的植物，这与在连续光照下生长的35S::G1988植物相似。观察到向上叶、长下胚轴和长叶柄表示G4004和G4005在光信号传导中具有与G1988相似的功能，其可能是造成G1988进化枝过表达植物产量增加的一个因素。许多35S::G4004系的发育相对于对照较晚。

在研究的20个转基因系中，一个35S::G4005系在幼苗阶段的大小大于对照，另一系的大小与野生型相同，所有其它系在此阶段的大小都小于对照。

G1988的异位表达对早季生长的影响

G1988在大豆植物中的组成型过表达造成一致的相对于对照植物的早季生长的增 加。当将过表达子和对照的种子的种植时间从早春推迟到晚春时，这一影响特别明显。特别 地，与高产量相关的G1988过表达子的系，如系178、189、200、209、213和218(例如见表12)， 一般显示出比对照更多的早季生长。

G1988的异位表达对大豆植物茎直径的影响

当在控制的短日条件(10小时光照)下生长时，过表达G1988的大豆植物的系未显示相对于对照植物任何显著的增加的茎直径。不过，在长日长度(20小时光照)下，G1988过表达子一般产生比对照显著更大的茎直径。G1988过表达子增加的茎直径在田间条件下生长的大豆植物中得到了证实。增加的茎直径可积极影响生物质以及导致增加的抗倒伏性。

表5.在短日和长日长度下生长的各种G1988过表达子和对照的大豆茎直径

213	短日	4.89	+0.07	0.268
					A3244(对照)	长日	15.75	-
178	长日	16.83	+1.08	0.071
					213	长日	16.92	+1.07*	0.021
218	长日	17.46	+1.71*	0.004
					206**	长日	16.29	+0.54	0.104
209	长日	17.17	+1.42*	0.027

*相对于对照显示更大的茎直径的系(在p<0.05下显著)

**G1988表达未达显著水平

G1988的异位表达对大豆植物节间长度的影响

在短日实验(每天光照10小时)中，大豆节间长度相对于对照增加。此影响对几乎所有植物的节间一般都明显，但是对在植物的发育中形成相对较晚的第8-12节间特别显著(图10)。不过，节间长度在事实上所有生长阶段，包括早季生长过程中，一般都更大，见图10中比较的早期节间(例如，第1-5节间)。

G1988的异位表达对冠幅盖度的影响

G1988在大豆植物中的组成型过表达造成晚季冠幅盖度相对于对照植物的一致增 加。增加的冠幅盖度与产生增加的产量的系正相关。G1988的过表达程度不如高产系的系 217(系217异位表达G1988的水平是高产系中常见水平的约60％)，未显示相对于对照的显 著更大的冠幅盖度。

实施例VIII.基于平板的实验结果

此报告提供在基于平板的分析中，对过表达G1988相关多肽的转基因幼苗的实验观察，所述分析测试了对非生物胁迫包括水剥夺、冷和低氮或改变的C/N敏感的耐受性。

G1988(SEQIDNO：1和2；拟南芥)-组成型35S启动子

拟南芥中基于平板的生理学分析结果

在较早的研究中，我们证实，在包含限制氮(添加谷氨酰胺)的平板上萌发的幼苗比对照显示更轻的胁迫。

在测量对改变的碳/氮比的响应的分析(C/N敏感分析)中，发现35S::G1988植物具有改变的表现。在C/N敏感分析中，10个35S::G4004系中有9个系还显示与对照幼苗相比显著不同的差异，这与在35S::G1988植物中观察到的表型一致。

对10个35S::G1988拟南芥植物系进行了生理分析。除了先前分析中观察的C/N敏感表型之外，在根生长分析中，还观察到对低氮的增强的表现。10个系中有3个系在基于平板的重度干燥分析(一种水剥夺分析)中还显示脱水耐受性。在6个系中还观察到在萌发分析中对蔗糖(9.4％蔗糖的高渗胁迫)的耐受性。这些后面的结果暗示所述过表达子可能对其它形式的水剥夺，如干旱和其它相关胁迫有较大耐受性。这一推测得到了基于土壤的干旱分析的结果的证实，如下文所述。

表6.G1988(SEQIDNO：1和2，来自拟南芥col)-组成型35S直接启动子融合

germ.＝萌发，gln＝谷氨酰胺

(+)指示阳性分析结果/相对于对照耐受性更强或观察到表型

(空格)指示该行第1列中过表达G1988的植物的表现与野生型相同

除了表6中显示的实验结果之外，在基于PEG的高渗胁迫耐受性筛选中还发现35S::G1988幼苗对于在3％聚乙二醇上生长表现出比对照幼苗更强的耐受性。35S::G1988幼苗在3％聚乙二醇上显示出更大的根生长。

虽然在此组实验中G1988(SEQIDNO：1和2)未赋予拟南芥增加的耐寒性，但是在过表达拟南芥G1988蛋白的萌发大豆植物中，G1988能够赋予更强的耐寒性。

G4004(SEQIDNO：3和4，来自大豆)-使用组成型CaMV35S启动子过表达

根据目前得到的结果，35S::G4004过表达子对低氮条件有更大耐受性，显示C/N敏感表型。此外，7个35S::G4004系在冷条件下的萌发分析中具有比对照幼苗更好的表现，表现为所述转基因植物中花青素积累更少，表示此基因还可用于赋予改善的冷萌发(表7)。对于研究的10个系，其中有7个系的对照萌发平板上的幼苗显示具有长下胚轴。对照生长平板上的幼苗还显示出小和矮化；由于这些分析是在连续光照下执行的，此表型与形态分析中显示的矮化是一致的。这些转基因植物在其萌发过程中还比对照具有更强的耐寒性，表现为所述转基因植物中花青素积累更少(表7)。

表7.G4004(SEQIDNO：3和4，来自大豆)-组成型35S直接启动子融合

germ.＝萌发

(+)指示阳性分析结果/相对于对照耐受性更强或观察到表型

(空格)指示该行第1列中过表达G1988的植物的表现与野生型相同

(-)指示相对于对照观察到更敏感的表型

实施例IX.拟南芥和大豆的干旱分析

水是作物产量的主要限制因素。在限水环境中，作物产量是水分利用、水分利用效率(WUE；定义为空气生物质产量/水分利用)和收获指数(HI；收获时的生物质产量与总空气生物质的比率)的函数。WUE性状已被提议作为干旱下产量改善的标准。

在土壤干旱分析(一种可用于比较WUE的水剥夺分析形式)中，研究了三个已充分鉴定的35S::G1988拟南芥系。其中的两个系，系10-6-3和12-2-2，具有高水平的G1988表达，并表现出长下胚轴、向上的叶和伸长的叶柄。这些系在执行的两个分析中的一个分析中均显示增强的干旱恢复。第3个系，系8-5-1，具有较低的G1988水平，并且未显示其它两个系的特性形态。此系未显示存活上的改善，并且，事实上，在所述分析的一个重复中表现更差(未在表8中显示)。虽然如此，鉴定了两个的确显示显著改善的干旱表现的单独的系，因而可以据此选择其用于进一步开发和用作产物。

土壤干旱-基于瓦盆的生理学总结。

表8.35S::G1988干旱分析结果：

DPF＝直接启动子融合项目

存活率＝每个盆中存活的植物的比例

干旱尺度：6(最高评分)＝无胁迫症状，0(最低评分；最严重的影响)＝极端胁迫症状

*表现优于对照的系(在p<0.11下显著)

除了拟南芥植物之外，过表达的大豆植物在水分利用效率(WUE)筛选中的表现也优于对照。收获来自干旱地区的组织，燃烧植物材料，转换为CO₂，并通过质谱分析，然后测量¹³C/¹²C含量。通过与已知标准比较，¹³C含量的改变方式表明，G1988的过表达改善水分利用效率。

还测量了气孔导度。在第一个田间试验中，发现三个独立的转基因系具有统计学显著的更低的导度。测试的其它35S::G1988大豆系也具有较低的气孔导度，

但是这些系获得的数据不具统计学显著性。后续的田间试验中未观察到气孔导度的显著差异。

综合考虑，同位素鉴别和气孔导度分析表示过表达G1988的植物具有增加的蒸腾效率，其指示所述植物的水分利用效率增强。

使用枯萎筛选分析对过表达G1988的大豆植物进行了存活分析。当针对野生型对照植物进行分析时，测试的转基因系中有一些系显示显著的(p<0.1)高风险评分和延长的达到枯萎的时间。几乎所有11个测试的过表达子系都显示延长的达到枯萎的时间，并且有三个系达到枯萎的时间与对照相比具有统计学显著的差异(表9，数据按统计学显著性降低的顺序呈现)。仅有的两个显示比对照提前枯萎的系(结果不显著)未显著表达G1988。

综合考虑，这些数据清楚地表明，G1988(SEQIDNO：1和2)在大豆中的过表达可显著改善对水分亏缺条件的耐受性。

表9.35S::G1988大豆植物和对照达到枯萎的时间

*相对于对照显示显著延长的达到枯萎的时间的系(在p<0.10下显著)

**G1988未表达至显著水平

***G1988表达水平低于高产转基因系

实施例X.大豆中的耐寒性结果

图7显示使用野生型对照系和许多35S::G1988过表达系获得的实验数据，其显示G1988过表达造成改善的冷萌发。此田间试验于冬季在加利福尼亚州进行，对照种子的总萌发(在图7中用点线表示)表现差，并注意到有高百分比的种子是“硬实种子”，一种造成种子在标准条件下无法吸水的胁迫诱导的现象。在此田间试验中，显著更大百分比的G1988过表达种子在不同时间点萌发，在伊利诺斯州和堪萨斯州进行的试验获得的种子也一样。这些数据表明G1988在战胜胁迫应答和增强细胞生长中发挥作用。

使用G4004(SEQIDNO：4)(与G1988在系统发育上相关的G1988大豆同源物)(图3和图4A-4F)转化玉米植物。然后确定过表达G4004的玉米植物的萌发指数。萌发指数是萌发百分比和萌发速率的函数，可通过下式确定：

萌发指数＝[(T-T1+1)xP1+(T-T2+1)x(P2-P1)+(T-T3+1)x(P3-P2)+...+(T-TT+1)x(PT-PT-1)]/T

其中T是测试萌发的天数。

P1、P2、P3、...和PT是种子在第T1、T2、T3、...和T天的萌发百分比。

如表10所示，一些G4004-过表达玉米系的萌发显示，所述过表达子与对照植物相比具有更强的耐寒性。

表10.过表达G4004的玉米植物冷萌发实验的表型数据

显示的数据是相对于野生型对照的变化百分比。

*萌发指数显著大于对照(p<0.05)

**萌发指数显著低于对照(p<0.05)

因此，本发明证明，使用多肽的G1988进化枝的成员转化植物，包括单子叶植物，可赋予所述转化植物比对照植物显示的耐寒性水平更强的对冷条件的耐受性。

实施例XI.玉米氮利用效率的田间试验结果

许多过表达大豆G4004多肽序列(SEQIDNO：4)的玉米植物对氮的利用比对照植物更加有效，当在温室中在含有2.0mM硝酸铵作为氮源的低氮培养基中生长时，测量得到增加的叶绿素和芽鲜重(表11)。

表11.过表达G4004的玉米植物低氮筛选的表型数据

显示的数据是相对于野生型对照的变化百分比。

*值显著大于对照(p<0.05)

**值显著低于对照(p<0.05)

因此，本发明证明，使用多肽的G1988进化枝的成员转化植物，包括单子叶植物，可赋予所述转基因植物相对于对照植物对低氮条件的耐受性和氮利用效率的更大的对低氮条件的耐受性和增加的氮利用效率。

实施例XII.大豆田间试验中改善的产量

拟南芥序列G1988(SEQIDNO：1和2)是推定的转录因子，显示其增加大豆(Glycinemax)的产量潜力。在连续多年的大面积产量试验中，组成型表达G1988的转基因植物胜过对照栽培变种，平均一个构建体具有大于6％的产量增加。对G1988转基因大豆的田间观察鉴定了多个受所述转基因调节的产量相关性状，包括增加的高度、改善的早季活力和增加的估计植株密度计数。过表达G1988的大豆植物开花略早(平均一个构建体低于一天)、成熟略有延迟(平均一个构建体大约一天)，并在该季晚期产生额外的主茎含荚节(图9)。

表12显示2004年在美国的10个地方(每个地方两个重复)对9个35S::G1988大豆系测试的大面积产量获得的结果。每个重复的种植密度为每英尺9粒种子，两个12英尺行被3英尺小径分开。产量记录为每英亩的蒲式耳(bushel)，并通过空间分析与非转化的亲本对照系比较。在显示显著的转基因表达的7个系中，有6个系的G1988过表达子显示增加的产量(表12)。除了产量的增加之外，多个所述系显示早花、延迟的成熟和早期的密度计数。

表12.2004年田间试验中过表达的35S::G1988大豆植物相对于对照植物的产量

*显示相对于对照的显著的产量增加

**G1988未表达至显著水平

***G1988表达水平低于高产转基因系

还在2005年的田间试验中种植了过表达G1988(35S::G1988)的转基因大豆植物的不同的系。在2004年和2005年两年中，平均来讲，过表达G1988的大豆植物稍微高于对照植物。当平均多个地方的产量数据时，与亲本系相比，两年中均观察到每英亩蒲式耳产量的一致增加(图6)。在2005年的田间试验中，G1988过表达显著增加了测试的19个地方中17个地方的产量。如果从所述统计分析中除去系4，其与图6中显示的其它系不同，显示很少或不显示G1988在叶组织中的表达，则2005年的平均产量增加为约6.7％。

对三年田间试验的大豆产量的分析显示，当过表达于许多转基因系时，G1988能够赋予相对于对照的增加的产量(表13)。

表13.过表达G1988的转基因系大豆产量的跨年分析

*显示相对于对照的显著的产量增加

**G1988未表达至显著水平

***G1988表达水平低于高产转基因系

表14显示了其中G1988过表达可增加大豆植物产量的另一方法。在此表中，比较了来自早晚两种种植日期的转基因和对照植物的最终密度计数。与相同条件下测试的对照系相比，高产系显示显著更大的最终密度计数。在许多情况下，这些结果在p<0.05水平显著。

表14.过表达G1988的转基因系大豆产量的跨年分析

*在p<0.05水平显著

**G1988未表达至显著水平

***G1988表达水平低于高产转基因系

图11显示种植密度田间试验的结果。此图中代表过表达G1988的大豆植物在多种植物密度下均显示相对于不过表达G1988的对照植物(显示为空心圆圈)或不显著表达G1988的对照转基因植物(显示为实心圆圈)的可观测的产量增加。

5个过表达子系用空心三角、实心三角、空心方块、实心方块和星形表示。如此图所示，所述5个显著表达G1988的系在测试的所有密度下均提供比对照更大的产量，因此，植物密度计数对可收获产量无大的贡献。

大豆产量增加的一个可能解释是含荚主茎节相对于未过表达所述G1988多肽的对照植物增加。如图9所示，当比较过表达许多序列的各系大豆植物时，观察到相对于亲本对照系的相当大范围的含荚主茎节的平均数(观察的对照系的差异为“0”，并由此在图9中用“0”纵坐标线表示)。阴影条代表G1988过表达系，其所有系均产生比对照更多的节，其中所述5个系中的4个系在观察的节数上产生最高的正差异。

因此，本发明证明，使用多肽G1988进化枝的成员转化的转基因植物，包括豆科植物，特别地包括大豆，可显示相对于对照植物表现的产量的产量增加。

实施例XIII.G1988和其在系统发育上相关的序列对改善产量的效用。

增加的非生物胁迫耐受性可改善产量。

G1988还改善了拟南芥的胁迫耐受性，并且早期的实验已显示G1988近缘同源序列也相对于对照赋予改善的对如冷或低氮等条件的非生物胁迫耐受性。改善的非生物胁迫耐受性可显著影响产量，包括在轻度、中度和相当大的胁迫过程中。

增加的茎直径可改善产量。

增加的茎直径可对植物的生物质有正影响，并且还提供增加的抗倒伏性。

更多的次生生根作用可改善产量。

用G1988进化枝成员序列转化植物所提供的更大的次生生根作用可赋予相对于对照植物的更好的固定。还可产生具有在贫瘠土壤，如在低营养环境或在低可用水量地区或阶段中茁壮生长的能力的转化植物。增加的根生长还可介导渗透胁迫耐受性。这些因素增加了作物的有效种植范围和/或增加存活和产量。

增加主茎节数可改善产量。

多种作物的主茎节数与所述植物生产的产量相关。例如，大豆和其它荷有种子的作物在其主茎节产生荷种子荚，因此，增加主茎节数对所述植物产生的种子数有正影响。更大的主茎节数还可增加生物质或其它作物，如棉花(其成铃与主茎节数相关)的产量。

降低的光敏感性可改善产量。

光可对植物生长和发育的许多方面，包括萌发、绿化和开花时间，造成影响。光触发对下胚轴伸长以及幼嫩幼苗绿化的抑制。因此，下胚轴长度的差异是测量对光的响应度的良好指标。由于降低的对下胚轴伸长的抑制，过表达G1988的幼苗在光下显示伸长的下胚轴。G1988过表达子还对蓝、红和红外波长低敏，指示G1988在负责感知不同颜色的光的光受体下游起作用。此发现指示过表达G1988的成年植物对照射(incumbent)光具有降低的敏感性。

当在拟南芥中过表达时，来自玉米(G4000、SEQIDNO：8)、大豆(G4004、SEQIDNO：4)、水稻(G4012)和番茄(G4299、SEQIDNO：22)的G1988近缘同源序列也赋予长下胚轴。在目前为止执行的实验中，过表达大豆来源的同源物G4005(SEQIDNO：6)在生产的系中未造成长下胚轴，但是G4005的确赋予改变的光响应的其它指示，如向上的叶柄和叶。因此，G1988和其来自玉米、大豆、水稻和番茄的直系同源物在其降低光敏感性能力方面具有强的相关性，这些数据指示G1988和其近缘同源序列在参与光敏感性的信号传导途径中具有相似的功能。因此，可以预测的，像G1988一样，近缘G1988进化枝成员同源序列也可改善可受降低的光敏感性影响的性状。降低的光敏感性可造成产量相对于对照植物的改善。

更多的早季生长可改善产量。

对于几乎所有商业作物来说，都希望使用快速建成的植物，因为幼苗和幼嫩的植物对胁迫条件如盐或疾病特别易感。由于许多杂草可超过幼嫩作物生长或同它们竞争养分，所以也需要确定允许幼嫩的作物植物战胜杂草物种的方法。增加幼苗和幼嫩植物活力允许作物在更早季节中种植，而减少对环境因素造成的损失的顾虑。

更大的晚季活力可改善产量。

G1988的组成型表达显著改善大豆的晚季生长和活力。G1988过表达子具有增加的含荚主茎节、更高的植物高度和一致性的晚季冠幅盖度增加。这些相对于对照或未转化植物的差异可对产量具有显著的正影响。

由于在G1988和其近缘同源序列观察到的形态、生理和胁迫耐受性的相似性，因此预期G1988进化枝的多肽成员，包括表1和序列表中显示的序列，在许多作物植物、观赏植物和食品、观赏、造纸、纸浆、木材或其它工业中使用的木本植物中增加产量、作物质量和/或生长范围并减少肥料和/或水分利用。

实施例XIV.转化真双子叶植物以产生增加的产量和/或非生物胁迫耐受性

过表达本发明多肽的作物物种可生产在胁迫和非胁迫条件下均具有增加的水剥夺、冷和/或营养耐受性和/或产量的植物。因此，可将重组至例如本发明表达载体之一或另一合适的表达载体的序列表中列出的多核苷酸序列转化植物以修饰植物性状、改善产量和/或质量。所述表达载体可包含可操作连接至多核苷酸的组成型、组织特异性或诱导型启动子。所述克隆载体可用本领域公知的方法，例如，直接DNA转移或根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的转化而导入多种植物。使用大多数真双子叶植物生产转基因植物已成为常规内容(见Weissbach和Weissbach(1989)；Gelvin等(1990)；Herrera-Estrella等(1983)；Bevan(1984)；和Klee(1985))。分析性状的方法是本领域的常规操作，并且上文已公开了实施例。

许多转化番茄和大豆植物的方案先前已有描述并在本领域公知。Gruber等(1993)，在Glick和Thompson(1993)中描述了可用于细胞或组织转化和后续再生的多个表达载体和培养方法。大豆转化的方法见Miki等(1993)；和1996年10月8日授权的第5,563,055号美国专利(Townsend和Thomas)。

存在相当多的农杆菌介导转化方案的可选方法和用于将外源基因转移至大豆或番茄的其它方法。所述方法之一是微弹介导的转化，其中位于微弹颗粒表面的DNA通过基因枪设备(biolisticdevice)转入植物组织(例如见Sanford等(1987)；Christou等(1992)；Sanford(1993)；Klein等(1987)；1991年5月14日授权的第5,015,580号美国专利(Christou等)；和1994年6月21日授权的第5,322,783号美国专利(Tomes等)。

可选地，超声方法(例如见Zhang等(1991))；使用CaCl₂沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将DNA直接吸收到原生质体中(例如见Hain等(1985)；Draper等(1982))；脂质体或原生质球融合(例如见Deshayes等(1985)；Christou等(1987))；和原生质体和完整细胞和组织的电穿孔(例如见Dorm等(1990)；D'Halluin等(1992)；和Spencer等(1994))已用于将外源DNA和表达载体导入植物。

转化植物或植物细胞(并且转化的宿主植物细胞然后再生为植物)之后，所述转化植物可与其自身或同系的植物、未转化的或野生型植物或来自植物不同的转基因系的另一转化植物杂交。杂交的好处是产生新的并且通常是稳定的转基因品种。使用本领域公知的传统回交技术，可将已导入番茄或大豆系的基因和它们赋予的性状移动至植物的不同系。番茄植物的转化可按Koornneef等(1986)和第6,613,962号美国专利的方案执行，

在此简要描述后一种方法。8日龄子叶外植体在培养皿中预培养24小时，所述培养皿含有涂布于MS培养基(2％(w/v)蔗糖和0.8％琼脂添加10μMα-萘乙酸和4.4μM6-苄氨基嘌呤)上的矮牵牛悬浮细胞饲养层。然后用稀释的根癌农杆菌(含有包含本发明多核苷酸的表达载体)的过夜培养物感染外植体5-10分钟、在无菌滤纸上印干，然后在原始饲养层平板上共培养48小时。培养条件如上所述。根癌农杆菌的过夜培养物用液体MS培养基(2％(w/v/)蔗糖，pH5.7)稀释至OD₆₀₀为0.8。

共培养之后，将所述子叶外植体转移至具有选择培养基的培养皿，所述选择培养基包含MS培养基和4.56μM玉米素、67.3μM万古霉素、418.9μM头孢噻肟和171.6μM硫酸卡那霉素，并在上述培养条件下培养。所述外植体每三周继代培养至新鲜培养基。将新生芽从下面的愈伤组织上切下并转移至不含玉米素的选择培养基玻璃罐以形成根。在含有硫酸卡那霉素的培养基上形成根是转化成功的阳性指示。

大豆植物的转化可使用例如第5,563,055号美国专利(Townsend等，1996年10月8日授权)的方法进行，在此对该方法进行简要描述。在此方法中，大豆种子通过接触玻璃钟罩析出的氯气进行表面消毒。种子通过涂布于1/10强度琼脂固化的不含植物生长调节剂的培养基并在28℃，16小时日长下培养进行萌发。3或4天后，种子可准备进行共培养。除去种皮，取子叶下方3-4毫米处伸长的胚根。

含有包含本发明多核苷酸的表达载体的根癌农杆菌的过夜培养物生长至对数期，收集并通过离心浓缩。分批执行接种，以便每个平板的种子都得到新重悬的农杆菌沉淀的处理。所述沉淀用20ml接种培养基重悬。将接种物倒入含有准备的种子的培养皿，使用手术刀片分离子叶节。30分钟后将所述外植体转移至已固化的相同培养基的平板中。将外植体近轴面向上，水平嵌于所述培养基表面，在22℃、白色荧光下培养3天。然后可根据本领域公知的方法对这些植物进行再生，如通过在3天后将外植体移至液体反向筛选培养基(见第5,563,055号美国专利)。

然后可在固化选择培养基上挑选、嵌入和培养所述外植体。在选择培养基上一个月之后，转化组织变得可见，因为再生组织具有绿色部分，而背景则为漂白、健康状况较差的组织。将具有绿色部分的外植体转移至伸长培养基。在培养基上继续培养，每两周转移至新鲜平板。当芽的长度达到0.5cm时，可将其从基部切下，然后置于生根培养基。

实施例XV：转化单子叶植物以产生增加的产量或非生物胁迫耐受性

禾谷类植物，如但不限于玉米、小麦、水稻、高粱或大麦，可用本发明多核苷酸序列、包括单子叶植物或真双子叶植物衍生序列如本发明表中提供的序列，进行转化；所述序列克隆至如pGA643并含有卡那霉素抗性标记的载体，在例如CaMV35S或COR15启动子下组成表达或使用组织特异性或诱导型启动子。所述表达载体可以是序列表中提供的载体，或可以相似地使用任何其它合适的表达载体。例如，pMEN020可修改为用吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的BAR基因取代NptII编码区域，所述BAR基因赋予对草丁膦的抗性。使用沉默的密码子改变通过定向诱变除去Bar基因的KpnI和BglII位点。

所述克隆载体可通过本领域公知的方法导入多种禾谷类植物，所述方法包括直接DNA转移或根癌农杆菌介导的转化。后一种方法可通过多种手段完成，包括例如，第5,591,616号美国专利的手段，其中通过用去分化组织接触含有克隆载体的农杆菌来转化单子叶愈伤组织。

将样品组织在3x10^-9个含有所述克隆载体的农杆菌细胞的悬浮液中浸泡3-10分钟。将所述愈伤组织在固体培养基，25℃，暗条件下培养若干天。将在此培养基上生长的愈伤组织转移至再生培养基。每2-3周进行一次继代转移(2或3次)，直至形成芽。然后每2-3周将芽转移至芽伸长培养基。将外观健康的芽转移至生根培养基，形成根之后，将所述植物置于润湿的盆栽土中。

然后使用5Prime-3PrimeInc.(Boulder，CO)的ELISANPTII试剂盒通过ELISA分析所述转化植物中NPTII基因/卡那霉素抗性的存在。

常规也使用其它方法生产大多数禾谷类作物(Vasil(1994))如玉米、小麦、水稻、高粱(Cassas等(1993))和大麦(Wan和Lemeaux(1994))的转基因植物。DNA转移方法如微弹方法可用于玉米(Fromm等(1990)；Gordon-Kamm等(1990)；Ishida(1990))、小麦(Vasil等(1992)；Vasil等(1993)；Weeks等(1993))和水稻(Christou(1991)；Hiei等(1994)；Aldemita和Hodges(1996)；和Hiei等(1997))。对于大多数禾谷类植物，衍生自未成熟盾片组织的胚性细胞是转化的优选细胞靶(Hiei等(1997)；Vasil(1994))。对于使用基因枪法转化衍生自未成熟盾片组织的玉米胚性细胞，A188XB73基因型是优选的基因型(Fromm等(1990)；Gordon-Kamm等(1990))。微弹轰击后，对组织进行草丁膦选择以鉴定转基因胚性细胞(Gordon-Kamm等(1990))。可通过标准的玉米再生技术从转化的宿主植物细胞再生转基因植物(Fromm等(1990)；Gordon-Kamm等(1990))。

实施例XVI：非拟南芥物种中增加的产量或非生物胁迫耐受性的表达和分析

由于衍生自各种不同植物物种的G1988近缘同源序列在植物中过表达具有赋予增加的产量、相似的形态、降低的光敏感性和增加非生物胁迫耐受性、包括萌发时的耐寒性和低氮条件下耐受性的相同功能，因此预期多肽序列(包括序列表中提供的序列)G1988进化枝的结构相似的直系同源物，可赋予相对于对照植物增加的产量和/或对许多非生物胁迫、包括水剥夺、冷和低氮条件下增加的耐受性。由于本发明序列已显示在多个植物物种中增加产量或改善胁迫耐受性，因此还预期这些序列将增加作物或其它商业主要的植物物种的产量。

再生的转化植物的Northern点杂交分析、RT-PCR或微阵列分析可用于显示表达本发明多肽和相关基因的表达，所述多肽或基因能够诱导非生物胁迫耐受性和/或更大的大小。

当真双子叶植物、单子叶植物或植物细胞进行转化(和后者的植物宿主细胞再生成植物)并在胁迫条件下显示相对于对照植物的更大的大小、改善的种植密度(即能够耐受更大的种植密度并具有一致的产量增加)、改善的晚季活力或改善的对非生物胁迫的耐受性或产生更大的产量后，所述转化的单子叶植物可与其自身或同系的植物、未转化或野生型单子叶植物或来自植物不同的转基因系的另一转化单子叶植物杂交。

分析了本发明特定多肽包括近缘直系同源物的功能，可对其进行进一步的特性鉴定并将其引入作物植物。这些序列的异位过表达可使用组成型、诱导型或组织特异性调节元件进行调节。序列表中提供了由已进行研究并显示改良植物性状(包括增加产量和/或非生物胁迫耐受性)的基因编码的多肽。除这些序列之外，预期新发现的与序列表中提供的多核苷酸和多肽序列近缘的多核苷酸和多肽序列，当其转化至植物时也可赋予与序列表中提供的序列的方式相似的性状改变，所述植物是相当多样的不同物种(包括双子叶植物和单子叶植物)中的任何植物。衍生自单子叶植物的多核苷酸和多肽序列(例如水稻序列)可用于转化单子叶植物和双子叶植物，而衍生自双子叶植物的序列(例如，拟南芥和大豆基因)可用于转化任何一组，虽然预期其中一些序列在所述基因转化与该序列衍生自的植物为同一组的植物时功能最佳。

作为确定水剥夺相关耐受性第一步的实例，可对这些转基因植物的种子进行萌发分析以测量蔗糖敏感、重度干燥或干旱。蔗糖敏感、重度干燥或干旱分析的方法如上文所述。

发现过表达本发明序列的植物可对高蔗糖有更强的耐受性，表现为更好的萌发、更长的根和更多的子叶展开。

本发明序列(即G1988进化枝的成员)还可用于生成比对照植物更耐受低氮条件或寒冷的转基因植物。

所有这些由G1988赋予的非生物胁迫耐受性均可有助于增加可商业获得的植物的产量。不过，G1988过表达子已显示在显然没有显著可见的非生物胁迫下增加植物的产量，在过表达G1988的大豆植物中观察到的表现包括增加的高度、增加的早季活力和估计密度计数和减小的早季冠幅盖度。因此，预期G1988进化枝的成员将相对于对照植物改善植物(包括豆科物种)的产量，即使无明显的非生物胁迫。

比对照更耐受水剥夺分析、低氮条件或冷的植物更绿、更有活力，其将具有比对照更好的存活率或将比对照植物更好地从这些处理中恢复。

预期相同的方法可用于鉴定本发明序列多肽进化枝的其它有用和有价值的序列，所述序列可衍生自多种不同的物种。

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本发明涉及以下实施方式：

实施方式1.一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有性状改变，所述方法步骤包括：

(a)提供编码包含B-盒锌指保守结构域的多肽的表达载体，所述B-盒锌指保守结构域与SEQIDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或66中的任一项具有氨基酸同一性；

其中当在植物中过表达所述多肽时，所述多肽调节转录并赋予至少一种调节活性，造成相对于对照植物的性状改变；

其中氨基酸同一性百分比选自由下列组成的组：至少约56％、至少约58％、至少约60％序列同一性、至少约65％、至少约67％、至少约70％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％和约100％；和

(b)将所述表达载体导入靶植物从而产生所述转基因植物；

其中所述性状改变选自由下列组成的组：更多的早季生长、更多的晚季生长和活力、更大的冠幅盖度、更高的高度、更大的茎直径、增加的对倒伏的抗性、增加的节间长度、增加的次生生根作用、更强的耐寒性、更强的对水剥夺的耐受性、降低的气孔导度、增加的对高渗胁迫的耐受性和增加的主茎节数；和

(c)任选地，通过选择过表达所述多肽的转基因植物或选择相对于对照植物具有性状改变的转基因植物而鉴定所述转基因植物。

实施方式2.如实施方式1所述的方法，其中所述转基因植物是豆科植物。

实施方式3.如实施方式1所述的方法，其中所述多肽进一步包含SEQIDNO：62、SEQIDNO：57和/或SEQIDNO：58。

实施方式4.如实施方式1所述的方法，其中所述表达载体编码SEQIDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或66中的任一项。

实施方式5.如实施方式1所述的方法，其中所述表达载体进一步包含调节所述多肽表达的组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。

实施方式6.如实施方式5所述的方法，其中所述组织特异性启动子或诱导型启动子是新生叶原基组织特异性启动子、表皮组织特异性启动子、花分生组织组织特异性启动子、光合组织特异性启动子、根组织特异性启动子、根分生组织组织特异性启动子、根维管组织特异性启动子、维管组织特异性启动子、茎顶端分生组织特异性启动子、表皮组织特异性启动子、花原基或花特异性启动子、分生组织特异性启动子、原基组织特异性启动子、幼嫩器官特异性启动子或胁迫诱导型启动子。

实施方式7.如实施方式1所述的方法，其中所述方法步骤进一步包括将所述转基因植物分别与其自身自交或与另一植物杂交，以生产转基因种子。

实施方式8.如实施方式1所述的方法，其中所述方法步骤进一步包括将所述转基因植物分别与其自身自交或与另一植物杂交，以生产包含如实施方式1所述的表达载体的转基因种子。

实施方式9.一种转基因种子，其产自通过如实施方式1所述的方法生产的转基因植物，其中所述转基因种子包含如实施方式1所述的表达载体。

实施方式10.一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有性状改变，所述方法步骤包括：

(a)提供表达载体，其包含编码包含B-盒锌指保守结构域的多肽的重组多核苷酸；

其中所述重组多核苷酸在严格条件下与SEQIDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或65中的任一项杂交，并且其中所述严格条件至少与下述的杂交条件的严格性相同：其包含至少两个漂洗步骤，每个漂洗步骤在6xSSC中，在65℃下漂洗10至30分钟；

其中当在植物中过表达所述多肽时，所述多肽调节转录并赋予至少一种调节活性，造成相对于对照植物的性状改变；

(b)将所述表达载体导入靶植物以生产所述转基因植物；

其中所述性状改变选自由下列性状组成的组：更多的早季生长、更多的晚季生长和活力、更大的冠幅盖度、更高的高度、更大的茎直径、增加的对倒伏的抗性、增加的节间长度、增加的次生生根作用、更强的耐寒性、更强的对水剥夺的耐受性、降低的气孔导度、增加的对高渗胁迫的耐受性和增加的主茎节数；和

(c)任选地，通过选择过表达所述多肽的转基因植物或选择相对于对照植物具有性状改变的转基因植物而鉴定所述转基因植物。

实施方式11.如实施方式10所述的方法，其中所述转基因植物是豆科植物。

实施方式12.如实施方式10所述的方法，其中所述杂交条件包含至少两个漂洗步骤，每个漂洗步骤在0.5XSSC、0.1％SDS中，在65℃漂洗10至30分钟。

实施方式13.如实施方式10所述的方法，其中所述表达载体进一步包含调节所述多肽表达的组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。

实施方式14.如实施方式13所述的方法，其中所述组织特异性启动子或诱导型启动子是新生叶原基组织特异性启动子、表皮组织特异性启动子、花分生组织组织特异性启动子、光合组织特异性启动子、根组织特异性启动子、根分生组织组织特异性启动子、根维管组织特异性启动子、维管组织特异性启动子、茎顶端分生组织特异性启动子、表皮组织特异性启动子、花原基或花特异性启动子、分生组织特异性启动子、原基组织特异性启动子、幼嫩器官特异性启动子或胁迫诱导型启动子

本说明书中引用的所有出版物和专利申请均通过引用结合入本文，其等同于特异地单独指出每个单独的出版物和专利申请通过引用结合。

本发明不限于本文描述的具体实施方案。许多对本发明完整描述的更改和修饰对本领域普通技术人员是明显的，而不偏离权利要求书的精神或范围。从上文描述和附图中明显的修饰归入下列权利要求的范围内。

Claims (19)

1.一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有性状改变，所述方法步骤包括：

(a)提供包含编码与SEQIDNO:2有至少67％同一性的多肽的重组多核苷酸的表达构建体；

(b)将所述表达构建体导入靶双子叶植物从而产生所述转基因植物；

其中所述多肽在所述转基因植物中过表达，所述多肽造成相对于对照植物的性状改变，其中所述改变的性状选自由下列组成的组：更多的晚季活力、更大的晚季冠幅盖度、增加的主茎节数和增加的节间长度。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述多肽与SEQIDNO:2有至少90％同一性。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述多肽与SEQIDNO:2有至少95％同一性。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述多肽包含SEQIDNO:2。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸与SEQIDNO:1有至少80％同一性。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸与SEQIDNO:1有至少85％同一性。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸与SEQIDNO:1有至少90％同一性。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述植物是豆科植物。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述植物是大豆植物。

11.如权利要求1－10中任一项所述的方法，其中所述表达载体进一步包含调节所述多肽表达的组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。

12.如权利要求1－11中任一项所述的方法，其中进一步包含下述步骤：

c)通过选择过表达所述多肽的转基因植物或选择相对于对照双子叶植物具有性状改变的转基因植物而鉴定所述转基因植物。

13.一种表达载体，其中包含编码具有B-盒锌指保守结构域的多肽的重组多核苷酸以及与之可操作连接的用于在植物细胞中异位表达的调控序列，所述结构域与SEQIDNO:2的氨基酸残基5－50有至少67％氨基酸序列同一性；

其中当所述多肽在植物中过表达时，所述多肽调节转录并且赋予至少一种调节活性，从而在所述植物中引起相对于对照植物的性状改变；

其中所述改变的性状选自由下列组成的组：与对照植物相比更多的晚季活力、更大的晚季冠幅盖度、增加的主茎节数和增加的节间长度。

14.权利要求13的表达载体，其中所述多肽还包含SEQIDNO:57或SEQIDNO:58。

15.权利要求13的表达载体，其中所述表达载体编码SEQIDNO:2。

16.权利要求13的表达载体，其中所述表达载体还包含调节所述多肽的表达的组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。

17.权利要求16的表达载体，其中所述组织特异性启动子或诱导型启动子是新生叶原基组织特异性启动子、表皮组织特异性启动子、花分生组织组织特异性启动子、光合组织特异性启动子、根组织特异性启动子、根分生组织组织特异性启动子、根维管组织特异性启动子、维管组织特异性启动子、茎顶端分生组织特异性启动子、表皮组织特异性启动子、花原基或花特异性启动子、分生组织特异性启动子、原基组织特异性启动子、幼嫩器官特异性启动子或胁迫诱导型启动子。

18.权利要求13的表达载体，其中所述结构域与SEQIDNO:2的氨基酸残基5－50的氨基酸序列同一性百分比是：至少大约70％，至少大约75％，至少大约76％，至少大约77％，至少大约78％，至少大约79％，至少大约80％，至少大约81％，至少大约82％，至少大约83％，至少大约84％，至少大约85％，至少大约86％，至少大约87％，至少大约88％，至少大约89％，至少大约90％，至少大约91％，至少大约92％，至少大约93％，至少大约94％，至少大约95％，至少大约96％，至少大约97％，至少大约98％，至少大约99％或大约100％。

19.一种转基因植物细胞，其中包含权利要求13－18中任一项所定义的重组多核苷酸或表达载体。