BRPI0713794B1 - Rendimento e tolerância ao estresse aumentado em plantas transgênicas. - Google Patents

Abstract

rendimento e tolerância ao estresse aumentado em plantas transgênicas. polonucleotídeos e polipeptídeos incorporados em vetoress de expressão foram introduzidos em plantas e foram ectopicamente expressados. os polipeptídeos da invenção foram mostrados para conferir pelo menos uma atividade reguladora e conferir rendimento aumentado, altura maior, enraizamento secundário aumentado, germinação mais rápida, maior tolerância ao frio, maior tolerância à privação de água, condutância estomatal reduzida, sentido c/n alterado, tolerância à abaixa de n aumentada, tolerância à baixa de fósforo aumentada, ou tolerância aumentada ao estresse hiperosmótico como comparado a uma planta controle.

Description

(54) Título: RENDIMENTO E TOLERÂNCIA AO ESTRESSE AUMENTADO EM PLANTAS TRANSGÊNICAS.

(51) Int.CI.: A01H 1/00; A01H 5/00; C12N 15/00; C12N 5/04 (30) Prioridade Unionista: 29/06/2006 US 60/817,886 (73) Titular(es): MENDEL BIOTECHNOLOGY, INC.. MONSANTO COMPANY (72) Inventor(es): ROBERT CREELMAN; NEAL I. GUTTERSON; OLIVER J. RATCLIFFE; T. LYNNE REUBER; R. ERIC CERNY; KIMBERLY FAYE ZOBRIST DUFF; SUSANNE KJEMTRUP-LOVELACE; ROBERT MEISTER; MARIE PETRACEK; THOMAS RUFF; QINGZHANG XU

Relatório Descritivo da Patente de Invenção Para:

RENDIMENTO E TOLERÂNCIA AO ESTRESSE AUMENTADO EM PLANTAS TRANGÊNICAS .

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à genômica da planta e à melhoria da planta.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os efeitos de vários fatores no rendimento da planta

O rendimento das espécies comercialmente valiosas no ambiente natural pode ser subótimo já que as plantas crescem freqüentemente sob condições desfavoráveis, tais como em uma temperatura imprópria ou com uma fonte limitada de nutrientes do solo, de luz, ou de disponibilidade da água. Por exemplo, nitrogênio (N) e fósforo (P) são nutrientes de limitação críticos para plantas. O fósforo é inferior apenas ao nitrogênio em sua importância como um macronutriente para o crescimento da planta e seu impacto na colheita. As plantas tem desenvolvido diversas estratégias para ajudar a lidar com a privação P e N que inclui adaptações metabólicas assim como adaptações relativas ao desenvolvimento. A maioria, se não todas, estas estratégias possuem componentes que são regulados a nível de transcrição e são consequentemente favoráveis à manipulação por fatores da transcrição. As adaptações metabólicas incluem o aumento da disponibilidade de P e de N pelo aumento da captação do solo apesar da indução de transportadores de elevada afinidade e de baixa afinidade, e/ou aumento da sua mobilização na planta. As adaptações relativas ao desenvolvimento incluem aumentos em raízes primárias e secundárias, aumentos no número de pêlos na raiz e comprimento, e associações com fungos mycorrhizal (Bates e Lynch (1996); Harrison (1999)).

Os metabolismos do nitrogênio e do carbono são ligados firmemente em quase todas as vias bioquímicas na planta. Os metabólitos do carbono regulam os genes envolvidos na aquisição e no metabolismo de N, e são conhecidos por afetar a germinação e a expressão de genes fotossintéticos (Coruzzi et al. (2001)) e consequentemente o crescimento.

Os primeiros estudos sobre a nitrato redutase (NR) em 1976 mostraram que a atividade de NR poderia ser afetada pela

Glc/Suc (Crawford (1995); Daniel-Vedele et al. (1996)).

Aquelas observações foram suportadas por experiências posteriores que mostraram que os açúcares induzem mRNA de

NR em mudas verdes adaptadas no escuro (Cheng et al.

(1992)) . C e N podem ter relacionamentos antagonísticos como moléculas da sinalização; a indução de luz da atividade de NR e dos níveis do mRNA pode ser imitada por metabólitos de C e os metabólitos de N causam a repressão da indução de NR no tabaco (Vincentz et al. (1992)) . A regulação do gene pelo status de C/N (balanço carbononitrogênio) foi demonstrada para um número de genes Nmetabólicos (Stitt (1999)); Coruzzi et al. (2001)). Assim, uma planta com sensibilidade alterada de C/N pode exibir germinação e/ou crescimento melhorado(s) sob condições de limitação ao nitrogênio.

O déficit de água é uma limitação principal do rendimento das colheitas. Em ambientes de limitação de água, o rendimento da colheita é uma função do uso da água, eficiência do uso da água (WUE; definido como uso do rendimento/água da biomassa aérea) e o índice da colheita (HI; a relação do rendimento da biomassa para a biomassa cumulativa total na colheita) . WUE é uma característica complexa que envolve a água e a captação de CO2, o transporte e a troca na superfície da folha (transpiração) .

WUE melhorado tem sido proposto como um critério para a melhora do rendimento sob a seca. O déficit de água pode igualmente ter efeitos adversos sob a forma da susceptibilidade aumentada a doença e pragas, reduzindo o crescimento da planta e falhas reprodutivas. Os genes úteis para a expressão especialmente durante o déficit de água são os genes que promovem aspectos do crescimento ou da fertilidade da planta, os genes que concedem resistência a doença, os genes que concedem resistência a praga, e similares. Estas limitações podem atrasar o crescimento e o desenvolvimento, reduzir a produtividade, e em casos extremos, causar a morte da planta. A tolerância acentuada a estes estresses conduziría a aumentos no rendimento em variedades convencionais e redução na variação do rendimento em variedades híbridas.

Um outro fator que afeta o rendimento é o número de plantas que pode crescer por acre. Para espécies de colheita, a densidade da plantação ou da população varia de uma colheita para outra colheita, de uma região de crescimento a outra, e de ano a ano.

Características da planta, incluindo suas características bioquímicas, relativas ao desenvolvimento, ou fenotípicas que acentuam o rendimento ou a tolerância aos vários estresses abióticos, podem ser controladas com um número de processos celulares. Uma maneira importante de manipular esse controle é através dos fatores de transcrição - proteínas que influenciam a expressão de um gene particular ou conjuntos de genes. As plantas transformadas e transgênicas que compreendem células possuindo níveis alterados de pelo menos um fator da transcrição selecionado, por exemplo, possuem características vantajosas ou desejáveis. Estratégias para manipulação de características alterando o conteúdo do fator de transcrição de uma célula da planta pode consequentemente resultar em plantas e colheitas com propriedades comercialmente valiosas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objetivo desta invenção é fornecer plantas as quais possam expressar genes para aumentar o rendimento de plantas comercialmente significativas, assim como para melhorar os efeitos adversos do déficit de água ou de nutrientes.

A presente invenção pertence assim aos novos polinucleotídeos recombinantes, vetores de expressão, células da planta hospedeira e plantas transgênicas que os contêm, e métodos para produzir as plantas transgênicas.

Os polinucleotídeos recombinantes podem incluir qualquer uma das seguintes sequências:

(a) sequências de nucleotídeo encontradas na listagem de sequência;

(b) sequências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos encontrados na listagem de sequência;

(c) variações da sequência que são pelo menos 30% da sequência idêntica a qualquer uma das sequências de nucleotídeo de (a) ou de (b);

(d) sequências de polipeptídeo que são pelo menos 30% idênticas, ou pelo menos 32%, pelo menos 33%, pelo menos 36%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, ou pelo menos 67% idênticas em sua sequência de aminoácidos a qualquer uma das SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,

16, 18, 20, 22, ou 24;

(e) sequências de nucleotídeo ortólogas e parálogas que são pelo menos 40% idênticas a qualquer uma das sequências de nucleotídeo de (a) ou de (b);

(f) sequência de nucleotídeo que hibridiza a qualquer uma das sequências de nucleotídeo de (a) ou de (b) sob condições severas, que podem incluir, por exemplo, hibridização com etapas de lavagem de 6x SSC e 65°C por dez a trinta minutos por etapa; e;

(g) polipeptídeos, e as sequências de nucleotídeo que os codificam, tendo um domínio conservado de dedo de zinco de caixa B requerido para a função de regular a transcrição e alterar uma característica em uma planta transgênica. O domínio conservado sendo pelo menos

cerca	de	56%	de	identidade	da	sequência	ou	pelo	menos
cerca	de	58%	de	identidade	da	sequência,	ou	pelo	menos
cerca	de	60%	de	identidade	da	sequência,	ou	pelo	menos
cerca	de	65	Q. o r	ou pelo menos	cerca de	67	%, ou	pelo
menos	cerca	de	70%, ou pelo	menos cerca	de 75	%, ou

pelo menos cerca de 76%, ou pelo menos cerca de 77%, ou pelo menos cerca de 78%, ou pelo menos cerca de

79%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 81%, ou pelo menos cerca de 82%, ou pelo menos cerca de 83%, ou pelo menos cerca de 84%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 86%, ou pelo menos cerca de 87%, ou pelo menos cerca de 88%, ou pelo menos cerca de 89%, ou pelo menos cerca de

90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, idêntico em sua sequência do resíduo de aminoácido aos domínios conservados de dedo de zinco de caixa B (ZF) de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ou 24 (isto é, um polipeptídeo listado na listagem de sequência, ou codificado por qualquer das sequências de nucleotídeo acima, os domínios conservados estão sendo representados por SEQ ID NOs: 45-56, respectivamente). Os domínios conservados da invenção listados na tabela 1 compreendem um domínio requerido para a função de regular a transcrição e alterar uma característica em uma planta transgênica, a dita característica selecionada do grupo que consiste no rendimento aumentado, altura aumentada, sensibilidade C/N alterada, tolerância à baixa de nitrogênio aumentada, tolerância à baixa de fósforo aumentada, maior tolerância à privação da água, condutância estomacal reduzida, tolerância aumentada ao estresse hiperosmótico, como comparado à planta controle. Adicionalmente, os polipeptídeos da invenção podem compreender diversos resíduos de assinatura mais próximos ao C-terminal do que o domínio de caixa B.

Estes resíduos compreendem, em ordem do terminal N para o C:

W-X₄-G (SEQ ID NO: 62, onde X representa qualquer aminoácido; ver na Figura 4D) .

R-X3-A-X3-W (SEQ ID NO: 57, onde X representa qualquer aminoácido; ver na Figura 4D).

e

EGWXE (SEQ ID NO: 58; onde X representa qualquer aminoácido; ver na Figura 4E) .

Os vetores da expressão, e portanto as plantas transgênicas, da invenção, compreendem sequências de polinucleotídeos de fator da transcrição putativo e, em particular, sequências de dedo de zinco de caixa B. Quando qualquer um polipeptídeo da invenção é superexpressado em uma planta, o polipeptídeo confere pelo menos uma atividade reguladora à planta, que por sua vez manifestada em uma característica selecionada do grupo que consiste no rendimento aumentado, maior altura, enraizamento secundário aumentado, maior tolerânica a frio, maior tolerância à privação de água, condutância estomacal reduzida, sensibilidade C/N alterada, tolerância à baixa de nitrogênio aumentada, tolerância à baixa de fósforo aumentada, e tolerância aumentada ao estresse hiperosmótico em comparação à planta controle.

A invenção é também dirigida à semente transgênica produzida por qualquer uma das plantas transgênicas da invenção, e aos métodos para fazer as plantas transgênicas e as sementes transgênicas da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA E DESENHOS

A listagem de sequência fornece sequências exemplares de polinucleotídeo e polipeptídeo da invenção. As características associadas com o uso das sequências são incluídas nos exemplos.

Cópias 1 e 2 dos CD-ROMs, e a cópia do CRF da listagem de sequência sob a seção 1.821 (e) do CFR, são discos compactos legíveis para computador de memória de leitura apenas. Cada um contém uma cópia da listagem de sequência no formato de texto ASCII. A listagem de sequência é nomeada MBl0076.ST25.txt , o arquivo eletrônico da listagem de sequência contido em cada um destes CD-ROMs foi criado em 12 de junho de 2007, e é 83 quilobytes no tamanho. As cópias da listagem de sequência nos discos de

CD-ROM são incorporadas por referência em sua totalidade.

Figura 1 mostra uma estimativa conservadora de relações filogenéticas entre as ordens de plantas de floração (modificada de Soltis et al. (1997)). Aquelas plantas com um único cotilédone (monocotiledôneas) são um ciado monofilético aninhado dentro de pelo menos duas linhagens principais de dicotiledôneas; as eudicotiledóneas são ainda divididas em rosídeas e em asterídeas.

Arabidopsis é uma eudicotiledóneas rosuídea classificada dentro da ordem Brassicales; o arroz é um membro da ordem

Poales de monocotiledônea. Figura 1 foi adaptada de Daly et al. (2001) .

Figura 2 mostra um dendograma filogenético representando relações filogenéticas de uma taxa mais elevada da planta, incluindo os ciados contendo tomate e

Arabidopsis; adaptados de Ku et al. (2000); e Chase et al.

(1993).

Na figura 3, uma árvore filogenética e alinhamentos múltiplos da sequência de G1988 e de proteínas de comprimento integro relacionadas, foram construídas usando

ClustalW (versão 1.83, 2003 do programa de alinhamento da sequência múltipla de CLUSTAL W) . Os parâmetros de alinhamento múltiplos de ClustalW foram:

Intervalo de Penalidade de abertura: 10.00

Intervalo de Penalidade da extensão: 0.20

Sequências divergentes do atraso: 30%

Peso das transições de DNA: 0.50

Matriz do peso da proteína: Série de Gonnet

Matriz do peso de DNA: IUB

Uso de matriz negativa: OFF

Um alinhamento formatado FastA foi usado então para gerar uma árvore filogenética no software MEGA2 (MEGA2 (http://www.megasoftware.net) usando o algoritmo do vizinho mais próximo e um modelo p-distância. Um teste de filogenia foi feito via bootstrap com 1000 réplicas e sementes aleatórias definidas como padrão. Valores eliminados da árvore de bootstrap foram ajustados a 50%. Os homólogos estreitamente relacionados de G1988 são considerados como sendo aquelas proteínas dentro do nó da árvore abaixo com um valor de bootstrap de 74, limitado por

G4011 e por G4009 (indicados pela caixa em torno destas sequências). A sequência ancestral é representada pelo nó da árvore indicado pela seta na figura 3 que tem um valor de bootstrap de 74. Abreviaturas: At - Arabidopsis thalíana; Ct - Citrus sinensis; Gm - Glycine max; Os 12

Oryza sativa; Pt - Populus trichocarpa; Zm - Zea mays.

Figuras 4A - 4F mostram um alinhamento de Clustal W do ciado G1988 e das proteínas relacionadas. SEQ ID NOs:

aparecem entre parênteses após cada IDentificador do Gene (GID) . Alguns membros do ciado G1988 aparecem nas grandes caixas em cada uma das figuras 4A-4F. O domínio conservado (domínio B) do dedo de zinco de caixa B altamente conservado (ZF) é identificado nas figuras 4A-4B pela linha horizontal abaixo do alinhamento. Diversos resíduos de característica ou assinatura dentro dos motivos característicos exteriores e mais próximos ao C-términal do que o B-domínio são indicados pelos triângulos escuros pequenos nas figuras 4D e 4E.

Figura 5 mostra o nível médio da clorofila da folha

SPAD medido (SPAD ou Análise de Solo da Planta em

Desenvolvimento medido com um medidor de clorofila da folha de Minolta SPAD-502, eixo vertical) medido em linhagens superexpressadas G1988 de Arabidopsis (linhagens

OE, 10, 12 e 8-2; eixo horizontal). Igualmente são mostradas as medições para plantas controle (Cntl) para cada um das três linhagens experimentais. As plantas foram crescidas com 10 horas de luz, 0.1 mM de NH₄NO₃, préfixadas e foram analisadas 7,5 semanas após a plantação. As barras de erro representam o desvio padrão da média. As três linhagens G1988 tiveram um índice mais elevado de clorofila sob condições de baixa nitrogênio do que os controles. Os resultados obtidos para as linhagens 10 e 12 foram significativos em p< 0,01.

Figura 6 compara os efeitos no rendimento (eixo vertical: mudança na porcentagem do rendimento) em várias linhagens (eixo horizontal) de plantas de soja transgênica que superexpressão G1988 (35S::G1988) em experimentações de campo dos anos 2004 e 2005. Os dados são calculados através das localizações múltiplas e um aumento consistente no rendimento, como comparado com controles que abrigam um constructo vazio, foram observados. Nas análises de 2005, o

G1988 aumentou significativamente o rendimento em 17 de 19 posições. Se a linhagem 4, que ao contrário de outras linhagens apresentadas neste gráfico mostrou pouca ou nenhuma expressão de G1988 no tecido da folha, é removida da análise, o aumento médio do rendimento em 2005 foi aproximadamente de 6.7%.

Figura 7 mostra os dados experimentais obtidos em 2005 com semente de uma experimentação de campo na Califórnia que compara uma linhagem de soja de controle tipo selvagem e numerosas linhagens de superexpressão de 35S::G1988 de plantas de soja. A curva pontilhada representa a porcentagem da linhagem de germinação do tipo selvagem. A curva tracejada acima dela representa um baixo superexpressor que produza finalmente um aumento pequeno no rendimento sobre o controle. As curvas sólidas mais escuras acima daquele baixo superexpressor representam outro superexpressor 35S::G1988 que mostra um grau mais elevado de expressão, de rendimento significativamente mais elevado finalmente produzido, e de germinação melhorada no frio em comparação aos controles. Os resultados semelhantes foram obtidos com a semente derivada no mesmo ano de uma experimentação de campo conduzida em Kansas e em duas experimentações de campo em Illinois. Estes dados demonstraram que a superexpressão de G1988 conduz à germinação fria melhorada da soja.

Figura 8 compara a germinação total das sojas da experimentação de campo da Califórnia. A germinação de controle (curva pontilhada) era pobre e foi notado que uma porcentagem elevada da semente era semente dura, um fenômeno induzido por estresse que resulta em sementes que resistem à inibição sob condições padrão. A curva tracejada abaixo da curva de controle pontilhada representa o baixo superexpressor que pareceu ter uma porcentagem similar da semente dura, isto é, a mesma porcentagem da semente que não germinou em vários pontos do tempo, como o controle. As curvas sólidas mais escuras abaixo do controle e baixo superexpressor representam outras linhagens de superexpressão 35S::G1988 que tiveram uma porcentagem mais baixa de semente dura e produziram, eventualmente, um rendimento mais elevado do que os controles.

Figura 9 mostra o número médio de nós principais contendo vagem, relativo à linhagem de controle parental representada pela linhagem 0, observada em várias linhagens de plantas de soja superexpressando um número de sequências. As barras sombreadas denotam as linhagens de superexpressão G1988, que produziram geralmente um número significativamente maior de nós de marcação de vagem do que as plantas de controle.

Figura 10 demonstra como o aumento da altura da planta de soja que é característica da superexpressão de G1988 em períodos curtos do dia (10 horas de luz, 14 horas de escuro) é maior devido ao aumento do comprimento dos entrenós na porção superior da planta. As diferenças mais prontamente perceptíveis entre uma linhagem transgênica e uma linhagem controle foram observadas para os entrenós 8 ao 12. As diferenças na altura da planta entre plantas transgênicas G1988 e controles foram assim acentuadas no final da estação de crescimento. A linhagem não transformada de controle usada nestas experiências é representada pelas barras não sombreadas. As barras sombreadas mostram o comprimento do entrenó (em centímetros) da linhagem de superexpressão 178.

Figura 11 mostra os resultados de uma experimentação de campo da densidade de planta. Como visto nesta figura, as plantas de soja de superexpressão G1988 demonstraram um aumento perceptível do rendimento através de uma escala de densidades de planta, relativo às plantas controle que igualmente não superexpressaram G1988 (círculos não preenchidos), ou plantas transgênicas de linhagem 217 que expressaram G1988 a um grau mais baixo (aproximadamente 40% mais baixo) do que linhagens transgênicas de rendimento elevado (círculos preenchidos). A contagem do grupo de plantas não teve a grande contribuição para o rendimento cultivável. As plantas de linhagem 178 de superexpressão são representadas por triângulos não preenchidos. As plantas de linhagem 189 de superexpressão são representadas por triângulos preenchidos. As plantas de linhagem 209 de superexpressão são representadas por quadrados não preenchidos. As plantas de linhagem 200 de superexpressão são representadas por quadrados preenchidos. As plantas de linhagem 213 de superexpressão são representadas por asteriscos.

Figura 12 ilustra que a superexpressão constitutiva de G1988 (SEQ ID NO: 2) em plantas da soja promovem a germinação. Plantas transgênicas superexpressando G1988 que tinham sido mostradas aumentar rendimento de soja (linhagem 218, diamantes não preenchidos; e a linhagem 178, triângulos não preenchidos) demonstraram geralmente uma porcentagem de germinação acima da linhagem 217, que expressou G1988 a um grau mais baixo do que linhagens transgênicas de rendimento elevado (círculos preenchidos) e plantas não transformadas de controle (círculos não preenchidos). As sementes nestas experiências foram germinadas em ácido giberélico a 1.0 μΜ.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção refere-se à polinucleotídeos e polipeptídeos para modificar os fenótipos das plantas, particularmente aqueles associados com a tolerância de estresse abiótica aumentada e rendimento aumentado com relação a uma planta controle (por exemplo, um planta tipo selvagem). Durante esta descrição, as várias fontes de informação são referidas e/ou incorporadas especificamente.

As fontes de informação incluem artigos de jornal científico, documentos de patente, livros de texto, e endereços de página inativa - navegador World. Wide Web.

Enquanto a referência a estas fontes de informação claramente indicam que eles podem ser usados por um versado na técnica, cada uma das fontes de informação mencionada aqui é incorporada especificamente em sua totalidade, mesmo se uma menção específica de incorporação por referência for notada ou não. Os conteúdos e os ensinamentos de todas e cada uma das fonte de informação podem ser confiados sobre e usados para fazer e usar modalidades da invenção.

Como usado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares um, uma, e o/a incluem a referência plural a menos que o contexto dite claramente de outra maneira.

Assim, por exemplo, uma referência a uma célula hospedeira inclui uma pluralidade de tais células hospedeiras, e uma referência a um estresse é uma referência a um ou mais estresses e equivalentes conhecidos daqueles versados na técnica, e assim por diante.

DEFINIÇÕES

Polinucleotídeo é uma molécula de ácido nucléico que compreende uma pluralidade de nucleotídeos polimerizados, por exemplo, pelo menos cerca de 15 nucleotídeos polimerizados consecutivos. Um polinucleotídeo pode ser um ácido nucléico, oligonucleotídeo, nucleotídeo, ou qualquer fragmento do mesmo. Em muitos exemplos, um polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo (ou proteína) ou um domínio ou um fragmento do mesmo. Adicionalmente, o polinucleotídeo pode compreender um promotor, um íntron, uma região realçadora, um local de poliadenilação, um local de iniciação da tradução, regiões não traduzidas 5' ou 3', um gene repórter, um marcador selecionável, ou similares. 0 polinucleotídeo pode ser DNA ou RNA de filamento único ou duplo. 0 polinucleotídeo compreende opcionalmente bases modificadas ou uma espinha dorsal modificada. O polinucleotídeo pode ser, por exemplo,

DNA ou RNA genômico, um transcrito (tal como, um mRNA), um cDNA, um produto de PCR, um DNA clonado, um DNA ou RNA sintético, ou similares. 0 polinucleotídeo pode ser combinado com carboidrato, lipídeos, proteína, ou outros materiais para executar uma atividade particular tal como transformação ou para formar uma composição útil tal como um ácido nucléico de peptídeo (PNA). O polinucleotídeo pode compreender uma seqüência no sentido ou em orientações anti-sentido. Oligonucleotídeo é substancialmente equivalente aos termos amplimer, iniciador, oligômero, elemento, alvo, e sonda e é preferivelmente filamento único.

Um polinucleotídeo recombinante é um polinucleotídeo que não esteja em seu estado nativo, por exemplo, o polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeo não encontrada na natureza, ou o polinucleotídeo está em um contexto diferente daquele encontrado naturalmente, por exemplo, separado das sequências de nucleotídeo com a qual está tipicamente na proximidade na natureza, ou (ou contíguo com) sequências de nucleotídeo adjacentes com a qual não está tipicamente na proximidade. Por exemplo, a sequência em questão pode ser clonada em um vetor, ou de outra maneira recombinada com um ou mais ácidos nucléicos adicionais.

Um polinucleotídeo isolado é um polinucleotídeo,

quer ocorrendo	naturalmente <	ou recombinante, que	está
presente fora da célula em	que	se encontra tipicamente na
natureza, se	purificado	ou	não.	Opcionalmente,	um
polinucleotídeo	isolado	é	sujeito	a um ou	mais
procedimentos	de enriquecimento ou	purificação,	por

exemplo, lise de célula, extração, centrifugação, precipitação, ou similares.

Gene ou seqüência de gene refere-se à sequência de codificação parcial ou completa de um gene, seu complemento, e suas regiões não traduzidas 5' ou 3' . Um gene é igualmente uma unidade funcional de herança, e em termos físicos é um segmento particular ou uma sequência de nucleotídeos ao longo de uma molécula de DNA (ou RNA, no caso do vírus de RNA) envolvida em produzir uma cadeia de polipeptídeo. O último pode ser sujeitado ao processamento subsequente tal como a modificação química ou ao dobramento para obter uma proteína ou um polipeptídeo funcional. Um gene pode ser isolado, parcialmente isolado, ou encontrado com um organismo de genoma. A título de exemplo, um gene do fator da transcrição codifica um polipeptídeo de fator de

transcrição,	que possa ser	funcional	ou exigir o
processamento	para funcionar	como um	iniciador da
transcrição.
Operacionalmente, os genes	podem ser	definidos pelo

teste cis-trans, um teste genético que determina se duas mutações ocorrem no mesmo gene e podem ser usadas para determinar os limites da unidade geneticamente ativa (Rieger et al. (1976)). Um gene inclui geralmente as regiões que precedem (líderes; a montante) e seguintes (trailers; a jusante) a região de codificação. Um gene pode também incluir a intervenção, sequências de nãocodificação, referidas como íntrons, localizados entre os segmentos de codificação individuais, referidos como exons. A maioria dos genes têm uma região associada do promotor, uma seqüência reguladora 5' do códon de iniciação da transcrição (existem alguns genes que não têm um promotor identificável) . A função de um gene pode também ser regulada por realçadores, por operadores, e por outros elementos reguladores.

Um polipeptídeo é uma sequência de aminoácido compreendendo uma pluralidade de resíduos de aminoácido polimerizados consecutivos por exemplo, pelo menos cerca de resíduos de aminoácido polimerizados consecutivos. Em muitos casos, um polipeptídeo compreende uma sequência de resíduo de aminoácido polimerizada que é um fator da transcrição ou um domínio ou uma porção ou um fragmento do mesmo. Adicionalmente, o polipeptídeo pode compreender: (i) um domínio de localização; (ii) um domínio de ativação;

(iii) um domínio de repressão; (iv) um domínio de oligomerização; (v) um domínio da interação de proteínaproteína; (vi) um domínio de ligação de DNA; ou similares.

O polipeptídeo compreende opcionalmente resíduos de aminoácido modificados, resíduos de aminoácido de ocorrência natural não codificados por um códon, resíduos de aminoácido de ocorrência não natural.

Proteína refere-se a uma sequência de aminoácido, oligopeptídeo, peptídeo, polipeptídeo ou porções dos mesmos quer ocorrendo naturalmente ou sintético.

Porção, como usado aqui, refere-se a qualquer parte de uma proteína usada para qualquer finalidade, mas especialmente para a seleção de uma biblioteca de moléculas que ligam-se especificamente a essa porção ou para a produção de anticorpos.

Um polipeptídeo recombinante é um polipeptídeo produzido pela tradução de um polinucleotideo recombinante.

Um polipeptídeo sintético é um polipeptídeo criado pela polimerização consecutiva de resíduos de aminoácido isolados usando métodos bem conhecidos na técnica. Um polipeptídeo isolado, quer ocorrendo naturalmente ou um polipeptídeo recombinante, está mais enriquecido (ou fora de) em uma célula do que o polipeptídeo em seu estado natural em uma célula tipo selvagem, por exemplo, mais do que aproximadamente 5% enriquecido, mais do que aproximadamente 10% enriquecido, ou mais do que aproximadamente 20%, ou mais do que aproximadamente 50%, ou mais, enriquecido, isto é, denotado alternativamente: 105%,

110%, 120%, 150% ou mais, enriquecido relativo ao tipo selvagem padronizado em 100%. Tal enriquecimento não é o resultado de uma resposta natural de uma planta tipo selvagem. Alternativamente, ou adicionalmente, o polipeptídeo isolado é separado de outros componentes celulares com que é tipicamente associado, por exemplo, por qualquer um dos vários métodos de purificação da proteína aqui contidos.

Homologia refere-se à similaridade da sequência entre uma sequência de referência e pelo menos um fragmento de uma inserção do clone recentemente arranjada em sequência ou sua sequência de aminoácido codificada.

Identidade ou similaridade refere-se a uma similaridade da sequência entre duas sequências de polinucleotídeo ou entre duas sequências de polipeptídeo, com a identidade que é uma comparação mais rígida. As frases identidade por cento e de identidade referemse à porcentagem da similaridade da sequência encontrada em de sequências ou mais uma comparação de duas polinucleotídeo ou duas ou mais sequências de polipeptídeo.

Similaridade da sequência refere-se à porcentagem de similaridade na sequência de pares de base (como determinada por qualquer método apropriado) entre duas ou mais sequências de polinucleotídeo. Duas ou mais sequências podem ser em qualquer lugar de 0-100% similar, ou qualquer valor de número inteiro entre eles. A identidade ou a similaridade pode ser determinada comparando uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para finalidades da comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base do nucleotídeo ou aminoácido, então as moléculas são idênticas nessa posição. Um grau de similaridade ou de identidade entre sequências de polinucleotídeo é uma função do número de nucleotídeos idênticos, combinados ou correspondentes nas posições compartilhadas pelas sequências de polinucleotídeo. Um grau de identidade da sequências de polipeptídeo é uma função do número de aminoácidos idênticos nas posições correspondentes compartilhadas pelas sequências de polipeptideo. Um grau de homologia ou de similaridade de sequências de polipeptideo é uma função do número de aminoácidos nas posições correspondentes compartilhadas pelas sequências de polipeptideo.

Alinhamento refere-se a um número de bases de nucleotideo ou de sequências do residuo de aminoácido alinhadas pela comparação longitudinal de modo que os componentes em comum (isto é, bases de nucleotideo ou resíduos de aminoácido em posições correspondentes) possam ser visualmente e prontamente identificados. A fração ou a porcentagem dos componentes em comum é relacionada à homologia ou identidade entre as sequências. Os alinhamentos tais como aqueles das figuras 4A-4F podem ser usados para identificar domínios conservados e não relatados dentro destes domínios. Um alinhamento pode ser apropriadamente determinado por meio dos programas de computador conhecidos na técnica, tal como o software

MACVECTOR (1999) (Accelrys, Inc., San Diego, CA).

Um domínio conservado ou região conservada como usado aqui refere-se a uma região nas seqüências heterólogas de polinucleotídeo ou polipeptideo onde existe relativamente um alto nível da identidade da sequência entre as sequências distintas. Um dedo de zinco de caixa

B, tal como é encontrado em um membro de polipeptídeo da família do dedo do zinco de caixa B, é um exemplo de um domínio conservado. No que diz respeito aos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos presentemente descritos, um domínio conservado é preferivelmente pelo menos nove pares de base (bp) em comprimento. Um domínio conservado no que diz respeito aos polipeptídeos presentemente descritos refere-se a um domínio dentro de uma família de polipeptídeo que exibe um grau mais elevado de homologia da sequência, tal como pelo menos da identidade da sequência de aproximadamente 56%, ou pelo menos da identidade da sequência de aproximadamente 58%, ou pelo menos da identidade da seqüência de aproximadamente

60%,	ou	pelo	menos	cerca	de	65%,	ou	pelo	menos	cerca	de
67%,	ou	pelo	menos	cerca	de	70%,	ou	pelo	menos	cerca	de
75%,	ou	pelo	menos	cerca	de	76%,	ou	pelo	menos	cerca	de
77%,	ou	pelo	menos	cerca	de	78%,	ou	pelo	menos	cerca	de
79%,	ou	pelo	menos	cerca	de	80%,	ou	pelo	menos	cerca	de
81%,	ou	pelo	menos	cerca	de	82%,	ou	pelo	menos	cerca	de
83%,	ou	pelo	menos	cerca	de	84%,	ou	pelo	menos	cerca	de
85%,	ou	pelo	menos	cerca	de	86%,	ou	pelo	menos	cerca	de
87%,	ou	pelo	menos	cerca	de	88%,	ou	pelo	menos	cerca	de
89%,	ou	pelo	menos	cerca	de	90%,	ou	pelo	menos	cerca	de
91%,	ou	pelo	menos	cerca	de	92%,	ou	pelo	menos	cerca	de

93

O. ° z

ou

pelo

menos

cerca

de

94%,

ou

pelo

menos

cerca

de

95

o. ° z

ou

pelo

menos

cerca

de

96%,

ou

pelo

menos

cerca

de

97

Q. O z

ou

pelo

menos

cerca

de

98%,

ou

pelo

menos

cerca

de

99%, identidade da seqüência do resíduo de aminoácido, a um domínio conservado de um polipeptídeo da invenção (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID Nos: 45-56). As sequências que possuem ou codificam para os domínios conservados que encontram estes critérios da porcentagem de identidade, e que tem comparável atividade biológica às sequências de polipeptídeo presentes, assim sendo membros dos polipeptídeos de ciado G1988, são abrangidas pela invenção.

Um fragmento ou um domínio pode ser referido como a parte externa de um domínio conservado, a parte externa de uma seqüência de consenso, ou a parte externa de um local de ligação de DNA de consenso que é conhecido por existir ou que exista para uma classe de polipeptídeo particular, de família, ou de subfamília. Neste caso, o fragmento ou o domínio não incluirá os aminoácidos exatos de uma sequência de consenso ou um local de ligação de DNA de consenso de uma classe de fator de transcrição, de família ou de subfamília, ou os aminoácidos exatos de uma sequência de consenso particular de fator de transcrição ou de um local de ligação de DNA de consenso. Além disso, um fragmento, região, ou domínio particular de um polipeptídeo, ou de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, pode ser a parte externa de um domínio conservado se todos os aminoácidos do fragmento, região, ou queda do domínio da parte externa de um domínio conservado definido para um polipeptídeo ou uma proteína. As sequências possuindo poucos graus de identidade, mas de atividade biológica comparável são consideradas ser equivalentes.

Enquanto um versado na técnica reconhece, os domínios conservados podem ser identificados como regiões ou domínios da identidade a uma sequência de consenso específica (veja, por exemplo, Riechmann et al. (2000a,

2000b)). Assim, usando métodos do alinhamento conhecidos na técnica, os domínios conservados dos polipeptídeos da planta, por exemplo, para as proteínas de dedo de zinco de caixa B (Putterill et al. (1995)), podem ser determinados.

Os domínios conservados para muitas das sequências de polipeptídeo da invenção são listados na tabela 1. Também, os polipeptídeos da tabela 1 conservaram os domínios indicados especificamente por locais de começo e parada da coordenada de aminoácido. Uma comparação das regiões destes polipeptídeos permite um versado na técnica (veja, por exemplo, Reeves e Nissen (1990, 1995)) para identificar domínios ou domínios conservados para qualquer dos polipeptídeos listados ou referidos nesta descrição.

Complementaridade refere-se à ligação natural do hidrogênio pelo pareamento de base entre purinas e pirimidinas. Por exemplo, a sequência A-C-G-T (5' -> 3') forma ligações de hidrogênio com seus complementos A-C-G-T (5' -> 3') ou A-C-G-U (5' -> 3'). Duas moléculas de filamento único podem ser consideradas parcialmente complementares, se apenas alguns dos nucleotídeos se ligarem, ou totalmente complementares se todos os nucleotídeos se ligarem. O grau de complementariedade entre filamentos de ácido nucléico afeta a eficiência e a força das reações de amplificação e hibridização.

Complementariedade total refere-se ao caso onde a ligação ocorre entre cada par de base e seu complemento em um par de sequências, e as duas sequências tem o mesmo número de nucleotídeos.

O termo altamente severo ou condição altamente severa refere-se a condições que permitam hibridização dos filamentos de DNA cujas sequências são altamente complementares, onde estas mesmas condições excluem a hibridização de DNAs significativamente combinados. As sequências de polinucleotídeo capazes de hibridização sob condições severas com os polinucleotídeos da presente invenção podem ser, por exemplo, variações das sequências de polinucleotídeo descritas, incluindo variações alélicas ou de junção, ou sequências que codificam ortólogos ou parálogos dos polipeptídeos presentemente descritos. Os métodos de hibridação de ácido nucléico são descritos em detalhe por Kashima et al. (1985), Sambrook et al. (1989), e por Haymes et al. (1985), que são referências incorporadas aqui por referência.

Geralmente, a severidade é determinada pela temperatura, pela concentração iônica, e pela concentração de agentes desnaturantes (por exemplo, formamida) usados em um procedimento da hibridação e de lavagem (para uma descrição mais detalhada da elaboração e determinação da severidade, veja a seção Identifying Polynucleotides or

Nucleic Acids by Hybridization, abaixo). O grau a que dois ácidos nucléicos hibridizam sob várias condições severas é correlacionado com a extensão de sua similaridade. Assim, sequências de ácido nucléico similares de uma variedade de fontes, tais como dentro de um genoma da planta (como no caso dos parálogos) ou de uma outra planta (como no caso dos ortólogos) que pode executar funções similares podem ser isoladas com base em sua habilidade de hibridizar com sequências de polinucleotídeo relacionadas conhecidas. As variações numerosas são possíveis nas condições e meios pelo qual a hibridação do ácido nucléico pode ser executada para isolar as sequências de polinucleotídeo relacionadas que possuem similaridades às sequências conhecidas na técnica e não são limitadas àquelas descritas explicitamente aqui. Tal aproximação pode ser usada para isolar as sequências de polinucíeotídeo que possuem vários graus de similaridade com sequências de polinucleotídeo descritas, tal como, por exemplo, os fatores de transcrição codificados que possuem 56% ou maior identidade com os domínios conservados das sequências descritas.

Os termos parálogo e ortólogo são definidos abaixo na seção intitulada Ortólogos e Parálogos . No sumário, os ortólogos e os parálogos são os genes em evolução relacionados que possuem sequências e funções similares.

Ortólogos são os genes estruturalmente relacionados nas diferentes espécies que são derivadas por um evento de especificação. Parálogos são genes estruturalmente relacionados dentro de uma única espécie que seja derivada por um evento de duplicação.

O termo equivalog descreve membros de um conjunto de proteínas homólogas que são conservadas com relação à função desde seu último antepassado comum. Proteínas relacionadas são agrupadas em famílias equivalog, e por outro lado em famílias de proteína com outros tipos de homologia hierarquicamente definidas. Está definição é fornecida no Instituto para Pesquisa Genômica (TIGR) website World Wide Web (www) , tigr.org sob o cabeçalho

Termos associados com TIGRFAMs.

Geralmente, o termo variante refere-se a moléculas com algumas diferenças, geradas sintética ou naturalmente, em suas sequências de base ou de aminoácido como comparado a um polinucleotídeo ou a um polipeptídeo (nativo) de referência, respectivamente. Estas diferenças incluem substituições, inserções, deleções ou qualquer combinação desejada de tais mudanças em um polinucleotídeo nativo da sequência de aminoácido.

No que diz respeito aos polinucleotídeo variantes, as diferenças entre polinucleotídeos presentemente descritos e polinucleotídeos variantes são limitados de modo que as sequências de nucleotídeo do anterior e do posterior sejam completamente próximas similares e, em muitas regiões, idênticas. Devido à degeneração do código genético, diferenças entre as sequências de nucleotídeo anteriores e posteriores podem ser silenciosas (isto é, os aminoácidos codificados pelo polinucleotídeo são os mesmos, e a sequência de polinucleotídeo variante codifica a mesma sequência de aminoácido que o polinucleotídeo presentemente descrito). As sequências de nucleotídeo variantes podem codificar sequências de aminoácido diferentes, neste caso tais diferenças de nucleotídeo conduzirão às substituições, adições, deleções, inserções, truncamentos ou fusões do aminoácido no que diz respeito às sequências de polinucleotídeo descritas similares. Estas variações podem conduzir aos polinucleotídeos variantes que codificam os polipeptídeos que compartilham pelo menos uma característica funcional. Ά degeneração do código genético também dita que muitos polinucleotídeos variantes diferentes podem codificar polipeptídeos idênticos e/ou substancialmente similares além daquelas sequências ilustradas na listagem de sequência.

Também dentro do escopo da invenção está uma variante de um ácido nucléico listada na listagem de sequência, que é, uma que possuem uma sequência que difere de uma sequência de polinucleotídeo na listagem de sequência, ou uma sequência complementar, que codifica um polipeptídeo funcional equivalente (isto é, um polipeptídeo possuindo algum grau de atividade biológica equivalente ou similar) mas difere em sequência, da sequência na listagem de sequência, devido à degeneração no código genético. São incluídos dentro desta definição os polimorfismos que podem ou não podem ser prontamente detectáveis usando uma sonda de oligonucleotideo particular do polinucleotídeo codificando polipeptídeo, e a hibridação imprópria ou inesperada para variantes alélicas, com um local diferente do local cromossomático normal para a sequência de polinucleotídeo codificando o polipeptídeo.

Variante alélica alélica de ou

Variante polinucleotídeo refere-se a qualquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo local cromossomático. Ά variação alélica levanta-se naturalmente com a mutação, e pode conduzir ao polimorfismo fenotípico dentro das populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas ou pode codificar os polipeptídeos que alteram a seqüência de aminoácido. Variante alélica e variante alélica de polipeptídeo podem igualmente ser usadas no gue diz respeito aos polipeptídeos, e neste caso os termos referem-se a um polipeptídeo codificado por uma variação alélica de um gene.

Variante de junção ou variante de junção de polinucleotídeo como usado agui refere-se a formas alternativas de RNA transcrito de um gene. A variação de junção ocorre naturalmente em conseguência dos locais alternativos sendo unidos dentro de uma única molécula transcrita de RNA ou entre moléculas transcritas de RNA separadamente, e pode resultar em diversas formas diferentes de mRNA transcritos do mesmo gene. Assim, as variantes de junção podem codificar os polipeptídeos que possuem as sequências de aminoácido diferentes, que podem ou não podem ter funções similares no organismo. Variante de junção ou variante de junção de polipeptídeo pode igualmente referir-se a um polipeptídeo codificado por uma variante de junção de um mRNA transcrito.

Como usado aqui, variantes de polinucleotídeo podem igualmente referir-se às sequências de polinucleotídeo que codificam parálogos e ortólogos das sequências presentemente descritas de polipeptídeo. Variantes de polipeptídeo pode referir-se às sequências de polipeptídeo que são parálogas e ortólogas das sequências presentemente descritas de polipeptídeo.

As diferenças entre polipeptídeos e variantes de polipeptídeo presentemente descritos são limitadas de modo que as sequências do anterior e do posterior sejam completamente próximas similares e, em muitas regiões, idênticas. As sequências presentemente descritas de polipeptídeos e polipeptídeos variantes similares podem diferir na sequência de aminoácido por uma ou mais substituições, adições, deleções, fusões e truncamentos, que podem estar presentes em qualquer combinação. Estas diferenças podem produzir mudanças silenciosas e resultar em polipeptídeos funcionalmente equivalentes. Assim, será apreciado prontamente por aquele versado na técnica, que qualquer uma variedade de sequências de polinucleotídeo é capaz de codificar os polipeptídeos e polipeptídeos homólogos da invenção. Uma sequência de polipeptídeo variante pode ter mudanças conservativas, onde um aminoácido substituído tem propriedades estruturais ou químicas similares. As substituições deliberadas do aminoácido podem assim ser feitas com base na similaridade na polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou na natureza anfipática dos resíduos, contanto que uma quantidade significativa da atividade funcional ou biológica do polipeptídeo é retida. Por exemplo, os aminoácidos carregados negativamente podem incluir ácido aspártico e ácido glutâmico, aminoácidos carregados positivamente podem incluir lisina e arginina, e os aminoácidos com os grupos principais polares não carregados possuindo valores similares de hidrofilicidade podem incluir leucina, isoleucina, e valina; glicina e alanina; asparagina e glutamina; serina e treonina; e fenilalanina e tirosina. Mais raramente, uma variante pode possuir mudanças não conservativas, por exemplo, recolocação de uma glicina com um triptofano. As variações menores similares podem também incluir deleções ou inserções de aminoácido, ou ambas. Os polipeptídeos relacionados podem compreender, por exemplo, adições e/ou deleções de um ou mais locais de glicosilação ligados por N ou O, ou uma adição e/ou deleção de um ou mais resíduos de cisteína. Orientação na determinação de qual e quantos resíduos de aminoácido podem ser substituídos, introduzidos ou deletados sem abolir a atividade funcional ou biológica que pode ser encontrada usando programas de computador conhecidos na técnica, por exemplo, software DNASTAR (veja

USPN 5.840.544).

Fragmento, no que diz respeito a um polinucleotídeo, refere-se a um clone ou qualquer parte de uma molécula de polinucleotídeo que retenha uma característica útil, funcional. Os fragmentos úteis incluem os oligonucleotídeos e polinucleotídeo que podem ser usados em tecnologias da hibridização ou de amplificação ou na regulação da réplica, da transcrição ou da tradução. Um fragmento de polinucleotídeo refere-se a qualquer subseqüência de um polinucleotídeo, tipicamente, de pelo menos cerca de 9 nucleotídeos consecutivos, preferivelmente pelo menos cerca de 30 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50 nucleotídeos, ou qualquer das sequências fornecidas aqui. Os fragmentos exemplares de polinucleotídeo são os primeiros sessenta nucleotídeos consecutivos dos polinucleotídeos listados na listagem de sequência. Os fragmentos exemplares também incluem os fragmentos que compreendem uma região que codifique um domínio conservado de um polipeptídeo. Os fragmentos exemplares também incluem os fragmentos que compreendem um domínio conservado de um polipeptídeo. Os fragmentos exemplares incluem os fragmentos que compreendem um domínio conservado de um polipeptídeo, por exemplo, resíduos do aminoácido 5-50 de

G1988 (SEQ ID NO: 2), resíduos do aminoácido 6-51 de G4004 (SEQ ID NO: 4) ou resíduos do aminoácido 6-51 de G4005 (SEQ

ID NO: 6).

Os fragmentos podem igualmente incluir subsequências de polipeptídeos e moléculas de proteína, ou uma subsequência de polipeptídeo. Os fragmentos podem possuir usos em que podem ter potencial antigênico. Em alguns casos, o fragmento ou o domínio é uma subsequência de polipeptídeo que executa pelo menos uma função biológica do polipeptídeo intacto substancialmente na mesma maneira, ou a uma extensão similar, como faz o polipeptídeo intacto.

Por exemplo, um fragmento de polipeptídeo pode compreender um motivo estrutural reconhecível ou um domínio funcional tal como um local de ligação de DNA ou um domínio que ligue a uma região promotora de DNA, um domínio de ativação, ou um domínio para interações da proteína-proteína, e pode iniciar a transcrição. Os fragmentos podem variar em tamanho de no mínimo 3 resíduos de aminoácido ao comprimento completo do polipeptídeo intacto, mas são preferivelmente pelo menos cerca de 30 resíduos de aminoácido em comprimento e mais preferivelmente pelo menos cerca de 60 resíduos de aminoácido em comprimento.

A invenção igualmente abrange a produção de sequências de DNA que codificam polipeptídeos e derivados, ou fragmentos dos mesmos, inteiramente pela química sintética. Após a produção, a sequência sintética pode ser introduzida em qualquer um dos muitos vetores de expressão e sistemas de célula disponíveis usando reagentes bem conhecidos na técnica. Além disso, a química sintética pode ser usada para introduzir mutações em uma sequência codificando polipeptídeos ou qualquer fragmento do mesmo.

Derivado refere-se à modificação química de uma molécula de ácido nucléico ou sequência de aminoácido. As modificações químicas podem incluir a recolocação do hidrogênio por um grupo alquila, acila, ou amino ou glicosilação, peguilação, ou qualquer processo similar que retienha ou acentue a atividade biológica ou o tempo da molécula ou da sequência.

O termo planta inclui plantas inteiras, órgãos/estruturas vegetativas de broto (por exemplo, as folhas, as hastes e os tubérculos), raízes, flores e estruturas/órgãos florais (por exemplo, brácteas, sepalas, pétalas, estames, carpelos, anteras e óvulos), semente (incluindo embrião, endosperma, e revestimento de semente) e fruta (o ovário maduro) , tecido de planta (por exemplo, tecido vascular, tecido superficial, e similares) e células (por exemplo, células protetoras, células de ovo, e similares), e prole dos mesmos. A classe de plantas que pode ser usada no método da invenção é geralmente tão ampla quanto à classe de plantas mais elevadas e mais baixas favoráveis às técnicas da transformação, incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledônias) , gimnospermas, samambaias, cavalinhas, psilofitas, licofitas, briofitas, e algas multicelulares (veja, por exemplo, Figura 1, adaptada de Daly et al. (2001), Figura

2, adaptada de Ku et al. (2000); e veja também Tudge (2000) .

Uma planta controle como usada na presente invenção refere-se a uma célula de planta, semente, componente da planta, tecido de planta, órgão de planta ou planta inteira usada para comparar contra a planta modificada geneticamente ou transgênica para a finalidade de identificar um fenótipo acentuado na planta modificada geneticamente ou transgênica. Uma planta controle pode em alguns casos ser uma linhagem da planta transgênica que compreende um vetor vazio ou gene marcador, mas não contém o polinucíeotídeo recombinante da presente invenção que é expressada na planta transgênica ou geneticamente modificada que está sendo avaliada. Geralmente, uma planta controle é uma planta da mesma linhagem ou variedade que a planta transgênica ou geneticamente modificada que está sendo testada. Uma planta controle apropriada incluiría uma planta geneticamente inalterada ou não transgênica da linhagem parental usada para gerar uma planta transgênica aqui.

Uma planta transgênica refere-se a uma planta que contenha o material genético não encontrado em uma planta tipo selvagem da mesma espécie, variedade ou cultivar. O material genético pode incluir um transgene, um evento de inserção de mutagênese (como a inserção de mutagênese de TDNA ou por transposon) , uma ativação etiquetando a sequência, uma sequência transformada, um evento de recombinação homólogo ou uma sequência modificada por quimeroplastia. Tipicamente, o material genético estrangeiro foi introduzido na planta pela manipulação humana, mas qualquer método pode ser usado como um versado na técnica reconhece.

Uma planta transgênica pode conter um vetor de expressão ou cassete. 0 cassete de expressão tipicamente compreende uma sequência codificando polipeptídeo operavelmente ligado (isto é, sob controle regulatório de) a sequências regulatórias constitutivas ou induzíveis apropriadas que permitem a expressão controlada de polipeptídeo. 0 cassete de expressão pode ser introduzido em uma planta por transformação ou por reprodução após transformação de uma planta origem. Uma planta refere-se a uma planta total bem como a uma parte de uma planta, tal como semente, fruto, folha, ou raiz, tecido de planta, células de planta ou qualquer outro material de planta, por exemplo, um explantar da planta, bem como a prole dos mesmos, e a sistemas in vitro que mimetizam componentes bioquímicos ou celulares ou processos em uma célula.

Tipo selvagem ou tipo-selvagem , como usado aqui, refere-se a uma célula de planta, semente, componente da planta, tecido de planta, órgão de planta ou planta inteira que não seja modificada nem tratada em um sentido experimental. Células tipo-selvagem, semente, componentes, tecido, órgãos ou plantas inteiras podem ser usadas como controles para comparar níveis de expressão e a extensão e natureza da modificação da característica com as células, tecido ou plantas da mesma espécie em que uma expressão de polipeptídeo é alterada, por exemplo, em que a mesma foi nocauteada, superexpressada, ou expressada ectopicamente.

Uma característica refere-se a uma característica fisiológica, morfológica, bioquímica, ou física de uma planta ou material de planta particular ou célula. Em alguns casos, esta característica é visível ao olho humano, tal como o tamanho da semente ou da planta, ou pode ser medida por técnicas bioquímicas, tais como a detecção da proteína, do amido, ou do índice de óleo da semente ou das folhas, ou pela observação de um processo metabólico ou fisiológico, por exemplo, medindo a tolerância para a privação de água ou concentrações particulares de sal ou de açúcar, ou pela observação do nível da expressão de um gene ou genes, por exemplo, empregando análises Northern, RTPCR, ensaios da expressão de gene em microarran j o, ou sistemas de expressão de gene repórter, ou por observações agriculturais, tal como a tolerância ao estresse hiperosmót ico ou o rendimento. Toda a técnica pode ser usada para medir a quantidade de, o nível comparativo de, ou a diferença em qualquer composto químico selecionado ou macromolécula nas plantas transgênicas, entretanto.

Modificação de característica refere-se à diferença detectável em uma característica em uma planta que expressa ectopicamente um polinucleotídeo ou um polipeptídeo da presente invenção relativa a uma planta que não faz assim, como uma planta tipo-selvagem. Em alguns casos, a modificação de característica pode ser avaliada quantitativamente. Por exemplo, a modificação de característica pode envolver pelo menos cerca de um aumento ou uma diminuição de 2%, ou mesmo uma diferença maior, em uma característica observada em comparação a um controle ou a um tipo-selvagem. Sabe-se que pode haver uma variação natural na característica modificada. Consequentemente, a modificação da característica observada envolve uma mudança da distribuição normal e magnitude da característica nas plantas em comparação ao controle ou plantas tipo-selvagem.

Quando duas ou mais plantas têm imorfologias similares, substancialmente morfologias similares, uma morfologia que é substancialmente similar, ou são morfologicamente similares, as plantas possuem as formas comparáveis ou aparências, incluindo características análogas tais como dimensões totais, altura, largura, massa, massa da raiz, forma, lustro, cor, diâmetro da haste, tamanho da folha, dimensão da folha, densidade da folha, distância do entrenó, ramificação, ramificação da raiz, número e forma de inflorescência, e outras características macroscópicas, e as plantas individuais não são prontamente distinguíveis baseadas em características morfológicas sozinhas.

Modulados referem-se a uma mudança na atividade (biológico, química, ou imunológica) ou no tempo resultando da ligação específica entre uma molécula e uma molécula do ácido nucléico ou uma proteína.

O termo perfil transcrito refere-se a níveis de expressão de um conjunto de genes em uma célula em um estado particular, particularmente em comparação com os níveis de expressão daquele mesmo conjunto de genes em uma célula do mesmo tipo em um estado de referência. Por exemplo, o perfil transcrito de um polipeptídeo particular em uma suspensão de célula é o nível de expressão de um conjunto de genes em uma célula nocaute ou superexpressa que compara o polipeptídeo com os níveis de expressão do mesmo conjunto de genes em uma suspensão de célula que tenha níveis normais desse polipeptídeo. 0 perfil do transcrito pode ser apresentado como uma lista daqueles genes cujo nível de expressão seja significativamente diferente entre os dois tratamentos, e as relações de diferença. As diferenças e as similaridades entre níveis de expressão podem também ser avaliadas e calculadas usando métodos estatísticos e de grupo.

No que diz respeito aos nocautes dos genes como usados aqui, o termo nocaute refere-se a uma planta ou célula de planta possuindo um rompimento em pelo menos um gene na planta ou célula, onde os resultados do rompimento em uma expressão ou em uma atividade reduzida do polipeptídeo codificado por esse gene comparado a uma célula controle. O nocaute pode ser o resultado de, por exemplo, rompimentos genômicos, incluindo transposons, lavra, e recombinação homóloga, construção de anti-sentido, construção de sentido, construção de silêncio de RNA, ou interferência de

RNA. Uma inserção de T-DNA dentro de um gene é um exemplo de uma alteração genotípica que possa abolir a expressão desse gene.

Expressão ectópica ou expressão alterada em referência a um polinucleotídeo indica que o padrão da expressão em, por exemplo, uma planta transgênica ou um tecido de planta, é diferente do padrão de expressão em uma planta tipo-selvagem ou uma planta de referência da mesma espécie. O padrão de expressão pode igualmente ser comparado com um padrão de expressão de referência em uma planta tipo-selvagem da mesma espécie. Por exemplo, o polinucleotídeo ou o polipeptídeo é expressado em uma célula ou tipo de tecido diferente de uma célula ou tipo de tecido em que a sequência é expressada na planta tiposelvagem, ou pela expressão em um momento diferente no tempo, a sequência é expressada na planta tipo-selvagem, ou por uma resposta aos agentes induzíveis diferentes, tais como hormônios ou sinais ambientais, ou em níveis diferentes da expressão (mais elevado ou mais baixo) comparados com os aqueles encontrados em uma planta tipo47 selvagem. O termo também se refere aos padrões alterados da expressão que são produzidos abaixando os níveis de expressão abaixo do nível de detecção ou completamente abolindo a expressão. O padrão resultante de expressão pode ser transiente ou estável, constitutivo ou induzível. Em referência a um polipeptídeo, o termo expressão alterada ou expressão ectópica pode ainda relacionar-se aos níveis de atividade alterados resultando das interações dos polipeptídeos com os moduladores exógenos ou endógenos ou das interações com fatores ou como um resultado da modificação química dos polipeptídeos.

O termo superexpressão como usado aqui refere-se a um nível maior de expressão de um gene em uma planta, célula de planta ou tecido de planta, comparado à expressão em uma planta tipo-selvagem, célula ou tecido, em qualquer estágio desenvolvente ou temporal para o gene. A superexpressão pode ocorrer quando, por exemplo, os genes que codificam um ou mais polipeptídeos estão sob o controle de um promotor forte (por exemplo, a região da iniciação da transcrição do vírus 35S mosaico couve-flor). A superexpressão pode também sob o controle de um promotor específico do tecido ou induzível. Assim, a superexpressão pode ocorrer durante toda uma planta, em tecidos específicos da planta, ou na presença ou na ausência de sinais ambientais particulares, dependendo do promotor usado.

A superexpressão pode ocorrer nas células de planta que faltam normalmente à expressão de polipeptídeos equivalentes ou idênticos funcionalmente aos polipeptídeos atuais. A superexpressão pode também ocorrer nas células de planta onde a expressão endógena dos polipeptídeos atuais ou das moléculas funcionalmente equivalentes ocorrem normalmente, mas tal expressão normal está em um nível inferior. A superexpressão conduz assim a produção maior do que a normal, ou superprodução do polipeptídeo na planta, na célula ou no tecido.

O termo região de regulação da transcrição refere-se a uma seqüência reguladora de DNA que regula a expressão de um ou mais genes em uma planta quando um fator da transcrição que tem um ou mais domínios de ligação específicos ligam-se à sequência reguladora de DNA. Os fatores da transcrição possuem um domínio conservado. Os fatores da transcrição igualmente compreendem uma subsequência de aminoácido que forma um domínio da ativação de transcrição que regula a expressão de um ou mais genes abióticos da tolerância do esforço em uma planta quando o fator da transcrição liga-se à região de regulamento.

Rendimento ou rendimento da planta refere-se ao crescimento aumentado da planta, crescimento aumentado da colheita, biomassa aumentada, e/ou produção aumentada do produto da planta, e é dependente em certa extensão da temperatura, tamanho da planta, tamanho do órgão, densidade de plantação, luz, água e disponibilidade do nutriente, e como a planta lida com os vários estresses, tais como a aclimatização da temperatura e a água ou eficiência do uso do nutriente.

Densidade de plantação refere-se ao número de plantas que podem ser cultivada por acre. Para espécies de colheita, a densidade da plantação ou população varia de uma colheita para outra colheita, de uma região cultivável a outra, e de ano a ano. Usando o milho como um exemplo, a densidade de prevalência média em 2000 estava na escala de

20.000 - 25.000 plantas por o acre em Missouri, EUA. Uma maior densidade de população desejável (uma medida do rendimento) estaria a pelo menos 22.000 plantas por acre, e a uma maior densidade de população mais desejável seria de pelo menos 28.000 plantas por acre, mais preferivelmente pelo menos 34.000 plantas por acre, e mais preferivelmente

40.000 plantas por acre. As densidades de prevalência médias por acre de alguns outros exemplos de plantas de colheita nos EUA no ano de 2000 foram: trigo 1.000.0001.500.000; arroz 650.000-900.000; soja 150.000

200.000 canola 260.000-350.000, girassol 17.000-23.000 e algodão

28.000-55.000 plantas por acre (Pedido de Patente U.S. N°

20030101479 de Cheikh et al. (2003)). Uma maior densidade de população desejável para cada um destes exemplos, assim como outras espécies valiosas de plantas, seria pelo menos

10% mais elevada do que a densidade ou o rendimento de prevalência média.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ESPECÍFICAS

Os fatores de transcrição modificam a expressão de genes endógenos

Um fator de transcrição pode incluir, mas não está limitado a, qualquer polipeptídeo que possa ativar ou reprimir a transcrição de um único gene ou de um número de genes. Como um versado na técnica reconhece, os fatores da transcrição podem ser identificados pela presença de uma região ou um domínio de estrutural similaridade ou identidade a uma sequência de consenso específica ou a presença de um motivo de ligação de DNA de consenso específico (veja, por exemplo, Riechmann et al. (2000a)).

Os fatores da transcrição da planta da presente invenção pertencem à família do dedo de zinco de caixa B (Putterill et al. (1995)) e são os fatores putativos da transcrição.

Geralmente, os fatores de transcrição são envolvidos na diferenciação e proliferação celular e na regulação do crescimento. Conforme, o versado na técnica reconhecería que expressando as sequências atuais em uma planta, uma pode mudar a expressão de genes autólogos ou induzir a expressão de genes introduzidos. Afetando a expressão das sequências autólogas similares em uma planta que tem a atividade biológica das sequências atuais, ou introduzindo as sequências presentes em uma planta, uma pode alterar um fenótipo de planta com características melhoradas relacionadas aos estresses osmóticos. As sequências da invenção podem também ser usadas para transformar uma planta e para introduzir as características desejáveis não encontradas no cultivar ou cepa de tipo-selvagem. As plantas podem então ser selecionadas por aquelas que produzem o grau mais desejável de super- ou sobexpressão de genes alvo de interesse e da melhoria coincidente da característica.

As sequências da presente invenção podem ser de quaisquer espécies, particularmente espécies de planta, em uma forma de ocorrência natural ou de qualquer fonte quer natural, sintética, semi-sintética ou recombinante. As sequências da invenção podem também incluir fragmentos das sequências de aminoácido atuais. Onde sequência de aminoácido é relatada para referir a uma sequência de aminoácido de uma molécula de proteína de ocorrência natural, sequência de aminoácido e termos similares não são destinados a limitar a sequência de aminoácido à sequência de aminoácido nativa completa associada com a molécula de proteína relatada.

Além de métodos para modificar um fenótipo de planta empregando um ou mais polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção descrita aqui, os polinucleotídeos e os polipeptídeos da invenção possuem uma variedade de usos adicionais. Estes usos incluem seu uso na produção recombinante (isto é, expressão) de proteínas; como reguladores de expressão de gene da planta, como sonda diagnostica para a presença de ácidos nucléicos complementares ou parcialmente complementares (que incluem a detecção de ácidos nucléicos da codificação natural) ;

como substratos para outras reações, por exemplo, reações de mutação, reações de PCR, ou similares; como substratos para clonagem por exemplo, incluindo reações de digestão ou ligação; e para identificar moduladores exógenos ou endógenos dos fatores de transcrição. O polinucleotídeo pode ser, por exemplo, DNA ou RNA genômico, um transcrito (tal como, um mRNA) , um cDNA, um produto de PCR, um DNA clonado, um DNA ou um RNA sintético, ou similares.

polinucleotídeo pode compreender uma orientações de sentido ou anti-sentido.

sequencia em

A expressão dos genes gue codificam os polipeptídeos gue modificam a expressão de genes endógenos, polinucleotídeos, e proteínas é bem conhecida da técnica. Além disso, as plantas transgênicas gue compreendem os polinucleotídeos isolados gue codificam fatores da transcrição podem igualmente modificar a expressão de genes endógenos, de polinucleotídeos, e de proteínas. Os exemplos incluem Peng et al. (1997) e Peng et al. (1999). Além disso, muitos outros tem demonstrado gue um fator de transcrição de Arabidopsis expressado em uma espécie de planta exógena induz a mesma ou uma resposta fenotípica muito similar. Veja, por exemplo, Fu et al. (2001); Nandi et al. (2000); Coupland (1995); e Weigel e Nilsson (1995) ) .

Em um outro exemplo, Mandei et al. (1992b), e Suzuki et al. (2001), ensinam gue um fator de transcrição expressado em uma outra espécie da planta induz a mesma ou uma resposta fenotípica muito similar da seguência endógena, como previsto freguentemente nos estudos mais adiantados dos fatores de transcrição de Arabidopsis em

Arabidopsis (veja Mandei et al. (1992a); Suzuki et al.

(2001)). Outros exemplos incluem Müller et al. (2001); Kim et al. (2001); Kyozuka e Shimamoto (2002); Boss e Thomas (2002); He et al. (2000); e Robson et al. (2001).

Ainda em outro exemplo, Gilmour et al. (1998) ensina um fator de transcrição de Arabidopsis AP2, CBFl, que, quando superexpressado em plantas transgênicas, aumenta a tolerância da planta ao congelamento. Jaglo et al. (2001) identificou mais sequências em Brassica napus que codifica genes tipo CBF e esse transcrito para estes genes acumulados rapidamente em resposta à baixa temperatura. Os transcritos que codificam proteínas tipo CBF foram também encontrados para acumular rapidamente em resposta à baixa temperatura no trigo, assim como no tomate. Um alinhamento das proteínas de CBF de Arabidopsis , B. napus, do trigo, do centeio, e do tomate revelou a presença dos resíduos de aminoácido consecutivos conservados, PKK/RPAGRxKFxETRHP (SEQ ID NO: 69) e DSAWR (SEQ ID NO: 70), que suportam os domínios de ligação de DNA de AP2/EREBP das proteínas e as distinguem dos membros da família da proteína de AP2/EREBP.

(Jaglo et al. (2001))

Os fatores da transcrição negociam respostas celulares e características de controle através da expressão alterada dos genes que contêm as sequências de nucleotideo de atuação cis que são alvos do fator de transcrição introduzido. É bastante apreciado na técnica que o efeito de um fator da transcrição em respostas celulares ou em uma característica celular está determinado pelos genes particulares cuja expressão é diretamente ou indiretamente (por exemplo, por uma cascata de eventos de ligação de fator de transcrição e mudanças transcripcionais) alterada por ligação do fator da transcrição. Em uma análise global da transcrição comparando uma condição padrão com uma em que um fator de transcrição é superexpressado, o perfil do transcrito resultante associado com a superexpressão do fator da transcrição é relacionado a característica ou ao processo celular controlado por esse fator de transcrição.

Por exemplo, o gene PAP2 e outros genes na família de MYB tem sido demonstrado controlar à biossíntese de antocianina através da regulação da expressão dos genes conhecidos para ser envolvidos no caminho biossintético de antocianina (Bruce et al. (2000); e Borevitz et al. (2000)). Além disso, os perfis de transcritos globais tem sido usados com sucesso como ferramentas diagnosticas para estados celulares específicos (por exemplo, cancerígeno versus não cancerígeno; Bhattacharjee et al. (2001); e Xu et al.

(2001)). Consequentemente, é evidente para um versado na técnica que a similaridade do perfil transcrito em cima da superexpressão de fatores diferentes da transcrição indicaria a similaridade da função do fator da transcrição.

Polipeptídeos e polinucleotídeos da invenção

A presente invenção inclui fatores putativos da transcrição (TFs), e os polinucleotídeos isolados ou recombinantes que codificam os polipeptídeos, ou os polipeptídeos variantes de nova sequência ou os polinucleotídeos que codificam variantes novas dos polipeptídeos derivados das sequências específicas fornecidas na listagem de sequência; os polinucleotídeos recombinantes da invenção podem ser incorporados em vetores da expressão a fim de produzir plantas transformadas.

Também são fornecidos os métodos para modificar o rendimento de uma planta modificando a massa, tamanho ou número de órgãos da planta ou semente de uma planta controlando um número de processos celulares, e para aumentar uma resistência de planta aos estresses abióticos.

Estes métodos são baseados na habilidade de alterar a expressão das moléculas reguladores críticas que podem ser conservadas entre as espécies diversas da planta. As moléculas reguladoras conservadas relacionadas podem originalmente ser descobertas em um sistema modelo tal como

Arabidopsis e moléculas homólogas, funcionais então descobertas em outras espécies da plantas. Os últimos podem então ser usados para conferir aumento do rendimento ou da tolerância ao estresse abiótica nas diversas espécies de plantas.

Os polinucleotídeo exemplares que codificam os polipeptídeos da invenção foram identificados na base de dados Arabidopsis thaliana GenBank usando programas e parâmetros de análise da seqüência publicamente disponíveis. As sequências inicialmente identificadas foram então ademais caracterizadas para identificar as sequências que compreendem as fileiras de sequência específicas correspondendo aos motivos da seqüência atuais nas famílias de polipeptídeos conhecidos. Além disso, mais polinucleotídeos exemplares que codificam os polipeptídeos da invenção foram identificados na base de dados de planta

GenBank usando programas de análise de sequência e parâmetros disponíveis publicamente.

identificadas inicialmente foram caracterizadas para identificar as compreendem as fileiras de sequência específicas correspondendo aos motivos da sequência atual nas famílias de polipeptídeos conhecidos.

Os polinucleotídeos adicionais da invenção foram identificados pela triagem da Arabidopsis thaliana e/ou outras bibliotecas de planta de cDNA com as sondas que correspondem aos polipeptídeos conhecidos sob condições de hibridização de baixa severidade. As sequências adicionais, incluindo sequências de codificação de comprimento total, foram recuperadas subsequentemente pelo procedimento de amplificação rápida da extremidade de cDNA (RACE) usando um

As sequências então ademais sequências que kit comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante. Se necessário, múltiplos ciclos de RACE são executados para isolar as extremidades 5' e 3'. O cDNA completo foi recuperado então por uma reação em cadeia de polimerase de rotina extremidade-a-extremidade (PCR) usando iniciadores específicos para as extremidades isoladas 5' e 3'. As sequências exemplares são fornecidas na listagem de sequência.

Muitas das sequências na listagem de sequência, derivadas de diversas spécies de plantas, foram expressadas ectopicamente em plantas de superexpressão. As mudanças nas características ou nos traços característicos das plantas foram então observadas e encontradas para conferir rendimento aumentado e/ou tolerância ao estresse abiótico aumentada. Consequentemente, os polinucleotídeos e os

polipeptídeos podem	ser	usados para	melhorar
características desejáveis	das	plantas.
Os polinucleotídeos	da	invenção foram	expressados
igualmente ectopicamente	em	células da	planta de

superexpressão e as mudanças nos níveis da expressão de um número de genes, polinucleotídeos, e/ou de proteínas das células da planta observados. Consequentemente, os polinucleotídeos e os polipeptídeos podem ser usados para mudar níveis da expressão de genes, de polinucleotídeo, e/ou de proteínas das plantas ou das células da planta.

Os dados apresentados aqui representam os resultados obtidos nas experiências com os polinucleotídeos e os polipeptídeos que podem ser expressados nas plantas a fim de reduzir as perdas do rendimento que se levantam do estresse biótico e abiótico.

Informação antecedente para G1988, ciado G1988, e seqüências relacionadas.

G1988 pertence à família tipo CONSTANS de proteínas do dedo do zinco, que foi definida baseada em um domínio de dedo Zn conhecido como caixa B. A caixa B tem homologia a um domínio de interação de proteína-proteína encontrado em fatores de transcrição animal (Robson et al., 2001; Borden,

1998; Torok e Etkin, 2001) e o domínio B de G1988 e suas próximas funções de membros do ciado homólogos na mesma capacidade da interação da proteína-proteína. As proteínas tipo CONSTANS contêm um ou dois motivos da caixa B de término-N (ciado G1988 contém um único domínio de caixa B de término-N) . G1988 e seus homólogos de outra espécie conservaram os motivos de término-C que define um ciado desobstruído que seja distinto de outras proteínas de caixa

B, e contêm geralmente os resíduos de assinatura identificados pelos triângulos nas figuras 4D e 4E, e pela identificação SEQ ID NOs: 62, 57, e 58. G1988 é expressado em muitos tecidos. G1988 e seus homólogos são regulados diurnamente.

Como descrito abaixo nos exemplos, a expressão constitutiva de G1988 em Arabidopsis modula os diversos processos de crescimento da planta, incluindo o alongamento de hipocótilos, pecíolos estendidos e folhas sustentadas, florescendo cedo; crescimento acentuado da raiz e/ou do broto em meios fosfato-limitados; umas raízes mais secundárias em meios de controle, acentuam o crescimento e reduzem a antocianina em baixo nitrogênio/ meios de sacarose altamente suplementados com glutamina, acentuaram o crescimento da raiz em meios contendo sal, e acentuaram o crescimento da raiz em meios contendo polietilenoglicol, em comparação às plantas de controle. A superexpressão de

G1988 em plantas de soja tem mostrado resultar em um aumento estatístico significativo no rendimento em experimentações de campo (veja figura 6 e os exemplos apresentados abaixo) em comparação aos controles de linhagem parental.

O ciado de G1988 inclui um número de sequências descendentes de uma sequência ancestral comum, como mostrado na árvore filogenética vista na figura 3. A sequência ancestral é representada pelo nó da árvore indicada pela seta na figura 3 que tem um valor de bootstrap de 74. Os exemplos de membros do ciado incluem aquelas sequências dentro da caixa e limitados por G4011 e G4009 na figura 3. Membros do polipeptídeo do ciado G1988 examinados até agora, incluindo G1988 e sequências filogeneticamente relacionadas das diversas espécies, compreendem diversas características estruturais, incluindo um domínio B altamente conservado, indicado nas figuras 4A e 4B, e os diversos resíduos característicos ou de assinatura exteriores e mais próximo ao C-término do que ao

B-domínio. Os resíduos da assinatura são indicados pelos triângulos escuros pequenos nas figuras 4D e 4E. Estes resíduos compreendem, em ordem dos N e C terminais:

W-X₄-G (SEQ ID NO: 62, onde X representa qualquer aminoácido; ver na Figura 4D)

R-X₃-A-X₃-W (SEQ ID NO: 57, onde X representa qualquer aminoácido; ver na Figura 4D) seguida por:

EGWXE (SEQ ID NO: 58; onde X representa qualquer aminoácido; ver na Figura 4E).

Assim, uma sequência do ciado G1988 pode ser definida como tendo um domínio B altamente conservado de pelo menos

56% idêntico em sua sequência de aminoácido a SEQ ID NO:

45. Membros do ciado G1988 examinados até aqui podem ainda ser definidos por possuir resíduos de aminoácido caracterizados por um resíduo de triptofano e por um resíduo de glicina nas posições que correspondem aos primeiros e quintos resíduos mostrados na figura 4D mais próxima ao C-terminal do que ao B-domínio, e/ou tendo SEQ ID NO: 57 mais próximo ao C-terminal do que o dito resíduo de triptofano, e/ou tendo SEQ ID NO: 58 mais próximo ao Cterminal do que o SEQ ID NO: 57.

É provável que a expressão ectópica do produto G1988 possa afetar a sinalização clara, ou as vias hormonais a jusante. Baseado nas observações descritas acima, G1988 parece ser envolvido em fotomorfogênese e crescimento e desenvolvimento da planta. Consequentemente, sua superexpressão pode melhorar o vigor da planta, assim explicando a acentuação no rendimento vistos em plantas de soja 35S::G1988 como notável abaixo.

Um número de sequências tem sido encontradas em outras espécies de plantas que são estreitamente relacionadas a G1988. A tabela 1 mostra o número de polipeptídeos da invenção e inclui a SEQ ID NO: (Coluna 1), a espécie de que a sequência foi derivada e o identificador do gene (GID;

Coluna 2), a porcentagem de identidade do polipeptídeo na coluna 1 para o polipeptídeo G1988 de comprimento total,

SEQ ID NO: 1, como determinado por uma análise de blasto com um tamanho de palavra (W) de 3, de uma expectativa (E) de 10, e o BLOSUM62 da matriz de contabilização Henikoff &

Henikoff (1989, 1991) (coluna 3), as coordenadas do resíduo de aminoácido para os domínios ZF de caixa B conservados, em aminoácidos coordenados começando no n-terminal, de cada uma das sequências (coluna 4), as sequências de domínio ZF 5 de caixa B conservadas dos polipeptídeos respectivos (coluna 5) ; a SEQ ID NO: de cada um dos domínios ZF de caixa B (coluna 6) , e a porcentagem de identidade do domínio conservado na coluna 5 ao domínio conservado da sequência de Arabidopsis G 1988, SEQ ID NO: 45 (coluna 7) .

Tabela 1. Domínios conservados de G1988 e seqüências estreitamente relacionadas

Coluna 1	Coluna 2	Coluna 3	Coluna 4	Coluna 5	Coluna 6	Coluna 7
Polipept	Espécies	Porcenta	Domínio	Domínio	SEQ ID	Porcentag
ideo SEQ	GID No.	gem da	Z de	ZF de	NO: de	em da
ID NO:		identida	caixa B	caixa B	domínio	identidad
		de do	em		ZF de	e do
		polipept	coordena		caixa B	domínio
		ideo na	das de			ZF de
		coluna 1	amino			caixa B
		para o	ácidos			na coluna
		G1988				5 para o
						domínio
						conservad
						o de
						G1988
2	At/G1988	100%	5-50	CELCGAEA	45	100%

				DLHCAADS AFLCRSCD AKFHASNF LFARHFRR VICPNC
18	Zm/G4297	30%	14-55	CELCGGAA AVHCAADS AFLCPRCD AKVHGANF LASRHVRR RL	53	70%
24	Zm/G4001	30%	20-61	CELCGGAA AVHCAADS AFLCLRCD AKVHGANF LASRHVRR RL	56	70%
16	Os/G4012	32%	15-56	CELCGGVA AVHCAADS AFLCLVCD DKVHGANF LASRHRRR RL	52	67%
20	Os/G4298	67%	15-55	CELCGGVA AVHCAADS AFLCLVCD DKVHGANF LASRHPRR	54	67%

				R
14	Os/G4011	33%	8-49	CALCGAAA AVHCEADA AFLCAACD AKVHGANF LASRHHRR RV	51	65%
8	Zm/G4000	30%	20-61	CELCGGAA AVHCAADS AFLCLRCD AKVHGANF LASRHVRR RL	48	65%
67	Ta/Tal98 8	33%	13-54	CELCGGVA AVHCAADS AFLCVPCD AKVHGANF LASRHLRR RL	68	61%
4	Gm/G4004	33%	6-51	CELCHQLA SLYCPSDS AFLCFHCD AAVHAANF LVARHLRR LLCSKC	46	60%
6	Gm/G4005	32%	6-51	CELCDQQA SLYCPSDS AFLCSDCD	47	60%

				AAVHAANF LVARHLRR LLCSKC
10	Ct/G4007	45%	5-50	CELCSQEA ALHCASDE AFLCFDCD DRVHKANF LVARHVRQ TLCSQC	49	58%
22	S1/G4299	36%	9-54	CELCNDQA ALFCPSDS AFLCFHCD AKVHQANF LVARHLRL TLCSHC	55	58%
12	Pt/G4009	40%	6-51	CELCKGEA GVYCDSDA AYLCFDCD SNVHNANF LVARHIRR VICSGC	50	56%

Abreviaturas das espécies para a tabela 1: - AtArabidopsis thaliana; Ct - Citrus sinensis; Gm - Glycine max; SI - Solanum lycopersicum; Os - Oryza sativa; Pt Populus trichocarpa; Ta - Triticum aestivum; Zm - Zea mays. 5 ¹ Fenótipo observado em plantas Arabidopsis e de soja

As tabelas 2 e 3 listam algumas das características morfológicas e fisiológicas que conferiram a Arabidopsis, plantas de soja ou de milho que superexpressam G1988 ou ortólogos das diversas espécies de plantas, incluindo

Arabidopsis, soja, milho, arroz, e tomate, nas experiências 5 conduzidas até agora. Todas as observações foram feitas no que diz respeito às plantas do controle que não superexpressaram um fator da transcrição do ciado G 1988.

Tabela 2. Homólogos G1988 e características morfologicamente relacionadas potencialmente valiosas

Coluna 1	Coluna 2	Coluna 3	Coluna 4	Coluna 5
Espécies GID	Resposta	Rendimento	Raizes	Desenvolvime
(SEQ ID No.)	reduzida à	aumentado*	secundárias	nto
	claridade;		aumentadas	retardado
	hipocótilos			e/ou tempo
	alongados,			de
	petiolos ou			florescência
	folhas
	elevadas
G1988 (2) At	+ 1	+ 3	+ 1	+ 1,3
G4004 (4) Gm	+ 1	n/d	n/d	+ 1
G 4 0 0 5 (6) Gm	+ 1	n/d	n/d	+ 1
G4000 (8) Zm	+ 1	n/d	n/d	+ 1
G4012 (16) Os	+ 1	n/d	n/d	+ 1
G4299 (22)	+ 1	n/d	n/d	+ 1

Sl

* o rendimento pode ser aumentada por melhoramentos morfológicos e/ou tolerância aumentada à vários estresses fisiológicos

Tabela 3. Homólogos G1988 e caracter!sticas fisiológicos potencialmente valiosas.

Coluna 1	Coluna 2	Coluna 3	Coluna 4	Coluna	5	Coluna 6
Espécies	Melhor	aumento da	Sensibílid	Aument o	da	Aumento da
GID (SEQ	germinação	tolerância	ade ao C/N	tolerância	tolerância
ID No.)	em		a privação	alterada	a baixa	de	ao
	condições	de água	OU	P		estresse
	de	frio		tolerância			hiperosmót
				a baixa			ico
				de N			(sacarose)
G1988 (2) At	+3	+ 1.3	+ 1	+ 1	+1
G4OO4 (4) Gm	+ 1,2,3	n/d	+ 1,2
G4005 (6) Gm			+ 1		_1
G4000 (8) Zm	n/d	n/d	n/d	n/d	n/d
G4012 (16) Os	n/d	n/d	n/d	n/d	n/d
G4299 (22) Sl	n/d	n/d	n/d	n/d	n/d

Abreviações das espécies para as Tabelas 2 e 3: At Arabidopsis thaliana; Gm- Glycine max; Os - Oryza sativa; SI - Solanum lycopersicum; ZM - Zea mays (+) indica resultado positivo do ensaio/mais tolerante ou o fenótipo observado, relativo aos controles (-) indica resultado negativo do ensaio/menos tolerante ou o fenótipo observado, relativo aos controles

Células vazias - resultado do ensaio similar aos controles ¹ fenótipo observado em plantas Arabidopsis ² fenótipo observado em plantas de milho ³ fenótipos observado em plantas de soja n/d - ensaio ainda não feito ou terminado

N - Sensibilidade C/N alterada ou tolerância a baixa de nitrogênio

P - fósforo

A tolerância a privação de água foi indicada em ensaios baseados em solo seco ou placa de dessecamento.

estresse hiperosmótica foi indicado por tolerância maior que 9.4% de sacarose do que os controles.

A tolerância aumentada ao frio foi indicada pela tolerância maior que 8° C durante a germinação ou crescimento do que os controles.

Ensaios de sensibilidade ao C/N alterada ou tolerância a baixa de nitrogênio foram conduzidos em meios básicos menos o nitrogênio mais 3% de sacarose ou em meios básicos menos o nitrogênio mais 3% de sacarose e 1 mM de glutamina; para o ensaio da limitação do nitrogênio, a fonte do nitrogênio do meio de 80% MS foi reduzida a 20 mg/L de

NH₄NO₃.

A tolerância a baixa de P aumentada foi indicada pelo melhor crescimento no meio MS com falta de uma fonte de fósforo.

Um fenótipo de sensibilidade à luz reduzida foi indicado por pecíolos mais longos, hipocólitos mais longos e/ou pelas folhas modificadas relativas às plantas de controle.

n/d - ensaio ainda não feito ou terminado

Ortólogos e Parálogos

Sequências homólogas como descritas acima podem compreender sequências ortólogas ou parálogas. Diversos métodos diferentes são conhecidos por aqueles versados na técnica para identificar e definir estas sequências funcionalmente homólogas. Os métodos gerais para identificar ortólogos e parálogos, incluindo métodos filogênicos, similaridade da sequência e métodos de hibridização, são descritos neste; um ortólogo ou parálogo, incluindo equivólogos, podem ser identificados por uns ou vários dos métodos descritos abaixo.

Como descrito por Eisen (1998) Genome Res.8:163 - 167, informações evolucionárias podem ser usadas para prever a função do gene. É comum para grupos de genes gue são homólogos em seguência terem várias, embora geralmente relacionadas, funções. Entretanto, em muitos casos, a identificação dos homólogos não é suficiente para fazer previsões específicas porgue nem todos os homólogos têm a mesma função. Assim, uma análise inicial da relação funcional baseada na similaridade da seguência somente pode não fornecer um meio para determinar onde a similaridade termina e a relação funcional começa. Felizmente, é conhecido do versado da técnica gue a função da proteína pode ser classificada usando análises filogenéticas das árvores do gene combinadas com a espécie correspondente. As predições funcionais podem ser significativamente melhoradas focalizando em como os genes se tornaram similares na seguência (isto é, por processos evolucionários) mais do que na própria similaridade da sequência (Eisen, supra). Na verdade, muitos exemplos específicos existem nos quais a função do gene foi mostrada para correlacionar bem com a filogenia do gene (Eisen, supra). Assim, a primeira etapa para fazer predições funcionais é a geração de uma árvore filogenética que represente a história evolucionária do gene de interesse e de seus homólogos. Tais árvores são distintas dos grupos e outros meios de caracterização da similaridade da sequência porque são inferidos por técnicas que ajudam na conversão dos padrões de similaridade em relações evolucionárias....

Depois que a árvore genealógica é inferida, funções determinadas biologicamente dos vários homólogos são colocadas na árvore. Finalmente, a estrutura da árvore e as posições filogenéticas relativas dos genes de funções diferentes são usadas para traçar a história de mudanças funcionais, que é usada então para prever funções [até agora] do genes não caracterizados (Eisen, supra).

Dentro de uma única espécie de planta, a duplicação do gene pode causar duas cópias de um gene particular, causando dois ou mais genes com sequência similar e frequentemente com função similar conhecida como paráloga.

Um parálogo é consequentemente um gene similar formado pela duplicação dentro das mesmas espécies. Os parálogos tipicamente se agrupam ou no mesmo ciado (um grupo de genes similares) quando uma filogenia de família de gene é analisada usando programas tais como CLUSTAL (Thompson et al.(1994); Higgins et al.(1996)). Os grupos de genes similares podem também ser identificados com análise de dupla forma BLAST (Feng e Doolittle (1987)). Por exemplo, um ciado de fatores de transcrição de domínio MADS muito similares de Arabidopsis todos partilhando uma função comum no tempo de florescência (Ratcliffe et al.(2001)), e um grupo de fatores de transcrição de domínio AP2 muito similares da Arabidopsis estão envolvidos na tolerância das plantas ao congelamento (Gilmour et al. (1998)) . Análise de grupos de genes similares com função similar que caem dentro de um ciado pode render subsequências que são particulares do ciado. Estas subsequências, conhecidas como sequências de consenso, não podem somente ser usadas para definir as sequências dentro de cada ciado, mas definem as funções destes genes; genes dentro de um ciado podem conter sequências parálogas, ou sequências ortólogas que compartilham da mesma função (veja igualmente, por exemplo,

Mount (2001)).

As sequências de fatores de transcrição dos genes são conservadas através das diversas linhagens de espécies eucarióticas (Goodrich et al.(1993); Lin et al.(1991);

Sadowski et al.(1988)). As plantas não são exceção a esta observação; diversas espécies da plantas possuem fatores de transcrição que possuem sequências e funções similares. A especiação, produção de novas espécies a partir de uma espécie parental, origina dois ou mais genes com sequências e funções similares. Estes genes, denominados ortólogos, frequentemente possuem uma função idêntica dentro de suas plantas hospedeiras e são frequentemente permutáveis entre as espécies sem função perdedora. Como as plantas possuem antepassados comuns, muitos genes em qualquer espécie de planta terão um gene ortólogo correspondente em outra espécie de planta. Uma vez que uma árvore filogênica para uma família de genes de uma espécie tiver sido construída usando um programa tal como CLUSTAL (Thompson et al. (1994);

Higgins et al.(1996)) as sequências ortólogas potenciais podem ser colocadas na árvore filogenética e sua relação com os genes da espécie de interesse pode ser determinada.

As sequências ortólogas podem também ser identificadas por uma estratégia recíproca BLAST. Uma vez que uma sequência ortóloga tiver sido identificada, a função do ortólogo pode ser deduzida da função identificada da sequência da referência.

Usando uma análise filogenética, uma pessoa qualificada reconhecería que a habilidade de deduzir funções similares conferida por polipeptídeos estreitamente relacionados é previsível. Esta previsibilidade foi confirmada pelos nossos vários estudos próprios em que nós encontramos que uma grande variedade de polipeptídeos tem as sequências ortólogas ou estreitamente homólogas relacionadas que funcionam como as primeiras, sequência estreitamente relacionada da referência. Por exemplo, fatores da transcrição distintos, incluindo:

(i) AP2 família Arabidopsis G47 (encontrado na patente

U.S. 7.135.616), uma sequência filogeneticamente relacionada da soja, e dois homólogos filogeneticamente relacionados do arroz todos podendo conferir maior tolerância à seca, ao estresse hiperosmótico, ou à florescência atrasada em comparação às plantas do controle;

(ii) CAAT família Arabidopsis G481 (encontrado na patente PCT W02004076638) , e numerosas sequências filogeneticamente relacionadas das eucotiledôneas e das monocotiledôneas podem conferir maior tolerância ao estresse relacionado à seca em comparação às plantas do controle;

(iii) Arabidopsis G682 Myb-relacionado (encontrado nas patentes U.S 7.223.904 e 7.193.129) e várias sequências filogeneticamente relacionadas das eucotiledôneas e das monocotiledôneas podem conferir maior tolerância ao calor, estresse relacionado à seca, frio, e sal em comparação às plantas do controle;

(iv) WRKY (SEQ ID NO: 71) família Arabidopsis G1274 (encontrada na patente US 7.196.245 dos E.U.) e numerosas sequências estreitamente relacionadas das eucotiledôneas e das monocotiledôneas foram mostradas para conferir tolerância aumentada à privação da água, e (v) AT-hook família de sequências de soja G3456 (encontrado na publicação da patente US 20040128712A1) e as numerosas sequências filogeneticamente relacionadas das eucotiledôneas e das monocotiledôneas, biomassa aumentada comparada às plantas do controle quando estas sequências estão superexpressadas nas plantas

As sequências dos polipeptídeos pertencem à ciados distintos dos polipeptídeos que incluem membros de diversas espécies. Em cada caso, a maioria ou todas as sequências dos membros do ciado derivados de ambas eucotiledôneas e monocotiledôneas tem demonstrado conferir rendimento ou tolerância aumentada a uns ou vários esforços abióticos quando as sequências foram superexpressas. Estes estudos demonstram cada um que os genes evolucionariamente conservados das diversas espécies são prováveis de funcionar similarmente (isto é, regulando sequências similares do alvo e controlando as mesmas características), e que os polinucleotídeos de uma espécie podem ser transformados na espécie estreitamente relacionada ou distantemente relacionada da planta para conferir ou melhorar as características.

Como demonstrado na tabela 1, os polipeptídeos que são relacionados filogeneticamente aos polipeptídeos da invenção podem ter conservado os domínios que compartilham de pelo menos 56%, 58%, 60%, 65%, 67%, ou 70%, 75%, 80%,

85%, 90%, ou 95%, da identidade da sequência de aminoácidos e tem funções similares em que os polipeptídeos da invenção podem, quando superexpressos, conferir pelo menos uma atividade reguladora selecionada do grupo que consiste no maior rendimento, um crescimento mais rápido, maior tamanho, enraizamento secundário aumentado, maior tolerância ao frio, maior tolerância à privação de água, condutibilidade estomatal reduzida, sensibilidade de C/N alterada ou tolerância a baixa de nitrogênio aumentada, tolerância a baixa de fósforo aumentada, tolerância ao estresse hiperosmótico aumentada, e/ou sensibilidade à luz reduzida em comparação a uma planta do controle.

No nível de nucleotídeo, as sequências da invenção compartilharão tipicamente pelo menos aproximadamente 30% ou 40% da identidade da sequência de nucleotídeo, preferivelmente pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70% ou cerca de 80% da identidade da seqüência, e mais preferivelmente cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de

95% ou cerca 97% ou mais da identidade da sequência a uma ou várias das sequências completas listadas, ou a uma sequência listada, mas excluída ou na parte externa das regiões que codificam uma sequência de consenso conhecida ou um local de ligação de DNA de consenso, ou partes externas das regiões que codificam um ou todo o domínio conservado. A degeneração do código genético permite variações maiores na sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo ao manter a sequência de aminoácidos da proteína codificada.

A percentagem de identidade pode ser determinada eletronicamente, por exemplo, usando o programa MEGALIGN (DNASTAR, Inc. Madison, Wis.). O programa MEGALIGN pode criar alinhamentos entre duas ou mais sequências de acordo com métodos diferentes, por exemplo, o método clustal (veja, por exemplo, Higgins e Sharp (1988). O algoritmo clustal agrupa sequências em conjuntos examinando as distâncias entre todos os pares. Os conjuntos são alinhados por pares e depois em grupos. Outros algoritmos ou programas podem ser usados, incluindo FASTA, BLAST, ou

ENTREZ, FASTA e BLAST, e os quais podem ser usados para calcular a similaridade de percentagem. Estes estão disponíveis porque uma parte do pacote de análise da sequência de GCG (universidade de Wisconsin, Madison, WI), o qual podem ser usados com ou sem as configurações padrão.

ENTREZ está disponível através do Centro Nacional de

Informação Biotecnológica. Em uma modalidade, a identidade de percentagem de duas sequências pode ser determinada pelo programa de GCG com um intervalo de peso de 1, por exemplo, cada intervalo de aminoácidos é pesada como se fosse um único aminoácido ou incompatibilildade do nucleotídeo entre as duas sequências (veja USPN 6.262.333).

O software para executar análises BLAST está publicamente disponível, por exemplo, através do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (veja o site da

Internet em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) . Este algoritmo envolve primeiramente identificar pares de contabilização das sequências de pares de alto escore (HSPs) identificando palavras curtas de comprimento W na sequência em questão, que combine ou satisfaça algum limiar positivamenteavaliado T quando alinhado com uma palavra de mesmo comprimento em uma sequência da base de dados. T é referido como o limiar de escore da palavra da vizinhança (Altschul (1990); Altschul et al.(1993)). Estas palavras de vizinhança inicialmente acertadas atuam como sementes para iniciar pesquisas para encontrar um HSPs mais longo contendo-as. As palavras acertadas são estendidas então em ambos os sentidos ao longo de cada sequência para até que a contagem cumulativa do alinhamento possa ser aumentada. As contagens cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (contagem da recompensa para um par de resíduos de harmonização; sempre > 0). Para sequências de aminoácidos, a matriz de contagem é usada para calcular o escore cumulativo. A extensão das palavras acertadas em cada sentido é parado quando: a contagem cumulativa de alinhamento cai pela quantidade X de seu valor máximo conseguido; a contagem cumulativa vai a zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou vários alinhamentos de resíduo de contagem negativa; ou o fim de uma ou outra sequência é alcançado. Os parâmetros do algoritmo W, T, e X do BLAST determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa um padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, de uma interrupção de 100, M=5, N=-4, e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de contagem BLOSUM62 (veja Henikoff & Henikoff (1989, 1991)). Salvo indicação contrária para comparações de polinucleotídeos previstos, a identidade da sequência; refere-se à % da identidade da sequência gerada de um tblastx usando a versão NCBI do algoritmo nos ajustes padrão usando alinhamentos abertos com o filtro desligado (veja, por exemplo, o site da Web em http://www.nchi.nlm.nih.gov/).

Outras técnicas para o alinhamento são descritas por

Doolittle (1996). Preferivelmente, um programa de alinhamento que permite aberturas na sequência é utilizado para alinhar as sequências. O Smith-Waterman é um tipo de algoritmo que permite alinhamentos das aberturas em ordem (veja Shpaer (1997). Também, o programa GAP usando o método de alinhamento Needleman e Wunsch pode ser utilizado para alinhar sequências. Uma estratégia de pesquisa alternativa usa o software MPSRCH, que funciona em um computador

MASPAR. O MPSRCH usa um algoritmo Smith-Waterman para contar as sequências em um computador maciçamente paralelo.

Esta abordagem melhora a habilidade de captar sequências correspondentes relativamente distantes, e é especialmente tolerante a pequenas aberturas e erros de sequência de nucleotídeo. As sequências de aminoácidos ácido-codifiçadas nucléicas podem ser usadas para procurar a proteína e as bases de dados do DNA.

A similaridade da porcentagem entre duas sequências de polipeptídeos, por exemplo, sequência A e sequência B, é calculada dividindo o comprimento da sequência A, menos o número de abertura de resíduos na sequência A, menos o número de abertura dos resíduos na sequência B, na soma de resíduos correspondentes entre a sequência A e a sequência

B. Aberturas de baixa ou nenhuma similaridade entre duas sequências de aminoácidos não são incluídas na determinação da porcentagem de similaridade. A percentagem de identidade entre sequências de polinucleotídeos pode igualmente ser contada ou calculada por outros métodos conhecidos na técnica, por exemplo, o método de Jotun Hein (veja, por exemplo, Hein (1990)) A identidade entre sequências pode igualmente ser determinada por outros métodos conhecidos na técnica, por exemplo, variando as condições da hibridação (veja o Pedido de Patente n° US 20010010913).

Assim, a invenção fornece métodos para identificação de uma sequência similar ou paráloga ou ortólogas ou homólogos para um ou vários polinucleotídeos como notável neste, ou um ou vários polipeptídeos alvo codificados pelos polinucleotídeos, ou notáveis de outra maneira neste e pode incluir o ligamento ou a associação de um fenótipo da planta ou de uma função dada do gene com uma sequência. Nos métodos, uma base de dados de sequências é fornecida (localmente ou através de uma internet ou intranet) e uma pergunta é feita de encontro à base de dados da sequência usando, as sequências relevantes neste e fenótipos da planta ou funções associadas ao gene.

Além disso, umas ou várias sequências de polinucleotídeos ou um ou vários polipeptídeos codificados pelas sequências de polinucleotídeos podem ser usados para procurar em bases de dados BLOCKS (Bairoch et al. (1997) ),

PFAM, e outras bases de dados que contêm motivos, sequências e funções de genes previamente identificados e anotados. Os métodos que procuram por padrões de sequências primárias com falhas da abertura da estrutura secundária (Smith et al. (1992)) assim como algoritmos tais como a ferramenta de pesquisa por alinhamento de sequências básicas (BLAST; Altschul (1990); Altschul et al.(1993)),

BLOCKS (Henikoff e Henikoff (1991)), Modelos escondidos de

Markov (HMM; Eddy (1996); Sonnhammer et al.(1997)), e semelhantes, podem ser usados para manipular e analisar as sequências do polinucleotídeos e de polipeptídeos codificadas por polinucleotídeos. Estas bases de dados, algoritmos e outros métodos são conhecidos na técnica e são descritos em Ausubel et al. (1997), e em Meyers (1995) .

Um método adicional para identificação ou confirmação de que sequências homólogas específicas controlam a mesma função é pela comparação dos perfis transcritos obtidos pela superexpressão ou queda de dois ou mais polipeptídeos relativos. Desde que os perfis de transcrição sejam diagnosticados para estados celulares específicos, uma pessoa qualificada apreciará que os genes que possuem um perfil de transcrição altamente similar (por exemplo, com mais de 50% de transcritos regulares em comum, ou com mais de 7 0% de transcritos regulares em comum, ou com mais de

90%de transcritos regulares em comum) terão funções altamente similares. Fowler e Thomashow (2002), mostraram que três genes parálogos da família AP2 (CBF1, CBF2 e CBF3) estão induzidos em um tratamento frio, e cada qual pode condicionar tolerância melhorada ao congelamento, e todos possuem perfis altamente similares de transcrição. Quando um polipeptídeo tiver sido mostrado para fornecer uma função específica, seu perfil de transcrição transforma-se em uma ferramenta diagnostica para determinar se os parálogos ou ortólogos têm a mesma função.

Além disso, métodos usando o alinhamento manual das sequências similares ou homólogas para uma ou várias sequências de polinucleotídeos ou a um ou vários polipeptídeos codificados pelas sequências do polinucleotídeo podem ser usados para identificar regiões de similaridade e domínios de caixa B de dedo de zinco.

Tais métodos manuais são conhecidos pelos versados na técnica e podem incluir, por exemplo, comparações de estruturas terciárias entre uma sequência de polipeptídeo codificada por um polinucleotídeo que compreenda uma função conhecida e uma sequência do polipeptídeo codificada por uma sequência do polinucleotídeo que tenha uma função ainda não determinada. Tais exemplos de estrutura terciária podem compreender hélices alfa previstas, folhas-beta, hélices anfipáticas, motivos do zipper da leucina, motivos do dedo do zinco, regiões ricas em prolina, motivos de repetição do cisteína, e semelhantes.

Ortólogos e parálogos de polipeptídeos presentemente divulgados, podem ser clonados usando as composições fornecidas pela presente invenção atual de acordo com métodos conhecidos na técnica. cDNAs podem ser clonados usando o mRNA de uma célula ou um tecido de planta que expresse uma das sequências atuais. As fontes apropriadas do mRNA podem ser identificadas interrogando o Northern blots com as sondas projetadas das sequências atuais, depois do qual uma biblioteca é preparada do mRNA obtido de uma célula ou tecido positivo. 0 cDNA de codificação polipeptídica é então isolado utilizando, por exemplo, o

PCR, usando primers projetados de uma sequência presentemente divulgada do gene, ou sondando um cDNA parcial ou completo ou um ou vários conjuntos de provas degeneradas baseadas nas sequências divulgadas. A biblioteca do cDNA pode ser usada para transformar células da planta. A expressão dos cDNAs de interesse é detectada utilizando, por exemplo, microarranjos, Northern blots, PCR quantitativo, ou qualquer outra técnica para o monitoramento das mudanças na expressão. Os clones genômicos podem ser isolados usando técnicas similares àquelas .

Exemplos de ortólogos das sequências do polipeptídeo Arabidopsis e de seus ortólogos funcionalmente similares são listados na tabela 1 e na Listagem de Sequências. Em adição a sequência na tabela 1 e a listagem de sequência a invenção abrange as sequências de nucleotídeos isoladas que são filogeneticamente e estruturalmente similares às sequências listadas na Listagem de Sequência e podem funcionar em uma planta aumentando o rendimento e/ou a tolerância ao esforço abiótico quando expressada ectopicamente em uma planta.

Quando um número significativo destas sequências for relacionado filogeneticamente e sequencialmente relacionado um ao outro, e tiver mostrado aumentar o rendimento de uma planta e/ou da tolerância ao esforço abiótico, uma pessoa qualificada preveria que outras sequências similares, filogeneticamente relacionadas caindo nos ciados atuais dos polipeptídeos igualmente executariam funções similares quando expressadas ectopicamente.

Identificando polinucleotídeo ou ácidos nucléicos por

Hibridação

Os polinucleotídeos homólogos às sequências ilustradas na Listagem de Sequências e às tabelas podem ser identificadas, por exemplo, pela hibridação entre eles sob circunstâncias severas ou altamente severas. Os únicos polinucleotideos de fita dupla que hibridizam quando são associados baseado em uma variedade de forças fisicoquímicas bem caracterizadas, tais como ligação de hidrogênio, exclusão do solvente, empilhamento de base e semelhante. A severidade de uma hibridização reflete o grau de identidade da sequência dos ácidos nucleicos envolvidos, tal que quanto maior a severidade, mais similares são as duas fitas do polinucleotídeo. A severidade é influenciada por uma variedade de fatores, incluindo temperatura, concentração e composição do sal, os aditivos orgânicos e não-orgânicos, solventes, etc. presentes tanto na hibridização na solução e na incubação de lavagem (e número disso), como descrito mais detalhadamente nas referências mencionadas abaixo (por exemplo, Sambrook et al. (1989);

Berger e Kimmel (1987); e Anderson e Young (1985)).

São abrangidas pela invenção as sequências de polinucleotideos que são capazes de hibridizarem com as sequências reivindicadas do polinucleotídeo, incluindo alguns dos polinucleotideos dentro da Listagem de

Sequências, e fragmentos disso sob várias circunstâncias de severidade (veja, por exemplo, Wahl e Berger (1987); e

Kimmel (1987Y). Além das sequências de nucleotídeos listadas na Listagem de Sequências, cDNA com comprimento completo, ortólogos e parálogos das sequências de nucleotídeos atuais podem ser identificados e isolados usando métodos conhecidos. As bibliotecas de cDNA, ortólogos e parálogos das presentes sequências de nucleotídeos podem ser selecionadas usando métodos de hibridização para determinar sua utilidade como alvos de hibridização ou provas de amplificação.

No que diz respeito à hibridização, as circunstâncias altamente severas, e os meios para consegui-la, são conhecidos do versado na técnica. Veja, por exemplo,

Sambrook et al.(1989); Berger (1987), páginas 467-469; e

Anderson e Young (1985).

A estabilidade dos dúplex de DNA é afetada por tais fatores como a composição, o comprimento, e o nível de pares incompatíveis. As condições de hibridização podem ser ajustadas para permitir DNAs de diferentes sequências afins a hibridizarem. A temperatura de derretimento (T_m) está definida como a temperatura quando 50% dos dúplex da molécula se separarem em suas únicas fitas constitutivas. A temperatura de derretimento de um dúplex perfeitamente combinado, onde o tampão da hibridização contenha a formamida como um agente de desnaturação, pode ser estimada pelas seguintes equações:

(I) DNA-DNA:

T_m(° C)=81.5+16.6(log [Na+])+0.41(% G+C)- 0.62(% formamida) - 500/L (II) DNA-RNA:

T_m(° 0=79.8 + 18.5 (log [Na+] ) +0.58 (% G+C)+ 0.12(%G+C)²0.5(% formamida) - 820/L (TtT) RNA-RNA:

T_m(° C)=79.8+18.5(log [Na+])+0.58(% G+C)+ 0.12(%G+C)²0.35(% formamida) - 820/L onde L é o comprimento do dúplex formado, [Na +] é a concentração molar dos íons de sódio na solução de hibridização ou lavagem, e % G + C é o percentual de (guanina + citosina) baseados no híbrido. Para híbridos pareados imperfeitamente, aproximadamente 1°C é necessário 15 para reduzir a temperatura de fusão para cada 1% desencontros.

As experiências de hibridização são geralmente conduzidas em tampão de pH entre 6.8 a 7.4, embora a taxa de hibridização seja quase independente do pH nas concentrações iônicas provavelmente a serem usadas no tampão de hibridização (Anderson e Young (1985)). Além disso, um ou vários dos seguintes podem ser usados para reduzir a hibridização não específica: DNA de esperma de salmão sonicado ou outro DNA não-complementar, albumina de soro bovino, pirofosfato de sódio, dodecilsulfato de sódio (SDS), polivinilpirrolidona, ficol e solução de Denhardt.

Sulfato de dextrano e polietileno glicol 6000 agem para excluir o DNA da solução, assim aumentando a concentração eficaz da sonda de DNA e o sinal de hibridização dentro de uma dada unidade de tempo. Em alguns casos, as condições até de maior severidade podem ser desejáveis ou exigidas para reduzir a hibridização não específica e/ou secundária.

Estas circunstâncias podem ser criadas com o uso de temperaturas mais altas, concentração iônica mais baixa e da concentração mais elevada de um agente de desnaturação tal como o formamida

As condições de severidade podem ser ajustadas para classificar fragmentos moderadamente semelhantes, tais como sequências homólogas de organismos distantemente relacionados, ou fragmentos altamente semelhantes, tais como genes que duplicam enzimas funcionais a partir de organismos estreitamente relacionados. A severidade pode ser ajustada tanto durante a etapa de hibridização ou nas lavagens pós-hibridização. Concentração de sal, concentração de formamida, temperatura de hibridização e comprimentos da sonda são variáveis que podem ser utilizados para alterar a severidade (conforme descrito pela fórmula acima). Como uma orientação geral a severidade elevada é tipicamente realizada a T_m-5°C até T_m-20°C, severidade moderada a T_m-20C° até T_m 35°C- e a baixa severidade a T_m-35°C a T_m-50°C para dúplex > 150 pares de base. Ά hibridização pode ser realizada sob severidade de baixa a moderada (25-50°C abaixo da T_m) , seguido de lavagens pós-hibridização para severidades aumentadas. Taxas máximas de hibridização em solução são determinadas empiricamente para ocorrer a T_m-25°C para dúplex DNA-DNA e T_m-15°C para dúplex RNA-DNA. Opcionalmente, o grau de dissociação pode ser avaliado depois de cada passo de lavagem para determinar a necessidade de etapas de lavagem subsequentes com maior severidade.

As condições de severidade elevada podem ser usadas para selecionar sequências de ácido nucleico com altos níveis de identidade com as sequências divulgadas. Um exemplo de condições severas de hibridização, obtidas por um método baseado em filtro tal como uma Southern ou

Northern blot para a hibridização dos ácidos nucléicos complementares que possuem mais de 100 resíduos complementares, é cerca de 5°C a 20°C mais baixo do que o ponto de derretimento térmico (T_m) para a sequência específica em uma concentração iônica e em um pH definidos.

As circunstâncias usadas para a hibridização podem incluir aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M de cloreto de sódio, aproximadamente 0,5% à 5% de caseína, aproximadamente 0,02% de SDS ou aproximadamente 0,1% de Nlaurilsarcosina, aproximadamente 0,001 M a 0,03 M de citrato de sódio, em temperaturas de hibridização entre cerca de 50°C a cerca de 70°C. Mais preferivelmente, condições elevadas de severidade são cerca de 0,02 M de cloreto de sódio, aproximadamente 0,5% de caseína, aproximadamente 0,02% de SDS, aproximadamente 0,001 M de citrato de sódio, a uma temperatura aproximadamente 50 °C. Moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições estritas hibridizarão tipicamente a uma sonda baseada na molécula inteira do DNA ou em parcelas selecionadas, por exemplo, a uma única subsequência de DNA.

Severas concentrações de sal serão normalmente inferiores a cerca de 750 mM de NaCI e 75 mM de citrato trissódico. Condições cada vez mais severas podem ser obtidas com menos de cerca de 500 mM de NaCI e 50 mM de citrato trissódico, para uma severidade ainda maior com menos de cerca de 250 mM de NaCI e 25 mM de citrato trissódico. Baixa severidade de hibridização pode ser obtida na ausência de solvente orgânico, por exemplo, formamida, enquanto elevada severidade de hibridização pode ser obtida na presença de, pelo menos, cerca de 35% de formamida, e mais preferivelmente, pelo menos, cerca de 50% de formamida. Condições severas de temperatura incluirão normalmente temperaturas de pelo menos cerca de 30°C, mais de preferência, pelo menos, cerca de 37°C, e mais preferivelmente de pelo menos cerca de 42°C com formamida presentes. Parâmetros variantes adicionais, tais como o tempo de hibridização, concentração de detergente, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS) e força iônica, são bem conhecidos dos qualificados no versado da técnica.

Diversos níveis de severidade são desempenhados através da combinação destas diversas condições como necessário.

As etapas de lavagem que seguem a hibridização podem igualmente variar na severidade; as etapas da lavagem da pós-hibridização determinam primeiramente a especificidade da hibridização, com os fatores mais críticos sendo temperatura e a concentração iônica da solução final de lavagem. A severidade da lavagem pode ser aumentada diminuindo a concentração de sal ou aumentando a temperatura. A concentração estrita de sal para as etapas da lavagem será preferivelmente menos do que cerca de 30 milímetros de NaCl e 3 milímetros de citrato trisodium, e mais preferivelmente menos do que cerca de 15 milímetros de

NaCl e 1.5 milímetros de citrato trisodium.

Assim, condições da hibridização e lavagem que podem ser usadas para ligar e remover os polinucleotídeos com menos do que a homologia desejada das sequências de ácido nucléico ou seus complementos que codificam os polipeptídeos atuais incluem, por exemplo:

6X SSC a 65° C;

50% de formamide, 4X SSC a 42° C; ou

0,5X SSC, 0,1% SDS a 65° C;

com, por exemplo, duas etapas de lavagem de 10 - 30 minutos cada uma. As variações úteis nestas circunstâncias serão prontamente aparentes àqueles versados na técnica.

Uma pessoa versada na técnica não esperaria uma variação substancial entre a espécie do polinucleotídeo abrangida dentro do escopo da presente invenção porque as circunstâncias altamente severas determinam nos produtos das fórmulas acima polinucleotídeos estruturalmente similares.

Se desejado, pode-se empregar as etapas da lavagem mesmo de maior severidade, incluindo cerca de 0,2x SSC,

0.1% SDS a 65° C e lavando duas vezes, cada etapa de lavagem que é de aproximadamente 30 minutos, ou aproximadamente 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 65° C e lavando duas vezes por 30 minutos. A temperatura para as soluções de lavagem será ordinariamente pelo menos cerca de 25°C, e para a maior severidade pelo menos a 42°C. A severidade de hibridização pode ser aumentada usando as mesmas circunstâncias que nas etapas de hibridização, com a

temperatura de	lavagem elevada a cerca	de 3	Ο z-, C para
aproximadamente	5° C, e a	severidade pode	ser	aumentada
mesmo que usando	as mesmas	circunstâncias a	não	ser que a
temperatura de	lavagem	seja elevada	de	6°C a
aproximadamente	9°C. Para	a identificação	de	homólogos

menos estreitamente relacionados, as etapas de lavagem podem ser executadas a uma temperatura mais baixa, por exemplo, 50° C

Um exemplo de uma etapa de lavagem de baixa severidade emprega uma solução e condições de pelo menos 25°C em 30 mM de NaCl, 3 mM citrato trissódico e 0,1% SDS ao longo de 30 minutos. Maior severidade pode ser obtida a 42°C em 15 mM de NaCl, com 1,5 mM citrato trissódico e 0,1% SDS ao longo de 30 minutos. Condições de lavagem ainda mais severas são obtidas a 65°C -68°C em uma solução de NaCl de 15 mM, 1,5 mM de citrato trissódico e 0,1% de SDS. Procedimentos de lavagem utilizarão geralmente pelo menos duas etapas finais de lavagem. Variações adicionais sobre essas condições serão facilmente perceptíveis para aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, o Pedido de patente US No.

20010010913) .

As condições de severidade podem ser selecionadas tais que, um oligonucleotídeo que seja perfeitamente complementar ao oligonucleotídeo codificado hibridizado com o oligonucleotídeo codificado com pelo menos um sinal maior que 5-10x à taxa de ruído do que a relação para a hibridização do oligonucleotídeo perfeitamente complementar a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo conhecido até à data de arquivamento do pedido. Pode ser desejável selecionar circunstâncias para um ensaio particular tais que um sinal mais elevado da taxa de ruído, isto é, cerca de 15x ou mais, é obtido. Conformemente, um ácido nucleico sujeito hibridizará com um oligonucleotídeo original da codificação com pelo menos um sinal 2x ou maior da taxa de ruído em comparação à hibridização do oligonucleotídeo codificado a um polipeptídeo conhecido da codificação do ácido nucleico. 0 sinal particular dependerá da etiqueta usada no ensaio relevante, por exemplo, uma etiqueta fluorescente, uma etiqueta colorimétrica, uma etiqueta radioativa, ou semelhante. A hibridização etiquetada ou as provas do PCR para detectar sequências relacionadas do polinucleotídeo podem ser produzidas oligoetiquetando, tradução de apelido, etiquetagem final ou por amplificação do PCR usando um nucleotídeo etiquetado.

São abrangidas pela presente invenção as sequências do polinucleotídeo que são capazes de hibridizar com as sequências de polinucleotídeos reivindicadas, incluindo alguns dos polinucleotídeos dentro da Listagem de

Sequências, e fragmentos disso sob várias circunstâncias de severidade (veja, por exemplo, Wahl e Berger (1987), páginas 399-407; e Kimmel (1987)). Além das sequências de nucleotídeo na Listagem de Seqüência, o cDNA de comprimento completo, os ortólogos, e parálogos das sequências de nucleotídeo atuais podem ser identificados e isolados usando métodos conhecidos. As bibliotecas, os ortólogos e os parálogos do cDNA das sequências de nucleotídeo atuais podem ser selecionados usando métodos da hibridização para determinar sua utilidade como prova do alvo ou da amplificação da hibridização

EXEMPLOS

Deve ser compreendido que esta invenção não está limitada aos dispositivos, às máquinas, às materiais e aos métodos particulares descritos. Embora as modalidades particulares sejam descritas, as modalidades equivalentes podem ser usadas para praticar a invenção.

A invenção, agora sendo geralmente descrita, será compreendida mais prontamente pela referência aos seguintes exemplos, que são incluídos meramente para finalidades de ilustração de determinados aspectos e das modalidades da invenção atual e não pretendem ser limitantes da invenção.

Será reconhecido por aqueles versados na técnica que um polipeptídeo que seja associado com uma primeira característica particular pode igualmente ser associado com pelo menos outro, não relacionado e a inerente segunda característica que não foi prevista pela primeira característica.

Exemplo I. Tipos de Projetos e Vetor e Informação de clonagem

Um número de construções foi usado para modular a atividade das sequências da invenção. Um projeto individual foi definido como a análise das linhagens para uma construção particular (por exemplo, este pôde incluir as linhagens de G 1988 que constitutivamente superexpressam uma sequência da invenção) . No presente estudo, uma versão do tipo selvagem com comprimento completo de um gene foi fundido diretamente a um promotor que conduziu sua expressão em plantas transgênicas. Tal promotor poderia ser o promotor nativo desse gene, ou um promotor constitutivo tal como o promotor do vírus 35S do mosaico da couve-flor.

Alternativamente, um promotor que conduzisse a expressão específica ou condicional do tecido poderia ser usado em estudos similares.

No estudo atual, expressão de um dado polinucleotídeo de um promotor particular foi conseguida por uma construção da fusão conduzida pelo promotor em que essa sequência foi clonada diretamente do promotor de interesse. Uma aproximação direta da fusão tem a vantagem de permitir a análise genética simples, se uma dada linhagem do promotor de polinucleotídeo deve ser cruzada em outro dia com bases genéticas diferentes.

Para a análise de plantas que superexpressam Gl 988, linhagens transgênicas foram criadas com o vetor da expressão P2499 (SEQ ID NO: 59), que continham um clone do cDNA G1988. Esta construção constituiu um 35S::G1988 promotor de fusão direto que carregam um marcador da resistência à canamicina e foram introduzidos em plantas de

Arabidopsis.

G4004 (polinucleotídeo SEQ ID NO: 3 e polipeptídio SEQ

ID NO: 4) é uma sequência derivada de soja. G4004 foi identificado como um homólogo estreitamente relacionado do

G1988 baseado na análise filogenética descrita acima.

P26748 (SEQ ID NO: 60) contidos em um clone do cDNA G4004, eram um promotor de fusão de construção 35S::G4004 carregando um marcador de resistência à canamicina. Esta construção foi usada para gerar linhagens de plantas transgênicas de Arabidopsis que superexpressaram constitutivelmente o polipeptídeo G4004.

G4005 (polinucleotídeo SEQ ID NO: 5 e polipeptídeo SEQ

100

ID NO: 6) foram também derivados de soja, e igualmente identificados como um homólogo estreitamente relacionado do G1988 baseado na análise filogenética descrita acima.

P26749 (SEQ ID NO: 61) contidos um clone do cDNA G4005, e era um promotor de fusão de construção 35S::G4005 que carregando um marcador de resistência à canamicina. Esta construção foi usada para gerar linhagens de plantas transgênicas de Arabidopsis que superexpressaram constitutivelmente o polipeptídio G4005.

Uma lista de construções (estes vetores de expressão são identificados por uma designação PID fornecida na segunda coluna) usada para criar plantas que superexpressam os membros do ciado G1988 encontrados neste relatório são fornecidos na tabela 4 e na Listagem de Sequência.

Tabela 4. Construções de expressão usadas para criar as plantas com membros do ciado da G1 988 superexpressos.

Identificador do gene	Construção (PID)	SEQ ID NO: do PID	Promotor	Tipo de projeto
G1988 (2) At	P2499	59	35S	Promotor de fusão direto
G4004 (4) Gm	P26748	60	35S	Promotor de fusão direto
G4005 (6) Gm	P26749	61	35S	Promotor de fusão direto
G4000 (8) Zm	P27404	63	35S	Promotor de fusão

101

				direto
G4012 (16) Os	P27406	64	35S	Promotor de fusão direto
G4299 (22) SI	P27428	65	35S	Promotor de fusão direto

Abreviaturas da espécie para a tabela 4: AtArabídopsis thaliana; Gm - Glicina max; Os - Oriza sativa;

SI - Solarium lycopersicum; Zm - Zea mays

Exemplo II . Transformação

A transformação de Arabidopsis foi executada por um protocolo mediado por Agrobacterium baseado no método de

Bechtold e de Pelletier (1998). A menos que especificamente de outra maneira, todo o trabalho experimental foi feito usando o ecótipo da Colômbia.

Preparação da planta. As sementes de Arabidopsis foram semeadas em recipientes cobertos por malhas. As mudas foram diluídas de modo que 6-10 plantas uniformemente espaçadas permanecessem em cada recipiente 10 dias após a plantação.

Os brotos preliminares foram eliminados uma semana antes da transformação para quebrar o domínio apical e para incentivar a formação de brotos auxiliares. A transformação foi executada tipicamente em 4-5 semanas após a semeadura.

Preparação da cultura bacteriana. Os estoques da

Agrobacterium foram inoculados das únicas placas da colônia

102 ou dos estoques do glicerol e crescidos com os antibióticos apropriados até a saturação. Na manhã da transformação, as culturas saturadas foram centrifugadas e as pelotas bacterianas foram re-suspendidas nos meios da infiltração (0,5X MS, IX de vitaminas B5, sacarose a 5%, 1 mg/ml ribosideo do benzilaminopurina, 200 μΙ/L de Silwet L77) até que uma leitura A600 de que 0,8 foi alcançada.

Transformação e colheita da semente. A solução da

Agrobacterium foi derramada em recipientes de imersão.

Todas os botões de flores e rosetas de folhas das plantas foram imersas nesta solução por 30 segundos. As plantas foram colocadas em seu lado e envolvidas para manter a umidade elevada. As plantas foram mantidas desta maneira de noite a 4° C e então os recipientes foram verticalmente girados, desempacotado, e movido para as prateleiras do crescimento.

As plantas foram mantidas na prateleira de crescimento sob a luz de 24 horas até que as sementes estivessem prontas para serem colhidas. As sementes foram colhidas quando 80% dos siliques das plantas transformadas eram maduros (aproximadamente 5 semanas após a transformação inicial). Esta semente foi considerada semente T0, desde que foi obtida da geração T0, e chapeada mais tarde em placas de seleção (canamicina ou sulfonamida). As plantas

103 resistentes que foram identificadas em tais placas da seleção compreenderam a geração Ti, de que a semente transgênica que compreende um vetor da expressão de interesse poderia ser derivada

Exemplo III. Análise de Morfologia

Análises morfológicas foram executadas para determinar se as mudanças em níveis do polipeptídio afetam o crescimento e o desenvolvimento da planta. Isto foi realizado primeiramente na geração Ti, quando pelo menolO20 linhagens independente foram examinadas. Entretanto, nos casos onde um fenótipo exigiu a confirmação ou detalhou a caracterização, as plantas das gerações subsequentes foram analisadas igualmente.

Os transformantes preliminares foram selecionados no meio do MS com 0.3% sacarose e 50 mg/1 de canamicina. Ο T2 e gerações de plantas posteriores foram selecionadas da mesma maneira, salvo que a canamicina foi usada em 35 mg/1. Em casos onde as linhagens carregam um marcador de sulfonamida (como em todas as linhagens geradas pela supertransformação), sementes foram selecionadas no meio MS com

0,3% de sacarose e 1,5 mg/1 de sulfonamida. As linhagens KO foram geralmente germinadas em placas sem uma seleção. As sementes foram tratadas no frio (estratificado) em placas por três dias na escuridão (a fim de aumentar a eficiência

104 da germinação) antes da transferência para as prateleiras de crescimento. Inicialmente, as placas foram incubadas a 22 °C sob uma intensidade de luz de aproximadamente 100 microEinsteins por 7 dias. Nesta fase, os transformantes eram verdes, possuindo as primeiras duas folhas verdadeiras, e foram distinguidas facilmente de canamicina branqueadora ou mudas suscetíveis à sulfonamida. As mudas resistentes foram então transferidas para o solo (mistura de plantação Sunshine). Depois da transferência para o solo, bandejas de mudas foram cobertas com tampas plásticas por 2-3 dias para manter a umidade quando eles se tornaram estabelecidos. As plantas foram cultivadas no solo sob luz fluorescente a uma intensidade de 70-95 microEinsteins e uma temperatura de 18-23°C. Condições de luz consistiram em um fotoperíodo de 24 horas a menos que de outra maneira indicado. Nos exemplos onde as alterações no tempo de florescência eram aparentes, o tempo de florescência foi re-examinada com 12 horas e com 24 horas de luz para avaliar se o fenótipo era dependente do fotoperíodo. Sob nossas circunstâncias de luz de 24 horas do crescimento, o tempo de geração típico (semente a semear) foi de aproximadamente 14 semanas.

Porque muitos aspectos do desenvolvimento de

Arabidopsis são dependentes das circunstâncias ambientais

105 locais, em todas as plantas dos casos foram avaliadas em comparação com controles no mesmo plano. Como notável abaixo, os controles para linhagens transgênicas foram de plantas tipo selvagem ou plantas transgênicas que abrigam um vetor de transformação vazio selecionado de canamicina ou sulfonamida. 0 exame cuidadoso foi feito nos seguintes estágios: muda (1 semana), roseta (2-3 semanas), florescência (4-7 semanas), e conjuntos tardio de sementes (8-12 semanas). A semente foi inspecionada igualmente. A morfologia da muda foi avaliada em placas de seleção. Em todos os estágios restantes, as plantas foram avaliadas macroscopicamente ao crescer no solo. Todas as diferenças significativas (que incluem alterações na taxa de crescimento, o tamanho, a morfologia da folha e da flor, a coloração, e tempo de florescimento) foram registradas, mas medidas rotineiras não foram tomadas se nenhuma diferença aparecesse. Em determinados casos, as seções da haste foram manchadas para revelar a distribuição de lignina. Nestes exemplos, as hastes secionadas manualmente foram montadas no floroglucinol saturado a 2M de HCI (que mancha a lignina de cor-de-rosa) e vistas imediatamente sob um microscópio de dissecação.

Note que para um dado projeto (a combinação do genepromotor, linhagens da fusão GAL4, linhagem RNAi e etc.) ,

106 dez linhagens foram examinadas tipicamente em placas subsequentes baseadas em ensaios da fisiologia.

Exemplo IV. Métodos Experimentais Fisiológicos.

Nos exemplos subsequentes, a menos que processado de outra maneira, os traços morfológicos e fisiológicos são divulgados em comparação com as plantas tipo selvagem do controle. Isto é, uma planta transformada que fosse descrita como grande e/ou mais tolerante a seca no que diz respeito a uma planta do controle, aos últimos incluir as plantas tipo selvagem, às linhagens parentais e às linhagens transformadas com um vetor que não contivesse uma sequência de interesse. Quando uma planta é dita como tendo um desempenho melhor do que as controles, geralmente era maior, tinha o maior rendimento, e/ou mostrado menos sintomas de estresse do que plantas do controle. As linhagens de execução melhores podem, por exemplo, ter produzido menos anticianina, ou eram maiores, mais verdes, ou mais vigorosas em resposta a um estresse particular, como notável abaixo. O melhor desempenho implica geralmente no maior tamanho ou rendimento, ou tolerância a um esforço biótico ou abiótico particular, menos sensibilidade ao ABA, ou melhor recuperação de um estresse (como no caso de um tratamento baseado na seca do solo) do que controles.

Ensaios de placa. Os ensaios fisiológicos baseados em

107 placas diferentes (mostrados abaixo), representando uma variedade de circunstâncias abióticas e estresse de privação de água relacionadas, foram usadas como uma préclassificatória para identificar a parte superior que executa as linhagens (isto é linhagem da transformação com um constructo particular), que foram geralmente testadas então em ensaios baseados subsequentes no solo.

Tipicamente, dez linhagens foram sujeitadas aos ensaios de placa, as três melhores linhagens foram selecionadas para ensaios subsequentes baseados no solo. Entretanto, nos projetos onde a tolerância significativa do esforço não foi obtida em ensaios baseados em placa, as linhagens não foram submetidas a ensaios de solo.

Além disso, alguns projetos foram sujeitos aos estudos de limitação por nutrientes. Em um ensaio de limitação por nutriente foi pretendido encontrar os genes que reservaram mais crescimento de planta em cima da privação do nitrogênio. O nitrogênio é um nutriente principal que afeta o crescimento e o desenvolvimento da planta que finalmente impacta no rendimento e na tolerância ao estresse. Estes ensaios monitoraram primeiramente a raiz, mas igualmente o crescimento da roseta em meios deficientes de nitrogênio.

Em todas as plantas mais elevadas, nitrogênio inorgânico é assimilado primeiramente no glutamato, na glutamina, no

108 aspartato e na asparagina, os quatro aminoácidos usados para transportar o nitrogênio assimilado das fontes (por exemplo, folhas) aos dissipadores (por exemplo, sementes em desenvolvimento). Este processo pode ser regulado pela luz, assim como pelo status metabólico de C/N da planta. O ensaio de sensibilidade a C/N foi usado assim para procurar alterações no uso dos mecanismos das plantas para detectar níveis internos de metabólitos do carbono e do nitrogênio que poderiam ativar as cascatas de transdução do sinal que regula a transcrição de genes N-assimilatórios. Para determinar se estes mecanismos estão alterados, nós exploramos a observação que plantas do tipo selvagem crescidas nos meios que contêm altos índices de sacarose (3%) sem uma fonte do nitrogênio acumulam altos índices de anticianinas. Esta acumulação de antocianina sacarose induzida pode ser aliviada pela adição de nitrogênio inorgânico ou orgânico. Nós usamos a glutamina como uma fonte do nitrogênio desde que igualmente como um composto usado para transportar N nas plantas

Ensaios de germinação. Os seguintes ensaios de germinação foram conduzidos com os superexpressores de

Arabidopsis G 1988 e de sequências estreitamente relacionadas: NaCl (150 milímetros), manitol (300 milímetros), sacarose (9.4%), ΑΒΑ (0.3μΜ), frio (8° C) ,

109 glicol de polietileno (10%, com o fitogel como o agente de coagulação) , ou sensibilidades ao C/N ou baixo meio do nitrogênio. No texto abaixo, - N refere-se ao meio básico menos o nitrogênio mais a sacarose a 3% e o -N/Gln é meio básico menos o nitrogênio mais a sacarose a 3% e 1 milímetro de glutamina.

Todos os ensaios de germinação foram executados na cultura de tecidos. 0 crescimento das plantas sob temperatura controlada e a umidade no meio estéril produz a planta uniforme que não foi exposta aos esforços adicionais (tais como o esforço da água) que poderiam causar a variabilidade nos resultados obtidos. Todos os ensaios foram projetados para detectar as plantas que eram mais tolerantes ou menos tolerantes à condição particular de estresse e foram tornadas em referência às seguintes publicações: Jang et al.(1997), Smeekens (1998), Liu e Zhu (1997), Saleki et al.(1993), Wu et al.(1996), Zhu et al.(1998), Alia et al.(1998), Xin e Browse, (1998), LeonKloosterziel et al.(1996). Quando possível, as condições do ensaio foram testadas originalmente em uma experiência cega com controles que tiveram os fenótipos relativos à condição testada.

Antes do plaqueamento, as semente para todos os experimentos tiveram a superfície esterilizada da seguinte

110 maneira: (1) 5 minutos de incubação com mistura no álcool etílico a 70%, (2) 20 minuto de incubação com mistura do descorante a 30%, 0,01% triton-x 100, (3) 5X enxágue com água estéril, (4) sementes re-suspendidas em 0,1% agarose estéril e estratifiçada a 4°C por 3-4 dias.

Todos os ensaios de germinação seguem modificações do mesmo protocolo básico. As sementes estéreis foram semeadas nos meios condicionais que tem uma composição básica de 80% de MS + Vitaminas. As placas foram incubadas a 22°C sob a 24 horas de luz (120-130 μΕ m’² s’¹) em uma câmara de crescimento. A avaliação da germinação e do vigor da muda foi avaliada cinco dias após a plantação.

Ensaios de crescimento. Os seguintes ensaios de crescimento foram conduzidos com os superexpressores de

Arabidopsis G 1988 e de sequências estreitamente relacionadas: dessecação severa (um tipo de ensaio de privação da água), crescimento em condições frias a 8° C, desenvolvimento da raiz (avaliação visual de raízes laterais e preliminares, de cabelos de raiz e do crescimento total), e limitação de fosfato. Para o ensaio da limitação de nitrogênio, as plantas foram crescidas em

80% no meio MS em que a fonte do nitrogênio foi reduzida a 20 mg/L de NH4NO3. Note que 80% de MS tem normalmente 1,32 g/1 NH₄NO₃ e 1,52 g/1 KNO₃. Para ensaios da limitação de

111 fosfato, as mudas velhas de sete dias foram germinadas em meio livre de fosfato em meio de MS em que KH₂PO₄ foi substituído por K₂SO₄.

A menos que indicado de outra maneira, todas as experiências foram executadas com as plantas do ecótipo Arabidopsis thaliana da Colômbia (col-0), de soja ou de milho. Os ensaios foram conduzidos geralmente em populações de segregação não-selecionadas do T2 (a fim de evitar o estresse extra da seleção). Controle de plantas para ensaios nas linhagens que contêm construções diretas do promotor de fusão eram plantas de Col-0 transformadas em um vetor de transformação vazio (pMEN65). Os controles para linhagens de 2 componentes (geradas pela supertransformação) eram as linhagens do promotor-excitador do fundo (isto é promotor: : Linhagens LexA-GAL4TA), em que as super transformações foram executados inicialmente.

Procedimentos

Para ensaios de refrigeração do crescimento, as sementes foram germinadas e crescidas por sete dias no MS +

Vitaminas + 1% de sacarose a 22° C e transferido então à refrigeração condiciona em 8° C e avaliado após outros 10 dias e 17 dias.

Para ensaios severos da dessecação (placa-baseada na privação de água), as mudas foram crescidas por 14 dias em

112

MS + Vitaminas + 1% de sacarose a 22° C. As placas foram abertas na tampa estéril por 3 horas para endurecer-se e então as mudas foram removidas dos meios e deixadas secar por duas horas na tampa. Depois desse tempo as plantas foram transferidas de volta às placas e incubadas em 22° C para a recuperação. As plantas foram avaliadas então após cinco dias.

Para classificar a tolerância do estresse hiperosmótica do polietilenoglicol (PEG), as sementes da planta foram esterilizadas com gás de cloro por 2 horas. As sementes foram chapeadas em cada placa que contem o PEG de

3%, os sais do MS de 1/2 X, o fitagel de 1%, e o glufosinato-amónio de 10 pg/ml (BASTA). Duas placas de replicação por linhagem de semente foram plantadas. As placas foram colocadas a 4°C por 3 dias para estratificar sementes. As placas foram prendidas verticalmente por 11 dias adicionais em temperaturas de 22°C (dia) e de 20°C (noite) . O fotoperíodo era de 16 horas. Com uma intensidade de luz média de aproximadamente 120 pmol/m2/s. As cremalheiras que prendem as placas foram giradas diariamente dentro das prateleiras dos carros da câmara de crescimento. Em 11 dias, as medidas do comprimento da raiz são feitas. Em 14 dias, o status da muda era determinado, o comprimento da raiz foi medido, o estágio do crescimento

113 foi gravado, a cor visual foi avaliada, o peso fresco associado da muda foi medido, e uma fotografia inteira da placa foi tomada.

Ensaio de classificação de murchamento. Transgênico e plantas tipo selvagem de soja foram crescidas em 5 potes em câmaras de crescimento. Depois que as mudas alcançaram o estágio de VI (o estágio de VI ocorre quando as plantas têm uma trifoliolado, e o unifoliolate e as primeiras folhas trifolioladas são desenroladas), a água foi retida e o tratamento da seca começou assim. Uma contagem do fenótipo de ferimento da seca foi gravada, na severidade crescente de efeito, como 1 a 4, com o 1 designado nenhum efeito óbvio e os 4 que indicam uma planta inoperante. A contabilização da seca foi iniciada assim que uma planta em uma câmara de crescimento tivesse uma contagem da seca de

1,5. A marcação continuou diáriamente até que pelo menos

90% do tipo selvagem plantas conseguiu contagens de 3,5 ou mais. No fim da experiência as contagens para o tipo transgênico e mudas selvagens de soja foram analisadas estatisticamente usando métodos de análise de contagem e de sobrevivência do risco (Glantz (2001); Hosmer e Lemeshow (1999)).

Eficiência do uso da água (QUE) . A WUE foi estimada explorando a observação de que os elementos podem existir

114 nas formas(radioativas) estáveis e instáveis . A maioria dos elementos de interesse biológico (que incluem C, Η, O,

N, e S) possue dois ou mais isótopos estáveis, com o mais leve destes presentes em abundância muito maior do que o outro. Por exemplo, ¹²C é mais abundante do que C na natureza (¹²C = 98.89%, ¹³C =1.11%, ¹⁴C = <10-10%). Porque o ¹³C e levemente maior que o ¹²C, o f racionamento do CO₂ durante a fotossíntese ocorre em dois estágios:

1. ¹²CO₂ difunde através do ar e na folha mais facilmente;

2. ¹²CO₂ é preferido pela enzima na primeira etapa da fotossíntese, carboxilase/oxigenase ribulose bisfosfato.

WUE foi mostrado para ser correlacionado negativamente com a discriminação do isótopo do carbono durante a fotossíntese em diversas espécies de colheita C3. A discriminação do isótopo do carbono foi ligada igualmente à tolerância da seca e à estabilidade do rendimento em ambientes propensos à seca e usada com sucesso para identificar genótipo com melhor tolerância da seca. O índice ¹³C/¹²C foi medido após a combustão da planta e da conversão ao C0₂, e à análise pela espectroscopia maciça. Com comparação com um padrão conhecido, o índice ¹³C foi alterado de modo que sugerir que a superexpressão de G1988 ou de sequências relativas melhorasse a eficiência do uso

115 da água.

Outro indicador potencial da WUE era a condutibilidade estomatal, isto é, a extensão a que os estornas estavam abertos.

Interpretação dos dados

No tempo da avaliação, foram dadas as plantas uma das seguintes contagens:

(++) Desempenho substancialmente aumentado comparado aos controles. O fenótipo era muito consistente e o crescimento estava significativamente acima dos níveis normais de variabilidade observados para esse ensaio.

(+) Desempenho realçado comparado aos controles. A resposta era consistente, mas estava somente moderada acima dos níveis normais de variabilidade observados para esse ensaio, (wt) nenhuma diferença detectável nos controles tipo selvagem.

(-) 0 desempenho prejudicado comparado aos controles. A resposta era consistente, mas estava somente moderada acima dos níveis normais de variabilidade observados para esse ensaio.

(- -) Desempenho substancialmente prejudicado comparado aos controles. O fenótipo era consistente e o crescimento estava significativamente acima dos níveis normais de

116 variabilidade observados para esse ensaio, (n/d) A experiência falhou, os dados não obtidos, ou analise não executado.

Exemplo V. Seca do solo do. (pote de argila)

O ensaio da seca do solo (executado em potes de argila) foi baseado naquele descrito por Haake et al. (2002) .

Procedimento experimental

Previamente, nós executamos ensaios de pote de argila nas populações de segregação do T2, semeadas diretamente no solo. Entretanto, no procedimento atual, as mudas foram germinadas primeiramente nas placas da seleção que contêm o canamicina ou o sulfonamida.

As sementes esterilizadas por um tratamento de 2 minutos de álcool etílico seguido de 20 minutos em 30% de descorante e 0,01% de Tween e cinco lavagens na água destilada. As sementes foram semeadas ao ágar do MS em 0,1% de agarose e estratificadas por três dias a 4°C, antes de transferência aos armários de crescimento com uma temperatura de 22°C. Após sete dias de crescimento em placas de seleção, as mudas foram transplantadas aos potes de argila de 3,5 polegadas de diâmetro que contêm 80g de uma mistura do 50:50 de vermiculite:perlite coberto com 80g de ProMix. Tipicamente, cada pote continha 14 mudas, e as

117 plantas da linhagem transgênica que está sendo testada estavam em potes separados do tipo de controles selvagens.

Os potes que contêm a linhagem transgênica contra potes do controle foram intercalados no quarto do crescimento, mantido sob as circunstâncias de luz de 24 horas (18-23°C, e 90-100 pErrf²s^_1) e molhado por um período de 14 dias. A água foi retida então e os potes foram colocados no papel absorvente por um período de 8-10 dias para aplicar um tratamento da seca. Após este período, uma contagem qualitativa visual da seca; de 0-6 foi atribuído para gravar a extensão de sintomas visíveis do estresse da seca.

Uma contagem do 6 correspondendo a nenhum sintoma visível visto que uma contagem do 0 correspondendo ao murchamente extremo e às folhas tendo uma textura crespa. No fim do período da seca, os potes foram molhados e marcados após 56 dias; o número de plantas da sobrevivência em cada pote foi contado, e a proporção das plantas do total no pote que sobreviveu foi calculada.

Análise dos resultados.

Em uma dada experiência, nós comparamos tipicamente 6 ou mais potes de uma linhagem transgênica com 6 ou mais potes do controle apropriado. A contagem média da seca e a proporção média de plantas que sobrevivem (taxa de sobrevivência) foram calculadas para a linhagem transgênica

118 e os potes do tipo selvagem. Em cada caso um valor p * foi calculado, que indicasse o significado da diferença entre os dois valores médios. Os resultados para cada linhagem transgênica através de cada planta para um projeto particular foram apresentados então em uma tabela de resultados.

Cálculo de valores de p. Para os ensaios onde o controle e as plantas experimentais estavam em potes separados, à sobrevivência foi analisada com uma regressão logística para esclarecer o fato de que a variável aleatória é uma proporção entre 0 e 1. 0 valor p relatado era o significado da proporção experimental contrastada ao controle, baseado em regressão dos dados transformados de logit.

A contagem da seca, sendo um fator requisitado sem o significado numérico real, foi analisada com um teste nãoparamétrico entre os grupos experimentais e de controle. O valor de p foi calculado com um teste de soma de rank MannWhitney.

Exemplo VI. Medidas fisiológicas e bioquímicas da seca do solo

Estas experiências determinaram as bases fisiológicas para a tolerância da seca conferidas por cada ligação e foram executadas tipicamente sob circunstâncias de

119 crescimento no solo. Geralmente, a experiência foi executada sob condições fotoperiódica de 10 horas ou de 12 horas de luz. Sempre que possível, um projeto dado (combinação do gene/promotor ou variação da proteína) foi representado por três linhagens independentes. As plantas estavam geralmente no estágio vegetativo/cedo reprodutivo atrasado então as medidas foram tomadas. Tipicamente nós analisamos três estados diferentes: um estado bem-molhado, um estado da suave-seca e um estado moderado severo da seca, em cada caso, nós fizemos comparações das plantas selvagens com o mesmo grau de sintomas físicos do estresse (murchamento). Para conseguir este, as amostras desconcertadas foram exigidas frequentemente. Tipicamente, para uma dada linhagem, dez plantas individuais foram analisadas para cada estado.

Os seguintes parâmetros fisiológicos foram medidos rotineiramente: índice de água relativo, índice do ABA, índice do prolina, e taxa da fotossíntese. Em alguns casos, as medidas de níveis da clorofila, os níveis do amido, os níveis do carotenóide, e a fluorescência da clorofila foram feitos igualmente.

Análise dos resultados. Em uma experiência dada, para um parâmetro particular, nós comparamos tipicamente aproximadamente 10 amostras de uma linhagem transgênica

120 dada com aproximadamente 10 amostras de controle tipo selvagem apropriado em cada estado da seca. Os valores médios para cada parâmetro fisiológico foram calculados para a linhagem transgênica e potes do tipo selvagem. Em cada caso, um valor p (calculado através de um teste t simples) era determinado, que indicasse o significado da diferença entre os dois valores médios.

Um procedimento típico é descrito abaixo; isto corresponde ao método usado para a experiência do tempo do curso da seca que nós executamos em plantas tipo selvagem durante nossos estudos da linhagem de base ao princípio do programa da seca.

Procedimento. As sementes foram estratificadas por três dias em 4°C em 0,1% de agarose e semeadas em Metromix 200 em potes de 2,25 polegadas (quadrado ou redondo). As plantas foram mantidas em potes individuais dentro dos planos crescidos sob dias curtos (10 horas de luz, 14 horas de escuro). As mudas foram molhadas como necessárias para manter o crescimento e o desenvolvimento da planta saudável. Em 7 a 8 semanas após a plantação, as plantas foram usadas em experiências de seca.

As plantas combinadas para o desenvolvimento equivalente do crescimento (tamanho da roseta) foram removidas dos planos plásticos e colocadas no papel

121 absorvente. Os potes que contêm as plantas usadas como controles bem-molhados foram colocados dentro de um barco do peso e do prato colocados no papel do tecido. A finalidade do barco do peso era reter toda a água que pudesse escapar dos potes bem-molhados e afetar os potes que contêm as plantas que se submetem ao tratamento do estresse da seca.

Em cada dia da amostragem, até 18 plantas sujeitadas às condições da seca e 6 controles bem-molhados (de cada linhagem transgênica) foram escolhidos de uma associação aleatória gerada (dada que passaram padrões do controle da qualidade). A análise bioquímica para a fotossíntese, o

ABA, e a prolina foram executadas nos três seguintes os mais novos, melhor folhas completamente expandidas. O índice de água relativo foi analisado usando o tecido restante da roseta.

Medida da Fotossintese

A fotossintese foi medida usando um LICOR LI-6400 (LiCor, Biosciences,Lincoln, NE). O LI-6400 usou os analisadores de gás infravermelhos para medir o dióxido de carbono para gerar uma medida de fotossintese. Foi baseado na diferença da referência de CO₂ (a quantidade colocada dentro da câmara) e na amostra do CO₂ (a quantidade que sai da câmara) . Visto que a fotossintese é o processo de

122 converter o CO₂ aos hidratos de carbono, nós esperamos ver uma diminuição na quantidade de amostra do CO₂. Desta diferença, uma taxa da fotossíntese poderia ser gerada. Em alguns casos, a respiração pode ocorrer e um aumento no CO₂ detectado. Para executar medidas, o LI-6400 e instalado e calibrado como por direções padrão de LI-6400. A fotossíntese foi medida na folha mais nova, na folha mais completamente expandida no 300 e de 1000 ppm de CO2 usando uma fonte luminosa do metal haleto. Esta fonte luminosa forneceu aproximadamente 7 00 μΕ m~² s^_1.

A fluorescência foi medida na obscuridade e a luz adaptada as folhas usando um LI-6400 (LICOR) com um acessório de fluorímetro da câmara da folha ou uma OSI (Opti-Sciences, Hudson, NH) como descrita na literatura de produtor. Quando o LI-6400 foi usado, todas as manipulações foram executadas sob uma máscara de pano escuro. As plantas foram adaptadas ao escuro colocadas em uma caixa sob esta máscara de pano até usadas. O OS-30 utilizou pequenos grampos para criar as folhas adaptadas ao escuro.

Medida do ácido abscisico e da Prolina. A finalidade desta experiência foi medir o ABA e a prolina no tecido da planta. O ABA é um hormônio vegetal acreditado estar envolvido em respostas ao estresse e a prolina é um osmoprotetor.

123

Três das folhas maduras mais novas, mais completamente expandidas foram colhidas, congeladas em nitrogênio liquido, liofilizadas e anotada a medida do peso seco. O tecido vegetal foi então homogeneizado em metanol para o qual 500 ng de d6-ABA foi adicionado para atuar como um padrão interno. 0 homogeneizado foi filtrado para remover material vegetal e o filtrado evaporado a um pequeno volume. A este extrato cru, aproximadamente 3 ml de 1% de ácido acético foi adicionado e o extrato foi também evaporado para remover todo o metanol restante. O volume do extrato aquoso restante foi medido e uma pequena alíquota (usualmente 200 a 500 pl) foi removida para a análise de prolina (Protocolo descrito abaixo) . 0 extrato restante foi dividido então duas vezes contra o éter, o éter removido pela evaporação e o resíduo metilatado usando o diazometaneo eteral. Depois da remoção de todo o diazometano não reagido, o resíduo foi dissolvido em 100 a

200 μΐ de acetato de etila e analisado pela cromatografia a gás - espectrometro de massa. A análise foi executada usando um HP 6890 CG acoplado a um HP 5973 MSD usando uma coluna capilar de gás DB-5ms. A pressão da coluna foi de 20 psi. Inicialmente, a temperatura do forno era de 150°C. Depois da injeção, o forno foi aquecido em 5° C/min a uma temperatura final de níveis de 250°C. 0 ABA foi estimado

124 usando uma equação da diluição do isótopo e normalizado ao peso seco do tecido.

O índice livre de prolina foi medido de acordo com Bates (Bates e outros, 1973). O extrato aquoso cru obtido acima foi levado até um volume final de 500 μΐ usando água destilada. Subsequentemente, 500 μΐ de acético glacial foi adicionado seguido por 500 μΐ de Ninhidrina de Chinard. Ninhidrina de Chinard foi preparada dissolvendo 2,5g de ninhidrina (hidrato do tricetohidrindena) em 60 ml de ácido acético glacial a 70°C para a qual 40 ml do ácido fosfórico de 6 M foram adicionados.

As amostras foram aquecidas então em 95° a 100° C por uma hora. Após este período de incubação, as amostras foram refrigeradas e 1,5 ml de tolueno foi adicionado. A fase superior do tolueno foi removida e a absorvência medida em

515nm. As quantidades de prolina foram estimadas usando uma curva padrão gerada usando a L-prolina e normalizada ao peso seco do tecido.

Medida do índice de água relativa. O índice de água relativa (RWC) indicou a quantidade de água que é armazenada dentro do tecido vegetal a um momento determinado. Foi obtido tomando o peso de campo da roseta menos o peso seco da planta e dividindo-se pelo peso da roseta saturada com água menos o peso seco da planta. O

125 valor resultante de RWC pode ser comparado de planta à planta, sem levar em considerar o tamanho da planta, índice de água relativa = Peso de Campo - Peso Seco x 100

Peso Túrgido - Peso Seco

Depois que o tecido foi removido para a disposição e análise de ABA/prolina, a roseta foi cortada das raízes usando um par de tesouras pequeno. O peso de campo foi obtido pesando a roseta. A roseta então foi imergida em água fria e colocada em um banho de água gelada no escuro.

A finalidade deste foi para permitir que o tecido vegetal absorva a água enquanto previne qualquer metabolismo que poderia alterar o nível de pequenas moléculas dentro da célula. O próximo dia, a roseta foi removida com cuidado, marcada seca com o papel vegetal e pesada para obter o peso túrgido. O tecido foi então congelado, liofilizado e pesado para obter o peso seco.

Determinação do amido. O amido foi estimado usando um procedimento de marcação baseado em iodo simples. Folhas, jovens, inteiramente expandidas foram colhidas no final ou no início do período de luz de 12 horas e colocadas em tubos contendo etanol a 80% ou metanol a 100%. As folhas foram descoloridas pela incubação dos tubos em um banho de água de 70° a 80° C até que a clorofila tivesse sido removida do tecido da folha. As folhas foram imersas então

126 em água para deslocar qualquer metanol residual que pudesse estar presente no tecido. O amido foi marcado então incubando as folhas em uma coloração de iodo (2 g ΚΙ, 1 g

I2 em 100 ml de água) por um minuto e então lavado com quantidades copiosas de água. O tecido continha grandes quantidades de amido marcado com azul escuro ou preto;

tecidos esgotados de amido eram incolores.

Determinação da clorofila/carotenóide. Para alguns experimentos, a clorofila foi estimada em extratos metanólicos usando o método de Porra et al. (1989) . Os carotenóides foram estimados no mesmo extrato em 450 nanômetro usando um A (1%) de 2500. Nós medimos a clorofila usando um Minolta SPAD-502 (Konica Minolta Sensing

Américas, Inc., Ramsey, NJ) . Quando o SPAD-502 foi usado para medir a clorofila, tanto o índice e a quantidade de carotenóide quanto à de clorofila poderíam também ser determinados através de HPLC. Os pigmentos foram extraídos do tecido da folha homogeneizando as folhas em acetona: acetato de etil (3: 2). A água foi adicionada, a mistura foi centrifugada e a fase superior removida para a análise de HPLC. As amostras foram analisadas usando uma coluna(250x4,6) de Cl 8 (revestida na extremidade) da Zorbax (Agilent Technologies, Paio Alto, CA) com um gradiente de acetonitrila: água (85:15) para acetonitrilo: metanol

127 (85:15) em 12,5 minutos. Após manter nestas condições por dois minutos, as condições do solvente foram mudadas para metanol:acetato de etil (68: 32) em dois minutos.

Os carotenóides e as clorofilas foram determinados usando áreas máximas e os fatores de resposta calculados usando luteína e beta-caroteno como padrões.

Frações nucleares e citoplasmicamente-enriquecidas.

Nós desenvolvemos uma plataforma para preparar extratos nucleares e citoplásmicos da proteína em um formato de 96 poços usando grânulos de um carboneto de tungstênio para o rompimento da célula em um detergente moderado e uma sacarose revestida para separar frações nucleares das citoplasmáticas. Nós usamos anticorpos de histona para demonstrar que este método separa eficazmente frações nuclear-enriquecidas das citoplasmáticas. Um método alternativo (somente de giro) usou o mesmo procedimento de rompimento, mas simplesmente granulou os núcleos para separá-los do citoplasma sem a purificação adicionada de uma sacarose revestida.

Quantificação do nível do mRNA. Replicas de três caules e três raízes biológicas foram tipicamente colhidas para cada linhagem, como descritas acima na seção dos métodos da quantificação de proteína. O RNA foi preparado usando um protocolo do formato de 96 poços, e o cDNA

128 sintetizado de cada amostra. Estas preparações foram usadas como moldes para experiências de RT-PCR. Nós medimos os níveis de transcrição para um gene do interesse relativo à RNA 18S de transcrição para cada amostra usando uma máquina

ABI 7900 Real-Time RT-PCR com SYBR® Green Technology (Applied Biosystems, Foster City, CA) .

Análise Fenotipica: Tempo de florescência. As plantas foram crescidas no solo. O tempo de florescência foi determinado baseado em um ou outro ou ambos (i) número para os dias depois de plantada à primeira flor em botão visível, (ii) o número total de folhas (roseta ou roseta mais caulina) produzida pelo meristema primário do caule.

Análise Fenotipica: Estresses pelo calor. Em experimentos preliminares descritos neste relatório, as plantas foram germinadas em câmara de crescimento a 30°C com 24 horas de luz por 11 dias. As plantas foram deixadas a 22°C com 24 horas de luz por três dias e as fotografias foram feitas para registrar a saúde após o tratamento. Em um segundo experimento, as mudas foram crescidas em 22°C por quatro dias em meios seletivos e as placas transferidas a 32 °C por uma semana. Foram deixadas então para recuperação em 22°C por três dias. Quarenta plantas de duas placas separadas foram colhidas para cada linhagem e o peso fresco e o índice de clorofila medidos.

129

Análise Fenotipica: Senescência induzido pelo escuro.

Nos experimentos preliminares descritos neste relatório, as plantas foram crescidas no solo por 27-30 dias em 12h de luz a 22°C. Foram movidas para uma câmara escura a 22°C, e avaliadas visualmente para senescência após 10-13 dias. Em alguns casos nós usamos Fv/Fm como uma medida de clorofila (Pourtau e outros, 2004) na folha mais nova totalmente expandida de cada planta. O meio de Fv/Fm para as 12 plantas de cada linhagem foi normalizado ao meio de Fv/Fm para 12 controles combinados.

Microscopia. Microscopia luminosa, de elétron e uma microscopia de campo-focal foram realizadas.

Várias definições/abreviaturas usadas:

RWC = índice de água relativa (peso de campo - peso seco/(peso túrgido - peso seco) x 100

ABA= ácido abscísico , pg/gdw

Prolina= Prolina, pmole/gdw

Chi SPAD = clorofila estimada por um Minolta SPAD-502, razão de de 650 nm a 940 nm.

A 300 = taxa da assimilação líquida, pmole CC>2/m²/s a 300 ppm de CO₂

A1000 = taxa da assimilação líquida, pmole CO₂/m²/s a 100 ppm de CO₂

Total de Chi = mg/gfw, estimado por HPLC

130

Caroteno = mg/gfw, estimado por HPLC

FO = fluorescência mínima de uma folha adaptada ao escuro

Fm = fluorescência máxima de uma folha adaptada ao escuro

Fo' = fluorescência mínima de uma folha adaptada a luz

Fm' = fluorescência máxima de uma folha adaptada a luz

Fs - fluorescência de estado estacionário de uma folha adaptada a luz

Psi lf = potencial de água (Mpa) de uma folha

Psi p= potencial do turgência (Mpa) de uma folha

Psi PI= potencial osmótico (Mpa) de uma folha

Fv/Fm = (Fm - FO) /Fm; rendimento de quantum máximo de

PSII

Fv'/Fm' = (Fm' - Fo')/Fm' ; eficiência de energia colhida pelos centros de reação PSII aberto.

PhiPS2 = (Fm' - Fs) /Fm' \ rendimento de quantum real de PSII

ETR= PhiPS2 x intensidade de luz absorvida x 0.5; nós usamos 100 pE/m²/s para uma intensidade de luz média e 85% como quantidade de luz absorvida

131 qP = (Fm' -Fs/(Fm' - Fo'); repleção fotoquímica (inclui a fotossintese e a fotorespiração); proporção de

PSII aberto qN= (Fm - Fm')Z (Fm - Fo'); repleção não-fotoquimica (inclui mecanismos como a dissipação pelo calor).

NPQ = (Fm- Fm')/Fm' ; repleção não-fotoquimico (inclui mecanismos como a dissipação de calor).

Seleção para a Eficiência do Uso da Água.

Um aspecto desta invenção fornece plantas transgênicas com rendimento melhorado resultante da eficiência do uso da água e/ou da tolerância melhorada da privação da água.

Este exemplo descreve um método da elevada-produção para a seleção da estufa de plantas transgênicas para plantas do tipo selvagem (testadas como inatos ou híbridos) para a eficiência do uso da água. Este processo de seleção impõe três ciclos da secura/re-hidratação das plantas durante um período total de 15 dias após um período de crescimento livre de estresse inicial por 11 dias. Cada ciclo consistiu em cinco dias, sem a água sendo aplicada para os primeiros quatro dias e uma repleção de água no quinto dia do ciclo. Os fenótipos preliminares analisados pelo método da seleção foram as mudanças na taxa de crescimento da planta como determinados pela altura e pela

132 biomassa durante um tratamento vegetativo da seca. O status da hidratação dos tecidos do galho depois da seca foi também medido. As alturas de planta foram medidas em três pontos de tempo. O primeiro foi tomado apenas antes da seca no início em que a planta tinha 11 dias de idade, a qual estava o galho de altura inicial (SIH). A altura da planta foi também medido incompletamente durante todo o regime de seca/re-hidratação de água, no dia 18 após o plantio, para obter a altura do galho durante a seca (SMH) . Em cima da conclusão do ciclo final da seca no dia 26 após o plantio, a porção do galho da planta foi colhida e medida para uma altura final, a qual foi a altura do galho seco (SWH) e também medido para a biomassa de galhos secos (SWM). O galho foi colocado em água a 40° C no escuro. Três dias mais tarde, o peso do galho foi determinado para fornecer o peso túrgido do galho (STM). Após a secagem em um forno por quatro dias, os pesos dos galhos foram determinados para fornecer a biomassa seca do galho (SDM). A altura média do galho (SAH) foi uma altura de planta média através das três medidas da altura. Se desejado, o procedimento descrito acima pode ser ajustado para +/- ~ um dia para cada etapa. Para corrigir as ligeiras diferenças entre as plantas, um valor corrigido do tamanho de crescimento foi derivado de

SIH e de SWH. Esta foi a Taxa de Crescimento Relativa

133 (RGR) . A Taxa de Crescimento Relativa (RGR) foi calculada para cada galho usando a fórmula [RGR% = (SWH-SIH) / ( (SWH +SIH)/2) * 100]. 0 índice de água relativa (RWC) é uma medida de quanto (%) da planta estava de água na colheita.

índice de água (RWC) foi calculado para cada galho usando a fórmula [RWC% = (SWM-SDM/(STM- SDM) * 100]. Por exemplo, as plantas de milho totalmente molhadas deste estágio do desenvolvimento têm em torno de 98% de RWC.

Exemplo VII. Observações morfológicas com superexpressores de sequência relacionada e G1988 em Arabidopsis.

Em nossos estudos mais adiantados, a super-expressão de G1988 em Arabidopsis produziu um pequeno número de linhagens que floresceram cedo, e em diversas linhagens superexpressas as mudas cresceram mais rapidamente do que mudas do controle. Nós também demonstramos que, quando crescidas em meios livres de fosfato, todas as linhagens de mudas de Arabidopsis que superexpressando constitutivamente

G1988 sob o controle regulador do promotor 35S pareceram maiores e tivemos mais crescimento da raiz do que os controles. Plantas 35S::G1988 com altos níveis de expressão

G1988 produziram hipocótilos longos, pecíolos longos e folhas eretas, os fenótipos que sugerem um papel para este gene na sinalização da luz, o qual pode ser um dos fatores responsáveis conferido ao rendimento aumentado na colheita

134 de plantas. Linhagens 35S::G1988 amostraram fenótipos adicionais impressionantes quando crescido sob dias longos (16 horas de luz) ou luz contínua; as plantas foram atrofiadas e indicaram prematura clorose e atraso do desenvolvimento. Além disso, uma absorção de água ocasional das folhas foi observada.

Para o estudo atual, cinquenta e uma novas linhagens de promotor de fusão direto 35S::G1988 foram geradas. Nove destas linhagens mostraram um fenótipo longo de hipocótilo na geração do Tl. Dez linhagens que não tinham mostrado hipocótilo longos em Tl foram examinados na geração do T2 e seis destas linhagens mostraram pelo menos algumas plantas com hipocótilo longos e pecíolos longos, sugerindo que a penetração do fenótipo poderia ser influenciada pela dosagem do gene ou por circunstâncias ambientais. A maioria das linhagens de Tl examinada exibiu folhas eretas. Os efeitos na florescência foram inconsistentes; algumas linhagens de Tl foram anotadas outra vez para florescer mais cedo, mas uma caracterização cuidadosa de duas linhagens 35S;:G1988 com níveis elevados da expressão G1988 não revelaram nenhuma diferença na florescência ou num ligeiro atraso, dependendo do comprimento do dia em que as plantas foram crescidas.

135

Similaridades morfológicas conferidas por G1988 e por ortólogos

Linhagens 35S::G4000 (milho SEQ ID Nos: 7 e 8) . 35S::G4012 (arroz SEQ ID Nos. 15 e 16), 35S::G4299 (tomate

SEQ ID Nos: 21 e 22), 35S::G4004 (soja SEQ ID Nos: 3 e 4) e 35S::G4005 (soja SEQ ID Nos: 5 e 6) mostraram morfologia similar a linhagem 35S::G1988. Um número de mudas TI

35S::G4012, 35S::G4004 e 35S::G4005 tinham pecíolos em cotilédones estendidos e mudas 35S::G4000, 35S::G4012,

35S::G4299, e 35S::G4004 também tiveram hipocótilos mais longos do que controles sob a luz contínua. Plantas adultas

35S::G4004 e 35S::G4005 também pareceram muito similares a plantas 35S::G1988 de expressão elevada quando crescido sob a luz contínua. Quando constitutivamente superexpressada, todas estas sequências produziram plantas que tiveram folhas em verticalidade, similares a plantas 35S::G1988 crescidas sob luz contínua. As observações das folhas sustentadas, de hipocótilos longos e de pecíolos longos sugeriu que G4004 e G4005 funcionem similarmente a G1988 na sinalização da luz, a qual pode ser um fator que possa contribuir ao rendimento melhorado nas plantas G1988 superexpressando-claridade. Um número de linhagens 35S::

G4004 foram atrasadas em seu desenvolvimento relativo aos controles.

136

Das vinte linhagens transgênicas examinadas, uma das linhagens 35S::G4005 foi maior no tamanho do que o controle no estágio de muda, uma outra linhagem foi tipo selvagem no tamanho, e todas as linhagens restantes foram menores no tamanho do que os controles neste estágio.

Efeito da expressão ectópica de G1988 no crescimento do amadurecimento acelerado.

O superexpressão constitutiva de G1988 em plantas de soja resultou em consistentes aumentos no crescimento do amadurecimento acelerado relativo à planta controle. Este efeito foi particularmente evidente quando as sementes dos superexpressores e dos controles foram plantadas depois em oposição a antes da primavera. Em particular, as linhagens de superexpressores G1988 que foram associados com o rendimento elevado, tal como linhagens 178, 189, 200, 209,

213 e 218 (ver, por exemplo, Tabela 12) geralmente exibiram maior crescimento de amadurecimento acelerado do que os controles.

Efeito da expressão ectópica de G1988 no diâmetro do caule em plantas de soja.

Quando crescido em condições de dia curto controlado (10 horas de luz), linhagens de plantas de soja superexpressando G1988 não pareceram mostrar diâmetros do caule aumentados relativos a de plantas controle por

137 qualquer extensão significativa. Entretanto, nos dias de comprimento longo (20 horas de luz), os superexpressores

G1988 produziram geralmente o diâmetro do caule significativamente maior do que os controles. Os diâmetros do caule aumentados dos superexpressores G1988 foram confirmados em plantas de soja crescidas em condições de campo.

O diâmetro do caule aumentado pode positivamente impactar a biomassa assim como contribuir para a resistência aumentada ao tropismo.

Tabela 5- Diâmetro do caule da soja de vários superexpressores G1988 e controles crescidos em dias de comprimentos curtos e longos.

Linhagem	Comprimento	Diâmetro	Diferença do	Valor-P
	do dia	médio do	controle, dimetro
		caule (mm)	médio do caule (mm)
206* *	Dia curto	4,35	-0,47	0,025
178	Dia curto	4,43	-0, 39	0,049
218	Dia curto	4, 60	-0,22	0,250
A3244 (controle)	Dia curto	4,82	-
209	Dia curto	4,89	+ 0,07	0,338
213	Dia curto	4,89	+ 0, 07	0,268
A3244 (controle)	Dia longo	15,75	-

138

178	Dia longo	16, 83	+ 1, 08	0,071
213	Dia longo	16, 92	+1,07*	0,021
218	Dia longo	17,46	+1,71*	0, 004
206**	Dia longo	16,29	+ 0,54	0, 104
209	Dia longo	17,17	+ 1,42	0, 027

* linhagem que mostrou um diâmetro de caule maior relativo aos controles (significância em p <0,05) ** não expressa G1988 a um nível significativo.

Efeito da expressão ectópica de G1988 no comprimento internos em plantas de soja.

Em experimentos de dia curto (10 horas de luz por o dia) , o comprimento do interno da soja aumentou em relação aos controles. Este efeito foi geralmente visível para quase todos os internos das plantas, mas foi particularmente evidente para internos 8-12 os quais formados relativamente tarde no desenvolvimento de plantas (figura 10). Entretanto, o comprimento do interno foi geralmente maior virtualmente em todos os estágios do crescimento, incluindo durante o crescimento precoce da estação como visto com internos precoces (por exemplo, internos 1-5) comparados na Figura 10.

Efeito da expressão ectópica de G1 988 no revestimento da cúpula

139

A superexpressão constitutiva de G1988 em plantas de soja resultou em aumentos consistentes no revestimento da cúpula de amadurecimento tardio em relação a plantas controle. A cobertura da cúpula aumentada foi associada positivamente com as linhagens que produziram o rendimento aumentado. A linhagem 217, a qual não superexpressa como

G1988 para a mesma extensão que fez as linhagem de alto rendimento (linhagem 217 o ectopicamente expressada em cerca de 60% do nível de G1988 como geralmente encontrado

em linhagem	de	alto-rendimento;) , não	exibiu aumento
significativo	de	revestimento da cúpula	em relação ao
controle.
Exemplo VIII	•	Resultados experimentais	baseados em
plaqueamento.

Este relatório fornece as observações experimentais para as mudas transgênicas superexpressando polipeptídeos relacionado-G1988 em ensaios baseados em plaqueamento, testando para a tolerância aos estresses abióticos que incluem a privação de água, o frio e baixo nitrogênio ou sensibilidade alterada de C/N.

G1988 (SEQ ID No. : 1 β 2; Arabidopsis Thaliana) - promotor constitutivo 35S.

Resultados de ensaio de fisiologia baseado em plaqueamento em Arabidopsis.

140

Em nossos estudos mais adiantados, nós demonstramos que as mudas germinadas nas placas que continham limitado nitrogênio (suplementado com a glutamina) pareceram menos estressadas do que os controles.

Plantas 35S::G1988 foram descobertas por terem o desempenho alterado em um ensaio de medição de resposta para as razões alteradas de carbono/nitrogênio (ensaio de sensibilidade ao C/N) . Nove de dez linhagens 35S::G4004 também mostraram uma resposta significativamente diferente comparadas as mudas do controle no ensaio de sensibilidade ao C/N, consistente com o fenótipo observado para plantas

35S::G1988.

Dez linhagens de plantas Arabidopsis 35S::G1988 foram examinadas em ensaios fisiológicos. Além do que o fenótipo de sensibilidade ao C/N observado em análises precedentes, melhorou o desempenho em pouco nitrogênio em um ensaio do crescimento da raiz também foi observado. Três de dez linhagens também mostraram tolerância à desidratação em um ensaio severo de dessecação baseado em plaque mento, um tipo de ensaio de privação da água. A tolerância a sacarose (estresse hiperosmótico em 9,4% de sacarose) em um ensaio da germinação foi também observada em seis linhagens. Estes últimos resultados sugeriram que os superexpressores fossem mais tolerantes a outras formas de privação da água, tais

141 como, a seca e a outros estresses relativos. Esta suposição foi confirmada pelos resultados de um ensaio de secura baseado em solo como observado abaixo.

Tabela 6. G1988 (SEQ ID No..: 1 e 2 de Arabidopsis thaliana) - Promotor de fusão direto constitutivo 35S.

Linhagem	Germ.	Germ.	Germ	Crescimento	Dessecação	Germ.	Germ.	Crescim
	sacaros	ABA	. a	no frio	severa	em	em	ento da
	e		frio			pouco	pouco	raiz
						N	N +	com
							gin	pouco N
321						+	+	+
322	+					+	+	+
323						+	+	+
324							+
325	+				+
326	+				+			+
327					+	+	+
328	+					+	+	+
329	+						+	+
330	+						+	+

Germ.=germinação, gin = glutamina (+) indica o resultado positivo do ensaio/mais tolerante ou o fenótipo observado, (célula vazia) indica as plantas superexpressando G1988 na linhagem na primeira coluna eram tipo-selvagem em seu desempenho.

142

Além dos resultados experimentais mostrados na Tabela 6, mudas 35S::G1988 foram também encontradas para ser mais tolerantes ao crescimento no polietileno glicol a 3% em uma tela de tolerância ao estresse hiperosmótico baseado em PEG do que em mudas controle. Mudas 35S::G1988 mostraram um crescimento mais extensivo da raiz do que controles polietileno glicol a 3%.

Embora G1988, SEQ ID No..: 1 e 2, não conferiu tolerância aumentada ao frio em Arabidopsis neste conjunto de experiências, G1988 poderia ser capaz de conferir maior tolerância ao frio, relativo aos controles, em germinação de plantas de soja superexpressando a proteína G1988 de

Arabidopsis.

G4004 (SEQ ID No: 3 e 4 de Glicine max) - super expressada com o promotor constitutivo de CaMV 3SS.

Baseado nos resultados conduzidos até agora, superexpressores 35S::G4004 foram mais tolerantes às baixas condições do nitrogênio e demonstrada o fenótipo de sensibilidade ao C/N. Além disso, sete das linhagens

35S::G4004 executaram melhor do que as mudas do controle um ensaio de germinação sob circunstâncias frias, como evidenciado por menos acumulação de anticianina que ocorre nas plantas transgênicas, sugerindo que este gene possa

143 também ter a utilidade na melhora conferida na germinação a frio (tabela 7). As mudas em placas de germinação controle foram constatadas por possuir hipocótilos longos para sete de dez linhagens examinadas. As mudas também foram 5 constatadas por serem pequenas e atrofiadas em placas do crescimento controle; dado que estes ensaios foram executados sob a luz continua, este fenótipo foi consistente com notável atrofiamento em ensaios morfológicos. Estas plantas transgênicas foram também mais 10 tolerantes ao frio durante sua germinação do que controles, como evidenciado pela menor acumulação de anticianina que ocorre nas plantas transgênicas. (Tabela 7).

Tabela 7. G4004 (SEQ ID No.: 3 e 4 da Glicine max) Promotor de fusão direto constitutivo 35S.

Linhagem	Germ.	Germ.	Dessecação	Germ.	Germ. em pouco
	sacarose	frio	severa	Pouco N	N+ gin
301		—		+	+
302		+		+	+
303		+		+	+
304		+		+	+
305		+		+	+
306		+		+	+
307		+		+	+
308				+	+
309				+	+

144

310					+
311		+		+	+

germ. = germinação ( + ) indica resultado de ensaio positivo mais tolerância ou fenótipo observado, relativo ao controle.

(célula vazia) indica as plantas superexpressando

G1988 na linhagem da primeira coluna eram tipo-selvagem em seu desempenho.

(-) indica que um fenótipo mais sensível foi observado relativo aos controles.

Exemplo IX. Resultados do ensaio de secura em Arabidopsis e soja.

A água é o maior fator de limitação para a colheita.

Em ambientes de água-limitado, a colheita é uma função do uso da água, eficiência do uso da água (WUE; definido como o rendimento da biomassa/uso aéreo da água) e o índice da colheita (HI; a relação da biomassa do rendimento à área total da biomassa na colheita) . WUE é uma maneira que tem sido proposta como um critério para a melhoria do rendimento sob a seca.

Em um ensaio da seca em solo (um forma de ensaio de privação da água que pode ser usado para comparar WUE) , três poços-caracterizado de linhagens 35S::G1988 de

145

Arabidopsis foram examinadas. Duas destas linhagens, linhagem 10-6-3 e 12-2-2, tiveram altos níveis da expressão G1988 e hipocótilos longos exibidos, folhas levantadas, e pecíolos prolongados. Cada uma destas linhagens mostrou recuperação melhorada da seca em um dos dois ensaios executado. A terceira linhagem, linhagem 8-5-1, teve níveis inferiores de G1988 e não exibiu a morfologia característica das outras duas linhagens. Esta linhagem não mostrou nenhuma melhoria na sobrevivência, e, de fato, mal executado em um ensaio de replicata (não mostrado na tabela

8). Todavia, duas linhagens individuais foram identificadas que mostraram o desempenho significativamente melhorado da seca, e assim poderia ser selecionada nessa base para também um desenvolvimento e um uso como um produto.

Seca do solo - sumário da fisiologia baseado em recipiente de argila.

Tabela 8. Resultados dos ensaios de seca de 35S::G1988:

PID	linhagem	Tipo de proj eto	Escore seca média da linhage m	Escore seca média do controle	Valor-p para diferente s escore de seca	Meio de sobreviv ência para linhagem	Meio de sobreviv ência para controle	Valor-p para diferença em sobrevivênci a
P2499	10-6-3	DPF	3.1	2, 2	0,29	0, 55	0, 41	0, 015*

146

P2499	10-6-3	DFP	1,9	2,4	0,28	0,39	0, 37	0,81
P2499	12-2-2	DFP	2,4	2, 8	0, 58	0,41	0,48	0,28
P2499	12-2-2	DFP	2,8	2,1	0,17	0, 49	0,36	0,022*

DPF = projeto direto da fusão do promotor

Sobrevivência = proporção de plantas em cada potenciômetro que sobreviveu.

Escala de seca: 6 (a contagem a mais elevada) = nenhun sintoma de etresse, 0 (a mais baixa contagem; a maioria de efeito severo) = sintomas extremos do esforço ★ linha executada melhor do que o controle (significativo em p < 0,11).

Além das plantas de Arabidopsis, as plantas de soja superexpressandas também executou melhor do que os controles na eficiência do uso de água (WUE) em tela. O tecido foi colhido de locais secos e o índice ¹³C/¹²C foi medido após a combustão da planta e da conversão ao CO2, e a análise pela espectroscopia de massa. Com comparação com um padrão conhecido, o índice de ¹³C foi alterado de modo para indicar que o superexpressão de G1988 melhorou a eficiência do uso de água. A condutibilidade estomatal foi também medida. Na primeira experimentação de campo, três linhagens transgênicas independentes foram encontradas para terem estatisticamente a mais baixa condutibilidade significativa. Outra linhagens de soja 35S::G1988 testadas

147 também tiveram uma mais baixa condutibilidade estomatal, mas os dados obtidos com estas linhagens não foram estatisticamente significativos. As diferenças significativas na condutibilidade estomatal não foram observadas em uma subsequente experimentação de campo.

Tomado junto, a discriminação do isótopo e a análise estomatal da condutibilidade sugerem que as plantas que superexpressaram G1988 aumentaram a eficiência da transpiração, que indica a eficiência melhorada do uso da água pelas ditas plantas.

Uma análise da sobrevivência das plantas de soja superexpressando G1 988 foi executada usando um ensaio da tela seca. Quando analisado de encontro a plantas controle do tipo selvagem algumas das linhagens das linhagens transgênicas testadas mostraram significância (p<0,l) escore de risco aumentado e tempo prolongado estendendo-se a secagem e as diferenças de tempo na seca para três linhagens quando comparado aos controles, foram estatisticamente significativos (tabela 9, dados apresentados na ordem de diminuir a significância estatística). Apenas duas linhagens que pareceram mostrar mais vantagens à seca do que os controles (resultados não significativos) não expressaram G1988 a um grau significativo.

148

Tomados juntos, esses dados claramente indicam que a superexpressão de G1988, SEQ ID Nos: 1 e 2, em soja pode significativamente aumentar a tolerância a condições de déficit de água.

Tabela 9. Tempo de definhamento de controle e plantas de soja 35S::G1988.

Linhagem	Média de tempo	Média de tempo	Diferença, tempo	Valor p
	para definhamento,	para definhamento,	para definhamento
	superexpressores	controles (dias)	(dias)
	(dias)
651*	8, 867	6, 308	2, 559	0,0008
200*	7,933	6, 308	1,625	0, 0718
652*	8, 615	7,333	1,282	0, 0834
189	8,714	8,200	0, 514	0,1491
213	5,800	4,714	1,086	0, 1619
217***	6, 067	4,714	1,353	0,2022
198**	6, 938	8,200	-1,262	0,2174
206**	5, 923	6, 308	-0,375	0,3105
209	7,200	6, 308	0,892	0, 4200
178	8, 000	7, 083	0, 917	0,6613
218	7,600	7,083	0,517	0,9039

* linhagem que mostrou um tempo prolongado significante de definhamento em relação aos controles (significância em p<0,10).

★★ não expressa G1988 a um nivel significante *** expressou G1988 a um grau menor do que as linhagens transgênicas de rendimento elevado

149

Exemplo X. Resultados para tolerância ao frio em soja

Figura 7 indica os dados experimentais obtidos com uma linhagem controle do tipo selvagem e numerosas linhagens superexpressando 35S::G1988 que mostram os resultados da superexpressão G1988 melhorando a germinação no frio. A germinação total da semente do controle deste experimento de campo conduzido nos invernos, da Califórnia, representada pela linha pontilhada na Figura 7, foi fraca e foi observado que uma elevada porcentagem da semente foi semente dura, um fenômeno de estresses-induzido que resulta em sementes que resistem a inibição sob circunstâncias padrão. Uma porcentagem significativamente maior da semente superexpressando G1988 germinou em vários pontos do tempo neste experimento de campo e com a semente obtida nos experimentos conduzidos em Illinois e no Kansas.

Estes dados indicam um papel para G 1988 em superar respostas do estresse e em melhorar o crescimento celular.

G4004 (SEQ ID No: 4), um homólogo da soja G1988 que é relacionado filogeneticamente a G1988 (Figura 3 e Figuras

4A-4F) foram transformados dentro de plantas de milho. O índice de germinação das plantas de milho superexpressando

G4004 foi então determinado. O índice da germinação é uma

150 função da germinação da porcentagem e da taxa de germinação, e pode ser definido pela fórmula:

índice da germinação = [(T-Tl +1)χΡ1+(T-T2+1)x(P2-P1) + (T-T3 + 1) x (P3-P2) +...+ (T-TT+1)x PT-PT-1) ] /T onde T é o número de dias para a qual a germinação foi testada.

P 1, P2, P3,... e a PT são a porcentagem das sementes germinadas no dia Tl, T2, T3,... e T.

Como mostrado na Tabela 10, a germinação de algumas linhagens do milho superexpressando-G4004 demonstrou maior tolerância ao frio dos superexpressores em comparação às plantas controle.

Tabela 10.Dados fenotípicos de experimentos de germinação no frio das plantas de milho superexpressando G4004.

	índice de germinação
Experimento 1	Experimento 2
Linhagem	% de mudança	Valor de p	% de mudança	Valor de p
609	-14	0,145	-20	0, 073
610	-1	0,889	-8	, 0465
612	14	0, 131	13	0,242
616	25*	0,010*	41*	0,000*
619	7	0, 436	38	0, 001
710	28*	0,004*	45	0,000*
711	30*	0,002*	33	0,003*
117	-35	0,000**	-30	0,008**

151

Os dados são apresentados como a mudança de porcentagem sobre controles de tipo selvagem controles.

* índice da germinação significativamente maior do que os controles (p<0,05).

** índice da germinação significativamente menor do que os controles (p<0,05).

A presente invenção então demonstrou que a transformação de plantas, incluindo monocotilédones, com um membro de G1988 de polipeptídios pode conferir plantas transformadas com maior tolerância a condições de frio do que os níveis de tolerância ao frio exibido por plantas controle.

Exemplo XI. Resultados de experimentos de campo para a eficiência do uso de nitrogênio no milho.

Um número de plantas de milho superexpressando a sequência do polipeptídio G4004 de soja (SEQ ID No: 4) foi mais eficientes em seu uso do nitrogênio do que em plantas controle, como medido pela massa da raiz fresca e clorofila aumentada quando crescidos em uma estufa em baixos meios de nitrogênio contendo 2,0 mM de nitrato de amônio como fonte de nitrogênio (Tabela 11).

Tabela 11.Os dados fenotípicos de baixo teor de nitrogênio das plantas de milho superexpressando G4004.

152

	Clorofila da	folha	Massa fresca	da raiz
Linhagem	Experimento 1	Experimento 2	Experimento	1 Experimento
609	4,4	2,9	0,2	-2, 8
610	6, 1*	5,8*	0,5	1, 1
612	0, 9	3, 1	-9,4**	-6,2**
616	10, 8*	3, 6	2,0	-1,2
619	9,5*	6, 0*	15, 8	4, 9*
710	1, 6	5, 6*	3,1	-0,3
711	6,8*	12, 4*	7, 9*	5, 0
117	7,0	12,3*	9, 9*	3, 5

Os dados são representados como a mudança de porcentagem sobre controles do tipo selvagem.

* Valor significativamente maior do que controles em p<0,05 ★★ Valor significativamente menor do que controles em p<0,10

A presente invenção então demonstrou que a transformação de plantas, incluindo monocotiledôneas, com um membro de G1988 de polipeptídios pode conferir maior tolerância a condições de baixo nitrogênio e aumento da eficiência do uso de nitrogênio as ditas plantas transgênicas em relação às condições de tolerância de baixo nitrogênio e aumento da eficiência do uso de nitrogênio do que as plantas controle.

Exemplo XII. Rendimento melhorado em experimentos de campo de soja

153

Sequência G1 988 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID No.:

e 2), um fator de transcrição conhecido, foi mostrado para aumentar o potencial de rendimento na Glicine max (soja) . Em anos consecutivos de amplos experimentos de rendimento em campo, as plantas transgênicas constitutivamente expressando G1988 em cultivares controles de melhor qualidade, com uma média de construção maior do que 6% de rendimento aumentado. As observações do campo da soja transgênica G1988 identificaram diversas características relacionadas ao rendimento que foram modulados pelo transgene, incluindo a altura aumentada, o vigor melhorado precoce na estação e a contagem permanente estimada aumentada. As plantas da soja G1988superexpressando tiveram ligeiramente florescência precoce (menos de um dia como uma média de construção) , ligeiramente maturidade atrasada (aproximadamente um dia como uma média da construção) , e nós de contenção produzidos adicional mais tarde no fim da estação (Figura

9) .

A Tabela 12 mostra os resultados obtidos com nove linhagens 35S::G1988 de soja testadas para o amplo rendimento de solo em 2004 em dez locais nos E.U., com duas réplicas por localização. Cada réplica foi plantada em uma densidade de nove sementes por pé em duas dúzias de

154 fileiras do pé divididas por um beco de três pés. O rendimento foi gravado como alqueires por acre e comparado pela análise espacial a uma linhaqem não-transformada de controle parental. Os superexpressores G1988 mostraram o rendimento aumentado em seis de sete linhagens que mostraram a expressão significativa do transgene (Tabela

12) . Além do que no rendimento aumentado, diversas linhagens mostraram florescência mais cedo, maturidade atrasada e contagem permanente adiantada.

Tabela 12. Rendimento de plantas de soja superexpressando

35S::G1988 relativo as plantas controle em um experimento de campo em 2004.

linhagem	Rendimento	Valor de p	Expressão do mRNA
	(galão/acre)		(media normalizada)
206**	-5, 86	0, 000	19044
198**	-2,88	0, 043	63330
217***	-2, 69	0, 047	1412864
200*	0, 35	0,798	1972981
178*	2,4	0, 077	2155338
189*	2, 63	0,052	2197454
213*	3,21	0,018	2088698
209*	3, 63	0, 007	2175037
218*	4, 13	0, 002	2158073

★ mostrou aumento significativo no rendimento sobre o controle.

155 ** não expressou G1988 a um nível significativo.

★★★ expressou G1988 a um grau menor do que as linhagens transgênicas de rendimento aumentado.

Várias linhagens de plantas de soja transgênicas superexpressando G1988 (35S::GI988) foram também crescidas em experimentos de campo em 2005. Tanto em 2004 e em 2005, a média, as plantas de soja G1988 superexpressando foram um tanto mais altas do que as plantas do controle. Quando os dados do rendimento foram calculados a média através das posições múltiplas, um aumento consistente no rendimento nos alqueires por acre, em comparação à linhagem parental foi observado para ambos os anos (Figura 6). No experimento de campo em 2005, a superexpressão G1988 aumentou significativamente o rendimento em 17 de 19 locais testados. Se a linhagem mostrada como a linhagem 4 na

Figura 6, a qual ao contrário de outras linhagens apresentadas no gráfico da Figura 6 mostrou quase nenhuma expressão de G1988 no tecido da folha, foi removida da análise estatística, o aumento médio do rendimento em 2005 foi aproximadamente 6,7%.

A análise do rendimento da soja através de três anos de experimento de campo mostrou que G1988, quando superexpressado em numerosas linhagens transgênicas foi

156 capaz de conferir rendimento aumentado em relação aos controles (Tabela 13).

Tabela 13. Analise através dos anos do rendimento de soja de linhagens transgênicas superexpressando G1988.

Linhagem	Rendimento	Diferença relativa	% diferença	Valor de
da	(alqueire/acre)	ao controle		P
planta		(alqueire/acre)
178*	63,8	+ 3, 9	6, 5	0,000
189*	63, 6	+ 3, 7	6,1	0, 000
209*	63, 0	+ 3, 1	5,2	0, 001
218*	62, 8	+ 2, 9	4,9	0, 001
213*	62, 6	+ 2,7	4,5	0, 001
200*	62,2	+ 2, 3	3, 9	0, 007
217***	59, 8	-0,2	-0, 3	0, 827
206**	58,1	-1, 8	-3,1	0, 031

★ aumento significativo mostrado no rendimento sobre controles.

** não expressou G1988 a um nível significativo.

*** expressou G1988 a um grau mais baixo do que linhagens transgênicas de rendimento elevado.

A tabela 14 demonstra, contudo os outros meios pelo os quais a superexpressão de G1988 pode aumentar o rendimento em plantas de soja. Nesta tabela, a contagem final permanente de plantas transgênicas e do controle de ambos os dados de plantações adiantadas e atrasadas foi

157 comparada. As linhagens de rendimento elevado demonstraram uma contagem final permanente significativamente maior do que a linhagem de controle testada sob as mesmas circunstâncias. Em numerosos exemplos estes resultados foram significativos em p < 0,05.

Tabela 14. Analise através dos anos de rendimento de soja de linhagens transgênicas superexpressando G1988.

Tempo de	Linhagem	Grupo final	% Florescimento	Diferença de	Valor
plantaçã		(plantas por		plantas controle	de p
O		lote)		(#plantas)
Cedo	178	151	70	16	0, 05*
Cedo	189	147	68	11	0, 15
Cedo	200	146	67	7	0,40
Cedo	206**	141	65	4	0,65
Cedo	209	139	64	2	0,84
Cedo	213	150	69	16	0,05*
Cedo	217***	142	66	6	0,45
Cedo	218	157	73	28	0,001*
Cedo	Controle	134	62	0
Tarde	178	168	78	19	0,009*
Tarde	189	161	74	14	0,04*
Tarde	200	162	75	17	0, 01*
Tarde	206**	152	71	5	0, 42
Tarde	209	157	73	12	0,08*
Tarde	213	164	76	18	0, 01*
Tarde	217***	153	71	4	0, 56

158

Tarde	218	162	75	19	0,008*
Tarde	Controle	153	71	0

* significância em p<0,05.

** não expressou G1988 a um nível significativo.

★★★ expressou G1988 a um grau mais baixo do que linhagens transgênicas de rendimento elevado.

Figura 11 mostra os resultados de uma experimento de campo da densidade de planta. As plantas de soja representadas nesta figura que superexpressaram G1988 demonstraram um aumento perceptível do rendimento através de uma ampla escala de densidades de planta relativo às plantas do controle que não superexpressaram G1988 (mostrado como os círculos não preenchidos), ou as plantas transgênicas controle que não expressaram G1988 a um grau significativo (mostrado como os círculos preenchidos).

Cinco linhagens de superexpressores são representadas pelos triângulos não preenchidos, por triângulos preenchidos, por quadrados não preenchidos, por quadrados preenchidos e por asteriscos. Segundo as indicações desta figura, cada um das cinco linhagens que expressam G1988 a um grau significativo forneceu um rendimento maior do que os controles em todas as densidades testadas, e assim, a

159 contagem do grupo da planta não teve grande contribuição no rendimento cultiváveis.

Uma possível explanação para o aumento no rendimento da soja é um aumento dos nós em relação às plantas controle que não superexpressaram o polipeptídio G1988., como mostrado na figura 9, quando as várias linhagens de plantas de soja superexpressando um número de sequências foram comparadas, uma escala considerável do número médio de nós relativo à linhagem do controlo parental foi observada (a diferença observada para a linhagem controle foi 0 , e portanto é representado na Figura 9 pela linhagem da ordenada 0). As barras hachuradas denotam as linhagens

superexpressando	G1988,	que	produziram mais	nós do que o
controle,com as	quatro	das	cinco linhagens	produzindo a
diferença positiva maior	nos	nós observados.

A presente invenção demonstra assim que as plantas transgênicas, incluindo leguminosa, e incluindo particularmente soja, transformadas com um membro de G1988 polipeptídio podem mostrar o rendimento aumentado relativo ao rendimento exibido por plantas do controle.

Exemplo XIII. Utilidades de G1988 e suas sequências filogeneticamente-relacionadas para melhorar o rendimento.

Tolerância ao estresses abiótico aumentada pode melhorar o rendimento.

160

G1988 também melhorou a tolerância do estresse em

Arabidopsis e as experiências adiantadas mostraram que os homólogos estreitamente relacionados de G1988 também conferiram tolerância ao estresse abiótico melhorado relativo aos controles para condições, tais como, pouco nitrogênio ou frio. A tolerância do esforço abiótica melhorado pode ter um impacto significativo no rendimento incluindo durante períodos consideráveis de estresses suaves e moderados.

Diâmetro do caule aumentado pode melhorar o rendimento.

diâmetro do caule aumentado pode positivamente impactar a biomassa de uma planta e também fornece a resistência aumentada ao alojamento.

Mais enraizamento secundário pode melhorar o rendimento.

Fornecendo o maior enraizamento secundário pela transformação de plantas com sequências membros do ciado

G1988 podem conferir melhor ancoragem relativo às plantas do controle. As plantas transformadas podem também ser produzidas tendo uma capacidade para prosperar em solos de outra maneira improdutivos, como em ambientes com poucos nutrientes ou nas regiões ou nos períodos de pouca disponibilidade de água. A tolerância osmótica do estresses

161 pode também ser mediada pelo crescimento aumentado da raiz. Estes fatores aumentam a escala de plantio de eficiência da colheita e/ou aumentam a sobrevivência e o rendimento.

Números aumentados de nós do tronco principal podem melhorar o rendimento.

número de nós do tronco principal de uma variedade de colheitas é relacionado ao rendimento produzido pela planta. Por exemplo, a soja e outras colheitas da sementesustentada produzem vagens de semente-sustentada de seus nós do tronco principal , e assim, aumentando o número de nós do tronco principal tendo um impacto positivo no número de sementes produzidas pela planta. 0 maior número de nós do tronco principal pode também aumentar a biomassa ou o rendimento de outras colheitas, tais como, algodão,

onde o conjunto de cápsulas	está relacionado	ao número	de
nós do tronco principal .
Sensitividade da luz	reduzida pode	melhorar	o
rendimento.
A luz exerce sua influência em muitos	aspectos	do

crescimento e do desenvolvimento da planta, incluindo germinação, amadurecimento e tempo de florescimento. Ά luz provoca a inibição de alongamento do hipocótilo junto com o esverdeamento nas mudas novas. Assim, as diferenças do comprimento do hipocótilo são uma boa medida da

162 compreensibilidade a luz. As mudas superexpressando G1988 exibiram hipocótilos alongados na luz devido à inibição reduzida de alongamento do hipocótilo .Os superexpressores G1988 foram também hiposensitivos aos comprimentos de onda azuis, vermelhos e próximo do-vermelho, indicando que G1988 atua a jusante dos fotorreceptores responsáveis para perceber as diferentes cores de luz. Este descobrimento indicou que as plantas adultas superexpressando G1988 tinham reduzido a sensibilidade à luz incumbente.

Homólogos estreitamente relacionados de G1988 do milho (G4000, SEQ ID No: 8), de soja (G4004, SEQ ID No: 4), arroz (G4012), e tomate (G4299, SEQ ID No: 22), também conferem hipocótilos longos quando superexpressados em Arabidopsis.

Nas experiências conduzidas até aqui, a superexpressão do homólogo de soja-derivado G4005, (SEQ ID No: 6) não fizeram com que os hipocótilos longos nas linhagens fossem produzidos, mas G4005 conferiu outras indicações de uma resposta de luz alterada, tais como, peciolos e as folhas eretas. Assim, há uma forte correlação entre G1988 e seus ortólogos do milho, soja, arroz e do tomate em sua habilidade de reduzir a sensibilidade a luz e estes dados indicam que G1988 e seus homólogos estreitamente relacionados funcionam similarmente nos caminhos da sinalização envolvidos na sensibilidade da luz. Prevê-se

163 assim que, como G1988, os homólogos estreitamente relacionados do membro G1988 podem também melhorar as características que podem ser afetadas pela sensibilidade a luz reduzida. A sensibilidade a luz reduzida pode contribuir para melhorias no rendimento em relação as plantas do controle.

Maior crescimento do amadurecimento adiantado pode melhorar o rendimento.

Para quase todas as colheitas comerciais, é desejável usar plantas que estabelecem rapidamente, visto que as mudas e as plantas novas são particularmente suscetíveis às condições do estresses, tais como, a salinidade ou a doença. Desde que muitas ervas daninhas podem livra-se de colheitas novas ou para competir com os nutrientes, também seria desejável determinar meios para permitir que as plantas de colheita novas venham a competir com espécie de erva daninha. Aumentando o vigor da muda e da planta crescente permite para as colheitas a ser plantado mais cedo na estação com menos interesse para as perdas devido aos fatores ambientais.

Maior vigor atrasado na estação pode melhorar o rendimento.

A expressão constitutiva de G1988 melhorou significativamente o crescimento e o vigor da soja. Os

164 superexpressores de G1988 tiveram um aumento em nós do tronco principal , na maior altura de planta e em aumentos consistentes no revestimento da cúpula tardia na estação. O controle relativo destas diferenças ou plantas nãotransformadas podem ter tido um impacto positivo significativo no rendimento.

Por causa da morfologia observada, as similaridades fisiológicas e do estresses de tolerância entre G1988 e seus homólogos próximo-relacionados, membros do polipeptídio G1988, incluindo sequências apresentadas na

Tabela 1 e lista de sequência, são esperadas para aumentar o rendimento, a qualidade da colheita, e/ou a escala do crescimento e diminuição do uso de fertilizantes e/ou uso de água em uma variedade de colheitas de plantas, em plantas decorativas e nas plantas arborizados usadas na alimentação, ornamentação, papel, polpa, madeira serrada ou em outras indústrias.

Exemplo XIV. transformação dos eudicotiledóneas para produzir rendimento aumentado e/ou a tolerância ao estresses abiótico.

Espécie de colheita que superexpressam polipeptídios da invenção podem produzir plantas com privação da água, frio e/ou tolerância de nutrientes e/ou rendimento aumentados em circunstâncias de estresses e não-estresses.

165

Assim, as sequências do polinucleotídeo listado na listagem de sequência recombinada, por exemplo, em um dos vetores de expressão da invenção ou de um outro vetor de expressão apropriado, pode ser transformada dentro de uma planta a 5 fim de modificar caracteristicas da planta com a finalidade de melhorar o rendimento e/ou a qualidade. 0 vetor de expressão pode conter um constitutivo, promotor de indução ou tecido-especifico operativamente ligado ao polinucleotídeo. 0 vetor de clonagem pode ser introduzido em uma variedade de plantas por meios conhecidos na arte como, por exemplo, transferência direta do DNA ou transformação mediada por Agrobacterum tumefaciens. É agora rotina para produzir plantas transgênicas usando a maioria de plantas de eudicotiledóneas (ver, Weissbach e Weissbach (1989); Gelvin e outros (1990); Herrera-Estrella e outros (1983); Bevan (1984); e Klee (1985)). Os métodos para a análise das características são rotineiras na arte e os exemplos são divulgados acima.

Os numerosos protocolos para a transformação de plantas do tomate e da soja têm sido descritos previamente, e são conhecidos no art. Gruber e outros (1993), em Glick e

Thompson (1993) descrevem diversos vetores de expressão e métodos de cultura que podem ser usados para a transformação celular ou do tecido e a subsequente

166 regeneração. Para a transformação de soja, os métodos são descritos por Miki e outros (1993); e na patente US. no.

5.563.055, (Townsend e Thomas), concedida em 8 de outubro de 1996.

Há um número importante de alternativas aos protocolos de transformação mediada por Agrobacterium, outros métodos com a finalidade de transferir genes exógenos em soja ou em tomates. Um método é a transformação mediada por microprojéteis, em que o DNA na superfície de partículas microprojéteis é impulsionado em tecidos de planta com um dispositivo biolistico (ver, por exemplo, Sanford e outros (1987); Christou e outros (1992); Sanford (1993); Klein e outros (1987); patente US. no. 5.015.580 (Christou e outros), concedida em 14 de maio de 1991; e patente US. no.

5.322.783 (Tomes e outros), concedido em 21 de junho de

1994) .

Alternativamente, métodos do sonicação (ver, por exemplo, Zhang e outros (1991)); tomada direta do DNA nos protoplastos usando a precipitação do CaCl₂, álcool de polivinil ou poli-L-ornitina (ver, por exemplo, Hain e outros (1985); Draper e outros (1982)); fusão de lipossoma ou de esferoplasto(veja, por exemplo, Deshayes e outros (1985); Christou e outros (1987)); e eletroporação dos protoplastos e células e tecidos inteiros (ver, por

167 exemplo, Donn e outros (1990); D' Halluin e outros (1992);

e Spencer e outros (1994)) foram usados para introduzir o DNA estrangeiro e os vetores de expressão em plantas.

Após uma planta ou célula vegetal ser transformada (e a célula vegetal hospedeira transformada a seguir regenerado dentro da planta), a planta transformada pode ser cruzada com a própria ou uma planta da mesma linhagem, transformada ou uma planta tipo selvagem ou uma outra planta transformada de uma planta de linhagem transgênica diferente. 0 cruzamento fornece vantagens de produzir variedades transgênicas novas e frequentemente estáveis.

Genes e as características conferidas que foram introduzidas em uma linhagem de tomate ou de soja pode ser movido na linhagem distinta de plantas que usam as técnicas da arte.

tradicionais de cruzamento conhecidas

Transformação de plantas de tomate podem ser conduzidas usando os protocolos de Koornneef e outros (1986), e patente US 6.613.962, este último descrito no sumário aqui.

Oito tecidos de cotilédone de 8 dias de idade são precultivados por 24 horas em placas de Petri que contêm uma camada do alimentador celular da suspensão de Petúnia hybrida plaqueadas no meio do MS com o 2% (p/v) de sacarose e 0,8% de ágar suplementado com 10 μΜ de ácido acético oínafitleno e 4,4 μΜ de 6 - benzilaminopurina. Os tecidos

168 então são infectados com uma cultura da noite para o dia diluída de Agrobacterium tumefaciens que contêm um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da invenção por

5-10 minutos, marcado a seco no papel de filtro estéril e cocultivado por 48 horas nas placas originais da camada do alimentador. As condições da cultura são como descritas acima. As culturas de um dia para o outro de Agrobacterium tumefaciens são diluídas no meio líquido do MS com sacarose de 2% (p/v/), o pH 5,7) a um OD₆₀o de 0,8.

Depois da cocultivação, os tecidos do cotilédoneas são transferidos as placas de Petri com meio de inclusão médio seletivo do MS com zeatina de 4,56 μΜ, vancomicina de 67,3 μΜ, cefotaxime de 418,9 μΜ e o sulfato do canamicina de

171, 6 μΜ, e cultivados sob as condições da cultura descritas acima. Os tecidos são subcultivados a cada três semanas em meio fresco. Os caules emergentes são dissecados do calo subjacente e transferidos aos frascos de vidro com meio seletivo sem zeatina para forma as raízes. A formação de raízes em um meio de contenção de canamicina é uma indicação positiva de uma transformação bem sucedida.

A transformação de plantas de soja pode ser conduzida usando os métodos encontrados dentro, por exemplo, da patente US 5.563.055. (Townsend e outros, concedida em 8 de outubro de 1996), descrita no sumário aqui. Neste método a

169 semente de soja é esterilizada em sua superfície pela exposição ao gás de cloro evolvido em um frasco de sino de vidro. As sementes são germinadas pelo plaqueamento em ágar 1/10 de meio solidificado sem os reguladores de crescimento da planta e cultivado em 28°C. com um comprimento de um dia de 16 horas. Após três ou quatro dias, a semente pode ser preparada para o cocultivação. O revestimento da semente é removido e a pequena raiz de prolongamento removida de 3-4 mm abaixo dos cotilédones

As culturas de um dia para o outro dos Agrobacterium tumefaciens que abrigaram o vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da invenção são crescidas em fase log, agrupadas e concentradas pela centrifugação. As inoculações são conduzidas nos grupos, tais que, cada placa da semente foi tratada com um pelete recentemente ressuspendido de Agrobacterium. Os peletes são ressuspendidos em 20 ml de meio de inoculação. A inoculação é colocada dentro de uma placa de Petri que contem a semente preparada e os nós cotiledôneos são macerados com uma lâmina cirúrgica. Após 30 minutos os tecidos são transferidos às placas do mesmo meio que foram solidificados. Tecidos são embebidos com o lado adaxial acima e ao nível com a superfície do meio e cultivado em 22°C. por três dias sob a luz fluorescente branca. Estas

170 plantas podem então ser regeneradas de acordo com métodos bem conhecidos na arte, como mover os tecidos após três dias para um meio liquido de seleção (ver, patente US

5.563.055).

Os tecidos podem então ser cortados, embebidos e cultivado no meio de selação solidificado. Após um mês de meio seletivo no tecido transformado torna-se visível como setores verdes do tecido da regeneração de encontro a um fundo do tecido descorado, menos saudável. Tecidos com setores verdes são transferidos a um meio de alongamento. A cultura é continuada neste meio com transferências às placas frescas cada duas semanas. Quando os caules estão com 0,5 cm do comprimento podem ser extirpados na base e ser colocados em um meio de enraizamento.

Exemplo XV: transformação dos monocotilédeos para produzir rendimento ou tolerância ao estresses abiótico aumentado

As plantas do cereal como, mas não limitado a, milho, trigo, arroz, sorgo ou cevada, podem ser transformadas com as sequências presentes do polinucleotídeo, incluindo monocotiledôneas ou sequências derivadas de eudicotiledóneas, tais como, aqueles apresentados nas tabelas atuais, clonados em um vetor, tal como, pGA643 e contendo um marcador de resistência a canamicina e expressados constitutivamente abaixo, por exemplo,

171 promotores CaMV 35S ou COR1 5, ou com os de indução ou tecidos-específicos. Os vetores de expressão podem ser encontrados na lista da sequência, ou qualquer outro vetor de expressão apropriado pode similarmente ser usado. Por exemplo, pMEN020 pode ser modificado para substituir a região de codificação de NptH com o gene da BAR de

Streptomyces hygroscopicus que confere resistência ao f osf inotricina. Os locais Kpnl e de Bglll do gene Bar são removidos pela mutagenese local-dirigido com as mudanças silenciosas do códon.

O vetor de clonagem pode ser introduzido em uma variedade de plantas do cereal por meios conhecidos na arte que inclui transferência direta de DNA ou a transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. A última aproximação pode ser realizada por uma variedade de meios, incluindo, por exemplo, aquele da patente US no. 5.591.616, em que o calo de monocotiledôneas é transformado contactando o tecido de diferenciação com a Agrobacterium que contem o vetor de clonagem.

Os tecidos da amostra são imersos em uma suspensão de 3xl0^-9 células de Agrobacterium que contêm o vetor de clonagem por 3-10 minutos. O material do calo é cultivado no meio sólido em 25° C na obscuridade por diversos dias. O calo crescido neste meio é transferido ao meio da

172 regeneração. Transferências são continuadas cada 2-3 semanas (2 ou 3 vezes) até que se tornem caule. Os caule são transferidos então ao meio do alongamento de caule cada

2-3 semanas. Os caule de vista saudáveis são transferidos ao meio de enraizamento e depois que se tornam raizes, as plantas são colocadas no solo úmido.

As plantas transformadas são analisadas então para a presença da resistência do gene de resistência a canamicina NPTII por ELISA, usando o kit ELISA NPTII de 5Prime-3Prime

Inc. (Boulder, CO) .

É também rotineiro o uso de outros métodos para produzir plantas transgênicas das principais colheitas de cereais (Vasil (1994)) como o milho, trigo, arroz, sorgo(Cassas e outros (1993)), e cevada (Macilento e

Lemeaux (1994)). Os métodos de transferência de DNA, tais como, o método microprojéties podem ser usados para o milho (Fromm e outros (1990); Gordon-Kamm e outros (1990); Ishida (1990)), trigo (Vasil e outros (1992); Vasil e outros (1993); Weeks e outros (1993)), e arroz (Christou (1991);

Hiei e outros (1994); Aldemita e Hodges (1996); e Hiei e outros (1997)). Para a maioria de plantas de cereais, as células embriogênicas derivadas dos tecidos imaturos do escutelo são os alvos celulares preferidos para a transformação (Hiei e outros (1997); Vasil (1994)). Para a

173 transformação de células embriogênicas de milho derivadas do tecido escutelar imaturo usando o bombardeio de microprojéteis, o genótipo A188XB73 é o genótipo preferido (Fromm e outros (1990); Gordon-Kamm e outros (1990)). Depois do bombardeamento por microprojéteis os tecidos são selecionados na fosfinotricina para identificar as células embriogênicas transgênicas (Gordon-Kamm e outros (1990)) . As plantas transgênicas das células de planta hospedeira transformadas podem ser regeneradas por técnicas padrão da regeneração para o milho (Fromm e outros (1990); GordonKamm e outros (1990)).

Exemplo XVI: Expressão e análise da tolerância ao estresse abiótico e rendimento aumentado na espécie não de

Arabidopsis

Desde os homólogos estreitamente relacionados de

G1988, derivados das várias espécies diversas de plantas, que tem sido superexpressada em plantas tendo as mesmas funções de rendimento aumentado conferenciando, morfologias similares, redução a sensibilidade a luz e aumentando a tolerância abiótica do estresses, incluindo a tolerância ao frio durante a germinação e baixas condições de nitrogênio, é esperado que estruturalmente os ortólogos similares de sequência do polipeptidio G1988, incluindo aqueles encontrados na lista da sequência, podem conferir

174 rendimento aumentado, e/ou tolerância aumentada a um número de estresses abióticos, incluindo a privação da água, frio, e baixas condições do nitrogênio, relativo às plantas controle. Porque as sequências da invenção foram mostradas ao rendimento de aumento ou melhoram a tolerância do estresses em uma variedade de espécies da planta, igualmente espera-se que estas sequências aumentarão o rendimento da colheita ou da outra espécie de planta comercialmente importante.

A análise de northblot, RT-PCR ou a análise do microarray das plantas regeneradas, transformadas podem ser usadas para mostrar a expressão de um polipeptídio ou a invenção e os genes relativos que são capazes de induzir a tolerância do estresses abiótico e/ou tamanho maiores.

Após uma planta de eudicotiledóneas, planta de monocotiledone ou célula vegetal tenham sido transformadas (e a última célula hospedeira da planta regenerada dentro de uma planta) e mostrada para ter o maior tamanho, densidade de plantação melhorada, isto é, capaz de tolerar a maior densidade de plantação com um aumento coincidente no rendimento, melhorado vigor do amadurecimento adiantado da estação, ou a tolerância melhorada ao estresse abiótico, ou produz maior rendimento relativo a uma planta do controle sob as circunstâncias de estresse, a planta

175 transformada de monocotiledônea pode ser cruzada com a própria ou uma planta da mesma linhagem, não-transformada ou planta monocot iledônea do tipo selvagem ou uma outra planta monocotiledônea transformada de uma diferente linhagem transgênica de planta.

A função dos polipeptidios específicos da invenção, incluindo ortólogos estreitamente relacionados, foi analisada e pode também ser caracterizada e incorporado em plantas de colheita. A superexpressão ectópica destas sequências podem ser elementos reguladores específicos regulados da utilização constitutiva, indizíveis ou do tecido. Os genes que foram examinados e mostrados para modificar características da planta (incluindo o rendimento crescente e/ou a tolerância abiótica do estresse) codificam os polipeptidios encontrados na lista da sequência. Além do que estas sequências, espera-se que as sequências recentemente descobertas do polinucleotídeo e do polipeptídio estreitamente relacionadas às sequências do polinucleotídeo e do polipeptídio encontradas na lista da sequência podem também conferenciar alteração das características em uma maneira similar às sequências encontradas na lista da sequência, quando transformado em algumas das variedades consideráveis de plantas de espécies diferentes e de incluir dicotiledôneas e monocotiledôneas.

176

As sequências do polinucleotídeo e do polipeptídio derivados dos monocotiledôneas (por exemplo, as sequências do arroz) podem ser usadas para transformar plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas, e aqueles derivados dos dicotiledôneas (por exemplo, os genes de Arabidopsis e de soja) podem ser usadas para transformar um ou outro grupo, embora se espere que algumas destas sequências irão melhor funcionar se o gene for transformado em uma planta do mesmo grupo que aquele de que a sequência é derivada.

Como um exemplo de uma primeira etapa para determinar a tolerância a privação-relacionada da água, sementes destas plantas transgênicas pode ser sujeitadas aos ensaios de germinação à sacarose da medida que detecta, dessecação severa ou seca. Os métodos para a detecção da sacarose, a dessecação severa ou os ensaios da seca são descritos acima. As plantas superexpressando as sequências da invenção podem ser encontradas para ser mais tolerantes à sacarose elevada tendo a melhor germinação, as pequenas raízes mais longas e mais expansão dos cotilédones.

As sequências da invenção, isto é, membros G1988, podem também ser usadas para gerar plantas transgênicas que são mais tolerantes às baixas condições de nitrogênio ou frio do que as plantas controle.

177

Todas estas tolerâncias abióticas do estresses conferidas por G1988 podem contribuir ao rendimento aumentado de plantas disponíveis no comércio. Entretanto, superexpressores G1988 tem sido mostrado para aumentar o rendimento de plantas na ausência aparente significativa do estresse abiótico óbvio, como evidenciado incluindo a altura aumentada, adiantado amadurecimento aumentado da estação e contagem estimada do grupo e diminuída cobertura da cúpula na estação de amadurecimento observada nas plantas da soja superexpressando G1988. Assim, espera-se assim que os membros G1988 irão melhorar o rendimento nas plantas em relação às plantas controle, incluindo na espécie leguminosa, mesmo na ausência de evidentes esforços abióticos.

Plantas que são mais tolerantes do que os controles para ensaios de privação a água, condições de baixo nitrogênio ou o frio são mais verdes, mais vigorosas e terão melhores taxas de sobrevivência do que controles, ou se recuperarão melhor destes tratamentos do que as plantas controle.

Espera-se que os mesmos métodos podem ser aplicados para identificar outras sequências úteis e valiosas do presente polipeptídio e as sequências podem ser derivadas de diversas escala de espécie.

178

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Todas as publicações e pedidos de patente mencionadas neste relatório são incorporadas aqui pela referência à mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individualmente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado pela referência.

A presente invenção não é limitada pelas incorporações específicas descritas aqui. A invenção agora está sendo descrita inteiramente, e será aparente a uma pessoa com habilidade ordinária na arte que muitas mudanças e modificações podem ser feitas a este sem afastar do espírito ou do escopo das reivindicações.

As modificações que se tornam aparentes da descrição e figuras do acompanhamento anteriores caem dentro do escopo das reivindicações seguintes.

1/3

Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para produzir uma planta transgênica de soja tendo uma característica modificada em relação a uma planta controle caracterizado pelo fato de que as etapas do método compreendem:

   (a) fornecer um constructo de expressão compreendendo um polinucleotídeo recombinante codificando um polipeptídeo compreendendo um domínio dedo de zinco de caixa-B da SEQ ID NO: 2; e (b) introduzir o constructo de expressão em uma planta alvo de soja para produzir a planta transgênica;

   em que quando o polipeptídeo é ectotopicamente expresso em uma planta, o polipeptídeo confere a característica alterada em relação a uma planta controle, e, em que a característica é selecionada do grupo que consiste em: vigor melhorado na estação final; aumento nos nós de haste principal de poda; maior cobertura do dossel da temporada tardia; e aumento do comprimento do internodo.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa (c) de identificar a planta transgênica pela seleção da planta transgênica que superexpressa o polipeptídeo ou selecionar a planta transgênica que tem uma característica alterada em relação à planta controle.

   3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ainda a SEQ ID NO : 57. 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica é uma eudicotiledônea. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1,

   Petição 870170103501, de 29/12/2017, pág. 32/33

   2/3 caracterizado pelo fato de que o constructo de expressão compreende ainda um promotor constitutivo, induzível ou tecido-específico que regula a expressão do polipeptídeo.

   6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a etapa de autofertilização e cruzamento da planta transgênica com ela própria ou outra planta, respectivamente, para produzir uma semente transgênica.

   7. Vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo caracterizado por um dedo de zinco B-box da SEQ ID NO: 2, operacionalmente ligada a uma sequência regulatória para expressão ectópica numa célula vegetal, em que o polipeptídeo é expresso em uma planta transgênica de soja ou parte da planta para fornecer uma característica alterada em relação a uma planta controle.

   8. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a característica alterada é selecionada do grupo consistindo de uma porcentagem reduzida de semente dura; um maior diâmetro de caule; contagem de plantas aumentada; vigor de final de estação melhorado; e maior cobertura de copa no final da estação.

   9. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ainda a SEQ ID NO: 57.

   10. Constructo de expressão caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, em que o constructo de expressão é compreendido em uma planta transgênica de soja ou parte dessa planta.

   Petição 870170103501, de 29/12/2017, pág. 33/33

   1/17 rí

   FAGALES

   CUCURBITALES

   ROSALES

   FABALES

   OXALIDALES

   MALPIGHIALES

   SAPINDALES

   MALVALES

   BRASSICALES

   MYRTALES

   GERANIALES

   DIPSACALES

   ASTERALES *— APIALES — AQUIFOLIALES SOLANALES LAMIALES

   GENTIANALES GARRYALES

   -ERICALES _

   -CORNALES

   -SAXIFRAGALES

   -SANTALALES

   -CARYOPHYLLALES

   -PROTEALES

   -RANUNCULALES r—ZINGIBERALES ~ Π- COMMELINALES

   POALES ARECALES PANDANALES LILIALES DIOSCOREALES ASPARAGALES ALISMATALES _ ACORALES PIPERALES MAGNOLIALES LAURALES CERATOPHYLLALES

   FIGURA 1 w

   a

   Ω

   Ή ω

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   Ή

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   Ω

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   Η

   Ο υ

   ί

   MAGNOLIDEAS EUDICOTILEDÓNEAS

   DICOTILEDÓNEAS

   2/17 asterídea I asterídea II I— asterídea III — asterídea IV _asterídea V r rosídea I'

   L rosídea II _ rosídea III — caryophylidade _hamamelidae I — hamamelidae II — ranunculidae

   Solanaoeae (tomate, pimenta, berinjela) Rubiaceae (café)

   Asteraceae (girassol, alface)

   Cucurbitaceae (melão) Leguminoseae (alfafa, feijão) Rosaceae (pêssego, cereja, maçã) Salicácea (choupo) r* paleoherbs II L Magnoliales — monocotiledônea _ Laurales —paleoherbs I — Gnetales

   Malvaceae(algodão) Sterculiceae (cacau) Brassicaceae(Arabdcpsis) Chenopodiaceae (beterraba, espinafre)

   Rutaceae (cítricos)

   Gramineae(milho , trigo, arroz)

   Musaceae (banana) Lilaceae

   - coníferas Pinaceae (pinheiro)

   - Gingko . cycads

   -samambaia, musgo e outras plantas sem semente . chlorophyta “algae”

   FIGURA 2
3. 3/17

   98 76 100 751- 72 82 97

   GID SEQID Espéc G4011 14 Os G4012 16 Os G4000 8 Zm G1988 2 At G4007 10 Cs G4004 4 Gm G4005 6 Gm G4009 12 Pt G4019 44 Gm G1478 32 At G1929 36 At G4015 40 Gm G4014 38 Gm G4016 42 Gm G1481 34 At G900 26 At G1261 30 At G910 28 At

   FIGURA 3
4. 4/17

   Μ 0 Μ οσΐΜΓ*Γ*·<Λοο^·ιη

   ΟΗΗΟΙΟΟΟΟΟΟ

   ΟΟΟΝΟΟΦΟΟ ο ο ο ο 0 ο ο 0 0

   00 Ό· (Μ ω η <η •μ* >w> «μ* «τ η ω Η 00 Γ* Ο ^J· ’ί Η «Η 0 0 0

   G1929 (36) MCRGLNNEESRRSDGGGCRSLCTR-PSVPVRCELCDGDASVFCEADSAFLCRKCDRWVHG G4019 (44) MCKGAEGEKQHGFCSSFLHKECAT--RSATCj3ELCGLOASLYCQADDAYLCRKCDKRVHE

   FIGURA 4a
5. 5/17

   ΕΗ

   I

   I

   I

   I

   I

   I

   I

   I

   I

   I

   C0 C0 03 CO C0 R w

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   Η CO CO W C0 W W wQQ co co m n co 0 0 co

   CO CO CO CO CO Eh 0 CO CO < 52

   15199

   I CO I CO Q

   I Q I tf tf

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   I

   I

   CO

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   CO CO CO CO

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   2 tf A Η W Eh A l H Q tf 0 0 0 0 1 CO CO CO CO CO H tf > H tf tf tf tf tf tf 2 H 0 0 §4 0 sss³* asa

   Ol8 SZ tf tf CO CO tf CO «o tf O 0 o 0 u A H H A > pd CO CO tf tf A A > > H u u ü ü y > < e* co « CO H Eh 0 U 0 0 _ ããããã ââââAAA^H tftftftftftftftftf

   9§9§99§9§ x-»VD 00 i-H

   Η Η H CN

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   000000000

   00 Φ OJ v> ** n cn ω tn 4

   Ί» Η 00 Λ o» i-H 00 Γ~ CM rH 0 4 4^0 4 H ι-t rl 4 0 0 0 0 0

   FIGURA 4b
6. 6/17

   0ΟΟ0Η

   W M CO gí m 0« CM CM ο ο m cm Η Η α ω μ ω Λ « ω w co ζ co co w W WWÓ UWK« W CO Q fa SX Λ co co •5 Κ Η EH CO CO C0 d W{/) WM W W cq > ρ« to ω co co ω <Ο>ΗΗ>>>

   ίοωωωυυυϋϋ

   S99§8SS95êí

   COrMi-li-»r-lrMOI^V>

   101 Η Ο “ ' « Η co co otNrir^r-oico^in

   Or-trMO^OOQOOO

   ΟΟΟΓΊΟΟΛΟΟ

   ÜOÜÜOÜÜÜO

   CO Μ· Ol V> M» <n cncn n *í *H CO «Λ «Λ τΗ «0 Γ* CM rH O M· M* OV O H rl rl 0 0 0 0 0

   FIGURA 4c
7. 7/17

   Οιβι&ΟιΡιΡιΕ-ιΑΟι ο

   Η

   S « agga 3

   Odd wm ' -ii _ _π I 55 55 ω Ej 4 co ω agsss êjsêssssesss» §

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   00 *3· <n <*>

   τΗ i-l 00 Ο Ό· « «H 0 O

   G1478 (32) IR— G1929 (36) VT-G4019 (44) NINW

   FIGURA 4d
8. 8/17

   23U ο

   £ cu w δ tf >

   «V ω η h . £ tf S tf tf l Q Q | Q Q

   OOON/><^z> H HrlN^W

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   OOOOOOÜOO «§m

   Q Q H > H O W S 6 Ed q α ι ι i I I I I I

   CO C\l vo «J· φ h co οι σι i-l co r* cm «h ο φ φ σι o <frldrW <50000

   FIGURA 4e
9. 9/17

   G4000 (8) -------------G4012 (16) -------------G4011 (14) ALGGPHVSDTARQK G4297 (18) QGPHPSATTCGRRG4007 (10) -------------G4009 (12)-------------G1988 (2) -------------G4004 (4) -------------G4005 (6) -------------G4014 (38)-------------G1481 (34)-------------G1478 (32)-------------G1929 (36)-------------G4019 (44) -------------FIGURA 4f
10. 10/17 (9ΛΒ) OVdS

    FIGURA 5
11. 11/17

    1 1 1 1 ~ΓΊ 1 1 κι TT 1 1 1 1 1 1 — -\iy— — sssl rs — ^y k\sl — K\S JSSJ — 'Sy Rx\l £33 — Çy 1 1 1 1 kVJ 1 1 1......1 l l l l 1 1 1 1

    o in ο ιο ο ι

    Mudança, % rendimento

    Linhagem de planta

    FIGURA 6
12. 12/17 m

    CM o

    CM in o

    in o

    Ο

    CO

    Dias

    FIGURA 7
13. 13/17 ο

    (Ο

    Ο co m

    OJ ο

    ΙΟ

    - ιο ο

    CN

    Dias (%) Sementes duras

    FIGURA 8
14. 14/17

    Pod-contendo nó linhagem

    FIGURA 9
15. 15/17

    Comprimento

    Entre nó

    14.0

    FIGURA 10
16. 16/17

    Rendimento

    Densidade da planta

    FIGURA 11
17. 17/17 (%) Germinação

    9-Maio 10-Maio 11-Maio 12-Maio 13-Maio 14-Maio 15-Maio

    FIGURA 12