CN108795971A - miR159在改变植物根系形态中的应用 - Google Patents

miR159在改变植物根系形态中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了miR159在改变植物根系形态中的应用，并公开了基于miR159的改变植物根系形态的方法。本发明利用大豆转基因技术过量表达miR159基因家族的miR159e，研究发现miR159e能够改变大豆根系形态，与野生型大豆相比，过表达miR159e的转基因大豆植株，主根长都有明显下降，根鲜重都有明显上升，高磷条件下作用更加明显，即过表达miR159e的转基因大豆植株的根系更加发达，具有更强的吸收养分能力和抵御干旱的能力，尤其是高磷条件下更加明显，在培育具有更强的吸收养分能力和抵御干旱能力的转基因大豆方面，具有更广泛的潜在应用前景。

Description

miR159在改变植物根系形态中的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体地，涉及miR159在改变植物根系形态中的应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类长度为20-24个核苷酸的非编码小分子RNA，在植物体内大量存在，能在转录后水平抑制基因的表达(Jones-Rhoades et al.,2006；Rogers etal.,2013)。已有研究表明：miRNA在植物生长发育及非生物胁迫应答上，具有非常重要的作用。
miR159在植物生长发育方面，起着至关重要的作用。有研究表明，miR159在不同植物种子萌发时被检测到，说明在不同物种间具有高度保守性(Axtell et al.,2005)；在拟南芥中，miR159家族中有三个成员miR159A、miR159B、miR159C(Chen et al.,2002)，其中miR159ab双突变会造成多效形态学缺陷，包括生长习性的改变，叶片的卷曲，变小的荚果和变小的种子，说明了miR159在植物生长发育中起到重要的作用，但是miR159a或者miR159b单独突变，不会出现miR159ab突变的缺陷，说明miR159家族成员之间存在冗余(Allen etal.,2007)，这种功能能够使植物更好应对外界多变的环境。
目前研究显示，miR159对植物应对非生物胁迫具有十分重要的意义，如干旱胁迫、营养胁迫等。在干旱胁迫下，植物为适应环境会增加脱落酸(ABA)的表达(Bano et al.,1994；Figueiredo et al.,2008)。在miRNA生物合成中，关键基因hyl1-1突变，会对生长素、ABA、细胞分裂素应答减弱(Lu et al.,2000)，说明miRNA参与其信号应答。在拟南芥种子萌发早期，miR159在ABA和干旱处理下被诱导表达。ABI3(abscisic acid-insensitive)和ABI5转录因子，在种子萌发ABA应答上，是一个非常重要的调控因子(Lopez-Molina etal.,2002；Zhang et al.,2005)，在abi3和abi5突变体材料中，发现ABA诱导miR159的积累需要ABI3这个转录因子，但只是部分依赖ABI5；同时发现miR159的靶基因MYB33和MYB101，对种子萌发时ABA应答上，起一个正调控作用(Reyes et al.,2007)。磷作为植物不可缺少的矿质养分，不仅是构成核酸、磷脂、ATP等的组成成分，而且参与了光合作用、呼吸作用、能量传递及酶活性调节等生理生化过程；同时也是维持现代农业所必需的肥料主要成分之一(López-Arredondo et al.,2014)。大豆(Glycine max)是世界上重要的粮油作物，miRNA在植物生长发育上，具有如此重要作用，对大豆生长发育也不例外，但是目前对大豆高低磷响应miRNA如何调控磷养分平衡尚不清楚。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供大豆miR159调解大豆根的形态的应用。
本发明的第一个目的是提供miR159在改变植物根系形态中的应用。
本发明的第二个目的是提供miR159前体全长序列在改变植物根系形态中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种重组载体在改变植物根系形态中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种工程菌在改变植物根系形态中的应用。
本发明的第五个目的是提供miR159e在构建转基因大豆方面的应用以及构建转基因大豆的方法。
本发明的第六个目的是提供一种改变植物根系形态的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
发明人研究发现过表达大豆miR159e的转基因大豆，主根变短，根系鲜重增加，根系明显更加发达，具有更强的吸收养分的能力和抵御干旱的能力，尤其是在高磷处理时候，这种能力更加明显，因此本发明要求保护以下应用：
miR159在改变植物系形态中的应用。
miR159前体全长序列在改变植物根系形态中的应用。
一种重组载体在改变植物根系形态中的应用，所述重组载体上有miR159前体全长序列。
一种工程菌在改变植物根系形态中的应用，所述工程菌含有所述重组载体。
优选地，所述植物为大豆、玉米、水稻、花生和苜蓿。
更优选地，所述植物为大豆。
优选地，miR159为大豆miR159e。
本发明还要求保护miR159e在构建转基因大豆方面的应用，所述转基因大豆在高低磷条件下的根系更加发达，具有更强的吸收养分能力和抵御干旱的能力。
一种改变植物根系形态的方法，将miR159在植物内过表达。
一种构建转基因大豆的方法，是将miR159在植物内过表达；所述转基因大豆在高低磷条件下的根系更加发达，具有更强的吸收养分能力和抵御干旱的能力。
以上所述的方法，步骤如下：
S1.克隆miR159前体全长序列连接入表达载体，得到重组载体；
S2.将重组载体转化入受体农杆菌，得到工程菌；
S3.将大豆种子消毒后进行萌发；
S4.接种工程菌，并扩大培养，制备得到侵染悬浮液；
S5.处理侵染用外植体；
S6.用侵染悬浮液充分浸泡处理过的侵染用外植体；
S7.进行暗培养；
S8.进行幼芽的诱导；
S9.进行幼芽的伸长；
S10.生根培养；
S11.转基因植株的鉴定。
优选地，步骤S1中，扩增引物的核苷酸序列为：
上游引物：TAGCAAGGGTTTAGGTGGTG；
下游引物：AGAGCAAGAACGAGATTATGG。
优选地，步骤S1中，表达载体为pTF101.1。
优选地，步骤S2中，农杆菌菌株为EHA101。
优选地，步骤S3中，消毒步骤为：在可以密封的容器中放入大豆种子，加入次氯酸钠，然后沿着壁缓缓加入浓盐酸，静置密封过夜，次氯酸钠与浓盐酸的体积比为100：4.2。
优选地，步骤S3中，将消毒大豆种子，转到萌发培养基(GM)上培养，萌发条件为16小时光照24℃/8小时黑暗24℃，培养4-5天。
优选地，步骤S4中，将工程菌在50ml液体YEP培养基(抗生素)中扩大培养，28℃下200rpm培养20小时；之后5000rpm下将菌液离心10分钟，弃上清，用液体共培养液(CM)重悬菌液至OD650值为1.0-1.2。
优选地，步骤S5中，处理侵染用外植体的方法为用已灭菌的解剖刀从离子叶节大约0.5cm的下胚轴切下萌发的种子，沿着子叶剖开种子，并剔除子叶节上幼芽。在子叶、下胚轴和子叶节区域垂直于轴切出7-8个切口。
优选地，步骤S6中，用侵染悬浮液充分浸泡处理过的侵染用外植体的方法为充分浸泡外植体30分钟。
优选地，步骤S7中，进行暗培养的方法为：将浸泡过的外植体转移到固体CM培养基上，切口向下，用保鲜膜封住培养皿，水平放置在人工气候室暗培养3天。
优选地，步骤S8中，进行幼芽的诱导的方法为：在液体幼芽诱导培养液(SI)中清洗后，将外植体45°角斜插在固体SI培养基上，培养皿用医用透气胶带封口，人工气候室(16小时光照24℃/8小时黑暗24℃)培养；2周后，在子叶节切去下胚轴，将新的切面插入至新的SI培养基中继代培养2周。
优选地，步骤S9中，进行幼芽的伸长的方法为：切除未分化的外植体及子叶，并在分化的外植体基部切一个新切口，然后转移到幼芽伸长培养基(SE)上，培养皿用医用透气胶带封口，人工气候室(16小时光照24℃/8小时黑暗24℃)培养2－8周。每2周更换一次SE培养基，每次剔除老化的愈伤组织，在外植体基部切一个新切口。
优选地，步骤S10中，生根培养的方法为：待幼芽生长到3cm长时，把它们从愈伤组织上切下来，转移到装有生根培养基(RM)的培养瓶中进行生根培养2周左右。
优选地，步骤S11中，转基因植株的鉴定方法为：生根植株转入水培后，用除草剂涂半片叶片上检测植株是否具有除草剂抗性；同时采样提取DNA，进行Bar基因检测；其中，Bar基因检测的引物：
上游引物：CAACCACTACATCGAGACAAGCA；
下游引物：TCATCAGATCTCGGTGACGGG。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用大豆转基因技术过量表达miR159基因家族的miR159e，研究发现miR159e能够改变大豆根系形态，与野生型大豆相比，过表达miR159e的转基因大豆植株，主根长都有明显下降，根鲜重都有明显上升，高磷(正常条件)条件下作用更加明显，即过表达miR159e的转基因大豆植株的根系更加发达，具有更强的吸收养分能力和抵御干旱的能力，尤其是高磷(正常条件)条件下更加明显，在培育具有更强的吸收养分能力和抵御干旱能力的转基因大豆方面，具有更广泛的潜在应用前景。
附图说明
图1为转基因大豆miRNA159e的相对表达量。
图2为过表达MIR159e转基因大豆主根长和根鲜重；WT为野生型(粤春03-3)，OX-miR159e为过量表达MIR159e株系，LP为低磷处理，HP为高磷处理(对照)，处理90天。图中数据为4个生物学重复的平均值和标准差(SE)，星号代表同一处理下不同植株与野生型间的差异(Student’s t-test)，*表示差异显著(ρ<0.05)。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 miR159e过表达载体构建
(1)引物设计
从网站下载miR159e的前体全长序列，设计特异的扩增引物扩增miR159e，引物为：
F(Sma1):AAcccgggTAGCAAGGGTTTAGGTGGTG；
R(Xba1):AAtctagaAGAGCAAGAACGAGATTATGG。
(2)片段扩增及装载pTF101.1
以大豆YCO3-3的cDNA为模板，用OE-miR159e的特异引物扩增相应片段，反应体系及反应条件见表1和表2；
表1 PCR反应体系：
表2 PCR反应条件：
(3)PCR扩增产物纯化及T载体连接
使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，将回收片段与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH10B，PCR检测后送测序公司测序。
(4)目的载体连接
测序正确，提取该质粒与pTF101.1质粒，用同样的内切酶分别进行双酶切，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒分别回收酶切产物。用连接酶将两者连接后转化大肠杆菌DH10B，PCR检测后送测序公司测序。测序正确后将菌液和质粒分别保存备用。同时将重组的目的载体转化农杆菌菌株EHA101，检测无误后保存菌液备用。
实施例2大豆整株遗传转化
为了明确过表达大豆miR159e在不同磷营养的条件下，对大豆根系生长的影响，通过大豆整株转化体系获得了过表达miR159e的转基因大豆株系，并通过除草剂筛选、Bar基因检测以及荧光定量PCR鉴定，确定了过表达miR159e株系。
一、实验步骤
(1)种子萌发
将完好的大豆YC03-3种子单层排列在培养皿中，放入干燥器中，并将培养皿打开，盖子紧挨着培养皿。将100ml的次氯酸钠加至干燥器中250ml烧杯中，然后沿着杯壁缓缓加入4.2ml浓盐酸(HCl)，立即密闭干燥器，静置过夜。次日，盖上培养皿取出，将培养皿放到超净工作台中打开除去过多的氯气。将消毒的种子种脐朝下播到萌发培养基(GM)上，每个培养皿25颗。然后放置在人工气候室(16小时光照24℃/8小时黑暗24℃)培养4-5天。
(2)农杆菌接种
将携带目的载体的农杆菌EHA101在50ml液体YEP培养基(添加壮观霉素、卡那霉素、氯霉素)中扩大培养，28℃下200rpm培养20小时。5000rpm下将菌液离心10分钟，弃上清，用液体共培养基(CM)重悬菌液至OD650值为1.0-1.2。
(3)共培养
用已灭菌的解剖刀从离子叶节大约0.5cm的下胚轴切下萌发的种子，沿着子叶剖开种子，并剔除子叶节上幼芽。在子叶、下胚轴和子叶节区域垂直于轴切出7-8个切口。向装有外植体的培养皿中加入重悬的农杆菌菌液，充分浸泡外植体30分钟。随后将外植体转移到固体CM培养基上，切口向下，用保鲜膜封住培养皿，水平放置在人工气候室暗培养3天。
(4)幼芽的诱导
在液体幼芽诱导培养基(SI)中清洗后，将外植体45°角斜插在固体SI培养基上，培养皿用医用透气胶带封口，人工气候室(16小时光照24℃/8小时黑暗24℃)培养。2周后，在子叶节切去下胚轴，将新的切面插入至新的SI培养基中继代培养2周。
(5)幼芽伸长
切除未分化的外植体及子叶，并在分化的外植体基部切一个新切口，然后转移到幼芽伸长培养基(SE)上，培养皿用医用透气胶带封口，人工气候室(16小时光照24℃/8小时黑暗24℃)培养2－8周。每2周更换一次SE培养基，每次剔除老化的愈伤组织，在外植体基部切一个新切口。
(6)生根培养
待幼芽生长到3cm长时，把它们从愈伤组织上切下来，转移到装有生根培养基(RM)的培养瓶中进行生根培养2周左右。茎上长出几条根时，从培养基中取出转化苗，用自来水冲洗根部去除培养基，移植到水培瓶中。在培养箱中生长4周(16小时光照24℃/8小时黑暗24℃)后，将转化苗移植到温室中，用1/2浓度的Hoagland营养液培养至结荚，每2周换一次营养液。
(7)转基因大豆后代鉴定
转化苗(T0代植株)转移至水培后，用除草剂涂半片叶片上检测植株是否具有除草剂抗性。同时采样提取DNA，进行Bar基因检测。
其中，Bar基因检测的引物：
上游引物：CAACCACTACATCGAGACAAGCA；
下游引物：TCATCAGATCTCGGTGACGGG。
二、实验结果
获得了转基因大豆。
实施例3过量miR159e功能分析实验
一、实验方法
待转基因T0代收种后，将种子播种进行水培繁种，期间对过量表达转基因株系采样提取RNA，反转录成cDNA后利用荧光定量PCR检测基因相对表达量。
(1)种子消毒
将成熟、饱满的大豆种子单层排列在培养皿中，放入干燥器中，并将培养皿打开，盖子紧挨着培养皿。将100ml的次氯酸钠加至干燥器中的250ml烧杯中，然后沿着杯壁缓缓加入4.2ml浓盐酸(HCl)，立即密闭干燥器，静置10小时。从干燥器中拿出后除去过多的氯气。
(2)催芽
将消毒后的种子点入湿润的石英砂中催芽萌发。
(3)移苗
一周后两叶一心时选择正常、长势一致的幼苗移栽至水培系统，于温室中用1/2大豆营养液培养。
(4)处理
一周左右待第一片三出复叶完全展开后进行处理：低磷(LP：25μM)、高磷(HP：500μM；这里所述高磷是正常营养条件，是相对于低磷处理而言，相对于低磷处理的对照组)，每个处理5个生物学重复。每周换一次营养液，每3天调一次pH。
(5)采样
对处理后90天的根、叶采样，液氮冷冻，-80℃保存。
(6)荧光定量PCR
二、实验结果
结果显示(图1)，转基因大豆的miRNA159e的相对表达量显著上升。
实施例4过量miR159e对转基因大豆植株根系的影响。
根系是植物吸收营养的主要器官，因此根系形态和构型对植物吸收营养，正常生长具有十分重要的作用。过表达miR159e的转基因大豆与野生型大豆进行高低磷处理90天，然后对根系性状进行分析。
一、实验方法
大豆温室水培实验：
(1)种子消毒
将成熟、饱满的大豆种子(野生型植株WT、转基因植株miR159e-ox#2)单层排列在不同培养皿中，并将培养皿放入干燥器，并将培养皿打开，盖子紧挨着培养皿。将100ml的次氯酸钠加至干燥器中的250ml烧杯中，然后沿着杯壁缓缓加入4.2ml浓硫酸(HCl)，立即密闭干燥器，静置10h。从干燥器中拿出后，除去多余的氯气。
(2)催芽
将消毒后的(WT、miR159e-ox#2)种子点入湿润的石英砂中催芽萌发。
(3)移苗
一周后两叶一心时选择正常、长势一致的幼苗移栽至水培系统，于温室中用大豆营养液培养。
(4)转基因材料筛选
一周后待第一片三出复叶完全长出，将除草剂涂在miR159e-ox#2的第一片三出复叶上，三天后，叶片变黄的是假阳性，叶片仍然是绿色的则是转基因材料。
(5)处理
鉴定转基因材料后，将WT、miR159e-ox#2植株分别进行高低营养液处理：高磷(HP：500μm，正常营养条件，即为对照)、低磷(LP：25μm)，每个处理5个生物学重复。每周换一次营养液，每三天调一次pH为5.8。
(6)采样
对处理后90天的根、叶采样，液氮冷冻，-80℃保存。
二、实验结果
结果显示(图1)，在HP(对照)和LP条件下，转基因植株的主根长都显著性下降。在HP(对照)条件下，OE-miR159e株系的主根长与野生型相比下降了11％；在LP条件下，OE-miR159e株系的主根长与野生型相比下降了25％。
在HP(对照)和LP条件下，转基因植株的根鲜重都明显上升。在HP(对照)条件下，OE-miR159e株系的根鲜重与野生型相比增加了145％；在LP条件下，OE-miR159e株系的根鲜重与野生型相比增加了21％。
综上所述，在高低磷条件下，过表达miR159e转基因大豆的主根长都有明显下降，根鲜重都有明显上升，高磷条件下作用更加明显，即转基因大豆的根系明显更加发达，这显示转基因大豆具有更强的吸收养分的能力和抵御干旱的能力，尤其是在高磷处理时候，这种能力更加明显。
以下为本发明涉及的培养及配方及配制方法：
表3萌发培养基(GM)
注：高压灭菌(液体循环20分钟)，降温至50℃时倒培养基，每升可倒16个培养皿。
表4固体共培养基(CM)：
MixA：高压灭菌(液体循环20分钟)
Mix B：
Mix C：
注：Mix A降温至50℃时加入Mix B和Mix C。每升可倒40个培养皿(15×100mm)。使用前培养皿中铺上一张灭菌过的滤纸。
GA3(1mg/ml)配制：0.0125克GA3+0.25ml 150％乙醇+12.25ml双蒸馏水，过滤灭菌，4℃保存。
液体共培养液(CM)配方：在固体共培养基(CM)基础上不加琼脂。
表5固体幼芽诱导培养基(SI)：
MixA：
注：高压灭菌(液体循环20分钟)。
MiX B
注：配制SI固体幼芽诱导液体培养基时，MixA(不含phytagel和筛选剂Glufosinate)降温至50℃时，加入Mix B。
配制SI固体幼芽诱导固体培养基时，MixA降温至50℃时，加入Mix B.1升可倒20个培养基(20×100mm).
6-BA(1mg/ml)配制：0.0125克6-BA+0.25ml冰乙酸+12.25双蒸馏水，过滤灭菌，4℃保存液体幼芽诱导培养液(SI)配方：在固体幼芽诱导培养基(SI)基础上不加BBL Agar。
表6茎伸长(SE)培养基：
MixA：高压灭菌(液体循环20分钟)
Mix B：
注：配制SEG平板时，MixA降温至50℃时，加入MIx B。1升可倒15个培养皿。
Asparagine(10mg/mL)配制：0.5gAsaparagine+1N HCl溶解后补双蒸馏水至50ml，过滤灭菌，4℃保存
L-PyroglutamicAcid(10mg/ml)配制：0.5g L-Pyroglutamic Acid+50mL双蒸馏水，过滤灭菌，4℃保存
IAA(1mg/ml)配制：0.0125克IAA+0.25ml 1N NaOH+12.25ml双蒸馏水，过滤灭菌，4℃保存。
玉米素(1mg/ml)配制：10mg玉米素+10ml双蒸馏水，过滤灭菌，4℃保存。
表7生根培养基(RM)：
每瓶倒50ml，高压灭菌(液体循环20分钟)。
NAA(0.5mg/ml)配制：0.005g NAA+0.2ml NaOH+9.8ml双蒸馏水，过滤灭菌，4℃保存。

Claims (10)

1.miR159在改变植物根系形态中的应用。
2.miR159前体全长序列在改变植物根系形态中的应用。
3.一种重组载体在改变植物根系形态中的应用，其特征在于，所述重组载体上有miR159前体全长序列。
4.一种工程菌在在改变植物根系形态中的应用，其特征在于，所述工程菌含有权利要求3中所述的重组载体。
5.根据权利要求1到4任一所述应用，其特征在于，所述植物为大豆、玉米、水稻、花生和苜蓿。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，miR159为大豆miR159e。
7.miR159e在构建转基因大豆方面的应用，其特征在于，所述转基因大豆在高低磷条件下的根系更加发达，具有更强的吸收养分能力和抵御干旱的能力。
8.一种改变植物根系形态的方法，其特征在于，将miR159在植物内过表达。
9.一种构建转基因大豆的方法，其特征在于，是将miR159在植物内过表达；所述转基因大豆在高低磷条件下的根系更加发达，具有更强的吸收养分能力和抵御干旱的能力。
10.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，步骤如下：
S1. 克隆miR159前体全长序列连接入表达载体，得到重组载体；
S2. 将重组载体转化入受体农杆菌，得到工程菌；
S3. 将大豆种子消毒后进行萌发；
S4. 接种工程菌，并扩大培养，制备得到侵染悬浮液；
S5. 处理侵染用外植体；
S6. 用侵染悬浮液充分浸泡处理过的侵染用外植体；
S7. 进行暗培养；
S8. 进行幼芽的诱导；
S9. 进行幼芽的伸长；
S10. 生根培养；
S11. 转基因植株的鉴定。
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