MX2008016224A

MX2008016224A - Rendimiento mejorado y tolerancia al estres en plantas transgenicas.

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Publication number: MX2008016224A
Application number: MX2008016224A
Authority: MX
Inventors: Robert Creelman; Neal I Gutterson; Oliver J Ratcliffe; T Lynne Reuber; R Eric Cerny; Kimberly Faye Zobrist Duff; Susanne Kjemtrup-Lovelace; Robert Meister; Marie Petracek; Thomas Ruff; Qingzhang Xu
Original assignee: Mendel Biotechnology Inc
Priority date: 2006-06-29
Filing date: 2007-06-22
Publication date: 2009-02-23
Also published as: EP3574747A1; CA2918565A1; EP2912938B1; BRPI0713794A2; WO2008005210A3; EP2040533A2; CA2918565C; EP2040533B1; CN105734076A; CA2995933C; AR113985A2; CA2995933A1; EP2500433A3; CA2655870C; EP2500433A2; EP2040533A4; ZA200900024B; CN101478870A; BRPI0713794B1; AR061734A1

Abstract

Se introdujeron polinucleótidos y polipéptidos incorporados en vectores de expresión, en plantas, y se expresaron ectópicamente. Los polipéptidos de esta invención han demostrado conferir al menos una actividad regulatoria y confieren mayor rendimiento, mayor altura, mayor crecimiento estacional temprano, mayor cubrimiento de área, mayor diámetro de tallo, mayor vigor estacional temprano, más raíces secundarias, germinación más rápida, mayor tolerancia al frío, mayor tolerancia a la falta de agua, menor conductancia por estomas, sensado C/N alterado, mayor tolerancia a bajo nitrógeno, mayor tolerancia a bajo fósforo, o mayor tolerancia a estrés hiperosmótico comparado con la planta control.

Description

RENDIMIENTO MEJORADO Y TOLERANCIA AL ESTRÉS EN PLANTAS TRANSGENICAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la genética vegetal y el mejoramiento de las plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los efectos de diferentes factores en el rendimiento de plantas. El rendimiento de especies comercialmente valiosas en el ambiente natural puede ser menor que el óptimo dado que a menudo las plantas crecen bajo condiciones desfavorables, tales como a una temperatura no apropiada o con un suministro limitado de nutrientes del suelo, luz, o disponibilidad de agua. Por ejemplo, nitrógeno (N) y fósforo (P) son nutrientes limitantes críticos para las plantas. El fósforo sólo es segundo al nitrógeno en importancia como macro nutriente para el crecimiento de plantas y por su impacto en el rendimiento de cultivos. Las plantas han desarrollado diferentes estrategias para ayudar a resistir a la falta de P y N que incluye adaptaciones metabólicas así como de desarrollo. La mayoría, si no todas, de estas estrategias tienen componentes que están regulados al nivel de transcripción y por consiguiente son sensibles a la manipulación por factores de transcripción. Entre las adaptaciones metabólicas se incluyen el aumento de la disponibilidad de P y N por incremento de la captación del suelo a través de la inducción de transportadores de alta afinidad y de baja afinidad, y/o aumentando su movilización en la planta. Entre las adaptaciones de desarrollo se incluyen aumento en las raíces primarias y secundarias, aumento en el número y longitud de los pelos radiculares, y asociaciones con hongos micorrizas (Bates y Lynch (1996); Harrison (1999)).

El metabolismo del nitrógeno y del carbono están íntimamente ligados en casi todas las rutas bioquímicas en las plantas. Los metabolitos del carbono regulan genes involucrados en la adquisición de N y en el metabolismo, y se sabe que afectan la germinación y la expresión de genes fotosintéticos (Coruzzi y col. (2001)) y por lo tanto en el crecimiento. Estudios previos sobre la nitrato reductasa (NR) en 1976 mostraron que la actividad NR podía estar afectada por Glc/Sac (Crawford (1995); Daniel-Védele y col. (1996)). Esas observaciones tuvieron el respaldo de experimentos posteriores que mostraron que los azúcares inducen el ARNm de NR en plántulas verdes, adaptadas a la oscuridad (Cheng y col. (1992)). El C y N pueden tener relaciones antagónicas como moléculas de señalización; la inducción por luz de la actividad de NR y los niveles de ARNm pueden ser imitados por metabolitos de C y los metabolitos de N causan represión de la inducción de NR en tabaco (Vincentz y col. (1992)) . Para varios genes del metabolismo del N se ha mostrado la regulación de genes de acuerdo al estado C/N (balance entre carbono-nitrógeno) (Stitt (1999)) ; Coruzzi y col. (2001)) . De este modo, una planta con sensado de C/N alterado puede exhibir mejoría en la germinación y/o crecimiento bajo condiciones limitantes de nitrógeno. El déficit de agua es una limitación importante del rendimiento de cultivos. En ambientes limitados en agua, el rendimiento del cultivo es una función del uso del agua, eficacia en el uso del agua (WUE; definido como rendimiento de biomasa aérea/uso de agua) y del índice de cosecha (HI; la relación de rendimiento de biomasa a la biomasa acumulada total en la cosecha) . WUE es una característica compleja que involucra la captación de agua y C02, transporte e intercambio en la superficie de la hoja (transpiración) . Se ha propuesto un WUE mejorado como criterio para la mejora del rendimiento en sequías. El déficit de agua también puede tener efectos adversos en forma de susceptibilidad aumentada a enfermedades y pestes, crecimiento reducido de la planta y falla en la reproducción. Los genes útiles para la expresión especialmente durante el déficit de agua son genes que promueven aspectos del crecimiento o fertilidad de la planta, genes que otorgan resistencia a enfermedades, genes que otorgan resistencia a pestes, y similares. Estas limitaciones pueden retrasar el crecimiento y el desarrollo, reducir la productividad, y en casos extremos, causar la muerte de la planta. Una tolerancia mejorada a estos tipos de estrés llevaría a incrementos en el rendimiento en variedades convencionales y a reducir la variación de rendimiento en las variedades híbridas . Otro factor que afecta el rendimiento es el número de plantas que se pueden hacer crecer por acre . Para las especies de cultivo, la densidad de siembra o población varía de un cultivo a otro, de una región de crecimiento a otra, y de año a año. Las características de la planta, incluyendo las características bioquímicas, de desarrollo, o fenotípicas que potencian el rendimiento o la tolerancia a diferentes tipos de estrés abiótico, se pueden controlar a través de varios procesos celulares. Una manera importante para manipular ese control es a través de factores de transcripción - proteínas que influyen en la expresión de un gen en particular o conjuntos de genes. Las plantas transformadas y transgénicas que comprenden células que tienen niveles alterados de al menos un factor de transcripción seleccionado, por ejemplo, tienen características favorables o deseables. Las estrategias para manipular las características por alteración del contenido de factores transcripción de las células de una planta pueden por lo tanto producir plantas y cultivos con propiedades comercialmente valiosas .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Un propósito de esta invención es proveer plantas que pueden expresar genes para aumentar el rendimiento de plantas comercialmente significativas, así como para mejorar los efectos adversos del déficit de agua o de nutrientes . La presente invención se relaciona con nuevos polinucleótidos recombinantes , vectores de expresión, células de planta hospedadora y plantas transgénicas que las contienen, y métodos para producir las plantas transgénicas . Los polinucleótidos recombinantes pueden incluir cualquiera de las siguientes secuencias: (a) las secuencias de nucleótidos que se encuentran en el listado de secuencias; (b) secuencias de nucleótidos que codifican para polipéptidos que se encuentran en el listado de secuencias; (c) variantes de secuencias que son al menos 30% de la secuencia idénticas a cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a) o (b) ; (d) secuencias de polipéptidos que son al menos 30% idénticas, o al menos 32%, al menos 33%, al menos 36%, al menos 40%, al menos 45%, o al menos 67% idéntica en su secuencia de aminoácidos a cualquiera de SEQ ID NOs : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, ó 24; (e) secuencias de nucleótidos ortólogas y parálogas que son al menos 40% idénticas a cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a) o (b) ; (f) secuencia de nucleótidos que hibridiza con cualquiera de las secuencias de nucleótidos (a) o (b) bajo condiciones rigurosas, que pueden incluir, por ejemplo, hibridación con pasos de lavado de SSC 6x y 65 °C durante entre diez y treinta minutos por paso; y (g) polipéptidos, y las secuencias de nucleótidos que los codifican, que tienen un dominio conservado dedo de zinc caja B requerido para la función de regular la transcripción y alterar una característica en una planta transgénica, donde el dominio conservado tiene al menos aproximadamente 56% de identidad de secuencia, o al menos aproximadamente 58% de identidad de secuencia, o al menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia, o al menos aproximadamente 65%, o al menos aproximadamente 67%, o al menos aproximadamente 70%, o al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 76%, o al menos aproximadamente 77%, o al menos aproximadamente 78%, o al menos aproximadamente 79%, o al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 81%, o al menos aproximadamente 82%, o al menos aproximadamente 83%, o al menos aproximadamente 84%, o al menos aproximadamente 85%, o al menos aproximadamente 86%, o al menos aproximadamente 87%, o al menos aproximadamente 88%, o al menos aproximadamente 89%, o al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 91%, o al menos aproximadamente 92%, o al menos aproximadamente 93%, o al menos aproximadamente 94%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 96%, o al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99%, idéntico en su secuencia de residuos de aminoácidos a los dominios conservados dedos de zinc (ZF) caja B de SEQ ID NOs : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ó 24 (es decir, un polipéptido listado en el listado de secuencias, o codificado por cualquiera de las secuencias de nucleótidos de más arriba, estando los dominios conservados representados por SEQ ID NOs : 45-56, respectivamente). Los dominios conservados de la invención listados en la Tabla 1 comprenden un dominio requerido para la función de regular la transcripción y alterar una característica en una planta transgénica, dicha característica seleccionada del grupo formado por rendimiento aumentado, altura aumentada, sensado al C/N alterado, tolerancia aumentada a bajo nitrógeno, tolerancia aumentada a bajo fósforo, tolerancia aumentada a la falta de agua, conductancia del estoma reducida, y tolerancia aumentada al estrés hiperosmótico, en comparación con la planta control. Adicionalmente, los polipéptidos de la invención pueden comprender varios residuos de identificación más cercanos al extremo C terminal que el dominio caja B. Estos residuos comprenden, en orden desde el N al C terminal: W-X3-G (SEQ ID NO: 62, donde X representa cualquier aminoácido; ver en la Figura 4D) R-X3-A-X3-W (SEQ ID NO: 57, donde X representa cualquier aminoácido; ver en la Figura 4D) y EGWXE (SEQ ID NO: 58; donde X representa cualquier aminoácido; ver en la Figura 4E) Los vectores de expresión, y por lo tanto las plantas transgénicas , de la invención, comprenden secuencias de polinucleótidos de factores de transcripción putativas y, en particular, secuencias de dedos de zinc caja B. Cuando cualquiera de estos polipéptidos de la invención se sobreexpresan en una planta, el polipéptido confiere al menos una actividad reguladora a la planta, que a su vez se manifiesta en una característica seleccionada del grupo formado por rendimiento aumentado, mayor altura, aumento de raíces secundarias, mayor tolerancia al frío, mayor tolerancia a la falta de agua, menor conductancia del estoma, sensado al C/N alterado, tolerancia aumentada a bajo nitrógeno, tolerancia aumentada a bajo fósforo, y tolerancia aumentada al estrés hiperosmótico en comparación con la planta control. La invención también está dirigida a semillas transgénicas producidas por cualquiera de las plantas transgénicas de la invención, y a los métodos para hacer las plantas transgénicas y las semillas transgénicas de la invención .

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS Y DIBUJOS El listado de secuencias provee secuencias de polinucleótidos y polipéptidos ejemplificativos de la invención. En los Ejemplos se incluyen las características asociadas con el uso de las secuencias. Los CD-ROMs Copia 1 y Copia 2, y los CRF copia del listado de secuencias en la Sección 1.821(e), son discos compactos de solo lectura legibles en memoria de computadora. Cada uno contiene una copia del listado de secuencias en formato de texto ASCII. El listado de secuencias se llama "MBI0076.ST25.txt", el archivo electrónico del listado de secuencias contenido en cada uno de estos CD-ROMs se creó el 12 de Junio de 2007, y tiene un tamaño de 83 kilobytes. Las copias del listado de secuencias en los discos de CD-ROM se incorporan a la presente en su totalidad a modo de referencia. La Figura 1 muestra una estimación conservadora de las relaciones filogenéticas entre los órdenes de plantas de floración (modificado de Soltis y col. (1997)). Esas plantas con un solo cotiledón (monocotiledóneas) son un ciado monofilético anidado en al menos dos linajes principales de dicotiledóneas; las eudicotiledóneas que a su vez se dividen en rósidas y astéridas. Arabidopsis es una eudicotiledónea rósida clasificada dentro del orden Brassicales; el arroz es un miembro del orden monocotiledónea Poales. La Figura 1 se adaptó de Daly y col . (2001) . La Figura 2 muestra un dendograma filogénico que describe las relaciones filogenéticas de taxones de plantas superiores, que incluye ciados que contienen tomate y Arabidopsis; adaptado de Ku y col. (2000); y Chase y col. (1993) . En la Figura 3, con el uso de ClustalW (Programa de Alineamiento de Secuencias Múltiples CLUSTAL W versión 1.83, 2003) se construyó un árbol filogenético y alineaciones de secuencias múltiples de G1988 y las proteínas de longitud completa relacionadas. Los parámetros de alineación múltiples de ClustalW fueron: Penalidad de apertura de falta de coincidencia: 10,00 Penalidad de extensión de falta de coincidencia: 0,20 Demora de secuencias divergentes: 30% Ponderación de las transiciones de ADN: 0,50 Matriz de ponderación de proteínas: serie Gonnet Matriz de ponderación de ADN: IUB; Uso de matriz negativa: desactivado Luego se empleó un alineamiento con un formato FastA para generar un árbol filogenético con el programa de computación MEGA2 (MEGA2 (http://www.megasoftware.net) con el uso del algoritmo de unión de adjuntos y un modelo de distancia p. Se realizó una prueba de filogenia bootstrap con 1000 réplicas y siembra al azar como parámetros por omisión. Los valores de corte del árbol bootstrap se fijaron en 50%. Los homólogos estrechamente relacionados de G1988 son considerados como aquellas proteínas dentro del nodo del árbol debajo con un valor bootstrap de 74, unidas por G4011 y G4009 (indicado por la caja alrededor de estas secuencias) . La secuencia ancestral se representa por el nodo del árbol indicado por la flecha en la Figura 3 que tiene un valor bootstrap de 74. Abreviaciones: At Arabidopsis thaliana; Ct - Citrus sinensis; Gm - Glycine max; Os - Oryza sativa; Pt - Populus trichocarpa; Zm -Zea mays . Las Figuras 4A-4F muestran un alineamiento de Clustal W del ciado G1988 y proteínas relacionadas. SEQ ID NOs : aparecen entre paréntesis después de cada Identificador del Gen (GID) . Algunos miembros del ciado de G1988 aparecen en recuadros grandes en cada una de las Figuras 4A-4F. El dominio conservado de dedos de zinc (ZF) caja B muy conservado (dominio B) se identifica en las Figuras 4A-4B por la línea horizontal debajo de la alineación. Varias características o residuos característicos dentro de los motivos característicos fuera de y más cerca del extremo C terminal que del dominio B se indican por triángulos oscuros pequeños en las Figuras 4D y 4E. La Figura 5 muestra la medida promedio del nivel de clorofila SPAD de la hoja (SPAD o "Análisis de Planta y Suelo", medido con un medidor de clorofila en hojas Minolta SPAD-502, eje vertical) medido en líneas de Arabidopsis con sobreexpresión de G1988 (líneas de OE 10, 12 y 8-2; eje horizontal) . También se muestran las medidas para las plantas control (Cntl) para cada una de las tres líneas experimentales. Las plantas se hicieron crecer en 10 hr de luz, 0,1 mM de NH4N03 , pre-floración y se ensayaron 7,5 semanas luego de la siembra. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. Las tres líneas G1988 tuvieron mayor contenido de clorofila bajo condiciones de bajo nitrógeno que los controles. Los resultados obtenidos para las líneas 10 y 12 fueron significativos a p < 0,01. La Figura 6 compara los efectos sobre el rendimiento (eje vertical: cambio en el rendimiento porcentual) en diferentes líneas (eje horizontal) de plantas de soja transgénica con sobreexpresion de G1988 (35S::G1988) en ensayos en campo del año 2004 y 2005. Los datos se promedian entre múltiples lugares y se observó un aumento consistente en el rendimiento, en comparación con controles que albergan una construcción vacía. En el análisis del 2005, G1988 aumentó significativamente el rendimiento en 17 de 19 lugares. Si la línea 4, que a diferencia de otras líneas presentadas en este gráfico mostró poca o ninguna expresión de G1988 en el tejido de la hoja, se quita del análisis, el incremento del rendimiento promedio en 2005 fue de aproximadamente 6,7%. La Figura 7 muestra datos experimentales obtenidos en 2005 con semillas de un ensayo en campo de California que compara una línea de soja tipo salvaje control y varias líneas de plantas de soja con sobreexpresion de 35S::G1988. La curva de puntos representa el porcentaje de línea germinante tipo salvaje. La curva de líneas más arriba representa una línea con baja sobreexpresion que finalmente produjo un aumento pequeño en el rendimiento por encima del control. Las curvas sólidas más oscuras por encima de la línea con baja sobreexpresion representan otras líneas con sobreexpresion de 35S::G1988 que muestran un grado más alto de expresión, que finalmente produjeron un rendimiento significativamente más alto, y mejoraron la germinación en frío en comparación con los controles. Se obtuvieron resultados similares con semillas derivadas en el mismo año de un ensayo en campo realizado en Kansas y dos ensayos en campo en Illinois. Estos datos demostraron que la sobreexpresion de G1988 da como resultado una germinación de soja en frío mejorada. La Figura 8 compara la germinación total de soja del ensayo en campo de California. La germinación del control (curva punteada) fue pobre y se vio que un alto porcentaje de las semillas fueron "semillas duras" , un fenómeno inducido por estrés que da como resultado semillas que resisten la imbibición bajo condiciones normales. La curva de líneas por debajo de la curva punteada del control representa la línea de baja sobreexpresion que parecía tener un porcentaje similar de semillas duras, es decir, el mismo porcentaje de semillas que no germinaron a los diferentes puntos de tiempo, como el control. Las curvas sólidas más oscuras debajo del control y de la línea de baja sobreexpresion representan otras líneas de sobreexpresion de 35S::G1988 que tuvieron un menor porcentaje de semilla dura y eventualmente produjeron rendimiento más alto que los controles . La Figura 9 muestra el número promedio de nodos del tallo principal que contienen vainas, en relación a la línea control parental representada por la línea "0", observada en diferentes líneas de plantes de soja con sobreexpresión de varias secuencias. Las barras sombreadas indican las líneas con sobreexpresión de G1988 que generalmente produjeron un número significativamente mayor de nodos que dan vainas que las plantas control . La Figura 10 demuestra cómo la altura aumentada de la planta de soja, que es característico de la sobreexpresión de G1988 en períodos de días cortos (10 horas de luz, 14 horas en oscuridad) , es debido principalmente a un aumento en la longitud de entre nodos en la porción superior de la planta. Las diferencias más fácilmente observables entre una línea transgénica y una línea control se observó entre los entre nodos 8 y 12. Las diferencias en altura de las plantas entre las plantas transgénicas G1988 y controles de ese modo se acentuaron más tarde en la temporada de crecimiento. La línea no transformada control usada en estos experimentos se representa por barras sin sombreado. Las barras sombreadas muestran la longitud internodo (en centímetros) de la línea con sobreexpresión 178. La Figura 11 muestra los resultados de un ensayo en campo de densidad de plantas. Como se ve en esta figura, las plantas de soja con sobreexpresión de G1988 demostraron un aumento del rendimiento observable en un rango de densidades de planta, en relación a las plantas control que no expresaban G1988 (círculos vacíos) , o plantas transgénicas de la Línea 217 que expresaban G1988 en un grado menor (aproximadamente 40% más bajo) que las líneas transgénicas de alto rendimiento (círculos llenos) . El recuento de plantas no tuvo una mayor contribución al rendimiento cosechable. Las plantas con sobreexpresión de la línea 178 se representan con triángulos vacíos. Las plantas con sobreexpresión de la línea 189 se representan con triángulos llenos. Las plantas con sobreexpresión de la línea 209 se representan con cuadrados vacíos. Las plantas con sobreexpresión de la línea 200 se representan con cuadrados llenos. Las plantas con sobreexpresión de la línea 213 se representan con asteriscos. La Figura 12 ilustra que la sobreexpresión constitutiva de G1988 (SEQ ID NO: 2) en las plantas de soja promueve la germinación. Las plantas transgénicas que sobreexpresan G1988 que mostraron que aumentaban el rendimiento en soja (línea 218, diamantes vacíos; y línea 178, triángulos vacíos) generalmente demostraron un porcentaje de germinación por encima de la línea 217, que expresó G1988 en menor grado que las líneas transgénicas de alto rendimiento (círculos llenos) y plantas control no transformadas (círculos vacíos) . En estos experimentos se germinaron las semillas en 1,0 µ? de ácido giberélico.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención se relaciona con polinucleótidos y polipéptidos para modificar fenotipos de plantas, particularmente aquellos asociados con tolerancia aumentada al estrés abiótico y rendimiento aumentado respecto de una planta control (por ejemplo, una planta del tipo salvaje) . En toda esta memoria descriptiva, se citan y/o se incorporan específicamente diversas fuentes de información. Las fuentes de información incluyen artículos de publicaciones científicas, documentos de patentes, libros de texto y direcciones de páginas interactivas de Internet. Si bien la referencia a estas fuentes de información indica claramente que pueden ser usadas por los especialistas en la técnica, todas y cada una de las fuentes de información citadas se incorporan por completo y específicamente en la presente, se mencione o no que "se incorporan a modo de referencia" . Los contenidos y las enseñanzas de todas y cada una de las fuentes de información son confiables y se pueden usar para preparar y usar las realizaciones de la invención . Como se las usa en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/una" y "el/la" incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula huésped" incluye una pluralidad de estas células huésped y la referencia a "un tipo de estrés" es una referencia a uno o más tipos de estrés y los equivalentes de las mismas conocidos por los especialistas en la técnica y similares. Definiciones Un "polinucleótido" es una molécula de ácido nucleico que comprende una pluralidad de nucleótidos polimerizados , por ejemplo, al menos aproximadamente 15 nucleótidos polimerizados consecutivos. Un polinucleótido puede ser un ácido nucleico, un oligonucleótido, un nucleótido o cualquier fragmento del mismo. En muchos casos, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido (o una proteína) o un dominio o un fragmento del mismo. Además, el polinucleótido puede comprender un promotor, un intrón, una región potenciadora, un sitio de poliadenilación, un sitio de inicio de la traducción, regiones no traducidas 5' o 3', un gen informante, un marcador de selección o semejantes. El polinucleótido puede ser ADN o ARN de cadena simple o cadena doble. El polinucleótido comprende opcionalmente bases modificadas o un esqueleto modificado. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN o ARN genómico, un transcripto (tal como un AR m) , un ADNc , un producto de PCR, un ADN clonado, un ADN o un ARN sintético, o semejantes. El polinucleotido puede combinarse con hidratos de carbono, lípidos, proteínas u otros materiales para realizar una actividad particular, tal como la transformación, o formar una composición útil, tal como un ácido nucleico peptídico (PNA) . El polinucleotido puede comprender una secuencia orientada en el sentido del marco de lectura o antisentido. Un "oligonucleótido" es sustancialmente equivalente a los términos amplímero, cebador, oligómero, elemento, blanco y sonda, y preferiblemente es de cadena simple. Un "polinucleotido recombinante" es un polinucleotido que no se encuentra en su estado nativo, por ejemplo, el polinucleotido comprende una secuencia de nucleótidos que no se halla en la naturaleza, o el polinucleotido está en un contexto distinto del que se halla naturalmente, por ejemplo, está separado de las secuencias de nucleótidos en cuya cercanía se halla generalmente en la naturaleza, o está en una posición adyacente (o contigua) respecto de secuencias de nucleótidos a las que generalmente no está próximo. Por ejemplo, la secuencia en cuestión puede clonarse en un vector o puede recombinarse de otro modo con uno o más ácidos nucleicos adicionales. Un "polinucleotido aislado" es un polinucleotido, de natural o recombinante , que está presente fuera de la célula en la que generalmente se halla en la naturaleza, purificado o no. Opcionalmente , un polinucleótido aislado es sometido a uno o más procedimientos de enriquecimiento o purificación, por ejemplo, lisis celular, extracción, centrifugación, precipitación o semejantes. Un "gen" o una "secuencia genética" hace referencia a la secuencia codificante parcial o completa de un gen, su complemento, y sus regiones no traducidas 5' o 3' . Un gen también es una unidad de herencia funcional y, en términos físicos, es un segmento o una secuencia de nucleótidos particular, junto con una molécula de ADN (o AR , en el caso de los virus de ARN) que participa en la producción de una cadena polipeptídica. Esta última puede ser sometida a un procesamiento subsiguiente, tal como una modificación química o un plegamiento, para obtener una proteína o un polipéptido funcional. Un gen puede estar aislado o parcialmente aislado, o puede hallarse en el genoma de un organismo. A modo de ejemplo, un gen de un factor de transcripción codifica un polipéptido de un factor de transcripción, que puede ser funcional o puede necesitar un procesamiento adicional para que funcione como iniciador de la transcripción. En términos operativos, los genes pueden definirse con la prueba cis-trans, una prueba genética que permite determinar si dos mutaciones ocurren en el mismo gen, y que puede usarse para determinar los límites de la unidad con actividad genética (Rieger y col. (1976)). Un gen generalmente incluye regiones que preceden ("directrices", 5') y que suceden ("colas", 3') a la región codificante. Un gen también puede incluir secuencias no codificantes intervinientes , conocidas como "intrones", localizadas entre los segmentos codificantes individuales, conocidos como "exones" . La mayor parte de los genes tiene una región promotora asociada, una secuencia reguladora 5' del codón de inicio de la transcripción (hay algunos genes que no tienen un promotor identificable) . La función de un gen también puede ser regulada por potenciadores , operadores y otros elementos reguladores . Un "polipéptido" es una secuencia de aminoácidos que comprende una pluralidad de residuos de aminoácidos polimerizados consecutivos, por ejemplo, al menos aproximadamente 15 residuos de aminoácidos polimerizados consecutivos. En muchos casos, un polipéptido comprende una secuencia de residuos de aminoácidos polimerizados que es un factor de transcripción, o un dominio, una porción o un fragmento del mismo. Además, el polipéptido puede comprender: (i) un dominio de localización; (ii) un dominio de activación; (iii) un dominio de represión; (iv) un dominio de oligomerización; (v) un dominio de interacción proteína-proteína; (vi) un dominio de unión a ADN; o similares. Opcionalmente, el polipéptido comprende residuos de aminoácidos modificados, residuos de aminoácidos naturales que no están codificados por un codón o residuos de aminoácidos que no son naturales. Una "proteína" hace referencia a una secuencia de aminoácidos, un oligopéptido, un péptido, un polipéptido o porciones de la misma, ya sea natural o sintética. Una "porción", como se la usa en la presente, hace referencia a cualquier parte de una proteína usada para cualquier propósito, pero especialmente para el análisis de una biblioteca de moléculas que se unen específicamente a dicha porción, o para la producción de anticuerpos. Un "polipéptido recombinante" es un polipéptido producido por la traducción de un polinucleótido recombinante. Un "polipéptido sintético" es un polipéptido creado por la polimerización consecutiva de residuos de aminoácidos aislados usando métodos bien conocidos en la técnica. Un "polipéptido aislado", sea un polipéptido de ocurrencia natural o recombinante, se halla en una mayor cantidad en una célula (o fuera de ella) , en comparación con el polipéptido en su estado natural en una célula tipo salvaje, por ejemplo, en una cantidad superior en aproximadamente 5%, una cantidad superior en aproximadamente 10% o una cantidad superior en aproximadamente 20% o una cantidad superior en aproximadamente 50%, o más, es decir, en una denominación alternativa: en una cantidad de 105%, 110%, 120%, 150% o más, respecto del tipo salvaje, tomado como una referencia del 100%. Este incremento de la cantidad no es el resultado de una respuesta natural de una planta de tipo salvaje. Como alternativa, o además, el polipéptido aislado se separa de los otros componentes con los cuales generalmente está asociado, por ejemplo, de acuerdo con cualquiera de los diversos métodos de purificación de proteínas de la presente . La "homología" hace referencia a la similitud de secuencia entre una secuencia de referencia y al menos un fragmento de un inserto clonal recién secuenciado, o su secuencia de aminoácidos codificada. La "identidad" o "similitud" hace referencia a la similitud de secuencia entre dos secuencias de polinucleótidos o dos secuencias de polipéptidos , donde la identidad indica una comparación más estricta. Las frases "porcentaje de identidad" y "% de identidad" hacen referencia al porcentaje de similitud de secuencia hallado en una comparación de dos o más secuencias de polinucleótidos o dos o más secuencias de polipéptidos. La "similitud de secuencia" hace referencia al porcentaje de similitud en pares de bases de secuencia (determinado con cualquier método apropiado) entre dos o más secuencias de polinucleótidos . Dos o más secuencias pueden presentar una similitud de entre 0 y 100%, o cualquier valor entero comprendido por ellos. Es posible determinar la identidad o la similitud comparando una posición en cada secuencia, que puede alinearse con fines comparativos. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base nucleotídica o el mismo aminoácido, luego las moléculas son idénticas en esta posición. Un grado de similitud o identidad entre secuencias de polinucleótidos es una función de la cantidad de nucleótidos idénticos, coincidentes o correspondientes en las posiciones compartidas por las secuencias de polinucleótidos. Un grado de identidad de secuencias de polipéptidos es una función de la cantidad de aminoácidos idénticos en las posiciones correspondientes compartidas por las secuencias de polipéptidos. Un grado de homología o similitud entre secuencias de polipéptidos es una función de la cantidad de aminoácidos en las posiciones correspondientes compartidas por las secuencias de polipéptidos. Un "alineamiento" hace referencia a una cantidad de secuencias de bases nucleotídicas o residuos de aminoácidos alineadas por comparación en longitud de modo que los componentes en común (es decir, las bases nucleotídicas o los residuos de aminoácidos en las posiciones correspondientes) pueden identificarse fácilmente por medios visuales. La fracción o el porcentaje de los componentes en común se relaciona con la homología o la identidad entre las secuencias. Es posible usar alineamientos, tales como aquellos de las figuras 4A-4F, para identificar los dominios conservados y la relación entre estos dominios. El alineamiento se puede determinar apropiadamente con el uso de programas informáticos conocidos en la técnica, tales como el software MACVECTOR (1999) (Accelrys, Inc., San Diego, CA) . Un "dominio conservado" o una "región conservada" , como se la usa en la presente, hace referencia a una región en secuencias de polinucleótidos o polipéptidos heterólogos en la que hay un grado de identidad de secuencia relativamente elevado entre las distintas secuencias. Un "dominio dedos de zinc caja B", tal como se encuentra en un miembro polipeptídico de la familia dedos de zinc caja B, es un ejemplo de un dominio conservado. Respecto de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos descriptos en la presente, un dominio conservado preferiblemente tiene al menos nueve pares de bases (bp) de longitud. Un dominio conservado respecto de los polipéptidos expuestos en la presente se refiere a un dominio dentro de una familia polipeptídica que exhibe un mayor grado de homología, tal como al menos aproximadamente 56% de identidad de secuencia, o al menos 58% de identidad de secuencia, o al menos 60% de identidad de secuencia, o al menos 65%, o al menos 67%, o al menos 70%, o al menos 75%, o al menos 76%, o al menos 77%, o al menos 78%, o al menos 79%, o al menos 80%, o al menos 81%, o al menos 82%, o al menos 83%, o al menos 84%, o al menos 85%, o al menos 86%, o al menos 87%, o al menos 88%, o al menos 89%, o al menos 90%, o al menos 91%, o al menos 92%, o al menos 93%, o al menos 94%, o al menos 95%, o al menos 96%, o al menos 97%, o al menos 98%, o al menos 99%, de identidad de secuencia de residuos de aminoácidos, a un dominio conservado de un polipéptido de la invención (por ejemplo, cualquiera de SEQ ID NOs : 45-56) . Las secuencias que poseen o codifican para dominios conservados que cumplen con estos criterios de porcentaje de identidad, y que tiene actividad biológica comparable a las presentes secuencias de polipéptidos , que por lo tanto son miembros de los polipéptidos del ciado G1988, se incluyen en la invención. Un fragmento o un dominio puede denominarse un dominio conservado exterior, una secuencia consenso exterior o un sitio de unión a ADN consenso exterior, del que se sabe que existe o que existe con seguridad para una clase, una familia o una subfamilia de polipéptidos en particular. En este caso, el fragmento o el dominio no incluirá los aminoácidos exactos de una secuencia consenso o un sitio de unión a ADN consenso de una clase una familia o una subfamilia de factores de transcripción, o los aminoácidos exactos de una secuencia consenso o un sitio de unión a ADN consenso de un factor de transcripción en particular. Además, un fragmento, una región o un dominio de un polipéptido particular, o un polinucleótido que codifica un polipéptido, puede estar "fuera de un dominio conservado" si todos los aminoácidos del fragmento, la región o el dominio quedan fuera de uno o más dominios conservados definidos para un polipéptido o una proteína. Las secuencias que tienen grados de identidad menores pero presentan una actividad biológica comparable se consideran equivalentes. Según comprenderá el especialista en la técnica, los dominios conservados pueden identificarse como regiones o dominios de identidad con una secuencia consenso específica (véase, por ejemplo, Riechmann y col. (2000a, 2000b)). De este modo, con el uso de métodos de alineamiento bien conocidos en la materia, se pueden determinar los dominios conservados de los polipéptidos de plantas, por ejemplo, para las proteínas dedos de zinc caja B (Putterill y col. (1995) ) . Los dominios conservados de muchas de las secuencias de polipéptidos de la invención se indican en la Tabla 1. Además, los polipéptidos de la Tabla 1 tienen dominios conservados específicamente indicados por sitios de coordenadas de aminoácidos de comienzo y fin. Una comparación de estos polipéptidos permite que aquellos entrenados en la técnica (véase, por ejemplo, Reeves y Nissen (1990, 1995)) identifiquen dominios o dominios conservados en cualquiera de los polipéptidos indicados o citados en esta descripción. El término "complementario" hace referencia a la unión hidrógeno natural que permite el apareamiento entre bases de purinas y pirimidinas. Por ejemplo, la secuencia A-C-G-T (5' -> 3') forma enlaces hidrógeno con sus complementos A-C-G-T (5· -> 3') o A-C-G-U (5' -> 3') . Dos moléculas de cadena simple pueden considerarse parcialmente complementarias si solamente algunos de los nucleotidos se unen, o "completamente complementarias" si todos los nucleotidos se unen. El grado de complementariedad entre las cadenas de ácidos nucleicos afecta la eficiencia y la fuerza de las reacciones de hibridación y amplificación. "Completamente complementario" hace referencia al caso en que la unión ocurre entre cada par de bases y su complemento en un par de secuencias, y las dos secuencias tienen la misma cantidad de nucleotidos. Los términos "severidad elevada" y "condición de severidad elevada" hacen referencia a condiciones que permiten la hibridación de cadenas de ADN cuyas secuencias son altamente complementarias, donde estas mismas condiciones excluyen la hibridación de ADN con faltas de coincidencia significativas. Las secuencias de polinucleótidos capaces de hibridizar con los polinucleótidos de la presente invención bajo condiciones severas pueden ser, por ejemplo, variantes de las secuencias de polinucleótidos descriptas, incluyendo variantes alélicas o de procesamiento, o secuencias que codifican ortólogos o paralogos de polipéptidos descriptos en la presente. Se describen métodos de hibridación de ácidos nucleicos con mayor detalle en Kashima y col. (1985), Sambrook y col. (1989) y Haymes y col. (1985), donde estas referencias se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. En general, la severidad está determinada por la temperatura, la fuerza iónica y la concentración de agentes desnaturalizantes (por ejemplo, formamida) usados en un procedimiento de hibridación y lavado (para hallar una descripción más detallada del establecimiento y la determinación de la severidad, véase la sección "Identificación de polinucleótidos o ácidos nucleicos por hibridación" más adelante) . El grado con el que se hibridizan dos ácidos nucleicos bajo diversas condiciones de severidad se correlaciona con la extensión de su similitud. Por consiguiente, las secuencias de ácidos nucleicos similares de una variedad de fuentes, tal como dentro del genoma de una misma planta (como en el caso de los parálogos) o de otra planta (como en el caso de los ortólogos) , que presentan funciones similares, pueden aislarse sobre la base de su capacidad de hibridizarse con secuencias de polinucleótidos relacionados conocidos. Hay numerosas variantes posibles bajo las condiciones y con los medios que puede efectuarse la hibridación de ácidos nucleicos, que permiten aislar secuencias de polinucleótidos relacionados que son similares a secuencias conocidas en la técnica, y dichas secuencias no se limitan a aquellas descriptas en forma explícita en la presente. Tal abordaje se puede utilizar para aislar secuencias de polinucleótidos que tienen diferentes grados de similitud con las secuencias de polinucleótidos descriptas, tal como, por ejemplo, factores de transcripción codificados que tienen 56% o más de identidad con los dominios conservados de las secuencias descriptas . Los términos "parálogo" y "ortólogo" se definirán más adelante en la sección de "Ortólogos y parálogos" . Brevemente, los ortólogos y los parálogos son genes relacionados desde el punto de vista evolutivo, que tienen secuencias y funciones similares. Los ortólogos son genes relacionados desde el punto de vista estructural en distintas especies, que derivan de un evento de especiación. Los parálogos son genes relacionados desde el punto de vista estructural en una misma especie, que derivan de un suceso de duplicación. El término "equiválogo" hace referencia a miembros de un conjunto de proteínas homologas que están conservadas en lo referente a la función, respecto de su último ancestro común. Las proteínas relacionadas se agrupan en familias de equiválogos, y de otro modo en familias de proteínas con otros tipos de homología definidos en función de la jerarquía. Esta definición se proporciona en el sitio de Internet del Instituto de Investigaciones Genéticas (TIGR) , "tigr.org" bajo el encabezado "Términos asociados con TIGRFAM" . En general, el término "variante" hace referencia a moléculas con algunas diferencias en sus secuencias de bases o aminoácidos, generadas en forma sintética o natural, en comparación con un polinucleótido o un polipéptido de referencia (nativo), respectivamente. Estas diferencias incluyen sustituciones, inserciones, supresiones o cualquier combinación deseada de estos cambios en una secuencia nativa de un polinucleótido de aminoácidos . Respecto de las variantes de polinucleótidos , las diferencias entre los polinucleótidos descriptos en la presente y las variantes de polinucleótidos son limitadas, de modo que las secuencias de nucleótidos de los primeros y las últimas son muy similares en general, y en muchas regiones son idénticas. Debido a la degeneración del código genético, las diferencias entre las secuencias de nucleótidos de los primeros y las últimas pueden ser silenciosas (es decir, los aminoácidos codificados por el polinucleótido son iguales, y la variante de la secuencia del polinucleótido codifica la misma secuencia de aminoácidos que el polinucleótido descripto en la presente. Las variantes de las secuencias de nucleótidos pueden codificar distintas secuencias de aminoácidos, en cuyo caso las diferencias en las secuencias de nucleótidos resultarán en sustituciones, adiciones, supresiones, inserciones, cortes o fusiones de aminoácidos, respecto de las secuencias de polinucleótidos similares descriptas. Estas variaciones pueden resultar en variantes de polinucleótidos que codifican polipéptidos que comparten al menos una característica funcional. La degeneración del código genético también dicta que muchas variantes de polinucleótidos diferentes pueden codificar polipéptidos idénticos y/o sustancialmente similares, además de aquellas secuencias ilustradas en el listado de secuencias. En el alcance de la invención también se incluye una variante de un ácido nucleico indicado en el listado de secuencias, es decir, uno que tiene una secuencia que difiere de las secuencias de polinucleótidos en el listado de secuencias, o una secuencia complementaria, que codifica un polipéptido equivalente funcional (es decir, un polipéptido que tiene una actividad biológica equivalente o similar en algún grado) , pero que tiene una secuencia que difiere de la secuencia en el listado de secuencias, debido a la degeneración del código genético. En esta definición se incluyen los polimorfismos que pueden detectarse con facilidad o no usando un oligonucleótido sonda particular del polinucleótido que codifica el polipéptido, y la hibridación inapropiada o inesperada con variantes alélicas, con un locus distinto del locus cromosómico normal de la secuencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido . Una "variante alélica" o una "variante alélica de un polinucleótido" hace referencia a cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural a través de la mutación, y puede resultar en un polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser "silenciosas" o pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. También es posible usar una "variante alélica" y una "variante alélica de un polipéptido" en referencia a los polipéptidos, y en este caso, los términos hacen referencia a un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen. Una "variante de procesamiento" o una "variante de procesamiento de un polinucleótido" , como se la usa en la presente, hace referencia una forma alternativa de un ARN transcripto a partir de un gen. Las variaciones de procesamiento tienen lugar de forma natural como resultado del corte en sitios alternativos dentro de una misma molécula de ARN transcripta, o entre moléculas de ARN transcriptas de forma separada, y pueden resultar en diversas formas de ARNm transcripto a partir del mismo gen. Por consiguiente; las variantes de procesamiento pueden codificar polipéptidos con distintas secuencias de aminoácidos, que pueden tener o no funciones similares en el organismo. Una "variante de procesamiento" o una "variante de procesamiento de un polipéptido" también puede hacer referencia a un polipéptido codificado por una variante de procesamiento de un ARNm transcripto. Como se las usa en la presente, las "variantes de polinucleótidos" también pueden indicar secuencias de polinucleótidos que codifican parálogos y ortólogos de las secuencias de polipéptidos descriptas en la presente. Las "variantes de polipéptidos" pueden hacer referencia a secuencias de polipéptidos que son parálogos y ortólogos de las secuencias de polipéptidos descriptas en la presente. Las diferencias entre las variantes de polipéptidos y los polipéptidos descriptos en la presente están limitadas, de modo que las secuencias de las primeras y los últimos presentan un parentesco general cercano, y en muchas regiones son idénticas. Las secuencias de los polipéptidos y las variantes de polipéptidos similares descriptas en la presente pueden diferir en su secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y cortes, que pueden estar presentes en cualquier combinación. Estas diferencias pueden producir cambios silenciosos y resultar en un polipéptido equivalente desde el punto de vista funcional. Por consiguiente, los especialistas en la técnica podrán apreciar fácilmente que cualquiera de una variedad de secuencias de polinucleotidos puede codificar los polipéptidos y los polipéptidos homólogos de la invención. Una variante de una secuencia de polipéptidos puede tener cambios "conservadores" , en los que un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares. Por consiguiente, pueden efectuarse sustituciones de aminoácidos deliberadas sobre la base de la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza antipática de los residuos, siempre y cuando se retenga una cantidad significativa de la actividad funcional o biológica del polipéptido. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa pueden incluir ácido aspártico y ácido glutámico, los aminoácidos con carga positiva pueden incluir lisina y arginina, y los aminoácidos con grupos frontales polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares pueden incluir leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; serina y treonina; y fenilalanina y tirosina. Más raramente, una variante puede contener cambios "no conservadores", por ejemplo, el reemplazo de una glicina por un triptofano. Las variaciones menores similares también pueden incluir supresiones o inserciones de aminoácidos, o ambas. Los polipéptidos relacionados pueden comprender, por ejemplo, adiciones y/o supresiones de uno o más sitios de glicosilación unidos a N o unidos a O, o una adición y/o una supresión de uno o más residuos de cisteína. Es posible hallar una guía para determinar cuáles y cuántos residuos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o eliminarse, sin abolir la actividad funcional o biológica, usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software DNASTAR (véase USPN 5840544) . Un "fragmento", respecto de un polinucleótido, hace referencia a un clon o cualquier parte de una molécula de polinucleótido que retiene una característica funcional útil. Los fragmentos útiles incluyen oligonucleótidos y polinucleótidos que se pueden usar en tecnologías de hibridación o amplificación, o en la regulación de la replicación, la transcripción o la traducción. Un "fragmento de polinucleótido" hace referencia a cualquier subsecuencia de un polinucleótido, generalmente, de al menos aproximadamente 9 nucleótidos consecutivos, preferiblemente de al menos aproximadamente 30 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 50 nucleótidos, de cualquiera de las secuencias proporcionadas en la presente. Los ejemplos de fragmentos de polinucleótidos incluyen los primeros sesenta nucleótidos consecutivos de los polinucleótidos indicados en el listado de secuencias. Los ejemplos de fragmentos también incluyen fragmentos que comprenden una región que codifica un dominio conservado de un polipéptido. Los ejemplos de fragmentos también incluyen fragmentos que comprenden un dominio conservado de un polipéptido. Los ejemplos de fragmentos incluyen fragmentos que comprenden un dominio conservado de un polipéptido, por ejemplo, los residuos de aminoácidos 5-50 de G1988 (SEQ ID N° 2, los residuos de aminoácidos 6 a 51 de G4004 (SEQ ID N° : 4, los residuos de aminoácidos 6 a 51 de G4005 (SEQ ID N° : 6) . Los fragmentos también pueden incluir subsecuencias de moléculas de polipéptidos y proteínas o una subsecuencia del polipéptido. Los fragmentos pueden tener usos, es decir, pueden tener potencial antigénico. En algunos casos, el fragmento o el dominio es una subsecuencia del polipéptido que desempeña al menos una función biológica del polipéptido intacto sustancialmente del mismo modo, o en una extensión similar, que el polipéptido intacto. Por ejemplo, un fragmento de polipéptido puede comprender un motivo estructural o un dominio funcional reconocible, tal como un sitio de unión a ADN o un dominio que se une a una región promotora de ADN, un dominio de activación o un dominio para interacciones entre proteínas, y puede iniciar la transcripción. Los fragmentos pueden tener un tamaño que puede variar entre tan poco como 3 residuos de aminoácidos y la longitud completa del polipéptido intacto, pero preferiblemente tienen al menos aproximadamente 30 residuos de aminoácidos de longitud y más preferiblemente al menos aproximadamente 60 residuos de aminoácidos de longitud. En la invención también se incluye la producción de secuencias de ADN que codifican polipéptidos y derivados, o fragmentos de éstas, completamente por medios químicos sintéticos. Después de la producción, es posible insertar la secuencia sintética en cualquiera de los muchos vectores de expresión y sistemas celulares disponibles, usando reactivos bien conocidos en la técnica. Más aún, es posible usar una química sintética para introducir mutaciones en una secuencia que codifica polipéptidos, o cualquier fragmento de los mismos .

Un "derivado" hace referencia a la modificación química de una molécula de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos. Las modificaciones químicas pueden incluir el reemplazo del hidrógeno por un grupo alquilo, acilo o amino, o la glicosilación, el tratamiento con PEG o cualquier proceso similar que permita retener o mejorar la actividad biológica o la vida media de la molécula o la secuencia . El término "planta" incluye plantas completas, órganos/estructuras vegetativas de brotes (por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/estructuras florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos) , semillas (incluyendo el embrión, el endosperma y el recubrimiento de la semilla) y frutos (el ovario maduro) , tejido vegetal (por ejemplo, tejido vascular, tejido molido y semejantes) y células (por ejemplo, células de guardia, células de huevo y semejantes), y su progenie. La clase de plantas que se puede usar en el método de la invención es en general tan amplia como la clase de plantas superiores e inferiores que pueden ser sometidas a técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledoneas y dicotiledóneas), gimnospermas , heléchos, laminarias, psilofitas, licofitas, briofitas y algas multicelulares (véase, por ejemplo, la Figura 1, adaptada de Daly y col. (2001) supra, Figura 2, adaptada de Ku y col. (2000); y véase también Tudge (2000). Una "planta control" , como se la usa en la presente invención, hace referencia a una célula vegetal, una semilla, un componente de la planta, tejido vegetal, órganos de la planta o plantas completas usadas para realizar comparaciones con plantas transgénicas o modificadas genéticamente, con el fin de identificar un fenotipo mejorado en la planta transgénica o modificada genéticamente. En algunos casos, una planta control puede ser una planta de una línea transgénica que comprende un vector o un gen marcador vacío, pero que no contiene el polinucleótido recombinante de la presente invención, que se expresa en la planta transgénica o modificada genéticamente que se desea evaluar. En general, una planta control es una planta de la misma línea o variedad que la planta transgénica o modificada genéticamente que se desea evaluar. Una planta control apropiada incluiría una planta sin alteraciones genéticas o no transgénica de la línea progenitora usada para generar una planta transgénica en la presente . Una "planta transgénica" hace referencia a una planta que contiene material genético no hallado en una planta tipo salvaje de la misma especie, variedad o cultivar. El material genético puede incluir un transgen, un evento de mutagénesis por inserción (tal como un transposón o una mutagénesis por inserción de ADN-T) , una secuencia de marca de activación, una secuencia mutada, un evento de recombinación homologa o una secuencia modificada por quimeraplastia . Generalmente, el material genético extraño ha sido introducido en la planta merced a la manipulación humana, pero se puede usar cualquier método reconocido por los especialistas en la técnica. Una planta transgénica puede contener un vector o un cásete de expresión. El cásete de expresión generalmente comprende una secuencia que codifica un polipéptido, unida operativamente (es decir, bajo el control de regulación) a secuencias reguladoras inducibles o constitutivas apropiadas que permiten la expresión del polipéptido. El cásete de expresión se puede introducir en una planta por transformación, o por medio de un cruzamiento posterior a la transformación de una planta progenitora. Una planta hace referencia a una planta completa y a una parte de una planta, tal como una semilla, un fruto, una hoja, o una raíz, tejido vegetal, células vegetales o cualquier otro material vegetal, por ejemplo, un explante vegetal, así como a su progenie, y a sistemas in vitro que imitan los componentes bioquímicos o celulares, o los procesos en una célul . El término "tipo salvaje", como se lo usa en la presente, hace referencia a una célula vegetal, una semilla, un componente de una planta, tejido vegetal, un órgano de una planta o una planta completa que no ha sido modificada genéticamente o tratada en un sentido experimental. Las células, las semillas, los componentes, los tejidos, los órganos o las plantas completas tipo salvaje se pueden usar como controles para comparar los niveles de expresión y la extensión y la naturaleza de la modificación de caracteres, con células, tejidos o plantas de la misma especie en los que se ha alterado la expresión de un polipéptido, por ejemplo, en los que se lo ha eliminado, sobreexpresado o expresado en forma ectópica. Un "carácter" hace referencia a una característica fisiológica, morfológica, bioquímica o física de una planta o un material vegetal o una célula particular. En algunas instancias, esta característica es visible para el ojo humano, tal como el tamaño de una semilla o una planta, o puede medirse de acuerdo con técnicas bioquímicas, tales como la detección de la proteína, el almidón o el contenido de aceite de las semillas o las hojas, o mediante la observación de un proceso metabólico o fisiológico, por ejemplo, midiendo la tolerancia a la privación de agua o a concentraciones de una sal o un azúcar en particular, o mediante la observación del nivel de expresión de uno o más genes, por ejemplo, empleando análisis de Northern, RT-PCR, análisis de expresión de microseries de genes o sistemas de expresión de genes informantes, o realizando observaciones agrícolas, tales como la tolerancia al estrés hiperosmótico o el rendimiento. Sin embargo, se puede usar cualquier técnica para medir la cantidad, el nivel comparativo o la diferencia en cualquier compuesto químico o macromolécula seleccionada en las plantas transgénicas . La "modificación de caracteres" hace referencia a una diferencia detectable en una característica en una planta que expresa en forma ectópica un polinucleótido o un polipéptido de la presente invención, respecto de una planta que no lo hace, tal como una planta tipo salvaje. En algunos casos, la modificación del carácter puede evaluarse en forma cuantitativa. Por ejemplo, la modificación del carácter puede comprender un incremento o una disminución de aproximadamente 2%, o una diferencia aún mayor, en un carácter observado, en comparación con una planta control o tipo salvaje. Se sabe que puede haber una variación natural en el carácter modificado. Por ende, la modificación en el carácter observado comprende un cambio de la distribución normal y la magnitud del carácter en las plantas, en comparación con plantas control o tipo salvaje. Cuando dos o más plantas tienen "morfologías similares", "morfologías sustancialmente similares", "una morfología que es sustancialmente similar" , o son "similares desde el punto de vista morfológico", las plantas tienen formas o apariencias comparables, incluyendo características análogas, tales como dimensiones generales, altura, ancho, masa, masa de la raíz, forma, brillo, color, diámetro del tallo, tamaño de la hoja, dimensión de la hoja, densidad foliar, distancia entre los internodos, ramificación, ramificación de la raíz, cantidad y forma de las inflorescencias, y otras características macroscópicas, y las plantas individuales no se pueden distinguir fácilmente sobre la base de las características morfológicas por sí solas. La "modulación" hace referencia a un cambio en una actividad (biológica, química o inmunológica) o la vida media que resulta de la unión específica entre una molécula y una molécula de ácido nucleico o una proteína. El término "perfil de transcripción" hace referencia a los niveles de expresión de un conjunto de genes en una célula en un estado particular, particularmente en comparación con la expresión de los niveles de expresión del mismo conjunto de genes en una célula del mismo tipo en un estado de referencia. Por ejemplo, el perfil de transcripción de un polipéptido particular en una suspensión de células representa los niveles de expresión de un conjunto de genes en una célula en la que se ha eliminado o se sobreexpresa dicho polipéptido, en comparación con los niveles de expresión del mismo conjunto de genes en una suspensión de células que presenta niveles normales de dicho polipéptido. El perfil de transcripción puede presentarse como una lista de aquellos genes cuyo nivel de expresión difiere significativamente entre los dos tratamientos, y las relaciones de diferencia. También es posible evaluar y calcular las diferencias y las similitudes entre los niveles de expresión usando métodos estadísticos y de agrupamiento . Respecto de los noqueos de genes, como se lo usa en la presente, el término "noqueo" hace referencia a una planta o una célula vegetal en la que se ha alterado al menos un gen, donde la alteración resulta en una expresión o una actividad reducida del polipéptido codificado por dicho gen, en comparación con una célula control. El noqueo puede ser el resultado, por ejemplo, de alteraciones genómicas, que incluye transposones, cruzamiento superficial y recombinación homologa, construcciones antisentido, construcciones en el sentido del marco de lectura, construcciones de silenciamiento de ARN o interferencia de ARN. La inserción de ADN-T dentro de un gen es un ejemplo de una alteración fenotípica que puede abolir la expresión del gen. "La expresión ectópica" o "la expresión alterada", en referencia a un polinucleótido, indica que el patrón de expresión, por ejemplo, en una planta o un tejido vegetal transgénico, es diferente del patrón de expresión en una planta tipo salvaje o una planta de referencia de la misma especie. El patrón de expresión también puede compararse con un patrón de expresión de referencia en una planta tipo salvaje de la misma especie. Por ejemplo, el polinucleótido o el polipéptido se expresa en una célula o en un tipo de tejido distinto de la célula o el tipo de tejido en el que se expresa la secuencia en la planta tipo salvaje, o se expresa en un momento distinto del momento en que se expresa la secuencia en la planta tipo salvaje, o hay una respuesta diferente ante distintos agentes de inducción, tales como hormonas o señales ambientales, o se observan distintos niveles de expresión (mayores o menores) , en comparación con aquellos hallados en una planta tipo salvaje. El término también hace referencia a patrones de expresión alterados, que son producidos por la disminución de los niveles de expresión debajo del nivel de detección, o por la abolición completa de la expresión. El patrón de expresión resultante puede ser transitorio o estable, constitutivo o inducible. Además, en referencia a un polipéptido, los términos "expresión ectópica" o "expresión alterada" se pueden relacionar con niveles de actividad alterados como resultado de interacciones de los polipéptidos con moduladores exógenos o endógenos, o de interacciones con factores, o como resultado de la modificación química de los polipéptidos . El término "sobreexpresión" , como se lo usa en la presente, hace referencia a un mayor nivel de expresión de un gen en una planta, una célula vegetal o un tejido vegetal, en comparación con la expresión en una planta, una célula o un tejido tipo salvaje, en cualquier etapa de desarrollo o temporal del gen. La sobreexpresión puede ocurrir, por ejemplo, cuando los genes que codifican uno o más polipéptidos están bajo el control de un promotor fuerte (por ejemplo, la región de inicio de la transcripción 35S del virus del mosaico de la coliflor) . La sobreexpresión también puede estar bajo el control de un promotor inducible o con especificidad tisular. Por consiguiente, la sobreexpresión puede ocurrir en toda la planta, en tejidos específicos de la planta, o en presencia o ausencia de señales ambientales particulares, dependiendo del promotor usado. La sobreexpresión puede tener lugar en células vegetales que normalmente carecen de expresión de polipéptidos equivalentes o idénticos desde el punto de vista funcional a los presentes polipéptidos. La sobreexpresión también puede ocurrir en células vegetales en las que ocurre la expresión endógena de los presentes polipéptidos, o moléculas equivalentes desde el punto de vista funcional, pero esta expresión normal está a un nivel inferior. Por consiguiente, la sobreexpresión resulta en una producción mayor que la normal, o una "sobreproducción" del polipéptido en la planta, la célula o el tejido. El término "región reguladora de la transcripción" hace referencia a una secuencia de ADN reguladora que regula la expresión de uno o más genes en una planta cuando un factor de transcripción que tiene uno o más dominios de unión específicos se une a dicha secuencia de ADN reguladora. Los factores de transcripción poseen un dominio conservado. Los factores de transcripción también comprenden una subsecuencia de aminoácidos que forma un dominio de activación de la transcripción que regula la expresión de uno o más genes de tolerancia al estrés abiótico en una planta cuando el factor de transcripción se une a la región reguladora. "Rendimiento" o "rendimiento de planta" se refiere al crecimiento aumentado de la planta, crecimiento aumentado del cultivo, biomasa aumentada, y/o producción aumentada del producto de la planta, y es dependiente en cierta medida de la temperatura, tamaño de la planta, tamaño del órgano, densidad de siembra, luz, disponibilidad de agua y nutrientes, y de cómo la planta puede enfrentar diferentes tipos de estrés, tales como aclimatación a la temperatura y eficacia de uso de agua y nutrientes.

La "densidad de siembra" se refiere al número de plantas que se pueden hacer crecer por acre. Para especies de cultivo, la densidad de siembra o de población varía de un cultivo a otro, de una región de crecimiento a otra, y de año a año. Usando el maíz como un ejemplo, la densidad prevalente promedio en el 2000 estuvo en el rango entre 20.000 y 25.000 plantas por acre en Missouri, EE.UU. Una densidad de población más elevada deseada (una medida del rendimiento) sería al menos de 22.000 plantas por acre, y una densidad de población aún más elevada deseada sería de al menos 28.000 plantas por acre, más preferentemente al menos 34.000 plantas por acre, y aún más preferentemente al menos 40.000 plantas por acre. Las densidades prevalentes promedio por acre de otros pocos ejemplos de plantas de cultivo en los EE.UU. en el año 2000 fueron: trigo entre 1.000.000 y 1.500.000; arroz entre 650.000 y 900.000; soja entre 150.000 y 200.000, cañóla entre 260.000 y 350.000, girasol entre 17.000 y 23.000 y algodón 28.000 y 55.000 plantas por acre (Cheikh y col. (2003) Solicitud de Patente de los EE.UU. No. 20030101479) . Una densidad de población más elevada deseable para cada uno de estos ejemplos, así como de otras especies valiosas de plantas, sería de al menos 10% más elevada que la densidad o rendimiento prevalente promedio. Descripción de las realizaciones específicas Los factores de transcripción modifican la expresión de genes endógenos Un factor de transcripción puede incluir, sin limitaciones, cualquier polipéptido que active o reprima la transcripción de un único gen o una cantidad de genes. Como lo reconoce una persona con experiencia en la materia, los factores de transcripción se puede identificar por la presencia de una región o dominio de similitud o identidad estructural con una secuencia consenso específica o la presencia de un motivo de unión a ADN consenso específico (véase, por ejemplo, Riechmann y col. (2000a)). Los factores de transcripción de la planta de la presente invención pertenecen a la familia dedos de zinc caja B (Putterill y col. (1995)) y son factores de transcripción putativos. Generalmente, los factores de transcripción están involucrados en la diferenciación y proliferación celular y en la regulación del crecimiento. Por consiguiente, el especialista en la técnica reconocerá que al expresar las presentes secuencias en una planta, es posible cambiar la expresión de genes autólogos o inducir la expresión de genes introducidos. Al afectar la expresión de secuencias autólogas similares en una planta que tiene la actividad biológica de las presentes secuencias, o al introducir las presentes secuencias, es posible alterar el fenotipo de la planta para obtener uno con caracteres relacionados con el estrés osmótico mejorados. Las secuencias de la invención también se pueden usar para transformar una planta e introducir caracteres deseables no hallados en el cultivar o la cepa tipo salvaje. Luego pueden seleccionarse aquellas plantas que producen el grado de sobre o sobreexpresion más deseable para algunos genes blanco de interés, con la mejora coincidente de los caracteres. Las secuencias de la presente invención pueden ser de cualquier especie, particularmente especies vegetales, en una forma de ocurrencia natural, o pueden ser de cualquier fuente, sea natural, sintética, semisintética o recombinante . Las secuencias de la invención también pueden incluir fragmentos de las presentes secuencias de aminoácidos. Cuando se menciona una "secuencia de aminoácidos" para hacer referencia a una secuencia de aminoácidos de una molécula de proteína de ocurrencia natural, las "secuencias de aminoácidos" y los términos similares no pretenden limitar la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos nativa completa asociada con la molécula de proteína citada. Además de los métodos para modificar el fenotipo de una planta mediante el uso de uno o más polinucleótidos y polipéptidos de la invención descriptos en la presente, los polinucleótidos y los polipéptidos de la invención tienen una variedad de usos adicionales. Estos usos incluyen su uso en la producción (es decir, la expresión) recombinante de proteínas; como reguladores de la expresión de genes vegetales, como sondas de diagnóstico para la presencia de ácidos nucleicos complementarios o parcialmente complementarios (incluyendo para la detección de ácidos nucleicos codificantes naturales) ; como sustratos para reacciones adicionales, por ejemplo, reacciones de mutación, reacciones de PCR o semejantes; como sustratos para clonación, por ejemplo, incluyendo reacciones de digestión o unión; y para identificar moduladores exógenos o endógenos de los factores de transcripción. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN o ARN genómico, un transcripto (tal como un ARNm) , un ADNc, un producto de PCR, un ADN clonado, un ADN o un ARN sintético, o semejantes. El polinucleótido puede comprender una secuencia orientada en el sentido del marco de lectura o antisentido . La expresión de los genes que codifican los factores de transcripción que modifican la expresión de genes, polinucleótidos y proteínas endógenas es bien conocida en la técnica. Además, las plantas transgénicas que comprenden polinucleótidos aislados que codifican factores de transcripción también pueden presentar una expresión modificada de genes, polinucleótidos y proteínas endógenas.

Entre los ejemplos se incluyen Peng y col. (1997) y Peng y col. (1999). Además, muchos otros han demostrado que un factor de transcripción de Arabidopsis expresado en una especie de planta exógena provoca una respuesta fenotípica igual o muy similar. Véanse, por ejemplo, Fu y col. (2001); Nandi y col. (2000); Coupland (1995); y Weigel y Nilsson (1995) ) . En otro ejemplo, Mandel y col. (1992b), y Suzuki y col. (2001), indican que un factor de transcripción expresado en una planta de otra especie provoca una respuesta fenotípica de la secuencia endógena igual o muy similar, como se había predicho frecuentemente en los primeros estudios de los factores de transcripción de Arabidopsis en Arabidopsis (véanse Mandel y col. (1992a); Suzuki y col. (2001)). Entre otros ejemplos se incluyen Müller y col. (2001); Kim y col. (2001); Kyozuka y Shimamoto (2002); Boss y Thomas (2002); He y col. (2000); y Robson y col. (2001) . En aún otro ejemplo, Gilmour y col. (1998) describen un factor de transcripción de Arabidopsis AP2 , CBF1, que cuando se sobreexpresa en plantas transgénicas , incrementa la tolerancia al congelamiento de la planta. Además, Jaglo y col. (2001) identificaron secuencias en Brassica napus que codifican genes similares a CBF, y señalaron que los transcriptos de estos genes se acumulaban rápidamente en respuesta a una temperatura reducida. También se descubrió que los transcriptos que codifican proteínas similares a CBF se acumulan rápidamente como respuesta a temperaturas reducidas en trigo y también en tomate. Una alineación de las proteínas CBF de Arabidopsis, B. napus, trigo, centeno y tomate reveló la presencia de residuos de aminoácidos conservados consecutivos, PKK/RPAGRxKFxETRHP y DSAWR, que rodean los dominios de unión a ADN AP2/EREBP de las proteínas y las distinguen de otros miembros de la familia de proteínas AP2/EREBP (Jaglo y col (2001) ) . Los factores de transcripción actúan como mediadores de las respuestas celulares y controlan caracteres mediante la expresión alterada de genes que contienen secuencias de nucleótidos que actúan en cis, que son blancos del factor de transcripción introducido. En la técnica se sabe bien que el efecto de un factor de transcripción sobre las respuestas celulares o sobre un carácter celular es determinado por los genes particulares cuya expresión es alterada directa o indirectamente (por ejemplo, por una cascada de sucesos de unión de factores de transcripción y cambios en la transcripción) por la unión de un factor de transcripción. En un análisis global de la transcripción en el que se compara una condición de referencia con una en la que se sobreexpresa un factor de transcripción, el perfil de transcripción resultante asociado con la sobreexpresión del factor de transcripción se relaciona con el carácter o el proceso celular controlado por dicho factor de transcripción. Por ejemplo, se ha demostrado que el gen PAP2 y otros genes en la familia MYB controlan la biosíntesis de antocianina mediante la regulación de la expresión de genes de los que se sabe que participan en la vía de biosíntesis de antocianina (Bruce y col. (2000); y Borevitz y col. (2000)). Además, los perfiles de transcripción globales han sido usados exitosamente como herramientas de diagnóstico para estados celulares específicos (por ejemplo, cancerosos versus no cancerosos; Bhattacharjee y col. (2001); y Xu y col. (2001)). En consecuencia, para el especialista en la técnica será evidente que la similitud del perfil de transcripción al sobreexpresar los distintos factores de transcripción indicaría la similitud de las funciones de los factores de transcripción . Polipéptidos y polinucleótidos de la invención La presente invención incluye los factores de transcripción putativos (TFs) , y polinucleótidos aislados o recombinantes que codifican para polipéptidos, o polipéptidos variante de secuencia nueva o polinucleótidos que codifican para polipéptidos variantes de secuencia nueva derivados de las secuencias específicas provistas en el Listado de Secuencias; los polinucleótidos recombinantes de la invención se pueden incorporar en vectores de expresión con el propósito de producir plantas transformadas. También se proveen métodos para modificar el rendimiento de una planta por modificación de la masa, tamaño o número de órganos de la planta o semilla de una planta controlando varios procesos celulares, y por incremento de la resistencia de una planta a tipos de estrés abióticos. Estos métodos se basan en la capacidad de alterar la expresión de moléculas reguladoras críticas que pueden estar conservadas entre plantas de diversas especies. Las moléculas reguladoras conservadas relacionadas pueden haber sido descubiertas originalmente en un sistema modelo, tal como Arabidopsis y homólogos, y las moléculas funcionales pueden haber sido descubiertas posteriormente en plantas de otras especies. Estas últimas se pueden usar posteriormente para conferir un mayor rendimiento o tolerancia a estrés abiótico en plantas de diversas especies. Se identificaron ejemplos de polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención en la base de datos GenBank de Arabidopsis thaliana, usando programas y parámetros de análisis de secuencias disponibles para el público. Las secuencias identificadas inicialmente se caracterizaron además para identificar secuencias que comprendían porciones específicas de secuencia, que correspondían a motivos de secuencia presentes en familias de polipéptidos conocidos. Además, se identificaron otros ejemplos de polinucleótidos que codificaban los polipéptidos de la invención en la base de datos de plantas GenBank, con el uso de programas y parámetros de análisis de secuencias disponibles para el público. Las secuencias identificadas inicialmente se caracterizaron además para identificar secuencias que comprendían porciones específicas de secuencia, que correspondían a motivos de secuencia presentes en familias de polipéptidos conocidos.

Se identificaron otros polinucleótidos de la invención analizando bibliotecas de ADNc de Arabidopsis thaliana y/u otras plantas con sondas correspondientes a polipéptidos conocidos, bajo condiciones de hibridación de severidad baja. Luego se recuperaron secuencias adicionales, incluyendo secuencias codificantes completas, mediante procedimientos de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) , usando un conjunto de elementos disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. De ser necesario, se realizan múltiples procedimientos de RACE para aislar los extremos 5' y 3'. Luego se recuperó el ADNc completo con una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional entre los extremos, usando cebadores específicos para los extremos 5' y 3' aislados. Se proporcionan ejemplos de secuencias en listado de secuencias. Muchas de las secuencias en el listado de secuencias, derivadas de plantas de diversas especies, han sido expresadas en forma ectópica en plantas con sobreexpresión. Luego se observaron cambios en una o más características o caracteres de las plantas, y se estableció que conferían un mayor rendimiento y/o una mayor tolerancia al estrés abiótico. Por consiguiente, los polinucleótidos y los polipéptidos se pueden usar para mejorar características deseables de las plantas. Los polinucleótidos de la invención también se expresaron en forma ectópica en células vegetales con sobreexpresión, y se observaron los cambios en los niveles de expresión de una cantidad de genes, polinucleótidos y/o proteínas de las células vegetales. Entonces, los polinucleótidos y los polipéptidos se pueden usar para cambiar los niveles de expresión de genes, polinucleótidos y/o proteínas en plantas o células vegetales. Los datos presentados en la presente documentación representan los resultados obtenidos en experimentos con polinucleótidos y polipéptidos, que se pueden expresar en plantas con el fin de reducir las pérdidas de rendimiento que surgen del estrés biótico y abiótico. Información conocida sobre G1988, ciado G1988, y secuencias relacionadas G1988 pertenece a la familia del tipo CONSTANS de las proteínas dedos de zinc, que se definió en base a un dominio dedo de zinc conocido como caja B. La caja B tiene homología con un dominio de interacción proteína-proteína que se encuentra en factores de transcripción de animales (Robson y col., 2001; Borden, 1998; Torok y Etkin, 2001) y el domino B de G1988 y sus miembros de ciado homólogo relacionado funcionan con la misma capacidad de interacción proteína-proteína. Las proteínas del tipo CONSTANS contienen uno o dos motivos caja B N-terminal (el ciado G1988 contiene un solo dominio caja B N-terminal) . G1988 y sus homólogos de otras especies comparten motivos C-terminal conservados que definen un ciado claro que es distinto de otras proteínas caja B, y generalmente contiene los residuos característicos identificados por triángulos en las Figuras 4D y 4E, y por SEQ ID NOs : 62, 57, y 58. G1988 se expresa en muchos tejidos. G1988 y sus homólogos son regulados en forma diurna. Como se describe más abajo en los Ejemplos, la expresión constitutiva de G1988 en Arabidopsis modula diversos procesos de crecimiento de la planta, incluso el alargamiento de hipocotiledones , pecíolos extendidos y hojas erguidas, floración temprana; crecimiento mejorado de raíces y/o brotes en medio con limitación de fosfato; mayor número de raíces secundarias en medio control, crecimiento mejorado y antocianina reducida en medio de bajo nitrógeno/alta sacarosa suplementado con glutamina, crecimiento de raíces mejorado en medio conteniendo sal, y crecimiento de raíces mejorado medio conteniendo polietilenglicol, en comparación con las plantas control. La sobreexpresion de G1988 en plantas de soja ha mostrado dar como resultado un aumento estadísticamente significativo del rendimiento en los ensayos en campo (véase Figura 6 y Ejemplos presentados más abajo) en comparación a los controles de línea parental. El ciado G1988 incluye varias secuencias que descienden de una secuencia ancestral común, como se muestra en el árbol filogenético que se muestra en la Figura 3. La secuencia ancestral se representa por el nodo del árbol indicado por la flecha en la Figura 3 que tiene un valor bootstrap de 74. Entre los ejemplos de miembros del ciado se incluyen esas secuencias dentro de la caja y unidas por G4011 y G4009 en la Figura 3. Los miembros polipeptídicos del ciado G1988 examinados a la fecha, incluso G1988 y las secuencias filogenéticamente relacionadas de diversas especies, comprenden muchos rasgos estructurales característicos, incluso un dominio B altamente conservado, indicados en las Figuras 4A y 4B, y varias características o residuos característicos por fuera y más cerca del C-terminal que el dominio B. Los residuos característicos se indican por triángulos oscuros pequeños en las Figuras 4D y 4E. Estos residuos comprenden, en orden desde el N al C terminal: W-X3-G (SEQ ID NO: 62, donde X representa cualquier aminoácido; ver en la Figura 4D) R-X3-A-X3-W (SEQ ID NO: 57, donde X representa cualquier aminoácido; ver en la Figura 4D) seguido por: EGWXE (SEQ ID NO: 58; donde X representa cualquier aminoácido; ver en la Figura 4E) . De esta manera, una secuencia de ciado G1988 se puede definir como que tiene un dominio B altamente conservado al menos 56% idéntico en su secuencia de aminoácidos a SEQ ID NO: 45. Los miembros del ciado G1988 examinados hasta aquí además se pueden definir por tener residuos de aminoácidos caracterizados por un residuo de triptofano y un residuo de glicina en las posiciones que corresponden al primer y quinto residuo que se muestran en la Figura 4D más cercanos al extremo C-terminal que dicho dominio B, y/o por tener SEQ ID NO: 57 más cercana al extremo C-terminal que dicho residuo triptofano, y/o que tiene SEQ ID NO: 58 más cercana al extremo C-terminal que SEQ ID NO: 57. Es probable que la expresión ectópica del producto G1988 pueda afectar la señalización por luz, o vías hormonales corriente abajo. En base a las observaciones descriptas más arriba, G1988 parece que se encuentra involucrado en la foto morfogénesis y crecimiento y desarrollo de la planta. Por lo tanto, su sobreexpresión puede mejorar el vigor de la planta, explicando de esta manera las mejoras en los rendimientos vistos en las plantas de soja 35S::G1988 según se observa más abajo. Se han encontrado varias secuencias en otras especies de plantas que están estrechamente relacionadas con G1988. La Tabla 1 muestra varios polipéptidos de la invención e incluye la SEQ ID NO: (Columna 1) , las especies de las que se derivó la secuencia y el Identificador del Gen ("GID"; Columna 2) , la identidad por ciento del polipéptido en la Columna 1 respecto de la longitud completa del polipéptido G1988, SEQ ID NO : 1, determinado por un análisis con BLASTp con un valor por omisión de longitud de palabra ( ) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de calificación BLOSUM62, Henikoff & Henikoff (1989, 1991) (Columna 3), coordenadas de los residuos de aminoácidos para los dominios ZF caja B conservados, en las coordenadas de aminoácidos comenzando en el N-terminal, de cada una de las secuencias (Columna 4) , las secuencias del dominio ZF caja B conservado de los respectivos polipéptidos (Columna 5) ; SEQ ID NO: de cada uno de los dominios ZF caja B (Columna 6) , y la identidad del dominio conservado por ciento en la Columna 5 respecto al dominio conservado de la secuencia G1988 de Arabidopsis, SEQ ID NO: 45 (Columna 7) . Tabla 1. Dominios conservados de G1988 y secuencias estrechamente relacionadas Columna 1 SEQ ID NO: del Polipéptido Columna 2 Especies / GID No. Columna 3 Identidad por ciento de polipéptido en Columna 1 con G1988 Columna 4 Dominio Z caja B en coordenadas de aminoácido Columna 5 Dominio ZF caja B Columna 6 SEQ ID NO: del dominio ZF caja B Columna 7 Identidad por ciento de dominio ZF caja B en Columna 5 con el dominio conservado de G1988 2 At/G1988 100% 5-50 CELCGAEADLHCAADSAFLCRSCDAKFHASNFLFARHFRRVICPNC 45 100% 18 Zm/G4297 30% 14-55 CELCGGAAAVHCAADSAFLCPRCDAKVHGANFLASRHVRRRL 53 70% CELCGGAAAVHCAADSAFLCLRCDAKVHGANFLASRHVRRRL 56 70% 16 Os/G4012 32% 15-56 CELCGGVAAVHCAADSAFLCLVCDDKVHGANFLASRHRRRRL 52 67% CELCGGVAAVHCAADSAFLCLVCDDKVHGANFLASRHPRRR 54 67% 14 Os/G4011 33% 8-49 CALCGAAAAVHCEADAAFLCAACDAKVHGANFLASRHHRRRV 51 65% 8 Zm/G4000 30% 20-61 CELCGGAAAVHCAADSAFLCLRCDAKVHGA FLASRHVRRRL 48 65% 66 Ta/Tal988 33% 13-54 CELCGGVAAVHCAADSAFLCVPCDAKVHGA FLASRHLRRRL 68 61% 4 Gm/G4004 33% 6-51 CELCHQLASLYCPSDSAFLCFHCDAAVHAANFLVARHLRRLLCSKC 46 60% 6 Gm/G4005 32% 6-51 CELCDQQASLYCPSDSAFLCSDCDAAVHAA FLVARHLRRLLCSKC 47 60% 10 Ct/G4007 45% 5-50 CELCSQEAALHCASDEAFLCFDCDDRVHKANFLVARHVRQTLCSQC 49 58% 22 Le/G4299 36% 9-54 CELCNDQAALFCPSDSAFLCFHCDAKVHQANFLVARHLRLTLCSHC 55 58% 12 Pt/G4009 40% 6-51 CELCKGEAGVYCDSDAAYLCFDCDS VHNANFLVARHIRRVICSGC 50 56% Abreviaciones de las especies para la Tabla 1 : At -Arabidopsis thaliana; Ct - Citrus sinensis; Gm - Glycine max; Le - Lycopersicon esculentum; Os - Oryza sativa; Pt -Populus trichocarpa; Ta - Triticura aestivum; Zm - Zea mays . 1 fenotipo observado en plantas Arabidopsis y de soja Las Tablas 2 y 3 listan algunas de las características morfológicas y fisiológicas que confirió la sobreexpresion de G1988 u ortólogos de diferentes especies de plantas, incluso Arabidopsis, soja, espino, arroz, y tomate, a plantas de Arabidopsis, soja o maíz, en experimentos realizados hasta la fecha. Todas las observaciones están realizadas con respecto a las plantas control que no sobreexpresaron un factor de transcripción del ciado G1988.

Tabla 2. Homólogos G1988 y características relacionadas con la morfología potencialmente valiosas Col . 1 GID (SEQ ID No. ) Especies Col. 2 Respuesta a la luz reducida: hipocotiledones alargados, pecíolos largos u hojas erguidas Col. 3 Rendimiento aumentado * Col . 4 Aumento de Raíces secundarias Col . 5 Desarrollo y/o tiempo de floración retrasado G1988 (2) At +1 +3 +1 +1,3 G4004 (4) Gm +1 n/d n/d +1 G4005 (6) Gm +1 n/d n/d +1 G4000 (8) Zm +1 n/d n/d +1 G4012 (16) Os +1 n/d n/d +1 G4299 (22) Sl +1 n/d n/d +1 * el rendimiento se puede aumentar por mejoras morfológicas y/o tolerancia aumentada a diferentes tipos de estrés fisiológicos Tabla 3. Homólogos G1988 y características fisiológicas potencialmente valiosas Col. 1 GID (SEQ ID No. ) Especies Col. 2 Mejor germinación en condiciones frías Col. 3 Tolerancia aumentada a la falta de agua Col. 4 Sensado al C/N alterado o tolerancia a bajo N Col. 5 Tolerancia aumentada a bajo P Col. 6 Tolerancia aumentada a estrés hiperosmotico (sacarosa) G1988 (2) At +3 +1, 3 +1 +1 +1 G4004 (4) Gm +1,2,3 n/d +1,2 -1 G4005 (6) Gm -1 +1 -1 G4000 (8) Zm n/d n/d n/d n/d n/d G4012 (16) Os n/d n/d n/d n/d n/d G4299 (22) SI n/d n/d n/d n/d n/d Abreviaciones de especies para las Tablas 2 y 3 : At -Arabidopsis thaliana; Gm - Glycine max; Os - Oryza sativa; SI - Solanum lycopersicum; Zm - Zea mays (+) indica resultado de ensayo positivo/más tolerante 0 fenotipo observado, en relación a los controles. (-) indica resultado de ensayo negativo/menos tolerante o fenotipo observado, en relación a los controles celda vacía - resultado del ensayo similar a los controles 1 fenotipo observado en plantas Arabidopsis 2 fenotipo observado en plantas de maíz 3 fenotipo observado en plantas de soja n/d - ensayo aún no realizado o completado N - sensado de C/N o tolerancia a bajo nitrógeno alterado P - fósforo La tolerancia a la falta de agua se indicó en ensayos de sequía basados en tierra o de desecamiento basado en placas El estrés hiperosmótico se indicó por tolerancia a sacarosa 9,4% mayor que los controles La tolerancia aumentada al frío se indicó por tolerancia a 8o C durante la germinación o el crecimiento, mayor que los controles Los ensayos de sensado de C/N alterado o de tolerancia a bajo nitrógeno en medio base sin nitrógeno con 3% de sacarosa o medio base sin nitrógeno con 3% de sacarosa y 1 mM de glutamina; para el ensayo de limitación de nitrógeno, la fuente de nitrógeno de medio MS 80% se redujo a mg/L de NH4N03. La tolerancia aumentada a bajo P se indicó por un mejor crecimiento en medio MS desprovisto de fuente de fósforo Un fenotipo de sensibilidad a la luz reducida se indicó por pecíolos más largos, hipocotiledones más largos y/u hojas más erguidas en relación con las plantas control n/d - ensayo aún no realizado o completado Ortólogos y parálogos Las secuencias homologas descriptas previamente pueden comprender secuencias ortólogas o parálogas . Los especialistas en la técnica conocen varios métodos diferentes para identificar y definir estas secuencias con funciones homologas. Los métodos generales para identificar ortólogos y parálogos, que incluyen métodos filogenéticos , métodos de similitud de secuencias y de hibridación, se describen en la presente; un ortólogo o parálogo, incluyendo equiválogos, se puede identificar mediante uno o más de los métodos que se describen más adelante. Según describe Eisen (1998) Genome Res. 8: 163-167, se puede utilizar la información evolutiva para predecir la función genética. Es común que los grupos de genes que tienen secuencias homologas tengan funciones diversas, aunque habitualmente relacionadas. Sin embargo, en muchos casos, la identificación de homólogos no es suficiente para efectuar predicciones específicas porque no todos los homólogos cumplen la misma función. Por consiguiente, un análisis inicial de la relación funcional basado en la similitud de secuencias solamente no proporcionará un medio para determinar dónde termina la similitud y comienza la relación funcional. Afortunadamente, es sabido en la técnica que se puede clasificar la función de una proteína usando un análisis filogenético de los árboles de genes combinado con la especie correspondiente. Las predicciones funcionales se pueden mejorar en gran parte centrando la atención en la manera en que los genes se volvieron similares en cuanto a secuencia (es decir, por procesos evolutivos) en lugar de en la propia similitud de secuencias (Eisen, supra) . De hecho, existen muchos ejemplos específicos en los cuales se ha demostrado que la función genética se correlaciona bien con la filogenia de los genes (Eisen, supra) . Por lo tanto, el primer paso para efectuar predicciones funcionales es la generación de un árbol filogenético que representa ha historia evolutiva del gen de interés y sus homólogos . Dichos árboles son distintos de agrupaciones y otros medios para caracterizar la similitud de secuencias porque son inferidos mediante técnicas que ayudan a convertir patrones de similitud en relaciones evolutivas. Después de inferir el árbol de genes, se superponen las funciones determinadas biológicamente de los distintos homólogos sobre el árbol. Finalmente, se usa la estructura del árbol y las posiciones filogenéticas relativas de genes de función diferente para trazar la historia de los cambios funcionales, que luego se usa para predecir las función de genes no caracterizados [todavía] " (Eisen, supra) . Dentro de una planta de la misma especie, la duplicación de genes puede producir dos copias de un gen particular, lo que da lugar a dos o más con una secuencia similar, y comúnmente con una función similar, conocidas como parálogos . Por consiguiente, un parálogo es un gen similar formado por duplicación dentro de la misma especie. Generalmente, los parálogos se agrupan unos con otros o en el mismo ciado (un grupo de genes similares) cuando la filogenia de una familia de genes se analiza con el uso de programas tales como CLUSTAL (Thompson y col. (1994); Higgins y col. (1996)). También es posible identificar grupos de genes similares con análisis BLAST por pares (Feng y Doolittle (1987) ) . Por ejemplo, todos los miembros de un ciado de dominios de factores de transcripción MADS muy similares de Arabidopsis comparten una función común en el tiempo de floración (Ratcliffe y col. (2001)), y los miembros de un grupo de dominios de factores de transcripción AP2 muy similares de Arabidopsis participan en la tolerancia de las plantas al congelamiento (Gilmour y col. (1998)). El análisis de los grupos de genes similares con funciones similares que están dentro de un ciado puede proveer subsecuencias que son particulares para el ciado. Estas subsecuencias, conocidas como secuencias consenso, no solamente se pueden usar para definir las secuencias dentro de cada ciado, sino que también definen las funciones de estos genes; los genes dentro de un ciado pueden contener secuencias parálogas o secuencias ortólogas que comparten la misma función (véase también, por ejemplo, Mount (2001) ) Las secuencias de los genes de los factores de transcripción están conservadas entre diversas líneas de especies de eucariotas (Goodrich y col. (1993); Lin y col. (1991); Sadowski y col. (1988)). Las plantas no son una excepción a esta observación: las plantas de diversas especies poseen factores de transcripción que tienen secuencias y funciones similares. La especiación, la producción de nuevas especies a partir de una especie progenitora, también puede dar lugar a dos o más genes con una secuencia y una función similar. Estos genes, denominados ortólogos, comúnmente tienen una función idéntica dentro de sus plantas huésped, y comúnmente pueden intercambiarse entre las especies, sin que haya una pérdida de función. Como las plantas tienen ancestros comunes, muchos genes en una planta de cualquier especie tendrán un gen ortólogo correspondiente en una planta de otra especie.

Una vez que se ha construido un árbol filogenético para una familia de genes de una especie con el uso de un programa, tal como CLUSTAL (Thompson y col. (1994); Higgins y col. (1996) ) , es posible colocar las secuencias ortólogas potenciales en el árbol filogenético y determinar sus relaciones con genes de las especies de interés. Las secuencias ortólogas también se pueden determinar con una estrategia BLAST recíproca. Una vez que se ha determinado una secuencia ortóloga, es posible deducir la función del ortólogo a partir de la función identificada de la secuencia de referencia. Con el uso de un análisis filogenético, una persona con experiencia en la materia podría reconocer que la habilidad para deducir funciones similares conferidas por polipéptidos estrechamente relacionados es predecible. Esta previsibilidad ha sido confirmada por muchos estudios propios de los inventores en donde encontraron que una gran variedad de polipéptidos tienen secuencias homologas estrechamente relacionadas u ortólogas que funcionan como la primera secuencia de referencia estrechamente relacionada. Por ejemplo, distintos factores de transcripción, que incluyen: (i) la secuencia G47 de la familia AP2 de Arabidopsis (que se encuentra en la Patente de los EE.UU. 7.135.616), una secuencia filogenéticamente relacionada de soja, y dos homólogos filogenéticamente relacionados de arroz, todos pueden conferir mayor tolerancia a las sequías, estrés hiperosmótico, o floración retrasada en comparación con plantas ; (ii) la secuencia G481 de la familia CCAAT de Arabidopsis (que se encuentra en la publicación de patente PCT WO2004076638) , y varias filogenéticamente relacionadas de eudicotiledoneas y monocotiledóneas pueden conferir mayor tolerancia al estrés relacionado con las sequías en comparación con las plantas control; (iii) la secuencia G682 relacionada a Myb de Arabidopsis (que se encuentra en las Patentes de los EE.UU. 7.223.904 y 7.193.129) y varias filogenéticamente relacionadas de eudicotiledoneas y monocotiledóneas pueden conferir mayor tolerancia al calor, estrés relacionado con sequías, frío, y sal en comparación con las plantas control ; (iv) la secuencia G1274 de la familia RKY de Arabidopsis (que se encuentra en la Patente de los EE.UU. 7.196.245) y varias estrechamente relacionadas de eudicotiledoneas y monocotiledóneas han mostrado que confieren una tolerancia aumentada a la deprivación de agua, y (v) la secuencia G3456 de la familia AT-hook de soja (que se encuentra en la publicación de Patentes de los EE.UU. 20040128712A1) y varias estrechamente relacionadas de eudicotiledóneas y monocotiledóneas , aumentan la biomasa en comparación con plantas control cuando estas secuencias se sobreexpresan en plantas. Las secuencias de los polipéptidos pertenecen a distintos ciados de polipéptidos que incluyen miembros de diversas especies. En cada caso, la mayoría o todas las secuencias miembros del ciado derivadas de eudicotiledóneas y monocotiledóneas han mostrado que confieren un aumentado rendimiento o tolerancia a uno o más tipos de estrés abióticos cuando las secuencias se sobreexpresan. Cada uno de estos estudios demuestran que los genes evolutivamente conservados de diversas especies probablemente funcionen de manera similar (es decir, por regulación de secuencias blanco similares y por control de las mismas características) , y que los polinucleótidos de unas especies se pueden transformar a especies de plantas estrechamente relacionadas o lejanamente relacionadas para conferir o mejorar características. Como se muestra en la Tabla 1, los polipéptidos que son filogenéticamente relacionados a los polipéptidos de la invención pueden tener dominios conservados que comparten al menos 56%, 58%, 60%, 65%, 67%, ó 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ó 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos, y tener funciones similares en aquellos que los polipéptidos de la invención pueden, cuando se sobreexpresan, conferir al menos una actividad regulatoria seleccionada del grupo formado por mayor rendimiento, , crecimiento más rápido, mayor tamaño, raíces secundarias aumentadas, mayor tolerancia al frío, mayor tolerancia a la deprivación de agua, conductancia del estoma reducida, sensado de C/N alterado o tolerancia aumentada a bajo nitrógeno, tolerancia aumentada a bajo fósforo, tolerancia aumentada al estrés hiperosmótico, y/o sensibilidad a la luz reducida en comparación con una planta control. A nivel de los nucleótidos, las secuencias de la invención generalmente compartirán una identidad de secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente 30% ó 40%, preferiblemente al menos aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70% o aproximadamente 80% de identidad de secuencia, y más preferiblemente aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o aproximadamente 97% o más identidad de secuencia con una o más de las secuencias completas indicadas, o con una secuencia indicada, excluyendo o fuera de la o las regiones que codifican una secuencia consenso o un sitio de unión a ADN consenso conocido, o fuera de la o las regiones que codifican uno o todos los dominios conservados. La degeneración del código genético permite realizar grandes variaciones en las secuencias de nucleótidos, mientras se mantiene la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada . El porcentaje de identidad se puede determinar por medios electrónicos, por ejemplo, con el uso del programa MEGALIGN (DNASTAR, Inc. Madison, Wis.). El programa MEGALIGN puede crear alineaciones entre dos o más secuencias de acuerdo con diferentes métodos, por ejemplo, el método clustal (véase, por ejemplo, Higgins y Sharp (1988) . El algoritmo de grupos clustal agrupa a las secuencias en agrupaciones examinando las distancias entre todos los pares. Los conjuntos se alinean por pares, y luego en grupos. Es posible usar otros algoritmos o programas de alineamiento, incluyendo FASTA, BLAST, o ENTREZ, FASTA y BLAST, los cuales se pueden usar para calcular el porcentaje de similitud. Por consiguiente; están disponibles como parte del conjunto de análisis de secuencia GCG (Universidad de isconsin, Madison, I) , y se pueden usar con o sin los parámetros por omisión. ENTREZ está disponible en el Centro Nacional de Información de Biotecnología. En una realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar con el programa GCG, con una ponderación de falta de coincidencia de 1, por ejemplo, cada falta de coincidencia de aminoácidos se pondera como si fuera una falta de coincidencia de único aminoácido o nucleótido entre las s secuencias (véase USPN 6.262.333). El software para realizar análisis BLAST está disponible para el público, por ejemplo, en el Centro Nacional de Información de Biotecnología (véase el sitio de Internet http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo comprende identificar primero los pares de secuencia de puntaje alto (HSP) por identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen algún puntaje T límite de valor positivo cuando son alineadas con una palabra de la misma longitud en la secuencia de la base de datos. T se conoce como el valor de calificación de relación (Altschul (1990); Altschul y col. (1993)). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para hallar HSP más largas que contengan a las mismas. Los aciertos de palabra se extienden luego en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia por tanto como se pueda incrementar el puntaje de alineación acumulada. Los puntajes acumulados se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntaje de recompensa por cada par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntaje de penalidad para residuos no coincidentes; siempre < 0) . Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntaje para calcular el puntaje acumulado. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: el valor de alineación acumulativa cae debajo en una cantidad X respecto del valor máximo alcanzado; cuando el valor acumulativo disminuye hasta cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de valor negativo; o cuando se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST , T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como parámetros por omisión una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un corte de 100, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por omisión una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de calificación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff (1989, 1991) ) . A menos que se indique lo contrario, para las comparaciones de polinucleótidos predichos, la "identidad de secuencia" hace referencia al % de identidad de secuencia generado a partir de una matriz tblastx, usando la versión del NCBI del algoritmo con los parámetros por omisión, con alineamientos con faltas de coincidencia con el filtro "desactivado" (véase, por ejemplo, el sitio de Internet http : // ww. ncbi . nlm . nih . gov/ ) . Se describen otras técnicas de alineamiento en Doolittle (1996) . Preferiblemente se utiliza un programa de alineación que permite crear faltas de coincidencia en la secuencia para alinear las secuencias. El algoritmo de Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permites crear faltas de coincidencia en los alineamientos de secuencias (véase Shpaer (1997) . También se puede emplear el programa GAP, usando el método de alineación de Needleman y Wunsch, para alinear secuencias. En una estrategia de búsqueda alternativa se usa el software MPSRCH, que se ejecuta en una computadora MASPAR . MPSRCH usa un algoritmo de Smith-Waterman para calificar secuencias con una computadora masivamente paralela. Este enfoque mejora la capacidad de obtener coincidencias con relaciones distantes, y tolera especialmente bien las faltas de coincidencia pequeñas y los errores en las secuencias de nucleótidos. Es posible usar secuencias de aminoácidos codificadas por ácidos nucleicos para realizar búsquedas en bases de datos de proteínas y ADN. El porcentaje de similitud entre dos secuencias de polipéptidos , por ejemplo, la secuencia A y la secuencia B, se calcula dividiendo la longitud de la secuencia A, menos la cantidad de residuos no coincidentes en la secuencia A, menos la cantidad de residuos no coincidentes en la secuencia B, por la suma de los residuos coincidentes entre la secuencia A y la secuencia B, multiplicada por cien. En la determinación del porcentaje de similitud no se incluyen faltas de coincidencia de similitud baja o nula entre las dos secuencias de aminoácidos. El porcentaje de identidad entre secuencias de polinucleótidos también puede contarse o calcularse con otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, el método de Jotun Hein (véase, por ejemplo, Hein (1990)). La identidad entre secuencias también se puede determinar con otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, alterando las condiciones de hibridización (véase la Solicitud de Patente de los EE.UU. N° 20010010913) . Por consiguiente, en la invención se proveen métodos para identificar una secuencia similar o par loga, ortóloga u homologa a uno o más polinucleótidos mencionados en la presente, o uno o más polipéptidos blanco codificados por los polinucleótidos, o mencionados de otro modo en la presente, y pueden incluir unir o asociar un fenotipo de una planta dada o la función de un gen dado con una secuencia. En los métodos se provee una base de datos de secuencias (en forma local, en Internet o a través de una red interna) , y se realiza una búsqueda contra la base de datos de secuencias, con el uso de las secuencias relevantes en la presente, y fenotipos de plantas o funciones de genes asociados. Además, es posible usar una o más secuencias de polinucleótidos, o uno o más polipéptidos codificados por las secuencias de polinucleótidos, para realizar búsquedas contra bases de datos BLOCKS (Bairoch y col. (1997)), PFAM y otras bases de datos que contienen motivos, secuencias y funciones de genes identificados y anotados con anterioridad. Es posible usar métodos que permiten realizar una búsqueda de patrones de secuencias primarias con penalidades de falta de coincidencia de estructuras secundarias (Smith y col. (1992)), y también algoritmos, tales como Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; Altschul (1990); Altschul y col. (1993)), BLOCKS (Henikoff y Henikoff (1991)), modelos de arkov ocultos (HMM; Eddy (1996) ; Sonnhammer y col. (1997)) y semejantes, para manipular y analizar secuencias de polinucleótidos y polipéptidos codificados por los polinucleótidos. Estas bases de datos, algoritmos y otros métodos son bien conocidos en la técnica y se describen en Ausubel y col. (1997) , y en Meyers (1995) . Otro método para identificar o confirmar que las secuencias homologas específicas controlan la misma función comprende comparar el o los perfiles de transcripción obtenidos con la sobreexpresión o el noqueo de dos o más polipéptidos relacionados. Como los perfiles de transcripción son diagnósticos de estados celulares específicos, el especialista en la técnica apreciará que los genes que tienen un perfil de transcripción muy similar (por ejemplo, con más de 50% de transcriptos regulados en común, o con más de 70% de transcriptos regulados en común, o con más de 90% de transcriptos regulados en común) tendrán funciones muy similares. Fowler y Thomashow (2002), han mostrado que tres genes parálogos de la familia AP2 (CBF1, CBF2 y CBF3) son inducidos por tratamiento con frío, y cada uno de ellos pueden acondicionar una tolerancia mejorada al congelamiento, y todos tienen perfiles de transcripción muy similares. Una vez que se ha demostrado que un polipéptido proporciona una función específica, su perfil de transcripción se convierte en una herramienta de diagnóstico para determinar si los parálogos o los ortólogos tienen la misma función. Adicionalmente , se pueden utilizar métodos que usen alineamiento manual de secuencias similares u homologas a una o más secuencias de polinucleótidos o a uno o más polipéptidos codificados por las secuencias de polinucleótidos para identificar regiones de similitud y dominios dedos de zinc caja B. Estos métodos manuales son bien conocidos por los especialistas en la técnica, y pueden incluir, por ejemplo, comparaciones de estructura terciaria entre la secuencia de un polipéptido codificado por un polinucleótido, que comprende una función conocida, y la secuencia de un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos que tiene una función que aún no ha sido determinada. Estos ejemplos de estructuras terciarias pueden comprender hélices alfa, láminas beta, hélices antipáticas, motivos de cierre de leucina, motivos de dedos de zinc, regiones ricas en prolina y motivos de repetición de cisteína predichos y semejantes. Los ortólogos y los parálogos de los polipéptidos descriptos hasta la actualidad se pueden clonar con el uso de composiciones provistas en la presente invención, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Los ADNc se pueden clonar con el uso de ARNm de una célula o un tejido vegetal que expresa una de las presentes secuencias. Las fuentes de ARNm apropiadas se pueden identificar realizando búsquedas en transferencias Northern con sondas diseñadas a partir de las secuencias de la presente, después de lo cual se prepara una biblioteca a partir del ARNm obtenido a partir de una célula o un tejido positivo. Luego se aisla el ADNc que codifica el polipéptido usando, por ejemplo, PCR, con cebadores diseñados a partir de la secuencia de un gen descripto en la presente, o con un sondeo con un ADNc parcial o completo, o con uno o más conjuntos de sondas degeneradas basadas en las secuencias descriptas. La biblioteca de ADNc se puede usar para transformar células vegetales. La expresión de los ADNc de interés se detecta usando, por ejemplo, microordenamientos , transferencias Northern, PCR cuantitativa o cualquier otra técnica para monitorear los cambios en la expresión. Los clones genómicos pueden aislarse usando técnicas similares a éstas. En la Tabla 1 y el listado de secuencias se presentan ejemplos de ortólogos de las secuencias de polipéptidos de Arabidopsis, y sus ortólogos con funciones similares. Además de las secuencias en la Tabla 1 y el listado de secuencias, en la invención se incluyen secuencias de nucleótidos aisladas que presentan similitudes filogenéticas y estructurales con las secuencias indicadas en el listado de secuencias, y que pueden funcionar en una planta incrementando el rendimiento y/o la tolerancia al estrés abiótico, cuando se las expresa en forma ectópica en una planta. Como una cantidad significativa de estas secuencias están relacionadas unas con otras desde el punto de vista de la filogenia y la secuencia, y se ha demostrado que incrementan el rendimiento y/o la tolerancia al estrés abiótico de una planta, aquellos entrenados en la técnica podrán predecir que otras secuencias similares, relacionadas desde el punto de vista filogenético, que están dentro de los presentes ciados de polipéptidos, también desempeñarán funciones similares cuando se expresen en forma ectópica. Identificación de polinucleótidos o ácidos nucleicos por hibridación Es posible identificar polinucleótidos homólogos a las secuencias ilustradas en el listado de secuencias y las tablas, por ejemplo, por hibridación mutua bajo condiciones estrictas o muy estrictas. Los polinucleótidos de cadena simple hibridizan cuando pueden asociarse sobre la base de una variedad de fuerzas fisicoquímicas bien caracterizadas, tales como uniones hidrógeno, exclusión con solventes, agrupamiento de bases y semejantes. La severidad de una hibridación refleja el grado de identidad de secuencia de los ácidos nucleicos participantes, de modo que a mayor severidad, más similares son las dos cadenas de polinucleótidos. La severidad es afectada por una variedad de factores, incluyendo la temperatura, la concentración de sal y la composición, los aditivos orgánicos y no orgánicos, los solventes, etcétera, presentes en las soluciones y las incubaciones de hibridación y lavado (y una cantidad de éstas) , como se describe con mayor detalle en las referencias que se citan más adelante (por ejemplo, Sambrook y col. (1989); Berger y Kimmel (1987); y Anderson y Young (1985) ) . En la invención se incluyen secuencias de polinucleótidos capaces de hibridizar con las secuencias de polinucleótidos reivindicadas, incluyendo cualquiera de los polinucleótidos dentro del listado de secuencias, y fragmentos de éstas, bajo diversas condiciones de severidad (véanse, por ejemplo, Wahl y Berger (1987) ; y Kimmel (1987)). Además de las secuencias de nucleótidos indicadas en el listado de secuencias, es posible identificar y aislar ADNc completos, ortólogos y parálogos de las presentes secuencias de nucleótidos usando métodos bien conocidos. Las bibliotecas de ADNc, los ortólogos y los parálogos de las presentes secuencias de nucleótidos se pueden analizar usando métodos de hibridación, para determinar su utilidad como blancos de hibridación o sondas de amplificación. En lo referente a la hibridación, en la técnica son bien conocidas las condiciones muy severas, y los medios para generarlas. Véanse, por ejemplo, Sambrook y col. (1989); Berger (1987), páginas 467-469; y Anderson y Young (1985) . La estabilidad de los dobletes de ADN es afectada por factores tales como la composición de bases, la longitud y el grado de falta de coincidencia entre pares de bases. Las condiciones de hibridación pueden ajustarse para permitir la hibridación de ADN con secuencias con grados de relación diferentes. La temperatura de fusión (Tm) se define como la temperatura a la cual se disocia 50% de las moléculas dobles para dar las cadenas individuales constituyentes . La temperatura de fusión de un doblete con coincidencia perfecta, donde el amortiguador de hibridación contiene formamida como agente desnaturalizante, se puede estimar con las siguientes ecuaciones: (I) ADN-ADN: Tm(°C) = 81,5 + 16,6(log [Na+] ) + 0,41(% de G + C) -0,62(% de formamida) - 500/L (II) ADN-AR : Tm(°C) = 79,8 + 18,5(log [Na+] ) + 0,58( de G + C) + 0,12(% de G + C)2 -0,5(% de formamida) - 820/L, (III) AR -ARN: Tm(°C) = 79,8 + 18,5(log [Na+] ) + 0,58(% de G + C) + 0,12(% de G + C)2 - 0,35(% de formamida) - 820/L, donde L es la longitud del doblete formado, [Na+] es la concentración molar de ión sodio en la solución de hibridación o lavado, y % de G + C es el porcentaje de bases de (guanina + citosina) en el híbrido. Para los híbridos con coincidencias imperfectas, se necesita aproximadamente 1°C para reducir la temperatura de fusión por cada 1% de falta de coincidencia. Los experimentos de hibridización generalmente se realizan en un amortiguador a un pH de entre 6,8 y 7,4, aunque la tasa de hibridización es casi independiente del pH a las fuerzas iónicas que probablemente se usarán en el amortiguador de hibridización (Anderson y Young (1985) ) . Además, es posible usar uno o más de los siguientes elementos para reducir la hibridación no específica: ADN de esperma de salmón sonicado u otro ADN no complementario, albúmina de suero bovino, pirofosfato de sodio, dodecilsulfato de sodio (SDS) , polivinilpirrolidona, Ficoll y solución de Denhardt . El sulfato de dextrano y el polietilenglicol 6000 actúan excluyendo el ADN de la solución, con lo que incrementan la concentración efectiva de ADN sonda y la señal de hibridación en una unidad de tiempo dada. En algunos casos, pueden ser deseables o necesarias condiciones de aún mayor severidad para reducir la hibridación no específica y/o de fondo. Estas condiciones pueden crearse con el uso de una mayor temperatura, una menor fuerza iónica y una mayor concentración de un agente desnaturalizante, tal como la formamida . Las condiciones de severidad se pueden ajustar para buscar fragmentos moderadamente similares, tales como secuencias homologas de organismos con relaciones distantes, o fragmentos muy similares, tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados. La severidad puede ajustarse durante el paso de hibridación o en los lavados posteriores a la hibridación. La concentración de sal, la concentración de formamida, la temperatura de hibridación y las longitudes de las sondas son variables que se pueden usar para alterar la severidad (como se describe en la fórmula anterior) .

Como lineamientos generales, la severidad elevada generalmente se alcanza con una Tm de entre -5°C y -20°C, la severidad moderada, con una Tm de entre -20°C y -35°C, y la severidad baja, con una Tm de entre -35°C y -50 °C, para dobletes de más de 150 pares de bases. La hibridación puede realizarse con una severidad entre baja y moderada (25-50°C debajo de la Tm) , a lo que siguen lavados posteriores a la hibridación con severidad creciente. Las tasas de hibridación máxima en solución se determinan en forma empírica como una Tm de -25 °C para dobletes de ADN-ADN y una Tm de -15 °C para dobletes de ARN-ADN. Opcionalmente , el grado de disociación puede evaluarse después de cada paso de lavado, para determinar la necesidad de pasos de lavado de alta severidad subsiguientes. Se pueden usar condiciones de alta severidad para seleccionar secuencias de ácidos nucleicos con grados de identidad elevados con las secuencias descriptas. Un ejemplo de condiciones de hibridación severas obtenidas en un método basado en filtros, tal como transferencia Southern o Northern, para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios, comprende una temperatura entre aproximadamente 5°C y 20 °C menor que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica, a una fuerza iónica y un pH específico. Las condiciones usadas para la hibridación pueden incluir cloruro de sodio entre aproximadamente 0,02 M y aproximadamente 0,15 M, entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 5% de caseína, aproximadamente 0,02% de SDS o aproximadamente 0,1% de N-laurilsarcosina, citrato de sodio entre aproximadamente 0,001 M y aproximadamente 0,03 M, a temperaturas de hibridación de entre aproximadamente 50 °C y aproximadamente 70 °C. Más preferiblemente, las condiciones de severidad elevada incluyen cloruro de sodio aproximadamente 0,02 M, aproximadamente 0,5% de caseína, aproximadamente 0,02% de SDS, citrato de sodio aproximadamente 0,001 M, a una temperatura de aproximadamente 50 °C. Las moléculas de ácidos nucleicos que hibridizan bajo condiciones severas generalmente hibridizarán con una sonda basada en la molécula de ADN completa o en porciones relacionadas, por ejemplo, con una subsecuencia única del ADN. La concentración de sal bajo condiciones severas comúnmente comprenderá menos que aproximadamente NaCl 750 mM y citrato de trisodio 75 mM. Es posible obtener condiciones de severidad creciente con menos que aproximadamente NaCl 500 mM y citrato de trisodio 50 mM, y puede obtenerse una severidad aún mayor con menos que aproximadamente NaCl 250 mM y citrato de trisodio 25 mM. Puede obtenerse una hibridación de baja severidad en ausencia de un solvente orgánico, por ejemplo, formamida, mientras que es posible obtener una hibridación de gran severidad en presencia de al menos aproximadamente 35% de formamida, y más preferiblemente al menos aproximadamente 50% de formamida. Las condiciones de temperatura elevadas comúnmente incluirán temperaturas de al menos aproximadamente 30°C, más preferiblemente al menos aproximadamente 37 °C, y más preferiblemente al menos aproximadamente 42 °C, con la presencia de formamida. Los especialistas en la técnica saben que es posible alterar otros parámetros, tales como el tiempo de hibridación, la concentración de detergente, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio (SDS) , y la fuerza iónica. Se obtienen diversos niveles de severidad combinando estas condiciones diversas según sea necesario. Los pasos de lavado posteriores a la hibridación también pueden tener una severidad variable, los pasos de lavado posteriores a la hibridación determinan primariamente la especificidad de hibridación, y los factores más críticos son la temperatura y la fuerza iónica de la solución de lavado final. La severidad de lavado puede incrementarse disminuyendo la concentración de sal o incrementando la temperatura. La concentración de sal severa para los pasos de lavado preferiblemente comprenderá menos que aproximadamente NaCl 30 mM y citrato de trisodio 3 mM, y más preferiblemente menos que aproximadamente NaCl 15 mM y citrato de trisodio 1,5 mM. Por consiguiente, las condiciones de hibridación y lavado que se pueden usar para unir y eliminar los polinucleótidos con una homología menor que la deseada con las secuencias de ácidos nucleicos o sus complementes, que codifican los presentes polipéptidos , incluyen, por ejemplo : SSC 6X a 65°C; formamida 50%, SSC 4X a 42 °C; o SSC 0,5X, 0,1% de SDS a 65°C; por ejemplo, con dos pasos de lavado de entre 10 y 30 minutos cada uno. Las variaciones útiles de estas condiciones serán evidentes para los especialistas en la técnica . El especialista en la técnica no esperaría una variación sustancial entre las especies de polinucleótidos incluidas dentro del alcance de la presente invención, ya que las condiciones de severidad elevada indicadas en las fórmulas anteriores proporcionan polinucleótidos similares desde el punto de vista estructural. Si se desea, se pueden emplear pasos de lavado de aún mayor severidad, incluyendo aproximadamente SSC 0,2X, 0,1% SDS a 65 °C y dos lavados, donde cada paso de lavado se prolonga por aproximadamente 30 minutos, o aproximadamente SSC 0,1X, 0,1% de SDS a 65 °C y dos lavados de 30 minutos.

La temperatura de las soluciones de lavado comúnmente será de al menos aproximadamente 25 "C, y para obtener una mayor severidad, al menos aproximadamente 42 °C. Es posible incrementar aún más la severidad de hibridación usando las mismas condiciones que en los pasos de hibridación, con una temperatura de lavado incrementada entre aproximadamente 3°C y aproximadamente 5°C, y la severidad se puede incrementar aún más usando las mismas condiciones, excepto que la temperatura de lavado se incrementa entre aproximadamente 6°C y aproximadamente 9°C. Para identificar homólogos relacionados en forma menos cercana, es posible efectuar pasos de lavado a una temperatura inferior, por ejemplo, 50°C. En un ejemplo de un paso de lavado de baja severidad se emplea una solución y condiciones de al menos 25 °C en NaCl 30 mM, citrato de trisodio 3 mM y 0,1% de SDS durante 30 minutos. Es posible obtener una mayor severidad a 42°C en NaCl 15 mM, con citrato de trisodio 1,5 mM y 0,1% de SDS durante 30 minutos. Se obtienen condiciones de aún mayor severidad a 65°C-68°C, en una solución de NaCl 15 mM, citrato de trisodio 1,5 mM y SDS 0,1%. En los procedimientos de lavado generalmente se emplearán al menos dos pasos de lavado finales. Las variaciones adicionales de estas condiciones serán evidentes para aquellos entrenados en la técnica (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los EE.UU. N° 20010010913) . Las condiciones de severidad se pueden seleccionar de modo tal que un oligonucleotido que sea perfectamente complementario con el oligonucleotido codificante hibridice con el oligonucleotido codificante con una relación entre señal y ruido al menos aproximadamente entre 5 y 10 veces mayor que la relación correspondiente a la hibridación de un oligonucleotido perfectamente complementario con un ácido nucleico que codifica un polipéptido conocido en el momento de presentar la solicitud. Puede ser deseable seleccionar condiciones para un ensayo particular de modo tal que se obtenga una relación entre señal y ruido de aproximadamente 15, o mayor. Por consiguiente, un ácido nucleico sujeto hibridizará con un oligonucleotido codificante único con una señal entre señal y ruido de al menos 2, o mayor, en comparación con la hibridación del oligonucleotido codificante con un ácido nucleico que codifica un polipéptido conocido. La señal particular dependerá de la marca usada en el ensayo relevante, por ejemplo, una marca fluorescente, una marca colorimétrica, una marca radiactiva o semejantes. Es posible producir sondas marcadas de hibridación o PCR para detectar secuencias de polinucleótidos relacionadas por oligomarca, traducción de cortes, marcación terminal o amplificación por PCR usando un nucleotido marcado.

En la invención se incluyen secuencias de polinucleótidos capaces de hibridizar con las secuencias de polinucleótidos reivindicadas, que incluye cualquiera de los polinucleótidos dentro del listado de secuencias, y fragmentos de éstas, bajo diversas condiciones de severidad (véanse, por ejemplo, ahl y Berger (1987) ; y Kimmel (1987)). Además de las secuencias de nucleótidos en el listado de secuencias, es posible identificar y aislar ADNc completos, ortólogos y parálogos de las presentes secuencias de nucleótidos usando métodos bien conocidos. Las bibliotecas de ADNc, los ortólogos y los parálogos de las presentes secuencias de nucleótidos se pueden analizar con el uso de métodos de hibridación, para determinar su utilidad como blancos de hibridación o sondas de amplificación.

EJEMPLOS Se debe tener en cuenta que esta invención no se limita a los dispositivos, máquinas, materiales y métodos particulares descriptos. Si bien se describen realizaciones particulares, se pueden emplear realizaciones equivalentes en la práctica la invención. La invención, descripta ahora en general, se comprenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen meramente a efectos ilustrativos de determinados aspectos y realizaciones de la presente invención y no pretenden limitar la invención. El especialista en la técnica comprenderá que un polipéptido que está asociado con una primera característica particular también pueden estar asociados con al menos una segunda característica distinta, no relacionada e inherente que no fue predicha por la primera característica. Ejemplo I. Información de Tipos de proyecto y Vectores y Clonación Se usaron varias construcciones para modular la actividad de las secuencias de la invención. Un proyecto individual se definió como el análisis de líneas para una construcción particular (por ejemplo, esto podría incluir las líneas G1988 que sobreexpresan constitutivamente una secuencia de la invención) . En el presente estudio, una versión del tipo salvaje de longitud completa de un gen se fusionó directamente a un promotor que condujo su expresión en plantas transgénicas . Dicho promotor podría ser el promotor nativo de ese gen, o un promotor constitutivo tal como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor. De otra manera, un promotor que conduce la expresión específica de tejido o expresión condicional se podría usar en estudios similares. En el presente estudio, la expresión de un polinucleótido dado de un promotor en particular se logró con una construcción fusión directa de promotor en la que esa secuencia se clonó directamente detrás del promotor de interés. Un abordaje con fusión directa tiene como ventaja que permite el análisis genético más simple si una línea dada de promotor-polinucleótido se cruzará con diferentes antecedentes genéticos en un momento posterior. Para el análisis de las plantas que sobreexpresan G1988, se crearon líneas transgénicas con el vector de expresión P2499 (SEQ ID NO: 59) , que contenía un clon de ADNc de G1988. Esta construcción constituyó una fusión directa de promotor 35S::G1988 con un marcador de resistencia a kanamicina y se introdujo en plantas de Arabidopsis . G4004 (polinucleótido SEQ ID NO: 3 y polipéptido SEQ ID NO: 4) es una secuencia derivada de soja. G4004 se identificó como un homólogo estrechamente relacionado de G1988 en base al análisis filogenético descrito más arriba. P26748 (SEQ ID NO : 60) contenía un clon de ADNc de G4004, y fue una construcción de fusión directa de promotor 35S::G4004 con un marcador de resistencia a kanamicina. Esta construcción se uso para generar líneas de plantas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresaran constitutivamente el polipéptido G4004. G4005 (polinucleótido SEQ ID NO: 5 y polipéptido SEQ ID NO: 6) también se obtuvo de soja, y también se identificó como un homólogo estrechamente relacionado de G1988 en base al análisis filogenético descrito más arriba. P26749 (SEQ ID NO: 61) contenía un clon de ADNc de G4005, y fue una construcción de fusión directa de promotor 35S::G4005 con un marcador de resistencia a kanamicina. Esta estructura se uso para generar líneas de plantas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresaran constitutivamente el polipéptido G4005. En la Tabla 4 y en el listado de secuencias se provee un listado de construcciones (estos vectores de expresión se identifican con una designación "PID" provista en la segunda columna) usadas para crear plantas con sobreexpresion de miembros de ciado G1988 que se encuentran en este informe. Tabla 4. Construcciones de expresión usadas para crear plantas con sobreexpresion de miembros de ciado G1988 Identificador del gen Construcción (PID) SEQ ID NO: de PID Promotor Tipo de proyecto G1988 (2) A P2499 59 35S Fusión directa de promotor G4004 (4) Gm P26748 60 35S Fusión directa de promotor G4005 (6) Gm P26749 61 35S Fusión directa de promotor G4000 (8) Zm P27404 63 35S Fusión directa de promotor G4012 (16) Os P27406 64 35S Fusión directa de promotor G4299 (22) SI P27428 65 35S Fusión directa de promotor Abreviaciones de especies para la Tabla 4: At Arabidopsis thaliana Gm - Glycine max; Os - Oryza sativa; Si - Solanum lycopersicum; Zm - Zea mays Ejemplo II. Transformación La transformación de Arabidopsis se realizó mediante un protocolo mediado por Agrobacterium que se basa en el método de Bechtold y Pelletier (1998) . A menos que se especifique de otra manera, todo el trabajo experimental se efectuó con el uso del ecotipo Columbia. Preparación de las plantas. Las semillas de Arabidopsis se sembraron en macetas cubiertas con una malla. Las plántulas se entresacaron de modo que 10 días después de la siembra quedaran entre 6 y 10 plantas homogéneamente distribuidas en cada maceta. Los brotes primarios se recortaron una semana antes de la transformación para romper la dominancia apical y fortalecer la formación de brotes auxiliares. La transformación se realizó generalmente entre 4 y 5 semanas luego de la siembra. Preparación del cultivo bacteriano. Se inoculó material de Agrobacterium a partir de placas de colonias individuales o a partir de material común en glicerol y se cultivaron con los antibióticos apropiados y luego se dejaron crecer hasta saturación. La mañana de la transformación, los cultivos saturados se centrifugaron y se volvieron a suspender los pelets bacterianos en medio de infiltración (MS 0,5X, Vitaminas B5 IX, sacarosa 5%, ribósido de bencilaminopurina 1 mg/ml, Silwet L77 200 µ?/?) hasta obtener una lectura de A600 de 0,8. Transformación y cosecha de semillas. La solución de Agrobacterium se vertió en recipientes de inmersión. Todas las yemas florales y hojas en roseta de las plantas se sumergieron en esta solución durante 30 segundos. Las plantas se colocaron sobre su lado y se envolvieron para mantener elevada la humedad. Las plantas se mantuvieron de esta manera durante la noche a 4 °C y luego se enderezaron las macetas, se desenvolvieron y se llevaron a las gradillas de crecimiento. Las plantas se mantuvieron sobre la gradilla de crecimiento con 24 horas de luz hasta que las semillas estuvieron listas para ser cosechadas. Las semillas se cosecharon cuando el 80% de las vainas de las plantas transformadas estuvieron maduras (aproximadamente 5 semanas después de la transformación inicial) . Esta semilla se consideró como semilla T0, dado que se había obtenido de la generación T0 y luego se plaqueó sobre placas de selección (ya sea kanamicina o sulfonamida) . Las plantas resistentes identificadas sobre dichas placas de selección comprendieron la generación TI, de las cuales se puede derivar una semilla transgénica que comprenda el vector de expresión de interés. Ejemplo III. Análisis de morfología Se efectuaron análisis morfológicos para determinar si los cambios en los niveles de polipéptidos afectan al crecimiento y desarrollo de las plantas Esto se realizó en primer lugar con la generación TI, cuando se examinaron al menos entre 10 y 20 líneas independientes. Sin embargo, en los casos donde el fenotipo requería confirmación o una caracterización detallada, también se analizaron las plantas de las generaciones posteriores. Los transformantes primarios se seleccionaron sobre medio MS con 0,3% de sacarosa y 50 mg/1 de kanamicina. Las plantas T2 y de generaciones posteriores se seleccionaron de la misma manera, excepto que se usó kanamicina 35 mg/1. En los casos donde la líneas contienen un marcador de sulfonamida (como en todas las líneas generadas por supertransformación) , las semillas se seleccionaron sobre medio MS con 0,3% de sacarosa y 1,5 mg/1 de sulfonamida. Las líneas KO habitualmente se hacían germinar sobre las placas sin una selección. Las semillas se trataron con frío (estratificado) sobre placas durante 3 días en oscuridad (con el fin de incrementar la eficacia de la germinación) antes de la transferencia a los gabinetes de crecimiento. Inicialmente, las placas se incubaron a 22 °C bajo una intensidad de luz de aproximadamente 100 microEinsteins durante 7 días. En esta etapa, los transformantes eran verdes, ya tenían las dos primeras hojas verdaderas y eran fácilmente distinguibles de las plántulas blanqueadas susceptibles a kanamicina o sulfonamida. Las plántulas resistentes se transfirieron luego a tierra (mezcla para macetas Sunshine) . Después de la transferencia a tierra, las bandejas de plántulas se cubrieron con tapas de plástico durante entre 2 y 3 días para mantener la humedad mientras se volvían arraigadas. Las plantas se cultivaron en tierra bajo luz fluorescente a una intensidad de entre 70 y 95 microEinsteins y a una temperatura de entre 18 y 23 °C. Las condiciones de luz consistieron de un fotoperíodo de 24 horas a menos que se indique de otra manera. En los casos donde fueron evidentes las alteraciones en el tiempo de floración, el tiempo de floración fue examinado nuevamente bajo 12 horas y 24 horas de luz para evaluar si el fenotipo era dependiente del fotoperíodo. Bajo las condiciones de crecimiento de 24 horas de luz, el tiempo de generación típico (semilla a semilla) fue de aproximadamente 14 semanas .

Dado que muchos aspectos del desarrollo de Arabidopsis dependen de condiciones ambientales localizadas, en todos los casos las plantas se evaluaron en comparación con controles en el mismo cajón de macetas. Como se indica más adelante, los controles para las líneas transgénicas fueron plantas de tipo salvaje o plantas transgénicas que contienen un vector de transformación vacío seleccionado sobre kanamicina o sulfonamida. Se realizó un examen cuidadoso en las siguientes etapas: plántula (1 semana), roseta (entre 2 y 3 semanas) , floración (entre 4 y 7 semanas) y conjunto tardío de semillas (entre 8 y 12 semanas). También se inspeccionaron las semillas. La morfología de la plántula se evaluó sobre placas de selección. En todas las demás etapas, las plantas se evaluaron macroscópicamente mientras crecían en tierra. Se registraron todas las diferencias significativas (incluyendo las alteraciones en la tasa de crecimiento, tamaño, morfología de hojas y flores, coloración y tiempo de la floración) , pero no se realizaron mediciones de rutina si no se observaban diferencias evidentes. En determinados casos, se tiñeron secciones de tallo para revelar la distribución de lignina. En estos casos, se montaron tallos cortados manualmente en fluoroglucinol saturado en 2M de HC1 (que tiñe a la lignina de color rosa) y se visualizaron inmediatamente bajo microscopio disección. Se debe tener en cuenta que para un proyecto dado (combinación de gen-promotor, líneas de fusión GAL , líneas de ARNi, etc.), generalmente se examinaron diez líneas en posteriores ensayos de fisiología basados en placas. Ejemplo IV. Métodos Experimentales de fisiología En los Ejemplos subsiguientes, a menos que se indique de otra manera, las características morfológicas y fisiológicas se describen en comparación con plantas control de tipo salvaje. Es decir, una planta transformada que se describe como grande y/o tolerante a la sequía fue grande y más tolerante a la sequía con respecto a una planta control de tipo salvaje, la última incluye plantas tipo salvaje, líneas parentales y líneas transformadas con un vector que no contiene la secuencia de interés. Cuando se dice que una planta tiene un mejor rendimiento que los controles, generalmente fue más grande, tuvo mayor rendimiento, y/o mostró menos síntomas de estrés que las plantas control . Las líneas de mayor rendimiento pueden haber producido, por ejemplo, menos antocianina, o fueron más grandes, verdes o más vigorosas en respuesta a un tipo de estrés particular, tal como se indica más adelante. El mayor rendimiento generalmente implica mayor tamaño o rendimiento, o tolerancia a un tipo de estrés biótico o abiótico particular, menor sensibilidad a ABA, o mayor recuperación de un tipo de estrés (como en el caso de un tratamiento como en el caso de un tratamiento de sequía en tierra) que los controles. Ensayos en placa. Se utilizaron diferentes ensayos fisiológicos basados en placas (se muestran más abajo) , que representan una variedad de condiciones abióticas y relacionadas con el estrés por falta de agua, como un pre-cribado para identificar las líneas con mayor rendimiento (es decir líneas de transformación con una construcción en particular) , que generalmente se ensayaron en ensayos posteriores basados en tierra. Generalmente, se sometieron diez líneas a ensayos en placas, de entre las cuales se seleccionaron las tres mejores líneas para ensayos posteriores basados en tierra. Sin embargo, en los proyectos donde no se obtuvo una tolerancia significativa al estrés en los ensayos basados en placas, las líneas no se sometieron a ensayos en tierra. Además, algunos proyectos se sometieron a estudios de limitación de nutrientes. Un ensayo de limitación de nutrientes tuvo por objeto encontrar genes que permitieran mayor crecimiento de la planta luego de la falta de nitrógeno. El nitrógeno es uno de los principales nutrientes que afecta al crecimiento y desarrollo vegetal y que en última instancia afecta al rendimiento y la tolerancia al estrés. Estos ensayos monitorean primariamente las raíces pero también el crecimiento de roseta sobre medio deficiente en nitrógeno. En todas las plantas superiores, el nitrógeno inorgánico se asimila primero como glutamato, glutamina, aspartato y asparagina, los cuatro aminoácidos usados para transportar el nitrógeno asimilado de las fuentes (por ejemplo hojas) a los órganos de reserva (por ejemplo, semillas en desarrollo) . Este proceso puede estar regulado por la luz, así como por el estado metabólico C/N de la planta. Se utilizó un ensayo para medir C/N para buscar alteraciones en los mecanismos utilizados por las plantas para medir los niveles internos de metabolitos de carbono y nitrógeno que podrían activar las cascadas de transducción de señales que regulan la transcripción de los genes asimiladores de N. Para determinar si estos mecanismos estaban alterados, los inventores utilizaron la observación que las plantas de tipo salvaje cultivadas sobre medios que contiendan niveles altos de sacarosa (3%) sin una fuente de nitrógeno acumulaban niveles altos de antocianinas . Esta acumulación de antocianina inducida por sacarosa puede ser aliviada por la adición de nitrógeno, ya sea inorgánico u orgánico. Los autores emplearon glutamina como fuente de nitrógeno dado que también sirve como el compuesto usado para transportar N en plantas . Ensayos de germinación. Los siguientes ensayos de germinación se realizaron con Arabidopsis con sobreexpresión de G1988 y secuencias estrechamente relacionadas: NaCl (150 mM) , manitol (300 mM) , sacarosa (9,4%), ABA (0,3 µ ) , frío (8o C) , polietilenglicol (10%, con Phytogel como agente gelificante) , o sensado de C/N o medio con bajo nitrógeno. En el texto más abajo, -N se refiere al medio base sin nitrógeno adicionado con 0,3% de sacarosa y -N/+Gln es el medio base sin nitrógeno adicionado con 0,3% de sacarosa y 1 mM de glutamina. Todos los ensayos de germinación se efectuaron en cultivos de tejido. El crecimiento de las plantas bajo condiciones de temperatura y humedad controladas sobre un medio estéril produjo un material vegetal que no había estado expuesto a otros tipos de estrés adicionales (tal como estrés al agua) que podrían causar variabilidad en los resultados obtenidos . Todos los ensayos se diseñaron para detectar plantas que fueron más tolerantes o menos tolerantes a la condición de estrés particular y se desarrollaron en referencia a las siguientes publicaciones: Jang y col. (1997), Smeekens (1998), Liu y Zhu (1997), Saleki y col. (1993), u y col. (1996), Zhu y col. (1998), Alia y col. (1998), Xin y Browse, (1998), Leon-Kloosterziel y col. (1996). Cuando fue posible, las condiciones de ensayo se evaluaron originalmente en un experimento ciego con controles que tenían fenotipos relacionados con condición evaluada. Antes del plaqueado, se esterilizó la superficie de las semillas de todos los experimentos de la siguiente manera: (1) 5 minutos de incubación por mezclado en etanol 70%, (2) 20 minutos de incubación con mezclado en 30% de blanqueador, 0,01% de tritón-X 100, (3) 5X lavados con agua estéril, (4) las semillas se volvieron a suspender en 0,1% de agarosa estéril y se estratificaron a 4 °C durante entre 3 y 4 días . Todos los ensayos de germinación siguen las modificaciones del mismo protocolo básico. Se sembraron semillas estériles sobre medio condicional que tenía una composición basal de MS 80% + Vitaminas. Las placas se incubaron a 22 °C con 24 horas de luz (entre 120 y 130 µ? m-2 s-1) en una cámara de crecimiento. La evaluación de la germinación y del vigor de las plántulas se realizó 5 días después de la siembra. Ensayos de crecimiento. Los siguientes ensayos de crecimiento se realizaron con Arabidopsis con sobreexpresión de G1988 y secuencias estrechamente relacionadas : deshidratación severa (un tipo de ensayo de falta de agua) , crecimiento en condiciones frías a 8o C, desarrollo radicular (evaluación visual de raíces laterales y primarias, pelos radiculares y crecimiento general), y limitación de fosfato. Para el ensayo de limitación de nitrógeno, las plantas se crecieron en medio Murashige y Skoog (MS) 80% en el cual la fuente de nitrógeno se redujo a 20 mg/L de NH4N03. Obsérvese que el MS 80% normalmente tiene 1,32 g/1 de NH4N03 y 1,52 g/1 de K 03. Para los ensayos de limitación de fosfato, se germinaron plántulas de siete días en medio libre de fosfato en medio MS en el cual se reemplazó KH2P04 por K2S04. A menos que se indique de otra manera, todos los experimentos se efectuaron con plantas del ecotipo Columbia (col-0) de Arabidopsis thaliana, soja y maíz. Los ensayos habitualmente se realizaron con poblaciones T2 segregantes no seleccionadas (con el fin de evitar el estrés adicional por selección) . Las plantas control para los ensayos con líneas que contienen construcciones de fusión directa del promotor fueron plantas Col-0 transformadas con un vector de transformación vacío (pMEN65) . Los controles para las líneas de 2 componentes (generados por supertransformación) fueron las líneas conductoras de promotores antecedentes (es decir, líneas conductoras de promotor: : LexA-GAL4TA) , en las cuales se efectuaron inicialmente las supertransformaciones . Procedimientos Para los ensayos de crecimiento con sensibilidad al enfriamiento, se germinaron las semillas y se crecieron durante siete días en MS + Vitaminas + 1% de sacarosa a 22° C y luego se transfirieron a condiciones de sensibilidad a 8o C y se evaluó luego de otros 10 días y 17 días. Para los ensayos de deshidratación severa (falta de agua en placa) , las plántulas se cultivaron durante 14 días sobre S + Vitaminas + 1% de sacarosa a 22 °C. Las placas se abrieron bajo campana estéril durante 3 hs para el endurecimiento y luego se retiraron las plántulas del medio y se dejaron secar durante 2 hs bajo campana. Después de este período, las plantas se transfirieron nuevamente a las placas y se incubaron a 22 °C para su recuperación. Luego, las plantas se evaluaron después de 5 días. Para el pre-cribado de tolerancia al estrés hiperosmótico por polietilenglicol (PEG) , las semillas de las plantas se esterilizaron con gas cloro durante 2 hrs . Luego se sembraron las semillas en cada placa que contenía 3% de PEG, sales de MS 1/2 X , 1% de phytagel, y 10 pg/ml de glufosinato de amonio (BASTA) . Se plantaron dos réplicas de placa para cada línea de semillas. Las placas se colocaron a 4o C durante 3 días para estratificar las semillas. Los platos se sostuvieron verticalmente durante 11 días adicionales a temperaturas de 22° C (día) y 20° C (noche). El fotoperíodo fue de 16 hrs. con una intensidad media de luz de aproximadamente 120 pmol/m2/s. Las gradillas que contenían las placas se rotaron a diario dentro de los estantes de la cámara de crecimiento. A los 11 días, se realizaron las mediciones de la longitud de la raíz. A los 14 días, se determinó el estado de la plántula, se midió la longitud de la raíz, se registró la fase de crecimiento, se evaluó el color visual, se midió el peso fresco en conjunto de las plántulas, y se tomó una fotografía de la placa entera. Ensayo de cribado de marchitamiento. Se hicieron crecer plantas transgénicas y de soja de tipo salvaje en macetas de 5" en cámaras de crecimiento. Luego que las plántulas alcanzaron la etapa VI (la etapa VI ocurre cuando las plantas tienen una hoja trifoliada, y las hojas unifoliadas y la primera trifoliada están desenrolladas) , se quitó el agua y así comenzó el tratamiento de sequía. Se registró una calificación de fenotipo de daño por sequía, con severidad de efecto creciente, de entre 1 y 4, ningún efecto visible designado con 1, y 4 indicando una planta muerta. La calificación por sequía se comenzó tan pronto como una planta en un cámara de crecimiento tuvo una calificación por sequía de 1,5. Se continuó la calificación todos los días hasta que al menos el 90% de las plantas del tipo salvaje había logrado calificaciones de 3,5 o más. Al final del experimento se analizaron estadísticamente las calificaciones para las plántulas transgénicas y tipo salvaje de soja con el uso de métodos de análisis Puntaje de Riesgo y Supervivencia (Glantz (2001) ; Hosmer y Lemeshow (1999) ) . Eficacia del uso de agua (WUE) . Se estimó la UE utilizando la observación que los elementos pueden existir en forma estable e inestable (radiactivo) . La mayoría de los elementos de interés biológico (incluso C, H, 0, N, y S) tiene dos o más isótopos estables, con el más liviano de éstos presente en mayor abundancia que los otros. Por ejemplo, 12C es más abundantes en la naturaleza que 13C (12C = 98,89%, 13C =1,11%, 14C = < 10-10%) . Dado que 13C es ligeramente más grande que 12C, el fraccionamiento de C02 durante la fotosíntesis ocurre en dos pasos: 1. 12C02 difunde a través del aire y en la hoja más fácilmente ; 2. en el primer paso de fotosíntesis la enzima prefiere 12C02, ribulosa bifosfato carboxilasa/oxigenasa. Se ha mostrado que WUE se correlaciona en forma negativa con la discriminación de isótopo de carbono durante la fotosíntesis en varias especies de cultivos C3. La discriminación de isótopos de carbono también se ha ligado a la tolerancia a la sequía y estabilidad del rendimiento en ambientes con tendencia a la sequía y se ha usado con éxito para identificar los genotipos con la mejor tolerancia a la sequía. Se midió el contenido de 13C/12C después de la combustión de material vegetal y conversión a C02 , y análisis por espectroscopia de masa. En comparación con un estándar conocido, se alteró el contenido de 13C de un modo tal que sugirió que la sobreexpresión de G1988 o de las secuencias relacionadas mejora la eficacia del uso de agua . Otro indicador potencial de UE fue la conductancia del estoma, es decir, hasta que punto los estomas estaban abiertos . Interpretación de los datos Al momento de la evaluación, a las plantas se les dio una de las siguientes calificaciones: (++) Rendimiento sustancialmente mejorado en comparación con los controles. El fenotipo fue muy consistente y el crecimiento fue significativamente superior a los niveles normales de variabilidad observados para ese ensayo. (+) Rendimiento mejorado en comparación con los controles. La respuesta fue consistente pero fue tan sólo moderadamente superior a los niveles normales de variabilidad observados para ese ensayo. (wt) No hubo una diferencia detectable con respecto a los controles de tipo salvaje. (-) Rendimiento deteriorado en comparación con los controles. La respuesta fue consistente pero fue sólo ligeramente superior a los niveles normales de variabilidad observados para ese ensayo.

(- -) Rendimiento sustancialmente deteriorado en comparación a los controles. El fenotipo fue consistente y el crecimiento fue significativamente superior los niveles normales de variabilidad observados para ese ensayo. (n/d) Experimento fallido, datos no obtenidos, o ensayo no realizado. Ejemplo V. Sequía en tierra (maceta de arcilla) El ensayo de sequía en tierra (realizado en macetas de arcilla) se basó en el que fue descrito por Haake et al. (2002) . Procedimiento Experimental . Previamente, los inventores realizaron ensayos en macetas de arcilla con poblaciones segregantes T2, sembradas directamente en tierra. Sin embargo, en el procedimiento actual, las plántulas se hicieron germinar primero sobre placas de selección que contienen ya sea kanamicina o sulfonamida. Las semillas fueron esterilizadas mediante un tratamiento de 2 minutos en etanol seguido de 20 minutos en blanqueador 30% / Tween 0,01% y cinco lavados en agua destilada. Las semillas se sembraron con MS agar en agarosa 0,1% y se estratificaron durante 3 días a 4 °C, antes de su transferencia a gabinetes de crecimiento con una temperatura de 22 °C. Después de 7 días de crecimiento sobre placas de selección, las plántulas fueron transplantadas a macetas de arcilla 3,5 pulgadas de diámetro que contienen 80 g de una mezcla 50:50 de vermiculita:perlita completada con 80 g de Pro ix. Típicamente, cada maceta contenía 14 plántulas y las plantas de la línea transgénica evaluada se encontraban en macetas separadas de las de los controles de tipo salvaje. Las macetas que contienen la línea transgénica versus las macetas control se entremezclaron en el cuarto de crecimiento, se mantuvieron bajo condiciones de 24 horas de luz (entre 18 y 23 °C y entre 90 y 100 µ? m-2 s-1) y se regaron por un período de 14 días . Luego se les retuvo el agua y las macetas se colocaron sobre papel absorbente durante un período de entre 8 y 10 días para aplicar un tratamiento de sequía. Después de este período, se asignaron "calificaciones de sequía" cualitativas visuales de 0-6 para registrar la extensión de síntomas visibles de estrés por sequía. Una calificación de "6" correspondía a ningún síntoma visible en tanto una calificación de "0" correspondía a marchitamiento extremo y hojas con una textura "crespa" . Al final del período de sequía, las macetas se regaron nuevamente y se calificaron luego de 5-6 días; se efectuó un recuento de las plantas sobrevivientes en cada maceta y se calculó la proporción total de plantas en la maceta que habían sobrevivido . Análisis de resultados. En un experimento dado, los inventores compararon típicamente 6 o más macetas de una línea transgénica con 6 o más macetas del control apropiado. Se calculó la calificación media de sequía y la proporción media de plantas sobrevivientes (índice de sobrevida) para macetas con la línea transgénica y de tipo salvaje. En cada caso se calculó un valor p-*, que indicaba la significancia de la diferencia entre los dos valores de la media. Los resultados para cada línea transgénica de cada siembra para un proyecto particular se incluyeron en una tabla de resultados. Cálculo de los valores p. Para los ensayos donde las plantas control y experimentales se encontraban en macetas separadas, la sobrevida se analizó con una regresión logística para explicar el hecho que la variable aleatoria era una proporción entre 0 y 1. El valor p informado era la significancia de la proporción experimental en contraste con el control, en base a la regresión de los datos transformados con logit. La calificación de sequía, siendo un factor ordenado sin ningún significado numérico real, se analizó con una prueba no paramétrica entre los grupos experimental y control . El valor p se calculó con la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney . Ejemplo VI. Medidas Fisiológicas y Bioquímicas de Sequía en Tierra Estos experimentos determinaron la base fisiológica de la tolerancia a sequía conferida por cada candidato y típicamente se efectuaron bajo condiciones de crecimiento en tierra. Habitualmente, el experimento se realizó bajo condiciones fotoperiódicas de 10 hs o 12 hs de luz. Cuando fuera posible, cada proyecto dado (combinación de gen/promotor o variante de proteína) estaba representado por tres líneas independientes. Las plantas se encontraban habitualmente en la etapa vegetativa tardía/reproductiva temprana en el momento en que se tomaron las mediciones. Típicamente, los inventores evaluaron tres estados diferentes: un estado bien regado, un estado de sequía leve y un estado de sequía moderadamente severa. En cada caso, los inventores efectuaron comparaciones con plantas de tipo salvaje con el mismo grado de síntomas de estrés físico (marchitamiento) . Para lograrlo, a menudo fue necesario efectuar muéstreos escalonados. Típicamente, para una línea dada, se evaluaron diez plantas individuales para cada estado . Se midieron, de forma rutinaria, los siguientes parámetros fisiológicos: contenido relativo de agua, contenido de ABA, contenido de prolina e índice de fotosíntesis. En algunos casos, también se efectuaron mediciones de los niveles de clorofila, niveles de almidón, niveles de carotenoides y fluorescencia de clorofila.

Análisis de resultados. En un experimento dado, para un parámetro particular, los inventores compararon típicamente aproximadamente 10 muestras de una línea transgénica dada con aproximadamente 10 muestras del control de tipo salvaje apropiado en cada estado de sequía. Se calcularon los valores de la media para cada parámetro fisiológico para las macetas con la línea transgénica y el tipo salvaje. En cada caso, se determinó un valor P (calculado mediante una prueba t simple) , que indicaba la significancia de la diferencia entre los dos valores de la media . A continuación se describirá un procedimiento típico; este corresponde al método usado para el experimento de sequía en el tiempo que Los inventores realizaron con plantas de tipo salvaje durante los estudios preliminares al comienzo del programa de sequía. Procedimiento. Las semillas se estratificaron durante 3 días a 4o C en agarosa 0,1% y se sembraron en Metromix 200 en macetas de 2,25 pulgadas (cuadradas o redondas). Las plantas se mantuvieron en macetas individuales dentro de cajones, cultivadas con días cortos (10 horas de luz, 14 horas de oscuridad) . Las plántulas se regaron según necesidad para mantener un crecimiento y desarrollo saludables de la planta. A las 7 a 8 semanas después de la siembra, las plantas se usaron en los experimentos sequía. Las plantas apareadas para un desarrollo de crecimiento equivalente (tamaño de roseta) se retiraron del cajón de plástico y se colocaron sobre papel absorbente. Las macetas que contenían las plantas que se usaron como controles bien regados se colocaron dentro de un platillo y el disco se colocó sobre el papel absorbente. El propósito del platillo fue retener toda el agua que pudiera escapar de las macetas bien regadas y afectar a las macetas que contenían a las plantas sometidas al tratamiento de estrés por sequía. El día del muestreo, se tomaron hasta 18 plantas sometidas a condiciones de sequía y 6 controles bien regados (de cada línea transgénica) de una agrupación generada de forma aleatoria (con la condición de que hubieran pasado las normas de control de calidad) . Los análisis bioquímicos para fotosíntesis, ABA y prolina se efectuaron sobre las tres hojas vecinas más jóvenes, completamente expandidas. Se analizó el contenido relativo de agua usando el tejido de roseta remanente. Medición de Fotosíntesis. La fotosíntesis se midió usando un LICOR LI-6400 (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE) . El LI-6400 emplea analizadores de gases infrarrojos para medir dióxido de carbono para generar una medición de fotosíntesis. Este método se basó en la diferencia de la referencia de C02 (la cantidad introducida en la cámara) y la muestra de C02 (la cantidad que sale de la cámara) . Dado que la fotosíntesis es el proceso de convertir C02 en carbohidratos, los inventores esperaban una disminución en la cantidad de muestra de C02. A partir de esta diferencia, se puede generar un índice de fotosíntesis. En algunos casos, puede haber respiración y un incremento en el C02 detectado. Para efectuar las mediciones, el equipo LI-6400 se puso a punto y se calibró según las instrucciones estándar para LI-6400. La fotosíntesis se midió en la hoja más joven completamente expandida a 300 y 1000 ppm de C02 usando una fuente de luz de un haluro de metal. Esta fuente de luz proporcionó aproximadamente 700 µ? m-2 s-1. La fluorescencia se midió en las hojas adaptadas a oscuridad y luz usando un equipo LI-6400 (LICOR) equipado con un fluorómetro con cámara para hojas o un equipo OS-1 (Opti-Sciences , Hudson, NH) según se describe en las instrucciones del proveedor. Cuando se usó el equipo LI-6400, todas las manipulaciones tuvieron lugar bajo una tela de sombra oscura. Las plantas se adaptaron a la oscuridad colocándolas en una caja debajo de esta tela de sombra hasta el momento del uso. El equipo OS-30 empleaba pequeños clips para crear hojas adaptadas a la oscuridad. Medida de Ácido Abscísico y Prolina. El propósito de este experimento fue medir ABA y prolina en los tejidos vegetales . El ABA es una hormona vegetal presuntamente relacionada con las respuestas de estrés y la prolina es un protector osmótico. Se cosecharon tres de las hojas maduras más jóvenes, más expandidas, se congelaron en nitrógeno líquido, se liofilizaron y se tomó una medición de peso seco. A continuación, el tejido vegetal se homogeneizó en metanol al cual se habían agregado 500 ng de d6-ABA para actuar como estándar interno. El homogenato se filtró para retirar el material vegetal y el filtrado se evaporó hasta alcanzar un volumen pequeño. A este extracto crudo, se agregó aproximadamente 3 mi de ácido acético 1% y el extracto se evaporó otra vez para eliminar todo el metanol remanente. Se midió el volumen del extracto acuoso remanente y se tomó una pequeña alícuota (habitualmente entre 200 y 500 µ?) para el análisis de prolina (el protocolo se describirá más adelante) . El extracto remanente se particionó luego dos veces contra éter, el éter se eliminó por evaporación y el residuo se metilo usando diazometano etéreo. Después de eliminar todo el diazometano sin reaccionar, el residuo se disolvió en entre 100 y 200 µ? de acetato de etilo y se analizó por cromatografía gaseosa-espectrometría de masa. El análisis se efectuó usando un equipo HP 6890 GC acoplado a un HP 5973 MSD usando una columna capilar para gases DB-5ms . La presión de la columna era de 20 psi. Inicialmente , la temperatura del horno era de 150 °C. Después de la inyección, el horno se calentó a 5 °C/min hasta una temperatura final de 250 °C. Los niveles de ABA se estimaron usando una ecuación de dilución de isótopos y se normalizaron para el peso seco del tejido. Se midió el contenido de prolina libre de acuerdo con Bates (Bates et al., 1973). El extracto crudo acuoso que se obtuvo antes se llevó a un volumen final de 500 µ? usando agua destilada. A continuación, se agregaron 500 µ? de acético glacial seguido de 500 µ? de ninhidrina de Chinard. La ninhidrina de Chinard se preparó disolviendo 2,5 g de ninhidrina ( tricetohidrindeno hidrato) en 60 mi ácido acético glacial a 70°C, a lo que se agregó 40 mi de ácido fosfórico 6 M. Las muestras se calentaron luego a entre 95 y 100 °C durante 1 hora. Después de este período de incubación, se enfriaron las muestras y se agregaron 1,5 mi de tolueno. La fase de tolueno superior se retiró y se midió la absorbancia medida a 515 nm. Las cantidades de prolina fueron estimadas usando una curva estándar generada usando L-prolina y se normalizaron para el peso seco del tejido. Medida del Contenido Relativo de Agua. El contenido relativo de agua (R C) indicó la cantidad de agua almacenada dentro del tejido vegetal en cualquier momento dado. Se obtuvo tomando el peso a campo de la roseta menos el peso seco del material vegetal y dividiendo el peso de la roseta saturada con agua menos el peso seco del material vegetal . El valor resultante de RWC se pudo comparar entre plantas, independientemente del tamaño de la planta.

Peso a Campo - Peso Seco Contenido Relativo de Agua = Peso Saturado - Peso Seco x 00 Después de haber retirado el tejido para el análisis de ABA/prolina y de ordenamientos, la roseta se recortó de las raíces usando unas pequeñas tijeras. El peso a campo se obtuvo pesando la roseta. La roseta se sumergió luego en agua fría y se colocó en un baño de agua helada en oscuridad. El propósito de esto fue permitir que el tejido vegetal captara agua impidiendo al mismo tiempo todo metabolismo que pudiera alterar el nivel de las pequeñas moléculas dentro de la célula. Al día siguiente, la roseta se retiró cuidadosamente, se seco con papel tisú y se pesó para obtener el peso turgente. Luego el tejido se congeló, liofilizó y pesó para obtener el peso seco. Determinación de almidón. El almidón se estimó usando un procedimiento simple basado en coloración con iodo. Se cosecharon hojas jóvenes, completamente expandidas, ya sea al final o al comienzo del período de 12 hs de luz y se colocaron en tubos que contienen etanol al 80% o metanol al 100%. Las hojas se decoloraron por medio de incubación de los tubos en un baño de agua entre 70 y 80 °C hasta eliminar la clorofila del tejido foliar. Las hojas se sumergieron en agua para desplazar todo el metanol residual que pudiera estar presente en el tejido. A continuación, se tiñó el almidón incubando las hojas en un colorante de yodo (2 g de KI, 1 g de 12 en 100 mi de agua) durante 1 min y lavándolas después con cantidades abundantes de agua. El tejido que contiene grandes cantidades de almidón tomaba un color azul oscuro o negro; los tejidos sin almidón eran incoloros. Determinación de clorofila/carotenoides . Para algunos experimentos, la clorofila se estimó en extractos metanólicos usando el método de Porra et al. (1989). Los carotenoides se estimaron en el mismo extracto a 450 nm usando un valor de A(l%) de 2500. Los inventores miden actualmente la clorofila usando un SPAD-502 (Konica Minolta Sensing Americas, Inc., Ramsey, NJ) . En los casos en que se usó SPAD-502 para medir la clorofila, el contenido y la cantidad de carotenoides y clorofila también se podría determinar mediante HPLC. Los pigmentos se extrajeron del tejido foliar homogeneizando las hojas en acetona : acetato de etilo (3:2). Se agregó agua, la mezcla se centrifugó y se retiró la fase superior para el análisis por HPLC. Las muestras se analizaron usando una columna Zorbax (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) C18 (sin protección terminal) (250 x 4,6) con un gradiente de acetonitrilo : agua (85:15) a acetonitrilo : metanol (85:15) en 12,5 minutos. Después de mantener estas condiciones durante dos minutos, se cambiaron las condiciones de solvente por metanol : acetato de etilo (68:32) en dos minutos. Los carotenoides y clorofilas se cuantificaron usando las áreas pico y se calcularon los factores de respuesta usando luteína y beta- caroteno como estándares. Fracciones enriquecidas en núcleo y citoplasmáticas . Los inventores desarrollaron una plataforma para preparar extractos de proteínas nucleares y citoplasmáticos en un formato de 96 fosas usando esferas de carburo de tungsteno para la ruptura celular en un detergente suave y un lecho de sacarosa para separar las fracciones citoplasmáticos de las nucleares. Los inventores usaron anticuerpos con histona para demostrar que este método separaba eficazmente las fracciones citoplasmáticas de las fracciones nucleares enriquecidas. En un método alternativo (centrifugación solamente) se empleó el mismo procedimiento de ruptura, pero simplemente se peletearon los núcleos para separarlos del citoplasma sin la purificación adicional con un lecho de sacarosa. Cuantificación del nivel de ARNm. Se cosecharon típicamente tres réplicas biológicas de brotes y tres de raíces para cada línea, según se describió precedentemente en la sección de métodos de cuantificación de proteínas. El ARN se preparó usando un protocolo con un formato de 96 fosas y se sintetizó ADNc a partir de cada muestra. Estas preparaciones se usaron como moldes para experimentos de RT-PCR. Los inventores midieron los niveles de transcriptos para un gen de interés con relación a los transcriptos de ARN de 18S para cada muestra usando un equipo de RT-PCR de tiempo real ABI 7900 Time con tecnología SYBR® Green (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Análisis Fenotípico: Tiempo de la Floración. Las plantas se cultivaron en tierra. El tiempo de la floración se determinó basado en uno o ambos de (i) la cantidad de días después de la siembra hasta la aparición de la primera yema floral visible, (ii) la cantidad total de hojas (roseta o roseta más caulina) producidas por el meristema de brotes primario. Análisis Fenotípico: Estrés por Calor. En los experimentos preliminares descritos en este informe, las plantas se germinaron en una cámara de crecimiento a 30 °C con 24 hs de luz durante 11 días. Se dejó que las plantas se recuperaran a 22 °C con 24 hs de luz durante tres días y se tomaron fotos para registrar el estado de salud después del tratamiento. En un segundo experimento, las plántulas se cultivaron a 22 °C durante cuatro días sobre medio selectivo y se transfirieron las placas a 32 °C durante una semana. Se dejó que se recuperaran a 22 °C durante tres días. Se cosecharon 40 plantas de dos placas separadas para cada línea y se midió tanto el peso fresco como el contenido de clorofila. Análisis Fenotípico: Senescencia inducida por oscuridad. En los experimentos preliminares descritos en este informe, las plantas se cultivaron en tierra entre 27 y 30 días en condiciones de 12 hs de luz a 22 °C. Se llevaron a una cámara oscura a 22 °C y se evaluaron visualmente por senescencia después de entre 10 y 13 días. En algunos casos, los inventores usaron Fv/Fm como una medida de la clorofila (Pourtau et al., 2004) con la hoja más joven, completamente expandida, sobre cada planta. La media de Fv/Fm para las 12 plantas de cada línea se normalizó a la media de Fv/Fm correspondiente a los 12 controles apareados . Microscopía. Se llevaron a cabo microscopía óptica, electrónica y confocal. Diversas definiciones /abreviaturas usadas: R C = Contenido relativo de agua (peso a campo - peso seco) / (peso turgente - peso seco) x 100 ABA = Ácido abscísico, g/gdw Prolina = Prolina, µt???/gdw Cl SPAD = Clorofila estimada con Minolta SPAD-502, relación de 650 nm a 940 nm A 300 = índice de asimilación neta, µt??? C02/m2/s a 300 ppm de C02 A 1000 = índice de asimilación neta, µt??? C02/m2/s a 1000 ppm de C02 Cl Total = mg/gfw, estimado por HPLC Carot = mg/gfw, estimado por HPLC Fo = fluorescencia mínima de una hoja adaptada a oscuridad Fm =fluorescencia máxima de una hoja adaptada a oscuridad Fo' = fluorescencia mínima de una hoja adaptada a la luz Fm' =fluorescencia máxima de una hoja adaptada a la luz Fs = fluorescencia de estado estable de una hoja adaptada a la luz Psi lf = potencial de agua (Mpa) de una hoja Psi p = potencial de turgencia (Mpa) de una hoja Psi pi = potencial osmótico (Mpa) de una hoja Fv/Fm = (Fm - Fo) /Fm; rendimiento cuántico máximo de PSII Fv'/Fm' = (Fm' - Fo' ) /Fm' ; eficacia de captación de energía por centros de reacción PSII abiertos PhiPS2 = (Fm' - Fs) /Fm' , rendimiento cuántico real de PSII ETR = PhiPS2 x intensidad de luz absorbida x 0,5; Los inventores emplean 100 pE/m2/s para la intensidad de luz promedio y 85% como la cantidad de luz absorbida qP = (Fm' - Fs)/(Fm'- Fo' ) ; neutralización fotoquímica (incluye fotosíntesis y foto respiración) ; proporción de PSII abierto qN = (Fm - Fm' ) / (Fm - Fo' ) ; neutralización no fotoquímica (incluye mecanismos tipo disipación de calor) NPQ = (Fm - Fm')/Fm'; neutralización no fotoquímica (incluye mecanismos tipo disipación de calor) Cribado para Eficiencia en el Uso de Agua Un aspecto de esta invención provee plantas transgénicas con mejor rendimiento que resulta de una mejor eficiencia en el uso de agua y/o tolerancia a la falta de agua . Este ejemplo describe un método de alto rendimiento para la selección en invernadero, para alta eficiencia en el uso de agua, de plantas transgénicas a plantas de tipo salvaje (probadas como endogámicas o híbridas) . Este proceso de selección impuso tres ciclos de sequía/re-regado a las plantas durante un periodo total de 15 días luego de un periodo inicial de crecimiento libre de estrés de 11 días. Cada ciclo consistió en cinco días, sin aplicación de agua durante los primeros cuatro días y una aplicación de agua en el quinto día del ciclo. Los fenotipos primarios que se analizaron por medio del método de selección fueron los cambios en la tasa de crecimiento vegetal determinado por la altura y la biomasa durante un tratamiento de sequxa vegetativo. También se midió el estado de hidratación de los tejidos de brotes luego de la sequía. Las alturas de las plantas se midieron en tres puntos temporales . El primero se tomó justo antes de la sequía del comienzo cuando la planta tenía 11 días de edad, el cual fue la altura de brote inicial (SIH) . La altura de la planta también se midió a mitad de camino a lo largo del régimen de sequía/re-regado, en el día 18 luego de plantar, para dar origen a la altura de brote de media sequía (SMH) . Al completar el final del ciclo de sequía e el día 26 luego de plantar, se cosechó la porción del brote de la planta y se midió la altura final, la que fue la altura de brote marchito (S H) y también se midió la biomasa de brote marchito (SWM) . El brote se colocó en agua a 40° C en la oscuridad. Tres días después, se determinó el peso del brote para proveer el peso de brote turgente (STM) . Luego de secarlos en un horno durante cuatro días, se determinaron los pesos de los brotes para proveer la biomasa de brote seco (SDM) . La altura de brote promedio (SAH) fue la altura media de la planta a lo largo de las tres medidas de altura. Cuando se desee, el procedimiento que se describió anteriormente se puede ajustar en +/- un día para cada paso. Para corregir las pequeñas diferencias entre plantas, se derivó un valor de crecimiento corregido por tamaño a partir de SIH y S H. Este fue la Tasa de Crecimiento Relativo (RGR) . La Tasa de Crecimiento Relativo (RGR) se calculó para cada brote usando la fórmula [RGR% = (SWH-SIH) / ( (SWH+SIH) /2) *100] . El contenido relativo de agua (RWC) es una medida de cuanto (en %) de la planta era agua al momento de la cosecha. El Contenido de Agua (RWC) se calculó para cada brote usando la fórmula [RWC% = (SWM-SDM) / (STM-SDM) *100] . Por ejemplo, las plantas de maíz totalmente regadas en esta etapa de desarrollo tienen alrededor de 98% de RWC. Ejemplo VII. Observaciones morfológicas con G1988 sobreexpresiones de secuencias relacionadas en Arabidopsis En sus primeros estudios, la sobreexpresión de G1988 en Arabidopsis produjo un pequeño número de líneas que florecieron tempranamente, y varias plántulas de líneas de sobreexpresión crecieron más rápido que los controles. Los inventores también demostraron que, cuando se crecen sobre medio libre de fosfato, todas las líneas de plántulas de Arabidopsis que sobreexpresan en forma constitutiva G1988 bajo el control regulatorio del promotor 35S aparecieron más grandes y tuvieron más crecimiento de brote que los controles. Las plantas 35S::G1988 con altos niveles de expresión de G1988 produjeron hipocótilos largos, pecíolos largos, y hojas erguidas, fenotipos que sugieren un rol para este gen en la señalización de la luz, que puede ser uno de los factores responsables de conferir un mayor rendimiento en cultivo de plantas. Las líneas 35S::G1988 mostraron otros fenotipos llamativos cuando se las creció durante días largos (16 h de luz) o bajo días continuos; las plantas detuvieron su crecimiento y mostraron clorosis prematura y atraso del desarrollo. Además, se notó un humedecimiento ocasional de las hojas. A partir de este estudio, se generaron cincuenta y una nuevas líneas de fusión directa de promotor 35S::G1988. Nueve de estas líneas mostraron un fenotipo de hipocótilo largo en la generación TI. Diez líneas que no habían mostrado hipocótilos largos en TI se examinaron en la generación T2 , y seis de estas líneas mostraron al menos algunas plantas con hipocótilos largos y pecíolos largos, lo que sugiere que la penetrancia del fenotipo puede estar influenciada por la dosis génica o las condiciones del entorno. La mayoría de las líneas TI que se examinaron exhibieron hojas erguidas. Los efectos sobre la floración fueron inconsistentes; algunas líneas TI se notó nuevamente que florecieron tempranamente, pero la caracterización cuidadosa de dos líneas 35S::G1988 con altos niveles de expresión de G1988 revelaron o ninguna diferencia en la floración o un pequeño retraso, dependiendo de la longitud del día en la que se crecieron las plantas. Similitudes morfológicas conferidas por G1988 y ortólogos Las líneas 35S::G4000 (maíz SEQ ID NOs : 7 y 8), 35S::G4012 (arroz SEQ ID NOs : 15 y 16), 35S::G4299 (tomate SEQ ID NOS : 21 y 22), 35S::G4004 (soja SEQ ID NOs : 3 y 4) y 35S::G4005 (soja SEQ ID NOs : 5 y 6) mostraron morfología similar a las líneas 35S::G1988. Varias plántulas de 35S::Q4012, 35S::G4004 y 35S::G4005 TI tuvieron pecíolos extendidos sobre los cotiledones, y las plántulas de 35S::G4000, 35S::G4012, 35S::G4299, y 35S::G4004 también tuvieron hipocótilos más largos que los controles bajo iluminación continua. Las plantas 35S::G4004 y 35S::G4005 adultas también aparecieron muy similares a las plantas de alta expresión de 35S::G1988 crecidas bajo iluminación continua. Cuando se las expresó en forma constitutiva, todas estas secuencias produjeron plantas que tuvieron hojas erguidas, similares a las plantas 35S::G1988 crecidas con luz continua. Las observaciones de hojas firmes, hipocótilos largos y pecíolos largos sugieren que G4004 y G4005 funcionan en forma similar a G1988 en la señalización de la luz, lo que puede ser un factor que puede contribuir a mejorar el rendimiento en plantas que sobreexpresan el ciado G1988. Varias líneas de 35S::G4004 tuvieron un desarrollo tardío en relación a los controles. De las veinte líneas transgénicas que se examinaron, una de las líneas 35S::G4005 fue de mayor tamaño que los controles en la etapa de plántula, otra línea fue de tamaño de tipo salvaje, y todas las otras líneas fueron de tamaño más pequeño que los controles en esta etapa. Efecto de expresión ectópica de G1988 sobre el crecimiento estacional temprano La expresión constitutiva de G1988 en plantas de soja resultó en incrementos consistentes en el crecimiento estacional temprano en relación a las plantas controles. Este efecto fue particularmente evidente cuando las semillas de los sobreexpresantes y de los controles se plantaron en la primavera tardía en lugar de al principio. En particular, las líneas de sobreexpresión G1988 que estuvieron asociadas con un rendimiento más alto, tales como las líneas 178, 189, 200, 209, 213 y 218 (véase, por ejemplo, la Tabla 12) por lo general exhibieron mayor crecimiento estacional temprano que los controles. Efecto de expresión ectópica de G1988 sobre el diámetro de los tallos en plantas de soja Cuando se crecieron en condiciones de días cortos controlados (10 horas de luz) , las líneas de plantas de soja que sobreexpresan G1988 no mostraron diámetros de tallos incrementados en relación a las plantas controles en ninguna extensión significativa. Sin embargo, en longitudes de días largas (20 horas de luz) , los que sobreexpresan G1988 por lo general produjeron diámetros de tallo significativamente mayores que los controles. Los diámetros de tallo incrementados de los que sobreexpresan G1988 se confirmaron en plantas de soja crecidas en condiciones de campo. El diámetro de tallo incrementado puede impactar en forma positiva en la biomasa así como a incrementar la resistencia al almacenamiento. Tabla 5. Diámetros de tallo de soja de diferentes plantas que sobreexpresan G1988 y controles crecidos en longitudes de días cortas y largas Línea Longitud del día Diámetro de tallo promedio (mm) Diferencia con los controles, diámetro de tallo promedio (mm) Valor P Diferencia con los Diámetro controles , Longitud de tallo Línea diámetro Valor P del día promedio de tallo (mm) promedio (mm) 206** Día corto 4,35 - 0,47 0, 025 178 Día corto 4,43 - 0,39 0, 049 218 Día corto 4, 60 - 0,22 0, 250 A3244 Día corto 4, 82 - (control) 209 Día corto 4, 89 + 0, 07 0, 338 213 Día corto 4,89 + 0, 07 0, 268 A3244 Día largo 15, 75 - (control) 178 Día largo 16, 83 + 1,08 0,071 213 Día largo 16, 92 + 1,07* 0, 021 218 Día largo 17, 46 + 1,71* 0, 004 206** Día largo 16, 29 + 0,54 0, 104 209 Día largo 17, 17 + 1,42* 0, 027 * línea que mostró un diámetro de tallo en relación a s controles (con significancia de p < 0,05) ** no expresa G1988 a un nivel significativo Efecto de expresión ectópica de G1988 sobre longitud internodal en plantas de soja En experimentos de días cortos (10 horas de luz por día) , la longitud internodal de soja se incrementó, en relación a los controles. Por lo general este efecto se evidenció para casi todos los internodos de las plantas, pero fue particularmente evidente para los internodos 8-12 que se formaron relativamente tarde en el desarrollo de la planta (Figura 10) . Sin embargo, la longitud internodal por lo general fue mayor en todas las etapas de crecimiento, inclusive durante el crecimiento estacional temprano como se vio para los internodos tempranos (por ejemplo, internodos 1-5) comparados en la Figura 10. Efecto de expresión ectópica de G1988 sobre el cubrimiento de área La expresión constitutiva de G1988 en plantas de soja resultó en incrementos consistentes en el cubrimiento de área en estación tardía en relación a las plantas controles . El cubrimiento de área incrementado se asoció positivamente con las líneas que produjeron rendimientos incrementados. La línea 217, que sobreexpresa como G1988 en la misma extensión que lo hicieron las líneas de alto rendimiento (la línea 217 expresó ectópicamente alrededor de 60% del nivel de G1988 que generalmente se encuentra en líneas de alto rendimiento) , no exhibe significativamente mayor cubrimiento de área en relación a los controles. Ejemplo VIII. Resultados experimentales basados en placa Este informe provee observaciones experimentales para plántulas transgénicas que sobreexpresan polipéptidos relacionados con G1988 en ensayos basados en placa, en donde se ensaya para tolerancia a estreses abióticos incluyendo falta de agua, frío, y bajo nitrógeno o sensado alterado de C/N. G1988 (SEQ ID NO: 1 y 2; Arabidopsis thaliana) - Promotor 35S constitutivo Resultados de ensayos de fisiología en placa en Arabidopsis En los primeros estudios de los inventores, demostraron que las plántulas que germinaron en placa que contenían nitrógeno limitado ( suplementado con glutamina) aparecieron menos estresadas que los controles. Las plantas 35S::G1988 se hallaron con desempaño alterado en un ensayo que medía la respuesta a relaciones alteradas de carbono/nitrógeno (ensayo de sensado de C/N) . Nueve de diez líneas 35S::G4004 también mostraron una respuesta significativamente diferente en comparación con las plántulas controles en un ensayo de sensado de C/N, en consistencia con el fenotipo que se observó para las plantas 35S::G1988.

Se examinaron diez líneas de plantas 35S::G1988 de Arabidopsis en ensayos fisiológicos. Además del fenotipo de sensado de C/N que se observó en los análisis previos, también se observó un mejor desempeño ante bajo nitrógeno en un ensayo de crecimiento de raíz. Tres de diez líneas también demostraron tolerancia a la deshidratación en un ensayo de desecación severa en placa, un tipo de ensayo de escasez de agua. También se observó tolerancia a la sacarosa (estrés hiperosmótico en sacarosa al 9,4%) en un ensayo de germinación en seis líneas. Estos últimos resultados sugirieron que las plantas que sobreexpresan serían más tolerantes a otras formas de escasez de agua, tal como sequía u otros estrese relacionados. Esta suposición se confirmó a través de los resultados de un ensayo de sequía en tierra que se describe más adelante. Tabla 6. G1988 (SEQ ID NO: 1 y 2 de Arabidopsis thaliana col) - Fusión Directa de Promotor 35S Constitutiva Línea Germ . en Germ. en ABA Germ . en Crecí Deseca Germ . Germ . Crecí sacarosa frío miento ción severa en baj o en miento en frío N bajo N de + gln raíz en bajo N 321 + + + 322 + + + + 323 + + + 324 + 325 + + 326 + + + 327 + + + 328 + + + + 329 + + + + 330 + + + + germ. = germinación, gln = glutamina (+) indica resultado de ensayo positivo/ o fenotipo más tolerante observado, en relación a los controles (celda vacía) indica que las plantas que sobreexpresa G1988 en la línea en la primera columna tuvieron desempeño de tipo salvaje Además de los resultados experimentales que se muestran en la Tabla 6, las plántulas 35S::G1988 también se hallaron más tolerantes al crecimiento en 3% de polietilenglicol en un cribado de tolerancia al estrés hiperosmótico en PEG que las plántulas controles. Las plántulas 35S::G1988 mostraron un crecimiento de raíz más extensos que los controles en 3% de polietilenglicol. Aunque G1988, SEQ ID NO: 1 y 2, no confieren mayor tolerancia al frío en Arabidopsis en este grupo de experimentos, G1988 pudo conferir mayor tolerancia al frío, en relación a los controles, en plantas de soja en germinación que sobreexpresan la proteína G1988 de Arabidopsis . G4004 (SEQ ID NO: 3 y 4 de Glicina max) sobreexpresado con el promotor constitutivo CaMV 35S En base a los resultados obtenidos hasta la fecha, las plantas que sobreexpresan 35S::G4004 fueron más tolerantes a las condiciones de bajo nitrógeno y demostraron un fenotipo de sensado de C/N. Además, siete de las líneas 35S::G4004 se desempeñaron mejor que las plántulas controles en un ensayo de germinación bajo condiciones de frío, evidenciado por la menor acumulación de antocianina que existe en las plantas transgénicas , lo que sugiere que este gen también puede tener utilidad para conferir mejor germinación en frío (Tabla 7) . Las plántulas de las placas de control de germinación tuvieron hipocotilos largos para siete de las diez líneas examinadas. Las plántulas también fueron pequeñas y estancadas en crecimiento en las placas de crecimiento control; dado que estos ensayos se llevaron a cabo bajo iluminación continua, este fenotipo fue consistente con el estancamiento que se vio en los ensayos morfológicos. Estas plantas transgénicas también fueron más tolerantes al frío, durante su germinación, que los controles, evidenciado por la menor acumulación de antocianina que existe en las plantas transgénicas. (Tabla 7) . Tabla 7. G4004 (SEQ ID NO: 3 y 4 de Glicina max) -Fusión Directa de Promotor 35S Constitutiva Línea Germ . en Germ . Desecación Germ. en Germ . en sacarosa en severa bajo N bajo N + frío gln 301 - + + 302 + + + 303 + + + 304 + + + 305 + + + 306 + + + 308 + + + 309 + + 310 + 311 + + + germ. = germinación (+) indica resultado de ensayo positivo/ o fenotipo más tolerante observado, en relación a los controles (celda vacía) indica que las plantas que sobreexpresa G1988 en la línea en la primera columna tuvieron desempeño de tipo salvaje (-) indica un fenotipo más resistente observado en relación a los controles Ejemplo IX. Resultados de ensayos con sequía en Arabidopsis y soja El agua es un factor limitante importante para el rendimiento del cultivo. En los ambientes limitados en agua, el rendimiento del cultivo es una función del uso de agua, eficiencia del uso de agua (WUE; definido como rendimiento de biomasa aérea/uso de agua) y del índice de cosecha (HI; relación de biomasa obtenida a biomasa aérea total en el momento de la cosecha) . WUE es una característica que se ha propuesto como criterio para mejora de rendimiento bajo sequía. En un ensayo de sequía en suelo (una forma de ensayo de escasez de agua que se puede usar para comparar WUE) , se examinaron tres líneas bien caracterizadas de 35S::G1988 Arabidopsis. Dos de estas líneas, las líneas 10-6-3 y 12-2-2, tuvieron altos niveles de expresión de G1988 y exhibieron hipocótilos largos, hojas erectas, y pecíolos largos. Cada una de estas líneas mostró una mejor recuperación de la sequía en uno de los dos ensayos que se realizaron. La tercera línea, la línea 8-5-1, tuvo menores niveles de G1988 y no exhibió la característica morfológica de las otras dos líneas. Esta línea no mostró una mejora en la sobrevida, y, de hecho, se comportó peor en un replicado del ensayo (que no se muestra en la Tabla 8) . No obstante, se identificaron dos líneas individuales que mostraron una mejora significativa en el desempeño a la sequía, y así se pudieron seleccionar en base a eso para un posterior desarrollo y uso del producto.

Resumen de fisiología de sequía en tierra- en maceta arcilla. Tabla 8. Resultados de ensayo de sequía con S: :G1988 : PID Línea Tipo de Puntuación Puntuación valor p Sobrevida Sobrevida valor Proyecto de sequía de sequía para media media para media de media de diferencia para la para el diferen línea control de línea control de 5 puntuación sobrevi de sequía P2499 10-6- DPF 3,1 2,2 0,29 0, 55 0,41 0, 015* 3 P2499 10-6- DPF 1,9 2,4 0,28 0,39 0,37 0,81 3 P2499 12-2- DPF 2,4 2,8 0,58 0,41 0,48 0,28 2 P2499 12-2- DPF 2,8 2,1 0, 17 0,49 0,36 0, 022* 2 15 DPF = proyecto de fusión directa de promotor Sobrevida = proporción de plantas que sobrevivió en cada maceta Escala de sequía: 6 (puntuación más alta) = sin síntomas de estrés, 0 (puntuación más baja; efecto más severo) = síntomas de estrés extremo * la línea se desempeñó mejor que el control (significativo para p < 0,11) Además de las plantas de Arabidopsis, las plantas de soja que sobreexpresan también se desempeñaron mejor que los que los controles en un cribado de eficiencia en el uso de agua (WUE) . Se cosechó el tejido de las localizaciones secas y se midió el contenido de 13C/12C luego de la combustión del material vegetal y su conversión a C02 , y su análisis por espectroscopia de masa. Comparando con un estándar conocido, el contenido de 13C estuvo alterado en forma tal como para indicar que la sobreexpresion de G1988 mejoró la eficiencia en el uso de agua. También se midió la conductancia por estomas. En el primer ensayo a campo, se encontraron tres líneas transgénicas independientes con una conductancia menor estadísticamente significativa. Otras líneas de soja con 35S::G1988 probadas también tuvieron menor conductancia por estomas, pero los datos que se obtuvieron con estas líneas no fueron estadísticamente significativos. No se observaron diferencias significativas en la conductancia por estomas en un ensayo a campo subsiguiente. Tomado todo junto, el análisis de discriminación isotópica y la conductancia por estomas sugieren que las plantas que sobreexpresan G1988 tienen mayor eficiencia de transpiración, lo que indica mejor eficiencia en el uso de agua por parte de dichas plantas . Se llevó a cabo un análisis de sobrevida de las plantas de soja que sobreexpresan G1988 usando un ensayo de cribado de marchitamiento. Cuando se analizaron contra las plantas controles de tipo salvaje algunas de las líneas de las lineas transgénicas analizadas mostraron puntuación de riego alto significativa (p<0,l) y mayor tiempo para alcanzar el marchitamiento. Casi todas las once líneas que sobreexpresan probadas mostraron mayor tiempo de marchitamiento, y las diferencias en el tiempo de marchitamiento para tres líneas en comparación con los controles fueron estadísticamente significativas (Tabla 9, datos presentados en orden decreciente de significancia estadística) . Las únicas dos líneas que mostraron un marchitamiento más avanzado que los controles (resultados no significativos) no expresan G1988 a un grado significativo . Tomados en conjunto, estos datos indican claramente que la sobreexpresión de G1988, SEQ ID NOs : 1 y 2, en soja puede mejorar en forma significativa la tolerancia a condiciones de falta de agua. Tabla 9. Tiempo para marchitamiento de plantas de soja con 35S::Q1988 y controles Tiempo medio para Tiempo medio Diferencia marchita para marchita en el tiempo Línea miento, en miento, de de valor p sobreexpre controles marchitamien sión (días) to (días) (días) 651* 8 , 867 6,308 2 , 559 0, 0008 200* 7, 933 6, 308 1, 625 0, 0718 652* 8, 615 7, 333 1,282 0, 0834 189 8, 714 8, 200 0, 514 0, 1491 213 5,800 4 , 714 1, 086 0, 1619 217*** 6, 067 4, 714 1, 353 0, 2022 198** 6, 938 8,200 -1, 262 0, 2174 206** 5, 933 6,308 -0, 375 0, 3105 209 7,200 6,308 0, 892 0,4200 178 8, 000 7,083 0, 917 0, 6613 218 7,600 7,083 0, 517 0, 9039 * línea que mostró un tiempo de marchitamiento significativamente más largo en relación a los controles (significativo para p < 0,10) ** no expresa G1988 a un nivel significativo *** expresó G1988 en un grado menor que las líneas transgénicas de alto rendimiento Ejemplo X. Resultados para tolerancia al frío in soja La Figura 7 muestra los datos experimentales que se obtuvieron con una línea control de tipo salvaje y con numerosas líneas que sobreexpresan 35S::G1988 que muestran que la sobreexpresión de G1988 resulta en mejor germinación en frío. La germinación total de la semilla control en este ensayo a campo realizado en Winters, California, representado por la línea de puntos de la Figura 7, fue pobre y se notó que un alto porcentaje de las semillas eran "semillas duras", un fenómeno inducido por el estrés que resulta en semillas que resisten la imbibición bajo condiciones estándares. Un porcentaje significativamente mayor de semillas que sobreexpresan G1988 germinaron en distintos tiempos en este ensayo a campo y con semillas obtenidas en los ensayos llevados a cabo en Illinois y Kansas . Estos datos indican un rol para G1988 en la superación de respuestas al estrés y en la potenciación del crecimiento celular. Se transformó G4004 (SEQ ID NO: 4), un homólogo de soja de G1988 que está relacionado filogenéticamente a G1988 (Figura 3 y Figuras 4A-4F) , en plantas de maíz. Se determinó entonces el índice de germinación de las plantas de maíz que sobreexpresan G4004. El índice de germinación es una función del porcentaje de germinación y de la tasa de germinación, y se puede definir por medio de la fórmula: índice de germinación= [ (T-Tl+1) x Pl + (T-T2+1) x (P2 - Pl)+ (T-T3+1) X (P3-P2)+ ...+ (T-TT+1) X (PT-PT-1) ] /T en donde T es el número de días en los que se probó la germinación. Pl, P2, P3 , ... y PT son los porcentajes de semillas que germinaron en los días TI, T2 , T3 , ... y T. Como se muestra en la Tabla 10, la germinación de algunas de las líneas de maíz que sobreexpresan G4004 demostró la gran tolerancia al frío de las plantas que sobreexpresan en comparación con las plantas controles. Tabla 10. Datos fenotípicos de los experimentos de germinación en frío de plantas de maíz que sobreexpresan G4004 índice de germinación Ensayo 1 Ensayo 2 % de % de Línea cambio valor p cambio valor p 609 -14 0, 145 -20 0, 073 610 -1 0,889 -8 0,465 612 14 0, 131 13 0, 242 616 25* 0, 010* 41* 0,000* 619 7 0,436 38 0, 001 710 28* 0, 004* 45 0,000* 711 30* 0, 002* 33 0, 003* 117 -35 0, 000** -30 0,008** Los datos se presentan como porcentaje de cambio contra los controles de tipo salvaje. * índice de germinación significativamente mayor que los controles (p<0,05) ** índice de germinación significativamente menor que los controles (p<0,05) La presente invención demuestra de esta forma que la transformación de plantas, incluyendo a monocotiledones , con un miembro del ciado de polipéptidos G1988 puede conferir a las plantas transformadas mayor tolerancia a las condiciones de frío que el nivel de tolerancia al frío que exhiben las plantas controles .

Ejemplo XI. Resultados de Ensayo a Campo para eficiencia de uso de nitrógeno en maíz Varias plantas de maíz que sobreexpresan la secuencia polipeptídica de soja G4004 (SEQ ID NO: 4) fueron más eficientes en el uso de nitrógeno que las plantas controles, medido por medio del incremento de clorofila y masa de brotes frescos cuando se las creció en invernadero en medio con bajo nitrógeno media que contenía 2,0 mM de nitrato de amonio como fuente de nitrógeno (Tabla 11) . Tabla 11. Datos fenotípicos de cribado de bajo nitrógeno para plantas de maíz que sobreexpresan G4004 Clorofila de hoja Masa de brotes frescos Línea Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 1 Ensayo 609 4,4 2,9 0,2 -2,8 610 6,1* 5,8* 0,5 1,1 612 0,9 3,1 -9,4** -6,2** 616 10, 8* 3,6 2,0 -1,2 619 9,5* 6,0* 15, 8* 4, 9* 710 1,6 5,6* 3,1 -0,3 711 6,8* 12,4* 7,9* 5,0 117 7, 0* 12, 6* 9, 9* 3,5 Los datos se presentan como porcentaje de cambio contra controles de tipo salvaje. * Valor significativamente mayor que los controles a p < 0,05 ** Valor significativamente menor que los controles a p < 0,10 La presente invención demuestra de esta forma que las plantas transgénicas , incluyendo monocotiledóneas , transformadas con un miembro del ciado de polipéptidos G1988 puede conferir mayor tolerancia a condiciones de bajo nitrógeno e incrementar la eficiencia de uso de nitrógeno a dichas plantas transgénicas, en relación a la tolerancia a condiciones de bajo nitrógeno y eficiencia en el uso de nitrógeno de las plantas controles. Ejemplo XII. Mejor rendimiento en ensayos a campo con soja La secuencia de Arabidopsis thaliana G1988 (SEQ ID NOs : 1 y 2), un posible factor de transcripción, se demostró que incrementa el potencial de rendimiento en Glicina max (soja) . En años consecutivos de ensayos de rendimiento general por acre, las plantas transgénicas que expresan constitutivamente G1988 funcionaron mejor que los cultivos controles, con un promedio de construcción de más de 6% de incremento de rendimiento. Las observaciones a campo de soja transgénica con G1988 identificaron varias características relacionadas con el rendimiento que fueron moduladas por el transgen, incluyendo mayor altura, mejor vigor en estación temprana y mayor número de plantas en pie estimado. Las plantas de soja que sobreexpresan G1988 tuvieron floración algo temprana (menos de un día como promedio de construcción) , estuvieron algo retrasadas en maduración (aproximadamente un día como promedio de construcción) , y produjeron nodos que contienen vainas de tallo principal adicionales tarde, al final de la estación (Figura 9) . La Tabla 12 muestra los resultados que se obtuvieron con nueve líneas de soja con 35S::G1988 ensayadas para rendimiento general por acre en 2004 en diez localidades en los EE.UU., con dos réplicas por localidad. Cada réplica se plantó a una densidad de nueve semillas por pie en dos líneas de doce pies divididas por una calle de tres pies. El rendimiento se registró como celemines por acre y se comparó por medio de análisis espacial con una línea control parental no transformada. Las plantas que sobreexpresan G1988 mostraron mayor rendimiento en seis de siete líneas que mostraron expresión significativa del transgen (Tabla 12) . Además de mayor rendimiento, varias de las líneas mostraron floración temprana, retraso en la maduración, y puesta en pie temprana. Tabla 12. Rendimiento de plantas de soja que sobreexpresan 35S::G1988 en relación a las plantas controles en un ensayo a campo en 2004 Expresión de AR Rendimiento (promedio Línea (celemines/acre) valor p normalizado) 206** -5,86 0,000 19044 198** -2,88 0, 043 63330 217*** -2,69 0, 047 1412864 200* 0,35 0, 798 1972981 178* 2,4 0,077 2155338 189* 2, 63 0, 052 2197454 213* 3, 21 0, 018 2088695 209* 3, 63 0,007 2175037 218* 4,13 0, 002 2158073 * mostraron incremento significativo de rendimiento sobre los ocntrolesO ** no expresan G1988 en un nivel significativo *** expresaron G1988 en un grado inferior que las líneas transgénicas de alto rendimiento Diferentes líneas de plantas de soja transgénicas que sobreexpresan G1988 (35S::G1988) también se crecieron en ensayos de campo en 2005. Tanto en 2004 como en 2005, en promedio, las plantas de soja que sobreexpresan G1988 fueron algo más altas que las plantas controles . Cuando los datos de rendimiento se promediaron a lo largo de múltiples localidades, se observó un incremento consistente del rendimiento en celemines por acre, comparado con la línea parental, para ambos años (Figura 6) . En el ensayo de campo del 2005, la sobreexpresión de G1988 incrementó significativamente el rendimiento en 17 de las 19 localidades probadas. Si la línea que se muestra como línea 4 en la Figura 6, que es diferente a las otras líneas que se presentan en el gráfico de la Figura 6 que mostró poca o ninguna expresión de G1988 en el tejido foliar, se elimina del análisis estadístico, el incremento de rendimiento promedio del 2005 fue de alrededor de 6,7%. El análisis del rendimiento de soja a lo largo de tres años en ensayos de campo mostró que G1988, cuando se sobreexpresa en numerosas líneas transgénicas, fue capaz de conferir un incremento de rendimiento en relación a los controles (Tabla 13) . Tabla 13. Análisis a lo largo del año del rendimiento de soja de líneas transgénicas que sobreexpresan G1988 Diferencia % Línea Rendimiento en relación Valor de vegetal (celemines/acre) al control P diferencia (celemines/acre) 178* 63 , 8 + 3,9 6,5 0, 000 189* 63 , 6 + 3,7 6,1 0, 000 209* 63 , 0 + 3,1 5,2 0,001 218* 62, 8 + 2,9 4,9 0, 001 213* 62, 6 + 2,7 4,5 0, 001 200* 62,2 + 2,3 3,9 0, 007 217*** 59, 8 - 0,2 -0,3 0, 827 206** 58, 1 - 1,8 -3,1 0, 031 * mostró incremento significativo de rendimiento sobre los controles ** no expresa G1988 en un nivel significativo *** expresó G1988 en un menor grado que las líneas transgénicas de alto rendimiento La Tabla 14 demuestra aun otro medio por el cual la sobreexpresión de G1988 puede incrementar el rendimiento en plantas de soja. En esta tabla, se comparó el número final de plantas en pie para plantas transgénicas y plantas control tanto de fechas de plantación temprana como tardía. Las líneas de alto rendimiento demostraron un número final de plantas en pie significativamente mayor que la línea control probada bajo las mismas condiciones.

En varios casos, estos resultados fueron significativos para p<0,05. Tabla 14. Análisis a lo largo del año de rendimiento en soja de líneas transgénicas que sobreexpresan G1988 Tiempo de Línea Plantas Emer Diferencia Valor p plantación en pie gencia con final (%) plantas (plantas control (# por de plantas) gráfica) Temprana 178 151 70 16 0, 05* Temprana 189 147 68 11 0, 15 Temprana 200 146 67 7 0,40 Temprana 206** 141 65 4 0, 65 Temprana 209 139 64 2 0, 84 Temprana 213 150 69 16 0, 05* Temprana 217*** 142 66 6 0,45 Temprana 218 157 73 28 0,001* Temprana Control 134 62 0 Tardía 178 168 78 19 0, 009* Tardía 189 161 74 14 0, 04* Tardía 200 162 75 17 0, 01* Tardía 206** 152 71 5 0,42 Tardía 209 157 73 12 0,08* Tardía 213 164 76 18 0,01* Tardía 217*** 153 71 4 0,56 Tardía 218 162 75 19 0, 008* Tardía Control 153 71 0 * significativo con p < 0.05 ** no expresa G1988 en un nivel significativo *** expresó G1988 en un menor grado que las líneas transgénicas de alto rendimiento La Figura 11 muestra los resultados de un ensayo a campo son densidades de plantas. Las plantas de soja representadas en esta Figura que sobreexpresan G1988 demostraron un incremento de rendimiento observable a lo largo de un amplio rango de densidades de plantas, en relación a las plantas controles que no sobreexpresan G1988 (mostradas como círculo vacíos) , o plantas transgénicas control que no expresan G1988 en un grado significativo (mostrados como círculos rellenos) . Cinco de las líneas se representan con triángulos vacíos, triángulos rellenos, cuadrados vacíos, cuadrados rellenos, y asteriscos. Como se muestra en esta figura, cada una de las cinco líneas que expresan G1988 en un grado significativo proveyeron un mayor rendimiento que los controles a todas las densidades ensayadas, y por consiguiente, el número de plantas de pie no tuvo una gran contribución en el rendimiento de cosecha. Una posible explicación para el incremento en el rendimiento de soja es un incremento de nodos del tallo principal que contiene vainas, en relación a las plantas controles que no sobreexpresan el polipéptido G1988. Como se muestra en la Figura 9, cuando se comparan diferentes líneas de plantas de soja que sobreexpresan varias secuencias, se observó un rango considerable de número medio de nodos del tallo principal que contiene vainas, en relación a la línea control parental (la diferencia observada para la línea control fue "0", y por lo tanto se representa en la Figura 9 por medio de la línea de ordenada "0"). Las barras sombreadas designan líneas que sobreexpresan G1988, todas las cuales produjeron más nodos que el control, con cuatro o cinco líneas produciendo la mayor diferencia positiva en nodos observados. La presente invención demuestra de esta forma que las plantas transgénicas , incluyendo legumbres, y particularmente incluyendo soja, transformadas con un miembro del ciado de polipéptidos G1988 pueden mostrar un mayor rendimiento en relación al rendimiento exhibido por las plantas control . Ejemplo XIII. Utilidades de G1988 y sus secuencias relacionadas filogenéticamente para la mejora del rendimiento. La tolerancia al estrés abiótico incrementada puede mejorar el rendimiento. G1988 también mejoró la tolerancia al estrés in Arabidopsis, y los experimentos anteriores han demostrado que homólogos estrechamente relacionados de G1988 también confieren mejor tolerancia al estrés abiótico, en relación a los controles, para condiciones tales como frío o bajo nitrógeno. La mayor tolerancia al estrés abiótico puede tener un impacto significativo sobre el rendimiento, incluido durante periodos de estrés suave, moderado, y considerable . El diámetro de tallos incrementado puede mejorar el rendimiento . El diámetro del tallo incrementado puede impactar positivamente sobre la biomasa de una planta, y también provee mayor resistencia al almacenamiento. Más raíces secundarias pueden mejorar el rendimiento. La provisión de más raíces secundarias mediante la transformación de plantas con secuencias miembros del ciado G1988 puede conferir mejor anclaje en relación a las plantas controles . Las plantas transformadas también se pueden producir con la capacidad de prosperar en suelos que de otra forma serían improductivos, tales como en ambientes de bajos nutrientes, o en regiones o en periodos de baja disponibilidad de agua. La tolerancia al estrés osmótico también puede estar mediada por un mayor crecimiento de la raíz. Estos factores incrementan el rango de plantación efectivo de cultivo y/o incrementan la sobrevida y el rendimiento . Un mayor número de nodos de tallo principal puede mejorar el rendimiento. El número de nodos de tallo principal de una variedad de cultivos está relacionado con el rendimiento producido por la planta. Por ejemplo, la soja y otros cultivos que contienen semillas producen vainas que contienen semillas a partir de los nodos de tallo principal, y por consiguiente, un mayor número de nodos de tallo principal tiene un impacto positivo sobre el número de semillas producidas por la planta. Un mayor número de nodos de tallo principal también puede incrementar la biomasa o el rendimiento de otros cultivos tales como algodón, en donde el conjunto de bagas se relaciona con el número de nodos de tallo principal . La sensibilidad a la luz reducida puede mejorar el rendimiento. La luz ejerce su influencia sobre muchos aspectos del crecimiento y desarrollo de la planta, incluyendo germinación, coloración, y tiempo de floración. La luz dispara una inhibición de la elongación de hipocótilos junto con la coloración en plántulas jóvenes. Por consiguiente, las diferencias en la longitud del hipocótilo son una buena medida de la respuesta a la luz . Las plántulas que sobreexpresan G1988 exhiben hipocótilos más largos bajo la luz debido a una menor inhibición de la elongación de hipocótilos. Las plantas que sobreexpresan G1988 también fueron menos sensibles a longitudes de onda azul, roja y roja lejana, indicando que G1988 actúa corriente debajo de los fotorreceptores responsables de percibir los diferentes colores de la luz. Este hallazgo indicó que las plantas adultas que sobreexpresan G1988 tuvieron menor sensibilidad a la luz. Los homólogos estrechamente relacionados de G1988 de maíz (G4000, SEQ ID NO: 8), soja (G4004, SEQ ID NO: 4), arroz (G4012) , y tomate (G4299, SEQ ID NO: 22), también confirieron hipocótilos largos cuando se sobreexpresaron en Arabidopsis. En los experimentos conducidos hasta el momento, la sobreexpresión del homólogo derivado de soja G4005, (SEQ ID NO: 6) no causó hipocótilos largos en las líneas a producir, pero G4005 no confirió otras indicaciones de una respuesta alterada a la luz tales como pecíolos y hojas erectas. Por consiguiente, hay una fuerte correlación entre G1988 y sus ortólogos de maíz, soja, arroz y tomate en su habilidad para reducir la sensibilidad a la luz, y estos datos indican que G1988 y sus homólogos estrechamente relacionados funcionan en forma similar en las vías de señalización que están involucradas en la sensibilidad a la luz. Por consiguiente se predice que, como G1988, los homólogos miembros del ciado estrechamente relacionado con G1988 también pueden mejorar características que pueden estar afectadas por la sensibilidad a la luz reducida. La reducción de la sensibilidad a la luz puede contribuir a mejoras en el rendimiento en relación a las plantas controles. Un mayor crecimiento estacional temprano puede mejorar el rendimiento. Para la mayoría de los cultivos comerciales, es deseable usar plantas que se establezcan rápidamente, debido a que las plántulas y las plantas jóvenes son particularmente susceptibles a las condiciones de estrés tales como salinidad o enfermedad. Debido a que muchas malas hierbas pueden crecer más que los cultivos o competir con ellos por los nutrientes, sería deseable determinar medios para permitir que las plantas de cultivos jóvenes ganen en la competencia contra especies de malas hierbas. El incremento del vigor de las plántulas y plantas jóvenes permite a los cultivos ser plantados más tempranamente en la estación con menor posibilidad de pérdidas debido a los factores ambientales . Un mayor vigor de estacional tardío puede mejorar el rendimiento. La expresión constitutiva de G1988 mejoró en forma significativa el crecimiento estacional tardío y el vigor de la soja. Las plantas que sobreexpresan G1988 tuvieron un incremento de nodos de tallo principal que contiene vainas, mayor altura de planta, e incrementos consistentes de cubrimiento de área estacional tardío. Estas diferencias, en relación a las plantas control o sin transformar, pueden haber tenido un impacto significativamente positivo sobre el rendimiento. Debido a las similitudes morfológicas, fisiológicas, y de tolerancia al estrés que se observaron entre G1988 y sus homólogos estrechamente relacionados, los miembros polipeptídicos del ciado G1988, incluyendo las secuencias que se presentan en la Tabla 1 y el listado de secuencias, se espera que incrementen el rendimiento, calidad del cultivo, y/o rango de crecimiento, y que disminuyan el uso de fertilizante y/o agua en una variedad de plantas de cultivo, plantas ornamentales, y plantas para madera que se usan para la industria de alimentos, ornamental, de papel, de pulpa, madera para construcción u otras. Ejemplo XIV. Transformación de eudicotiledóneos para producir mayor rendimiento y/o tolerancia al estrés abiótico Las especies de cultivo que sobreexpresan polipéptidos de esta invención pueden producir plantas con mayor tolerancia a la falta de agua, al frío y/o nutrientes y/o rendimiento tanto en condiciones de estrés como de no estrés. Por consiguiente, las secuencias de polinucleótidos que se listan en la Lista de Secuencias recombinadas en, por ejemplo, uno de los vectores de expresión de la invención, u otro vector de expresión apropiado, se pueden transformar en una planta con el propósito de modificar características de la planta con el propósito de mejorar el rendimiento y/o calidad. El vector de expresión puede contener un promotor constitutivo, tejido específico o inducible ligado en forma operable al polinucleótido . El vector de clonación se puede introducir en una variedad de plantas por métodos bien conocidos en el arte tales como, por ejemplo, transferencia directa de ADN o transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Ahora es rutina producir plantas transgénicas usando la mayoría de las plantas eudicotiledóneas (véase Weissbach and Weissbach (1989); Gelvin et al. (1990); Herrera-Estrella et al. (1983); Bevan (1984); y Klee (1985)). Los métodos para el análisis de las características son de rutina en el arte y en los Ejemplos que se expusieron anteriormente. Previamente se han descrito numerosos protocolos para la transformación de plantas de tomate y soja, los cuales son bien conocidos en el arte. Gruber et al. (1993), y Glick y Thompson (1993) describen varios vectores de expresión y métodos de cultivo que pueden usarse para la transformación de células o cultivos, y la regeneración subsiguiente. Se describen métodos para la transformación de soja en Miki et al. (1993); y en la Patente de los EE.UU. N° 5563055, (Townsend y Thomas) , presentada el 8 de Octubre de 1996. Hay una cantidad sustancial de alternativas a los protocolos de transformación mediada por Agrobacterium, otros métodos con el propósito de transferir genes exógenos a soja o tomate. Uno de estos métodos es la transformación mediada por microproyectiles , en el que se transfiere ADN, aplicado sobre la superficie de partículas de microproyectiles, hacia los tejidos vegetales, con un dispositivo biolístico (véanse, por ejemplo, Sanford et al. (1987); Christou et al. (1992); Sanford (1993); Klein et al. (1987); la Patente de los EE.UU. N° 5015580 (Christou et al) , presentada el 14 de Mayo de 1991; y la Patente de los EE.UU. N° 5322783 (Tomes et al.), presentada el 21 de Junio de 1994) . Como alternativa, se han usado métodos de sonicación (véase, por ejemplo, Zhang et al. (1991)); asimilación directa de ADN en protoplastos usando precipitación con CaC12, alcohol polivinílico o poli-L-ornitina (Hain et al. (1985); Draper et al. (1982)); fusión con liposomas o esferoplastos (véase, por ejemplo, Deshayes et al. (1985); Christou et al. (1987)); y electroporacion de protoplastos y células completas y tejidos (véanse, por ejemplo, Donn et al. (1990); D'Halluin et al. (1992); y Spencer et al. (1994) ) para introducir ADN extraño y vectores de expresión en plantas .

Una vez que la planta o la célula vegetal se ha transformado (y esta última ha sido regenerada en una planta) , la planta transformada puede cruzarse consigo misma, o con una planta de la misma línea, con una planta no transformada o de tipo salvaje, o con otra planta transformada de una línea de plantas transgénicas diferentes. El cruzamiento provee las ventajas de producir variedades transgénicas nuevas y comúnmente estables. Los genes y los caracteres que confieren, que pueden haber sido introducidos en una línea de tomate o soja, pueden introducirse en una línea de plantas diferente, usando procedimientos de retrocruza tradicionales bien conocidos en el arte. La transformación de plantas de tomate puede realizarse usando los protocolos de Koornneef et al (1986) , y aquellos en la Patente de los EE.UU. N° 6613962, donde este último método se describe brevemente en la presente documentación. Se precultivan explantes de cotiledones de ocho días de edad durante 24 horas en placas de Petri que contienen una capa de células en suspensión de Petunia hybrida, plaqueadas en medio MS con 2% (p/v) de sacarosa y 0,8% de agar, suplementado con ácido D-naftaleno acético 10 µ? y 6-bencilaminopurina 4,4 DM. Luego se infectan los explantes con un cultivo diluido de una noche de Agrobacterium tumefaciens, que contiene un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la invención, entre 5 y 10 minutos, se realiza una transferencia en un papel de filtro estéril y se co-cultiva durante 48 horas en las placas con capas de células originales. Las condiciones de cultivo son como se describió con anterioridad. Los cultivos de una noche de Agrobacterium tumefaciens se diluyen en medio líquido MS con 2% (p/v) de sacarosa, pH 5,7) hasta una QD600 de 0,8. Después del co-cultivo, los explantes de cotiledones se transfieren a placas de Petri con un medio de selección que comprende un medio MS con zeatina 4,56 DM, vancomicina 67,3 DM, cefotaxima 418,9 DM y sulfato de kanamicina 171,6 ?M, y se cultiva bajo las condiciones de cultivo descriptas previamente. Los explantes se sub-cultivan cada tres semanas en medio fresco. Los brotes emergentes se disecan a partir de los callos subyacentes, y se los transfiere a recipientes de vidrio con medio selectivo sin zeatina para formar raíces . La formación de raíces en un medio que contiene sulfato de kanamicina es una indicación positiva de una transformación exitosa. La transformación de las plantas de soja puede realizarse usando los métodos hallados, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. N° 5563055 (Townsend et al., presentada el 8 de Octubre de 1996) , descriptos brevemente en la presente documentación. En este método, las semillas de soja se esterilizan en forma superficial exponiéndolas a cloro gaseoso en un recipiente con una campana de vidrio. Las semillas se dejan germinar sembrándolas en un medio de agar solidificado con 1/10 de fuerza sin reguladores de crecimiento vegetal, y se las cultiva a 28 °C con una longitud de día de 16 horas. Después de tres o cuatro días, es posible preparar las semillas para el co-cultivo. Se retira el recubrimiento de la semilla y se extrae la radícula en elongación 3-4 mm debajo de los cotiledones. Se desarrollan cultivos de una noche de Agrobacterium tumefaciens, que contienen el vector de expresión que comprende un polinucleótido de la invención, hasta una fase logarítmica, se los agrupa y se los concentra por centrifugación. Las inoculaciones se realizan en lotes, de modo que cada placa de semillas es tratada con un precipitado recién suspendido de Agrobacterium. Los precipitados se suspenden nuevamente en 20 mi de medio de inoculación. El inoculo se vierte en una placa de Petri que contiene semillas preparadas, y los nodos de los cotiledones se maceran con una cuchilla quirúrgica. Después de 30 minutos, los explantes se transfieren a placas del mismo medio que ha sido solidificado. Los explantes se embeben con el lado adaxial hacia arriba, se colocan parejos con la superficie del medio y se cultivan a 22 °C durante tres días bajo luz fluorescente blanca. Estas plantas pueden regenerarse posteriormente de acuerdo con métodos bien establecidos en el arte, tal como mediante el traslado de los explantes a un medio líquido de contraselección después de tres días (véase la Patente de los EE.UU. N° 5563055) . Luego es posible recoger, embeber y cultivar los explantes en un medio de selección solidificado. Después de un mes en el medio de selección transformado, el tejido transformado se torna visible como sectores verdes de tejido en regeneración, contra un fondo de tejido blanquecino menos saludable. Los explantes con sectores verdes se transfieren a un medio de elongación. Se continúa el cultivo en este medio, con transferencias a placas frescas cada dos semanas . Cuando los brotes tienen una longitud de 0,5, es posible cortarlos en la base y colocarlos en un medio de generación de raíces. Ejemplo XV: Transformación de monocotiledóneas para producir mayor rendimiento o tolerancia al estrés abiótico Es posible transformar plantas de cereales, tales como, sin limitaciones, maíz, trigo, arroz, sorgo o cebada, con las presentes secuencias de polinucleótidos , incluyendo secuencias derivadas de monocotiledóneas o dicotiledóneas, tales como aquellas indicadas en las presentes tablas, clonadas en un vector, tal como pGA643, que contiene un marcador de resistencia a kanamicina, y expresarlas de forma constitutiva, por ejemplo, bajo los promotores CaMV 35S o C0R15, o con promotores con especificidad tisular o inducibles. Los vectores de expresión pueden ser uno hallado en el listado de secuencias, o puede usarse cualquier otro vector de expresión apropiado de forma similar. Por ejemplo, es posible modificar pMEN020 para reemplazar la región codificante NptII con el gen BAR de Streptomyces hygroscopicus , que confiere resistencia a fosfinotricina . Los sitios Kpnl y BglII del gen Bar se eliminan por mutagénesis con especificidad de sitio, con cambios por codones silenciosos. El vector de clonación puede introducirse en una variedad de plantas por medios bien conocidos en el arte, incluyendo la transferencia directa de ADN o la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Este último abordaje puede efectuarse de acuerdo con una variedad de medios, incluyendo, por ejemplo, el descrito en la Patente de los EE.UU. N° 5591616, en el que se transforma un callo de monocotiledóneas poniendo en contacto el tejido en diferenciación con la Agrobacterium que contiene el vector de clonación. Los tejidos de muestra se sumergen en una suspensión de 3 x 10-9 células de Agrobacterium, que contienen el vector de clonación, durante 3-10 minutos. El material de callo se cultiva en medio sólido a 25 °C en la oscuridad durante varios días. Los callos que se desarrollan en este medio se transfieren a medio de regeneración. Se continúa con las transferencias cada 2-3 semanas (2 ó 3 veces) hasta que se desarrollan brotes. Luego se transfieren los brotes a medio de elongación de brotes cada 2-3 semanas. Los brotes de aspecto saludable se transfieren a medio de generación de raíces, y una vez que se han desarrollado las raíces, las plantas se colocan en tierra para macetas húmedas . Luego se analizan las plantas transformadas para determinar la presencia del gen NPTII/resistencia a kanamicina por ELISA, usando el conjunto de elementos de ELISA NPTII de 5Prime-3Prime Inc. (Boulder, CO) . También es común el uso de otros métodos para producir plantas transgénicas de la mayor parte de los cereales de cultivo (Vasil (1994)), tales como maíz, trigo, arroz, sorgo (Cassas et al. (1993)) y cebada (Wan y Lemeaux (1994)). Es posible usar métodos de transferencia de ADN, tales como el método de microproyectiles, para maíz (Fromm et al. (1990); Gordon-Kamm et al. (1990); Ishida (1990)), trigo (Vasil et al. (1992); Vasil et al. (1993); Weeks et al. (1993)) y arroz (Christou (1991); Hiei et al. (1994); Aldemita y Hodges (1996); y Hiei et al. (1997)). Para la mayor parte de las plantas de cereales, las células embriogénicas derivadas de tejidos de escutelos inmaduros son los blancos preferidos para la transformación (Hiei et al. (1997); Vasil (1994)). Para transformar células embriogénicas de maíz derivadas de tejido escutelar inmaduro usando bombardeo con microproyectiles, el genotipo A188XB73 es el genotipo preferido (Fromm et al. (1990); Gordon-Kamm et al. (1990)). Una vez realizado el bombardeo con microproyectiles, los tejidos se seleccionan en fosfinotricina para identificar las células embriogénicas transgénicas (Gordon-Kamm et al. (1990)). Las plantas transgénicas se regeneran de acuerdo con procedimientos de regeneración de maíz convencionales (Fromm et al. (1990); Gordon-Kamm et al. (1990)). Ejemplo XVI: Expresión y análisis de mayor rendimiento o tolerancia al estrés abiótico en especies distintas a Arabidopsis Debido a que los homólogos estrechamente relacionados a G1988, que derivan de diversas especies vegetales, que se han sobreexpresado en plantas tienen las mismas funciones de conferir mayor rendimiento, morfologías similares, sensibilidad a la luz reducida, y de incrementar la tolerancia al estrés abiótico, incluyendo la tolerancia al frío durante la germinación y condiciones de bajo nitrógeno, se espera que los ortólogos estructuralmente similares a las secuencias de polipéptidos del ciado G1988, incluyendo a aquellas que se encuentran en la Lista de Secuencias, puedan conferir mayor rendimiento, y/o tolerancia incrementada a varios estreses abióticos, incluyendo falta de agua, frío, y condiciones de bajo nitrógeno, en relación a las plantas controles. Como las secuencias de la invención han demostrado incrementar el rendimiento o mejorar la tolerancia al estrés en una variedad de especies vegetales, también se espera que estas secuencias incrementen el rendimiento de cultivos o de otras especies vegetales comercialmente importantes. Pueden usarse análisis de Northern blot, RT-PCR o microarreglos de las plantas transformadas regeneradas para demostrar la expresión de un polipéptido de un factor de transcripción de la invención, y de genes relacionados capaces de inducir resistencia a enfermedades, tolerancia a estrés abiótico y/o mayor tamaño. Una vez que se ha transformado una planta dicotiledónea, planta monocotiledónea o una célula vegetal (y que esta última célula hospedadora vegetal se ha regenerado en una planta) y que ha demostrado tener un mayor tamaño, mayor densidad de plantación, o sea, capaz de tolerar una mayor densidad de plantación con un incremento coincidente de rendimiento, mayor vigor estacional tardío, o mejor tolerancia al estrés abiótico, o producir un mayor rendimiento en relación a la planta control bajo condiciones de estrés, la planta monocotiledónea transformada se puede cruzar consigo misma o con una planta de la misma línea, una planta monocotiledónea no transformada o de tipo salvaje, u otra planta monocotiledónea transformada de una línea de plantas transgénicas diferente. La función de los polipéptidos específicos de esta invención, incluyendo a los ortólogos estrechamente relacionados, se ha analizado y se puede caracterizar más aún e incorporar en plantas de cultivo. La sobreexpresión ectópica de estas secuencias puede regularse usando elementos regulatorios constitutivos, inducibles o específicos de tejido. Los genes que se han examinado y que han demostrado modificar las características vegetales (incluyendo mayor rendimiento y/o tolerancia al estrés abiótico) codifican polipéptidos que se encuentran en la Lista de Secuencias. Además de estas secuencias, se espera que las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos recién descubiertas relacionadas estrechamente con las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos halladas en el listado de secuencias también puedan conferir la alteración de caracteres de forma similar a las secuencias halladas en el listado de secuencias, cuando se las transforme en cualquiera de una variedad considerable de plantas de distintas especies, incluyendo dicotiledóneas y monocotiledóneas . Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos derivadas de monocotiledóneas (por ejemplo, las secuencias de arroz) pueden usarse para transformar plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, y aquellas derivadas de dicotiledóneas (por ejemplo, los genes de Arabidopsis y soja) pueden usarse para transformar cualquier grupo, aunque se espera que algunas de estas secuencias funcionen mejor si el gen se transforma en una planta del mismo grupo del que deriva la secuencia. Como un ejemplo de un primer paso para determinar la tolerancia relacionada con la sequía, se someten semillas de estas plantas transgénicas a ensayos de germinación para medir la sensibilidad a la sacarosa, desecación severa o sequía . Los métodos para los ensayos de sensado de sacarosa, desecación severa o sequía están descritos más arriba. Las plantas que sobreexpresan secuencias de la invención se pueden encontrar más tolerantes a alta sucrosa por tener mejor germinación, radículas más largas, y mayor expansión de los cotiledones. Las secuencias de esta invención, o sea, los miembros del ciado G1988, también se pueden usar para generar plantas transgénicas que sean más tolerantes a condiciones de bajo nitrógeno o frío que las plantas controles. Todas estas tolerancias a estreses abióticos conferidas por G1988 pueden contribuir a un mayor rendimiento de plantas disponibles comercialmente . Sin embargo, los que sobreexpresan G1988 han demostrado incrementar el rendimiento de plantas en ausencia de un estrés abiótico obvio significativo, evidenciado por la inclusión de mayor altura, mayores vigor estacional temprano y número de plantas en pie estimado, y mejor cubrimiento de área estacional temprano observado en plantas de soja que sobreexpresan G1988. Por consiguiente, se espera que los miembros del ciado G1988 mejoren el rendimiento en plantas en relación a las plantas controles, incluyendo especies de legumbres, incluso en ausencia de estrés abiótico abierto. Las plantas que son más tolerantes que los controles en los ensayos de falta de agua, condiciones de bajo nitrógeno o frío son más verdes, más vigorosas, tendrán mejor tasa de sobrevida que los controles, o se recuperarán mejor de estos tratamiento que las plantas controles. Se espera que se puedan aplicar los mismos métodos para identificar otras secuencias de los presentes ciados pólipeptídicos útiles y valiosas, y que las secuencias puedan derivar de un rango amplio de especies. Referencias citadas: Aldemita y Hodges (1996) Planta 199: 612-617 Alia y col. (1998) Plant J. 16: 155-161 Altschul (1990) J. Mol. Biol . 215: 403-410 Altschul (1993) J. Mol. 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La presente invención no está limitada por las realizaciones específicas que se describen en la presente. Habiéndose descripto por completo la invención, resultará evidente para el especialista en la técnica que es posible efectuar cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones. Las modificaciones que resultan evidentes a partir de la descripción anterior y de las figuras acompañantes está dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como prioridad lo contenido en las siguientes:
REIVINDICACIONES 1. Un método para producir una planta transgénica que tenga una característica alterada en relación a una planta control, CARACTERIZADO PORQUE comprende los pasos de: (a) proveer un vector de expresión que codifica un polipéptido que comprende un dominio conservado de dedos de zinc caja B que comparte una identidad de aminoácidos con una de SEQ ID NOs : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 o 66; en donde, cuando se sobreexpresa el polipéptido en una planta, el polipéptido regula la transcripción y confiere al menos una actividad regulatoria que resulta en la característica alterada en relación a una planta control; en donde el porcentaje de identidad de aminoácidos se elige del grupo que consiste en al menos alrededor de 56%, al menos alrededor de 58%, al menos alrededor de 60% de identidad de secuencia, al menos alrededor de 65%, al menos alrededor de 67%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 76% al menos alrededor de 77' al menos alrededor de 78% al menos alrededor de 79% al menos alrededor de 80% al menos alrededor de 81s al menos alrededor de 82 '- al menos alrededor de 83! al menos alrededor de 84% al menos alrededor de 85% al menos alrededor de 86% al menos alrededor de 87% al menos alrededor de 88! al menos alrededor de 89' al menos alrededor de 90' al menos alrededor de 91' al menos alrededor de 92% al menos alrededor de 93% al menos alrededor de 94% al menos alrededor de 95% al menos alrededor de 96! al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98 al menos alrededor de 99%, y alrededor de 100%; y introducir el vector de expresión en una planta objetivo para producir la planta transgénica; en donde la característica alterada se elige del grupo que consiste en mayor crecimiento estacional temprano, mayor crecimiento estacional tardío y vigor, mayor cubrimiento de área, mayor altura, mayor diámetro de tallo, mayor resistencia al almacenamiento, mayor longitud internodal, más raíces secundarias, mayor tolerancia al frío, mayor tolerancia a la falta de agua, menor conductancia por estomas, mayor tolerancia a estrés hiperosmótico, y mayor número de nodos de tallo principal; y (c) opcionalmente , identificar la planta transgénica por medio de la selección de la planta transgénica que sobreexpresa el polipéptido o por medio de la selección de la planta transgénica que tiene una característica alterada en relación a la planta control. 2. El método de la reivindicación 1, CARACTERIZADO PORQUE la planta transgénica es una legumbre.
3. El método de la reivindicación 1, CARACTERIZADO PORQUE el polipéptido comprende además a SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 57 y/o SEQ ID NO: 58.
4. El método de la reivindicación 1, CARACTERIZADO PORQUE el vector de expresión codifica cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ,24, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 o 66.
5. El método de la reivindicación 1, CARACTERIZADO PORQUE el vector de expresión comprende además un promotor constitutivo, inducible, o específico de tejido que regula la expresión del polipéptido.
6. El método de la reivindicación 5, CARACTERIZADO PORQUE el promotor especifico de tejido o inducible es un promotor específico de tejido de hoja primordial emergente, un promotor específico de tejido epidérmico, un promotor específico de tejido de meristema floral, un promotor específico de tejido fotosintético, un promotor específico de tejido radicular, un promotor específico de tejido de meristema radicular, un promotor específico de tejido vascular radicular, un promotor específico de tejido vascular, un promotor específico de meristema apical de brote, un promotor específico de tejido epidermal, un promotor específico de flor o flor primordial, un promotor específico de meristema, un promotor específico de tejido primordial, un promotor específico de órganos jóvenes, o un promotor inducible por estrés .
7. El método de la reivindicación 1, CARACTERIZADO PORQUE los pasos del método comprenden además autocruzar o cruzar la planta transgénica consigo misma o con otra planta, respectivamente, para producir una semilla transgénica .
8. El método de la reivindicación 1, CARACTERIZADO PORQUE los pasos del método comprenden además autocruzar o cruzar la planta transgénica consigo misma o con otra planta, respectivamente, para producir una semilla transgénica que comprende el vector de expresión de la reivindicación 1.
9. Una semilla transgénica que se produjo a partir de la planta transgénica que se produjo en el método de la reivindicación 1, CARACTERIZADA PORQUE la semilla transgénica comprende el vector de expresión de la reivindicación 1.
10. Un método para producir una planta transgénica que tenga una característica alterada en relación a una planta control, CARACTERIZADO PORQUE los pasos del método comprenden: (a) proveer un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que comprende un dominio conservado de dedos de zinc caja B; en donde el polinucleótido recombinante hibridiza bajo condiciones severas con alguna de SEQ ID NOs : 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, o 65, y en donde las condiciones severas son al menos tan severas como las condiciones de hibridización que comprenden al menos dos pasos de lavado con SSC 6x y 65° C entre 10 y 30 minutos por paso de lavado; en donde, cuando se sobreexpresa el polipéptido en una planta, el polipéptido regula la transcripción y confiere al menos una actividad regulatoria que resulta en la característica alterada en relación a una planta control; (b) introducir el vector de expresión en una planta objetivo para producir la planta transgénica; en donde la característica alterada se elige del grupo que consiste en mayor crecimiento estacional temprano, mayor crecimiento y vigor estacional tardío, mayor cubrimiento de área, mayor altura, mayor diámetro de tallo, mayor resistencia al almacenamiento, mayor longitud internodal, más raíces secundarias, mayor tolerancia al frío, mayor tolerancia a la falta de agua, menor conductancia por estomas, mayor tolerancia a estrés hiperosmótico, y mayor número de nodos de tallo principal; y (c) opcionalmente , identificar la planta transgenica por medio de la selección de la planta transgénica que sobreexpresa el polipéptido o por medio de la selección de la planta transgénica que tiene una característica alterada en relación a la planta control .
11. El método de la reivindicación 10, CARACTERIZADO PORQUE la planta transgénica es una legumbre .
12. El método de la reivindicación 10, CARACTERIZADO PORQUE las condiciones de hibridización comprenden el menos dos pasos de lavado con SSC 0,5X, SDS al 0,1% a 65° C entre 10 y 30 minutos por paso de lavado.
13. El método de la reivindicación 10, CARACTERIZADO PORQUE el vector de expresión comprende además un promotor constitutivo, inducible, o específico de tejido que regula la expresión del polipéptido.
14. El método de la reivindicación 13, CARACTERIZADO PORQUE el promotor constitutivo inducible o específico de tejido es un promotor específico de tejido de hoja primordial emergente, un promotor específico de tejido epidérmico, un promotor específico de tejido de meristema floral, un promotor específico de tejido fotosintético, un promotor específico de tejido radicular, un promotor específico de tejido de meristema radicular, un promotor específico de tejido vascular radicular, un promotor específico de tejido vascular, un promotor específico de meristema apical de brote, un promotor específico de tejido epidermal, un promotor específico de flor o flor primordial, un promotor específico de meristema, un promotor específico de tejido primordial, un promotor específico de órganos jóvenes, o un promotor inducible por estrés .