CN105255941B - 基因OsBBX14在提高水稻干旱胁迫耐性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基因OsBBX14在提高水稻干旱胁迫耐性中的应用。本发明通过PCR方法，扩增出水稻品种日本晴的OsBBX14基因的全长编码区，正向连接在植物双T表达载体pCDMAR‑ubi‑Tnos上；再进行遗传转化至水稻中，提高OsBBX14基因的表达，得到OsBBX14基因表达增强的转基因水稻植株。在转基因的T3代植株中发现，阳性转基因水稻植株的干旱胁迫耐性显著高于野生型。

Description

基因OsBBX14在提高水稻干旱胁迫耐性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及通过提高OsBBX14基因的表达水平来提高水稻干旱胁迫耐性。

背景技术

水稻是中国第一大作物，其生产在中国国民经济中占有举足轻重的地位，近年来，由于人口的迅速增长，资源短缺与环境恶化，人民需求增加，中国粮食生产正面临着越来越严峻的挑战。因此，利用植物基因工程手段改良水稻，培育水稻优良新品种有着重要的意义。传统的转基因方法都涉及到选择标记基因，选择标记基因的应用使植物基因工程成为可能。然而另一方面，由于选择标记基因及其蛋白产物毕竟不是基因工程的目的产品，这些基因存在于转基因植物中会带来许多问题，如影响环境和人类健康的安全性(ZechendorfB.1994.12:870-875)。人们担心选择标记基因及其产物在食用时可能有毒性或会引起过敏反应，尤其是选择标记基因编码产物如具有某一临床或肠道应用的抗生素抗性时，人们担心选择标记基因转移进微生物中将增强病原微生物的抗药性，从而引起抗生素失效，此外如果抗生素选择标记基因平行转移到野草中，可能会使其转变成为难以控制的杂草，造成生态平衡的破坏。但是如果转化植株中不含有选择标记基因，那么上述问题就迎刃而解了。总而言之，培育无选择标记基因的植物有着重要的意义。水稻作为中国乃至世界上最重要的粮食作物之一，其转基因产品的无选择标记化尤为重要。

干旱已是世界性的问题，世界干旱、半干旱地区已占陆地面积的1/3以上，干旱对植物的影响在诸多自然逆境因素中占首位。旱灾造成的粮食损失要占全部自然灾害粮食损失的一半以上。国务院第二次全国农业普查领导小组办公室、国土资源部和国家统计局2008年2月29日发布第二次全国农业普查主要数据公报(第六号)显示，截至2006年10月31日，全国耕地面积一半以上是旱地。在自然条件下，干旱胁迫不仅严重影响了作物生长发育和产量，而且限制了植物的分布。因此培育高抗农作物新品种成了一个高度紧迫的重大问题。随着分子生物学技术的发展，基因工程已成为当今种质资源创新和改良的强有力的武器。水稻是世界第一大粮食作物，解决了全世界大约一半以上人口的吃饭问题。然而干旱也严重地影响着水稻的种植和生产，在我国，仅2001年华北、西北和东北地区的466.7万hm²稻田种植面积就因为缺水而减少了53.3万hm²。此外，水稻生产直接受到水资源分布的影响，我国大部分地区耕地是干旱和半干旱地区，因此水资源的缺乏和水稻需水量大的矛盾严重影响水稻种植面积的推广。

目前用于抗旱基因工程的基因主要包括以下几类。第一，参与渗透保护物质(如脯氨酸、甘露醇、甜菜碱、海藻糖等)合成的基因。这样能够使植物在水分胁迫下能合成更多的渗透调节物质，以提高植物的渗透调节能力，从而增强植物的抗旱性。如在水稻中过量表达脯氨酸生物合成途径上的关键酶基因(P5CS,delta1-pyrroline-5-carboxylatesynthase)提高了转基因植株的抗旱性(Zhu等，1998，Plant Sci，199:41–48)；第二，与清除活性氧相关的基因。这类基因的表达增强植物对活性氧自由基的清除能力，使植物在水分胁迫下过量表达一些酶(如SOD，POD，CAT等)，以有效地排除有害的活性氧自由基，从而提高细胞耐脱水的能力。这类基因在水稻中的应用未见报道；第三，编码晚期胚胎富含蛋白(LEA)的基因。推测LEA蛋白可能有以下三方面的作用：①作为脱水保护剂，由于LEA蛋白在结构上富含不带电荷的亲水氨基酸，它们既能像脯氨酸那样，通过与细胞内的其他蛋白发生相互作用，使其结构保持稳定，又可能给细胞内的束缚水提供了一个结合的衬质，从而使细胞结构在脱水中不致遭受更大的破坏。②作为一种调节蛋白而参与植物渗透调节。③通过与核酸结合而调节细胞内其它基因的表达。如在水稻中组成型地过量表达大麦的HVA1基因，导致转基因植株耐旱性增强(Xu等，1996，Plant Physiol，110:249–257)；第四，调控基因。这类基因包括与ABA途径相关的基因，包括ABA生物代谢相关基因(如NCED和ABAox)及ABA信号传导途径相关的基因(如编码bZIP类、Myb类、zinc-finger类转录因子的基因)。最近多个bZIP类转录因子被证明影响水稻干旱胁迫耐性，如OsbZIP23、OsbZIP72和TRAB1等(Xiang等，2008，Plant Physiol，148:1938-1952；Lu等，Planta，2009，229:605–615；Hobo等，1999，Proc Natl Acad Sci USA，96:15348–15353)。其它的调控基因如SNAC1和OsSKIPa也参与水稻干旱胁迫耐性(Hu等，2006，PNAS，35：12987-12992；Hou等，PNAS，2009，106:6410-6415)。特别是OsSKIPa过量表达的转基因水稻植株不仅提高了清除活性氧的能力，而且许多胁迫相关基因(SNAC1、CBF2、PP2C和RD22)转录水平也提高。

由于人们对植物抗旱的分子机制缺乏了解，抗旱分子育种还有很大的盲目性。而且水稻抗旱作用是众多抗旱基因共同表达的结果，采用单基因策略提高植物的抗旱性在实际生产应用中效果不明显，如果改变一个基因的表达能够整体调控植物耐旱反应能力，那将是一个理想的选择。

在分析光敏色素调节水稻农艺性状形成机制过程中，本课题组筛选到受phyB下调的一个double B-box锌指蛋白基因。进化树分析表明，该基因编码蛋白与拟南芥的BBX22属于同一个分支，Huang等人(2012)将其命名为OsBBX14。在我们前期研究过程中发现，亚细胞定位和转录激活活性分析结果表明OsBBX14定位于细胞核，并具有转录激活活性，据此推测OsBBX14可能是转录因子。

发明内容

本发明从水稻品种日本晴中分离克隆到B-box锌指蛋白的OsBBX14基因，转入水稻中提高OsBBX14基因的表达水平，显著提高了水稻的干旱胁迫耐性。因此，在水稻中过量表达OsBBX14基因的表达对于提高水稻干旱胁迫耐性具有重要意义，这为水稻的高抗旱性育种提供新的思路。

本发明申请人在一个水稻光敏色素突变体中，利用基因表达图谱鉴定到一个基因编号为Os05g0204600的、编码B-box锌指蛋白的OsBBX14基因的信使RNA序列。水稻OsBBX14基因信使RNA序列为2055个碱基，编码377个氨基酸和一个终止密码子。本发明通过PCR方法，扩增出水稻品种日本晴的OsBBX14基因的全长编码区，包含1134个碱基，正向连接在植物双T表达载体pCDMAR-ubi-Tnos上；再进行遗传转化至水稻中，提高OsBBX14基因的表达，得到OsBBX14基因表达增强的转基因水稻植株。在转基因的T3代植株中发现，阳性转基因水稻植株的干旱胁迫耐性显著高于野生型水稻。

本发明用于构建过量表达OsBBX14基因的植物双T表达载体、增强OsBBX14基因表达的基因OsBBX14的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明通过PCR方法，扩增出水稻品种日本晴的OsBBX14基因的全长编码区，正向连接在植物双T表达载体pCDMAR-ubi-Tnos上，得到植物表达载体pCDMAR-ubi-BBX14-Tnos；再进行遗传转化至水稻中，提高OsBBX14基因的表达水平，转基因水稻植株表现出干旱胁迫耐性增强。在干旱(20％PEG4000)条件下，90％以上的转基因植株能够恢复正常生长，而野生型几乎全部死亡。

其中，植物双T表达载体pCDMAR-ubi-Tnos是将克隆在pMD18-T载体上的玉米泛素启动子Ubi利用SacI和KpnI双酶切，替换pCDMAR-Hyg载体SacI和KpnI之间的片段，获得pCDMAR-ubi；然后将克隆在pMD18-T载体上的Tnos序列利用XbaI和SalI双酶切替换pCDMAR-ubi载体XbaI和SalI之间的片段，同时引入SpeI酶切位点，获得了pCDMAR-ubi-Tnos植物表达载体。

上述转基因水稻植株进一步剔除含有选择标记基因的转基因植株。转基因植株的具体获取方法是：植物表达载体pCDMAR-ubi-Tnos植物表达载体转化至农杆菌菌株EHA105，然后侵染水稻愈伤组织，采用含有潮霉素的固体筛选培养基培养，然后筛选具有潮霉素抗性的愈伤组织进行分化、生根、移苗得到转基因植株，并剔除携带有潮霉素选择标记的转基因水稻植株。

本发明的优点在于：

(1)本发明提供了一种提高水稻干旱胁迫耐性的基因OsBBX14。申请人在水稻中过量表达OsBBX14基因后，发现转基因阳性植株干旱胁迫耐性显著提高。

(2)本发明首次分离克隆了水稻OsBBX14基因，并首次在水稻中过量表达了OsBBX14基因。为培育耐受干旱的水稻品种提供了新的思路，也为其它作物利用异源基因技术提高水稻干旱胁迫耐性提供了理论支持。

(3)本发明首次初步揭示了水稻OsBBX14基因提高水稻干旱胁迫耐性的机制，为提高水稻等禾谷类作物的干旱胁迫耐性研究提供支持。

(4)本发明使用的植物双T表达载体pCDMAR-ubi-Tnos转化水稻获得的转基因水稻不含有选择标记基因，此外目的基因两侧含有MAR序列，能够提高目的基因在受体植物中的表达水平及表达稳定性，最终获得的转基因株系更加高效稳定。

附图说明

图1为本发明的OsBBX14基因表达载体的构建示意图。将克隆在pMD18-T载体上的Ubi用SacI和KpnI双酶切，替换pCDMAR-Hyg载体SacI和KpnI之间的片段，将克隆在pMD18-T载体上的Tnos用XbaI和SalI双酶切替换pCDMAR-ubi载体XbaI和SalI之间的片段，同时引入SpeI酶切位点，获得了pCDMAR-ubi-Tnos植物表达载体；将克隆在pMD18-T载体上的OsBBX14基因利用BamHI和SpeI酶切，替换植物双T表达载体pCDMAR-ubi-Tnos上BamHI和SpeI之间的DNA片段，这样OsBBX14基因正向插入玉米泛素基因启动子(Pubi)后，即pCDMAR-ubi-BBX14-Tnos植物表达载体；

图2为检测T3代转基因水稻阳性植株中OsBBX14基因转录本相对表达水平结果图。其中OsBBX14-OX表示过表达OsBBX14基因的植株，#7、#15和#17代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。EF-1a作为荧光定量PCR分析的内参基因；

图3为过表达OsBBX14基因水稻植株和野生型植株，在实验室条件模拟干旱环境条件下干旱胁迫耐性比较图。其中OsBBX14-OX表示过表达OsBBX14基因的植株，#7、#15和#17代表三个独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株；

图4为过表达OsBBX14基因水稻植株和野生型植株干旱胁迫条件下成活率的比较图。其中OsBBX14-OX表示转OsBBX14基因的植株，#7、#15和#17代表三个独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株；

图5为过表达OsBBX14基因水稻植株和野生型植株中干旱胁迫耐受相关基因的表达水平比较图。其中OsBBX14-OX表示转OsBBX14基因的植株，#7、#15和#17代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。OsNCED1-OsNCED6是ABA合成相关基因，OsABAox1、OsABAox2是ABA降解相关基因，上述基因与水稻干旱胁迫耐受性密切相关，0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h分别代表将营养液更换为含有20％PEG4000的yoshida液体培养基后，按0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h时间点取材。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆用于构建OsBBX14基因植物表达载体的DNA片段，以及验证功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其使用不同的用途和条件。

实施例1：分离克隆用于构建OsBBX14基因植物表达载体的DNA片段

采用TRIZOL试剂(Invitrogen)从水稻品种日本晴(公开报道的一个品种)的叶片中提取总RNA。具体步骤如下：将20毫克叶片放至液氮预冷的研钵中，加入液氮快速磨成粉末，将粉末装入1.5ml离心管中，迅速加入1ml Trizol(Invitrogen)颠倒混匀，室温静置5分钟。在4℃，12000rpm离心10分钟，取上清液移至新的1.5ml离心管中。加入200μl氯仿，用手剧烈摇动15秒钟，室温静置2-3分钟。4℃，12000rpm离心15分钟。取无色水相至一新的1.5ml离心管中，加入250μl异丙醇，250μl高盐溶液，颠倒混匀，室温静置10分钟。4℃，12000rpm离心10分钟，吸除上清液。加入1ml冰冷的75％乙醇，上下倒置几次，然后4℃，7500rpm离心5分钟，弃上清，在室温下干燥至沉淀变透明。加入适量的DEPC水(一般为60μl)溶解沉淀，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。

利用反转录酶SuperScript II(Invitrogen)将其反转录成cDNA，具体步骤如下：依次加入1μl 500μg/ml oligo(dT)12-18、2μg总RNA、1μl 10mM dNTP混合物和DEPC水至12μl，在65℃水浴中5分钟，迅速冰浴5分钟，稍微离心收集样品于管底。然后依次加入4μl 5×第一链缓冲液、2μl 0.1M DTT和1μl RNaseOUT(40U/μl)，42℃，2分钟。然后加入1μlSuperScript II，轻微混合均匀，42℃反应50分钟，然后70℃水浴15分钟使酶失活，这样就合成了第一链cDNA，以第一链cDNA为模板扩增目的基因。用带有酶切位点的上游引物OsBBX14F(5’-ATGGATCCATGTCGCCTCCTCCTCCACCATATTA-3’，SEQ ID NO：3，序列特异引物外加BamHI位点和两个保护碱基)和下游引物OsBBX14R(5’-AACTAGTTTATTGCCTCCGGCGTTTGGAGGTG-3’，SEQ ID NO：4，序列特异引物外加SpeI位点和两个保护碱基)。利用PrimerSTAR HS DNA polymerase with GC buffer(TaKaRa)扩增目的片段，PCR反应条件是94℃预变性1分钟；98℃10秒，68℃4分钟，30个循环。利用TArget CloneTM-Plus试剂盒(TOYOBO)在PCR产物末端加A。然后连接到pMD18-T载体(TaKaRa)。筛选阳性克隆并测序，获得所需DNA片段(序列如SEQ ID NO：1所示)，将该克隆命名为pMD18-OsBBX14cDNA。

实施例2：OsBBX14基因植物表达载体的构建和遗传转化

为了能更好地分析OsBBX14的功能，申请人通过过量表达技术使OsBBX14基因在水稻中表达水平提高。根据转基因植株的农艺性状特征研究该基因的功能。

为了构建OsBBX14基因植物表达载体，本申请首先构建了pCDMAR-ubi-Tnos的植物表达载体。首先利用下列方法提取玉米基因组DNA，从玉米品种鲁单981(公开报道的一个品种)的叶片中提取总DNA。具体步骤如下：取少量叶片(2-3cm长)，放入1.5ml离心管中，液氮速冻，快速研磨。加入200μl DNA Extraction buffer(20mM Tris-HCl pH＝7.5；250mMNaCl；25mM EDTA；0.5％SDS；0.2mg/ml蛋白酶K)，在涡旋器上混匀，放入65℃水浴中保温2h。随后12000rpm离心10min，将上清液移至新的1.5ml离心管中，加入等体积氯仿混合，上下颠倒数次，静止数分钟至液面分层，重复两次。取上层液相移入新1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒数次混匀后，12000rpm离心10min，倒净上清液，加入200μl的70％乙醇，12000rpm离心5min。室温下干燥DNA，用25ml TE-RNaseA buffer重悬基因组DNA。

利用玉米基因组DNA作为模板，利用上游引物UbiSacI F1(5’-ATGAGCTCG CAT GCCTGC AGT GCA GCG-3’，SEQ ID NO：5，序列特异引物外加SacI位点和两个保护碱基)和下游引物UbiKpnIR1(5’-AAGGTACCT CTA GAG TCG ACC TGC AGA AG-3’，SEQ ID NO：6，序列特异引物外加KpnI位点和两个保护碱基)进行扩增。扩增产物克隆在pMD18-T载体，筛选阳性克隆并测序，获得所需DNA片段，即为Ubi启动区，将该克隆命名为pMD18-Ubi。将上述克隆用SacI和KpnI双酶切，回收插入片段；同样，用同样的方法酶切pCDMAR-Hyg载体(常用的双T植物遗传转化载体)，回收载体片段。用回收的插入片段和载体片段做连接，转化大肠杆菌XL1-Blue，通过酶切筛选阳性克隆，即获得了pCDMAR-ubi植物表达载体。随后利用pCAMBIA1390(国际常用的植物遗传转化载体)表达载体上的Tnos序列连同多克隆位点SpeI为模板，利用上游引物TnosXbaIF1(5’-ATTCTAGAGGAGTCCACCATGGT-3’，序列特异引物外加XbaI位点和两个保护碱基，SEQ ID NO：29)和下游引物TnosSalIR1(5’-GAGTCGACCCGATCTAGTAACATAG-3’，序列特异引物外加SalI位点和两个保护碱基，SEQ IDNO：30)进行扩增，扩增产物克隆在pMD18-T载体，筛选阳性克隆并测序，获得所需DNA片段，即为Tnos启动区，将该克隆命名为pMD18-Tnos。将上述克隆用XbaI和SalI双酶切，回收插入片段；同样，用同样的方法酶切pCDMAR-ubi载体，回收载体片段。用回收的插入片段和载体片段做连接，转化大肠杆菌XL1-Blue，通过酶切筛选阳性克隆，即获得了pCDMAR-ubi-Tnos植物表达载体(见图1)。

OsBBX14基因植物表达载体的构建方法如下：首先将实施例1中得到的阳性克隆pMD18-OsBBX14cDNA用BamHI和SpeI双酶切，回收插入片段；并用同样的方法酶切pCDMAR-ubi-Tnos的植物表达载体，回收载体片段。用回收的插入片段和载体片段做连接反应，转化大肠杆菌XL1-Blue。通过酶切筛选阳性克隆，获得植物表达载体，命名为pCDMAR-ubi-BBX14-Tnos(见1)。将pCDMAR-ubi-BBX14-Tnos转化至农杆菌菌株EHA105。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系(参见本发明后面的实施例)将其导入到水稻品种日本晴中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、移苗得到转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化体系在Hiei等人报道的方法基础上进行改良(Hiei等，1994，Plant J.，6:271-282)。转化共获得18株独立的转基因水稻植株。

具体步骤如下：

(1)愈伤诱导：去壳的野生型日本晴水稻种子，用70％乙醇表面消毒1分钟；5％(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次；播种于愈伤诱导培养基上诱导愈伤组织(成分见后)，于25-26℃暗培养4-7天后，将从成熟胚盾片处诱导出初生愈伤组织，同时用镊子去掉胚上长出的胚芽，继代于愈伤诱导培养基继续培养2周，直至长出色泽淡黄，质地坚硬呈颗粒状的胚性愈伤组织。

(2)愈伤组织的预培养：将愈伤组织转至新鲜的愈伤诱导培养基培养，于25-26℃暗培养4天。

(3)农杆菌培养：挑取农杆菌单克隆接种到5mL YEP液体培养基中(含有50mg/L的卡那霉素)，28℃，220rpm，培养至对数生长晚期(大约培养18-24小时)。将获得的菌液按1％接种量转接到50mL新鲜的、含有50mg/L卡那霉素的AB液体培养基中(成分见后)；28℃，220rpm，培养至OD600值为0.5左右(培养5-6小时)。

(4)农杆菌侵染：把50mL菌液转入离心管，4℃，4000g离心10分钟，弃上清，加入等体积的AAM培养基重悬菌体。把(2)的日本晴胚性愈伤组织浸入上述AAM菌液，侵染2分钟，缓慢摇动。用无菌吸水纸将愈伤组织吸干，置于共培养培养基上(培养基上铺一层无菌滤纸)，26℃，黑暗共培养2-3天。

(5)愈伤洗涤和选择培养：共培养后的愈伤组织用无菌水洗4次，然后再用含500mg/L羧苄青霉素Cb的无菌水洗2次，再用无菌吸水纸吸干后置于工作台吹30分钟。将愈伤组织置于固体筛选培养基(含有25mg/L潮霉素，400mg/L羧苄青霉素)上，26℃暗培养2周。然后转移到固体筛选培养基(含有30mg/L潮霉素，300mg/L羧苄青霉素)上，26℃暗培养，每2周继代一次，筛选4周。

(6)分化培养：把抗性愈伤组织转移至分化培养基上，28℃光照培养7天，转接一次后，培养至产生再生苗。

(7)壮苗、移栽：将再生的小植株转至新鲜的1/2MS培养基上，于培养瓶中生根壮苗。待小苗长至10cm左右，打开封口膜，炼苗2-3天，将再生苗移至土中培养。

试剂配方：

(1)试剂和溶液缩写：本发明中作用到的植物激素的缩写表示如下：Cb(Cabenicillin,羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)；DMSO(Dimethyl sulfoxide,二甲基亚砜)。

(2)用于水稻遗传转化的培养基配方：

1)YEP液体培养基：2g Bacto-蛋白胨，2g酵母粉，1g NaCl，加水定容至200mL，用5NNaOH调pH至7.0。

2)愈伤诱导培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH 5.8。

3)AB液体培养基：3g/L K₂HPO₄，1g/L NaH₂PO₄，1g/L NH₄Cl，300mg/L MgSO₄·7H₂O，150mg/L KCl，10mg/L CaCl₂·2H₂O，2.5mg/L FeSO₄·7H₂O，5g/L葡萄糖，pH 7.0。

4)AAM培养基：AA大量，AA微量,0.9g/L L-谷氨酰胺，0.3g天冬氨酸，MS维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，36g/L葡萄糖，68.5g/L蔗糖，20mg/L AS，pH 5.2。

5)共培养培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.5g/L酸水解酪蛋白，2mg/L 2,4-D，20mg/L AS，Gelrite(Sigma)4g/L，pH 5.8。

6)固体筛选培养基：N6大量、N6微量和N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH 5.8，合适浓度的潮霉素和羧苄青霉素。

7)分化培养基：MS大量，MS微量，铁盐和MS维生素，2g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，30g/L山梨醇，2mg/L KT，0.2mg/L NAA，pH 5.8，30mg/L潮霉素B，200mg/L羧苄青霉素。

8)1/2MS培养基：1/2MS大量，1/2MS微量，MS维生素，30g/L蔗糖，4g/L Gelrite，30mg/L潮霉素B，200mg/L羧苄青霉素，pH 5.8.

(3)主要溶液配方：

1)N6大量元素(10×)

用水定容1L；

2)N6微量(1000×)：

用水定容1L；

3)N6维生素(1000×)

用水定容100 mL；

4)MS大量元素(10×)

用水定容1 L；

5)MS微量(1000×)：

用水定容1 L；

6)MS维生素(1000×)

用水定容100 mL；

7)铁盐(200×)

FeSO₄.7H₂O 5.56 g

Na₂EDTA.2H₂O 7.46 g；

8)AA大量(200×)

9)AA微量(1000×)

用水定容1L；

10)2,4-D储存液(2mg/ml)

称取2，4-D 100mg,溶于1ml DMSO，加入蒸馏水定溶至49ml，然后加入0.5N NaOH，至完全溶解，于-20℃保存。

11)Kinetin储存液(0.2mg/ml)

称取Kinetin 10mg，溶于1ml 1N KOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。

12)NAA储存液(0.2mg/ml)

称取NAA 10mg，溶于0.5ml 1N KOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。

13)乙酰丁香酮(100mg/ml)

称取乙酰丁香酮100mg，溶于1ml DMSO，于-20℃保存。

14)卡那霉素(50mg/ml)

称取卡那霉素500mg，溶于8ml蒸馏水中，加蒸馏水定溶至10ml，然后用0.22μm滤器过滤除菌，于-20℃保存。

实施例3：检测转基因水稻植株和野生型水稻的OsBBX14基因的转录本水平

以水稻野生型日本晴和7个独立的T3代转基因水稻植株为材料，提取四叶期水稻叶片的RNA，利用RT-PCR检测水稻叶片中OsBBX14基因的转录本水平。具体方法如下：采用TRIZOL试剂(Invitrogen)从上述材料收集0.03g水稻叶片提取总RNA，具体步骤如实施例1的描述。

利用RNase-free DNase(TaKaRa)除去RNA中的DNA，具体步骤如下：依次加入TotalRNA 50μg，10×DNase I Buffer 5μl，DNase I(RNase-free，5U/μl)2μl，RNase Inhibitor(50U/μl)0.4μl，加DEPC水补足总体积至50μl。反应体系混匀后在37℃反应30min。然后在反应体系中加入50μl DEPC水补足至100μl。随后加入苯酚：氯仿：异戊醇(体积比25：24：1)混合物100μl，充分混匀，4℃，12000rpm离心15min。将上层移至新的1.5ml离心管中。加入100μl氯仿：异戊醇(体积比24：1)混合物，充分混匀，4℃，12000rpm离心15分钟。取最上层移至另一新的1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M NaAc(pH＝5.2)和2.5倍体积的冷无水乙醇，-80℃放置1小时，4℃，12000rpm离心10分钟，吸除上清液。加入1ml冰冷的75％乙醇，上下倒置几次，然后4℃，7500rpm离心5分钟，弃上清，在室温干燥至沉淀变透明。加入25μl DEPC水溶解沉淀，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。

根据PrimeScript^TM RT Enzyme Mix I(TaKaRa)说明书合成cDNA第一链。具体步骤如下：依次加入上述总RNA 1μg、5×PrimeScript buffer 2μl、PrimeScript RT EnzymeMix 0.5μl、Random 6mers(100μM)和Oligo dT Prime(50μM)各0.5μl，最后用RNase FreedH₂O补充至总体积为10μl。然后将反应体系在37℃下保温15分钟，使反转录反应进行，然后用85℃高温处理5秒使酶失活，即完成了cDNA第一链的合成。

以上述cDNA为模板，用OsBBX14基因的特异性上游引物OsBBX14qF1(5’-TCCTCCACCATATTACCACCA-3’，SEQ ID NO：7)，和下游引物OsBBX14qR1(5’-GCGCTGCACAGTAGCTTCAT-3’，SEQ ID NO：8)进行荧光定量PCR分析。同时用水稻内源翻译延伸因子基因作为荧光定量PCR分析的内参基因，其特异上游引物为OsEF-1aF(5’-TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT-3’，SEQ ID NO：9)，特异下游引物为OsEF-1aR(5’-GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA-3’，SEQ ID NO：10)。利用SYBR Premix Ex Taq^TMPCR试剂盒(TaKaRa)进行荧光定量PCR反应。具体步骤如下：依次加入10μl 2×SYBR Premix Ex Taq^TM、2.0μl cDNA模板、0.2μM基因特异性引物对，用RNase-free H₂O补足反应体系为20μl。PCR反应条件是95℃预变性30秒；95℃变性30秒，60℃退火延伸30秒，40个循环。PCR反应结束后，分析各个样品的扩增曲线和溶解曲线以确定实验结果的可信度。然后用Excel通过2^-△△Ct法处理荧光定量PCR获得的Ct值并计算标准误差，对最终处理结果作图。结果表明过表达株系中OsBBX14基因的转录本水平是非转基因水稻植株的50-150倍，从而证明OsBBX14基因已整合到水稻基因组中并且在水稻中大量表达(图2)。

实施例4：携带有潮霉素选择标记的转基因株系的剔除

水稻总DNA的提取

取水稻新鲜叶片0.3mg至于研钵中，加液氮研成粉末，再加入0.6ml 60℃预热的CTAB缓冲液((30g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.2％的巯基乙醇，20mmol/L EDTA，100mmol/LTris-HCl，pH8.0)。60℃保温30min，其间轻摇数次。然后加等体积的氯仿：异戊醇(体积比24:1)抽提一次，上清液转移到新的离心管中加入2/3倍体积的异丙醇，形成的沉淀即是DNA，加入少许洗液(体积分数为70％的乙醇，10mmol/L NH₄AC)洗涤沉淀一次，干燥后用500μLTE缓冲液(10mmol/L Tris-HCL，pH8.0，1mmol/L EDTA)溶解DNA。随后加入Rnase A(终浓度10mg/L)，37℃保温30miin，依次用等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(体积比25:24:1)，氯仿：异戊醇(体积比24:1)各抽提一次，水相加入2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA。DNA干燥后溶于100μL无菌水中。

PCR检测

对T3代目的基因表达水平上调的共14个独立转化株系进行PCR检测，潮霉素磷酸转移酶(Hyg)基因扩增引物为HygF：TACACAGCCATCGGCCAGA(SEQ ID NO：11)，HygR：TAGGAGGGCGTGGATATGTC(SEQ ID NO：12)；反应体系为20μL体系中10μL PCR mix、1μL10mM浓度引物HygR、1μL10mM浓度引物HygF、1μL DNA模板，加无菌水至20μL。PCR反应条件如下：94℃预变性5min、94℃变性1min、52℃复性1min、72℃延伸1.5min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增出目的条带的转基因株系丢弃。

实施例5：转OsBBX14基因水稻在室内干旱处理条件下干旱胁迫耐性增强

将转基因植株和野生型植株用70％乙醇表面消毒1分钟；5％(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次；16℃浸种36小时，37℃催芽24小时，播种于96孔板中后，放置在装有yoshida液体培养基的水槽中，在光照培养箱(28℃14小时光照，23℃10小时黑暗)生长12天后，将营养液更换为含有20％PEG4000的yoshida液体培养基，此后每三天更换一次含有20％PEG4000的yoshida液体培养基，处理14天，处理过程中转基因植株比野生型更早出现萎蔫现象，至所有植株均出现萎蔫现象后，加水恢复5天后统计结果显示，95％的转基因植株能够恢复正常生长，而野生型全部死亡(如图3-4)。相同实验重复3次，结果表明，发现90％以上转基因阳性植株能够恢复正常生长，而对应的野生型植株无法恢复正常生长。

实施例6：转OsBBX14基因水稻植株和野生型植株中已知耐旱相关基因的表达模式比较

为了分析OsBBX14提高水稻耐旱性的机制，我们首先利用荧光定量PCR分析了OsBBX14过量表达是否影响已知的耐旱相关基因表达水平。具体步骤如下：将转基因植株和野生型植株用70％乙醇表面消毒1分钟；5％(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次；16℃浸种36小时，37℃催芽24小时，播种于96孔板中后，放置在装有yoshida液体培养基的水槽中，在光照培养箱(28℃14小时光照，23℃10小时黑暗)生长12天后，将营养液更换为含有20％PEG4000的yoshida液体培养基，随后按0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h时间点取材。根据实施例3的方法提取RNA、合成cDNA第一链。

以上述cDNA为模板，利用荧光定量PCR分析ABA合成相关基因OsNCED1-OsNCED6以及ABA降解相关基因OsABAox1，OsABAox2的表达模式。荧光定量PCR所用引物如下：OsNCED1基因的特异性上游引物OsNCED1qF1(5’-CTCACTCACTCACCATGAAGTC-3’，SEQ ID NO：13)，和下游引物OsNCED1qR1(5’-GCGTTCTTCTTCCTGCCATA-3’，SEQ ID NO：14)；OsNCED2基因的特异性上游引物OsNCED2qF1(5’-CCAAGGATGAGTCAGACATGAG-3’，SEQ ID NO：15)和下游引物OsNCED2qR1(5’-GCACAATCTCCTCTCCATCAG-3’，SEQ ID NO：16)；OsNCED3基因的特异性上游引物OsNCED3qF1(5’-GATCACGACGCCAGGATATG-3’，SEQ ID NO：17)，和下游引物OsNCED3qR1(5’-GGAGAATCTCACCGAATTGGA-3’，SEQ ID NO：18)；OsNCED4基因的特异性上游引物OsNCED4qF1(5’-GGTGGTATACGACAGGGAGAA-3’，SEQ ID NO：19)，和下游引物OsNCED4qR1(5’-TCCAGAGGTGGAAGCAGAA-3’，SEQ ID NO：20)；OsNCED5基因的特异性上游引物OsNCED5qF1(5’-GGAGGTGTGGCAAGAAGAA-3’，SEQ ID NO：21)，和下游引物OsNCED5qR1(5’-CTCTCCAGCACATTCGTGAT-3’，SEQ ID NO：22)；OsNCED6基因的特异性上游引物OsNCED6qF1(5’-GCGATCCCACTTCACTTTCT-3’，SEQ ID NO：23)，和下游引物OsNCED6qR1(5’-TGTCGAGCTTGATCCTGTTG-3’，SEQ ID NO：24)；OsABAox1基因的特异性上游引物OsABAox1qF1(5’-AAGCTGGCAAAACCAACATC-3’，SEQ ID NO：25)，和下游引物OsABAox1qR1(5’-CCGTGCTAATACGGAATCCA-3’，SEQ ID NO：26)；OsABAox2基因的特异性上游引物OsABAox2qF1(5’-CTACTGCTGATGGTGGCTGA-3’，SEQ ID NO：27)，和下游引物OsABAox2qR1(5’-CCCATGGCCTTTGCTTTAT-3’，SEQ ID NO：28)。同时用水稻内源翻译延伸因子基因(OsEF-1a)作为荧光定量PCR分析的内参基因，其特异上游引物为OsEF-1aF(SEQ ID NO：9)，特异下游引物为OsEF-1aR(SEQ ID NO：10)。利用SYBR Premix Ex Taq^TM PCR试剂盒(TaKaRa)进行荧光定量PCR反应，具体步骤见实施例3。PCR反应结束后，分析各个样品的扩增曲线和溶解曲线以确定实验结果的可信度。然后用Excel通过2^-△△Ct法处理荧光定量PCR获得的Ct值并计算标准误差，对最终处理结果作图。结果表明，干旱处理开始后，ABA合成相关基因OsNCED1-OsNCED6表达水平逐渐上调，在处理的第三个小时开始，表达水平下降，而相对于野生型水稻，在过表达株系中上述基因的表达水平显著降低(图5)，而ABA降解相关基因OsABAox1，OsABAox2的表达表达模式与合成相关基因的表达模式类似，在干旱处理开始时逐渐上调，在处理的第6到12小时开始，表达水平下降，而相对于野生型水稻，在过表达株系中上述基因的表达水平显著升高。上述结果显示，过表达株系中ABA合成水平呈现下降趋势，这说明OsBBX14过量表达株系干旱胁迫耐性增强可能不涉及到ABA途径，而ABA合成降低有可能由于干旱胁迫响应增强后产生的反馈调节作用。

Claims (1)

1.基因OsBBX14在提高水稻干旱胁迫耐性中的应用方法，其特征是，通过PCR方法，扩增出水稻品种日本晴的OsBBX14基因的全长编码区，正向连接在植物双T表达载体pCDMAR-ubi-Tnos上，得到植物表达载体pCDMAR-ubi-BBX14-Tnos；再进行遗传转化至水稻中，得到OsBBX14基因表达增强的转基因水稻植株，所述基因OsBBX14的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述植物双T表达载体pCDMAR-ubi-Tnos是将克隆在pMD18-T载体上的玉米泛素启动子Ubi利用SacI和KpnI双酶切，替换pCDMAR-Hyg载体SacI和KpnI之间的片段，获得pCDMAR-ubi；然后将克隆在pMD18-T载体上的Tnos序列利用XbaI和SalI双酶切， 替换pCDMAR-ubi载体XbaI和SalI之间的片段，同时引入SpeI酶切位点，获得了pCDMAR-ubi-Tnos植物表达载体。