CN110029106B - MSL1的RNAi片段及其在提高植物镉胁迫敏感性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种RNAi片段，其序列如SEQ ID NO:5所示。本发明还提供了含有该RNAi片段的载体。本发明的RNAi片段或载体可以用于提高植物镉胁迫敏感性、培育镉胁迫敏感性提高的转基因植物、调控植物镉胁迫、调控植物对镉的吸收和转运，以及用于土壤镉污染修复，其中的植物可以是水稻。

Description

MSL1的RNAi片段及其在提高植物镉胁迫敏感性中的应用
技术领域
本发明涉及RNAi技术领域，尤其涉及一种MSL1的RNAi片段及其在提高植物镉胁迫敏感性中的应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的农作物，全球一半以上的人口以稻米为主食。由于快速的工业化和工业活动带来的工业污染，含重金属镉化肥或农药的广泛施用，采矿和人类活动等，大量的镉被释放到土壤、空气和水体中。在包括中国的亚洲国家，高达50％的摄入镉来自大米及其制品。重金属一旦进入土壤—作物系统就很难排除，所以水稻镉污染问题已经引起全球各个国家相关部门的高度重视。镉不仅对水稻造成毒害并使其减产，而且沿着食物链逐级往上传递，由于其不易水解和生物难分解的特性，镉易被植物吸收并积累在一些可食用部位，最终在食物链末端的生物体中浓缩放大，对人类产生毒害效应，其中最典型的就是日本的“骨痛病”。近年来我国“镉米”事件频发，引起了全社会的高度关注。重金属污染已经成为制约我国发展安全(无公害)稻米的重要制约因子。因此，如何降低稻米中镉的积累、实现稻米的安全生产成为了一项亟需解决的课题。深入对重金属吸收、转运机制及积累的作用研究，这对保障农产品安全、生态安全以及人民身体健康都具有重要及深远的意义。
植物类受体激酶RLK(Receptor-like kinases，RLK)是一类跨膜受体蛋白。目前拟南芥中有600多个RLK，水稻有1100多个RLK，使得RLK成为植物蛋白家族中最大的家族之一(Shiu and Bleecker,2001；Shiu等，2004)。通常将RLK分为富含亮氨酸重复区型(LRR)、凝集素型(lectin-like)和细胞壁相联型(WAK)等不同的亚家族。其中，LRR-RLK是RLK家族中最大的亚家族，可感受多种发育和外界环境胁迫信号，通过催化功能蛋白的磷酸化导致其构象发生改变，从而在植物的生长发育、信号转导以及逆境胁迫响应过程中发挥重要的调控作用(曹玉婷等，2014；赵书平等，2017；Li等，2014)。植物LRR-RLK的典型结构包括位于胞外的膜定位信号肽(SP)、一组或多组连续LRR单元、位于LRR单元之间的间隔序列(ID)序列、跨膜结构域和胞内激酶结构域。目前普遍认可的LRR-RLK作用模式为配体结合到受体LRR-RLK的LRR域，在胞外结合信号分子后,激活胞内激酶活性，并引发MAP kinase、转录因子磷酸化等下游信号转导途径(Torii，2004)。水稻中已发现300多个LRR-RLK基因，其功能和作用机制研究近年来逐渐成为研究热点。有报道参与水稻花序、颖花和配子体发育的很少，只有FON1和MSP1两个，且都是LRR-RLK。FON1是拟南芥CLV1的直系同源基因，调节花序分生组织的分化和花器官的数目。MSP1是拟南芥EXS/EMS1的同源基因，也是一个水稻花药早期发育重要的信号转导蛋白(Zhao等，2008)。该基因突变后造成小孢子母细胞增加，花药壁损坏，绒粘层消失，尽管不影响染色体配对和交叉，但花粉母细胞的发育停滞在减数分裂期，最终雄性不育。水稻OsMSP1的配体分子是OsTDL1A。利用酵母双杂交和双分子荧光互补分析发现，OsTDL1A与OsMSP1的富亮氨酸重复区互作,共同调控花药壁和花粉细胞的分化和发育(Zhao等，2008；Yang等，2016)。
文献报道，水稻中MSP1存在一个结构高度相似的同源蛋白MSP1-like1(MSL1)(Os02g0194400)，也是富含亮氨酸重复区型RLK蛋白激酶。但是MSL1基因在水稻发育及抗性中的功能并未进行任何研究。因此，本研究克隆了MSL1基因。采用启动子融合GUS方法分析了MSL1的时空表达模式，发现MSL1在水稻抽穗灌浆期的稻穗及节中表达量非常高，而在水稻营养组织中，MSL1表达很低。另外，采用RNAi构建了转基因水稻植株，发现MSL1RNAi转基因植株没有生育缺陷，发育正常；镉处理后，MSL1RNAi转基因水稻植株降低了对镉胁迫的耐受性，提高了对镉向地上部的转运和积累。该研究有助于揭示水稻对重金属胁迫应答的生理分子机制，也可为土壤重金属污染的修复提供基础材料。
发明内容
为此，本发明的一个目的是提供一种MSL1的RNAi片段，其特征在于，其序列如SEQID NO.5所示。
本发明的另一个目的是提供一种载体，其特征在于，其中含有所述的RNAi片段。其进一步由如下方法构建而来，将权利要求1所述的RNAi片段正反双向插入到图2所示的p130035SI-X的两个多克隆位点，即将上述核酸序列的5′克隆进载体p130035SI-X的BamHⅠ酶切位点，将3′克隆进p130035SI-X的SpeⅠ酶切位点；同时再次将上述核酸序列的5′克隆进载体p130035SI-X的SacI酶切位点，将3′克隆进p130035SI-X的KpnⅠ酶切位点。
本发明的另一个目的是提供所述RNAi片段或载体在提高植物镉胁迫敏感性中的应用。
本发明的另一个目的是提供所述RNAi片段或载体在培育镉胁迫敏感性提高的转基因植物中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种培育镉胁迫敏感性提高的转基因植物的方法，其特征在于将所述RNAi片段或载体导入植物中，获得镉胁迫敏感性提高的转基因植物。
本发明的另一个目的是提供所述RNAi片段或载体在调控植物镉胁迫中的应用。
本发明的另一个目的是提供所述RNAi片段或载体在调控植物对镉的吸收和转运中的应用。
本发明的另一个目的是提供上述方法和应用，其中所述植物为水稻。
本发明的另一个目的是提供所述RNAi片段或载体在土壤镉污染修复中的应用。
本发明的有益效果如下：
本申请发现了一种RNAi片段，以水稻为例进行验证。通过构建相关载体并将其导入植物，获得了没有生育缺陷，发育正常的MSL1RNAi转基因植株。镉处理后，MSL1RNAi转基因水稻植株降低了对镉胁迫的耐受性，提高了对镉向地上部的转运和积累。该RNAi片段以及含有其的载体可用于提高植物镉胁迫敏感性、培育镉胁迫敏感性提高的转基因植物、调控植物镉胁迫、调控植物对镉的吸收和转运，以及修复土壤镉污染，具有良好的应用价值。
附图说明
图1是TAKARA试剂盒操作流程简图。
图2是RNAi表达载体p130035SI-X图谱。
图3是RNAi表达载体构建流程。
图4是MSL1的表达模式分析。(A)MSL1-GUS转基因水稻的GUS染色；(C)10μM CdCl2处理不同时间下MSL1的表达检测。
图5是载体p1300-MSL1RNAi构建及水稻转基因。
图6是在镉胁迫下野生型水稻及MSL1的RNAi转基因株系的表型变化。A镉处理前表型；B、镉处理14d后表型。
图7是镉处理对野生型水稻及MSL1的RNAi转基因株系叶片叶绿素含量的影响。
图8是镉处理对野生型水稻及MSL1的RNAi转基因株系叶片H2O2含量的影响。
图9是野生型水稻及MSL1的RNAi转基因株系中不同器官根茎叶中的镉含量。
具体实施方式
以下以具体实施方式详细描述本发明，不能将其解释为限制本发明的范围。
实施例一、研究材料与方法
1.实验材料和生长条件
野生型水稻(Oryza sativa，Zhonghua 11，简称ZH11)作为对照组，把MSL1RNAi转基因水稻阳性株系(i4；i8；i11)作为实验组。野生型和转基因株系种子在28℃暗处理3天，萌发后播种到网格上置于30℃，13小时光照、22℃，11小时黑暗，相对湿度为70％的培养箱中，用一半浓度的Kimura B溶液进行水培预培养。14天后换成全营养液进行培养。溶液每三天更换一次。培养至8周时在60μmol/L的CdCl2处理14d后，观察并比较RNAi转基因株系(i4；i8；i11)与野生型ZH11水稻植株在镉处理前后下的表型，并进行相关生理分子分析。
2.基因的表达特性分析
1)水稻样品总RNA的提取：用TAKARA的RNA提取试剂盒提取各个不同水稻样品中的总RNA
RNA样品的逆转录
采用TAKARA第一链cDNA合成试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser进行RNA逆转录。在DEPC处理的离心管内将试剂按表1所示混合均匀。按下列条件(表2)进行逆转录反应。
表1 RNA样品的逆转录：
Figure BDA0002018261850000041
表2 PCR反应温度和时间
Figure BDA0002018261850000042
实时荧光定量PCR
采用Rotor gene Q及时荧光定量PCR仪，对MSL1表达水平进行检测以获得相应的数据并进行分析。对于每一个cDNA样品进行3次重复实验。PCR采用SYBR Premix ex TaqTM(Takara,Japan)，并以β-actin作为内参。反应体系见表3；反应程序见表4。
表3实时荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0002018261850000043
Figure BDA0002018261850000051
表4实时荧光定量PCR反应温度和时间
Figure BDA0002018261850000052
表5 RT-PCR引物序列(序列SEQ ID NOs.1-4)
Figure BDA0002018261850000053
3.MSL1RNAi载体构建及水稻转基因
3.1材料和方法
大肠杆菌E.coli DH5α、根癌农杆菌EHA105由本实验室保存。植物过表达载体p130035SI-X(图2)由中国水稻研究所转基因技术研究室提供。克隆载体pMD-19T购自TaKaRa公司。需要说明的是，本发明中可以使用本领域已知的合适菌株或载体，并不限于上述菌株和载体，上述菌株和载体仅为了详细说明本发明的实施过程，不能认为菌株和载体均受限于这些。
3.2MSL1RNAi载体构建
提取水稻根RNA，逆转录为cDNA，PCR克隆MSL1基因靠近5`-UTR的CDS序列(待进行克隆实验的具体序列如下：序列SEQ ID NO:5
5’CCATGCTCTCGATCGCCTCCCGCTCGCCCTCGCCGGCGTTGATTGCACCTCACGCCTCCGCCCGCGCCACCGGTCTTCGTGCTCCGTTCGCCGGCAACCGCATTGTGGGGTGGGGGTGGGGGGATCAAACCAAATCAGGTACGGATCGTAATCGCGCATCGATCTGTGTCGTCCTGTTCCTGCGCGTCCGCTCCGGCGAGCCCACGCAGGCGCCGCGGGATCCCCCTGCTGCGGTAGGCGGCGGCGGCTG3’)。将上述核酸序列250bp正反双向插入到p130035SI-X的两个多克隆位点中。即：将上述核酸序列的5′克隆进载体p130035SI-X的BamHⅠ酶切位点，将3′克隆进p130035SI-X的SpeⅠ酶切位点；同时再次将上述核酸序列的5′克隆进载体p130035SI-X的SacI酶切位点，将3′克隆进p130035SI-X的KpnⅠ酶切位点。这时当载体质粒导入植物中时就可形成dsRNA结构，从而干扰目的基因的表达。RNAi表达载体构建流程如图3所示。KpnⅠ/SacⅠ和BamHⅠ/SpeⅠ双酶切体系见表1和表2。
表1 KpnⅠ/SacⅠ双酶切体系
Figure BDA0002018261850000061
表2 BamHⅠ/SpeⅠ双酶切体系
Figure BDA0002018261850000062
3.3MSL1RNAi载体的水稻转基因
1)胚性愈伤组织的诱导和继代培养
将水稻灌浆期稻穗取回脱粒，种子置于500ml烧杯中(种子数量约为烧杯体积的1/3)，70％酒精消毒2min，倒掉酒精加入500ml 25％次氯酸钠溶液(滴入2-3滴吐温-20)，抽真空浸泡90min，在超净工作台上倒去溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5次。在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，接种于诱导培养基中，封好膜后28℃/暗培养7d。在超净台上将已经诱导出的愈伤组织去芽，然后置于继代培养基中相同条件继续培养7d。
2)感菌与共培养
共培养前一周将含有重组质粒的农杆菌菌株划YM(+50mg/L Kan，40mg/L Rif)平板进行活化，提前2-3d挑取单菌落在新的含有抗生素的YM平板上再次化菌，一个单克隆菌落划一条。用金属药匙收集平板上的菌条，置于30ml悬浮侵染培养基中，并使该悬浮菌液OD600＝0.01。挑选淡黄色、致密、大小合适的愈伤组织颗粒放入农杆菌悬浮菌液中侵染30min，取出愈伤组织在无菌滤纸上微晾(20-30min)，置于铺有无菌滤纸的共培养基上，25℃/暗培养3d。
3)抗性愈伤组织的筛选
共培养后的愈伤组织首先依次用无菌水和含500mg/L头孢拉定的无菌水清洗3-5次，然后置于无菌滤纸上晾干，最后将它们转入抗性筛选培养基上，28℃/暗培养。14d后将能够长出抗性愈伤的愈伤组织移至新的筛选培养基上，28℃/光照培养14d，直到能够长出淡黄致密的抗性愈伤。
4)抗性愈伤组织的分化和生根
将经过筛选后颜色鲜黄有抗性的愈伤组织转入分化培养基中，密度保持在每支试管3-4粒或每瓶5-7粒，封好膜后于28℃/恒温昼夜交替培养15-30d至分化成苗，将长至1cm左右的分化苗放入生根培养基中培养。
5)转基因植株的炼苗和移栽
挑选根部生长较好的转基因苗置于蒸馏水或无菌水的试管中，炼苗3-7d后移栽至温室中土培并进行检测。
4镉胁迫下水稻表型观察及各器官生理指标测定方法
1)叶绿素：从水稻植株上剪取一定量新鲜的叶片，洗涤并擦净表面污物后，去除中脉并剪碎。称取剪碎的样品0.2g，剪成细丝，置于装有7.5ml 95％乙醇的试管内，置于暗处室温浸提至叶片完全变白后，过滤定容至10ml。取适量叶绿体色素提取液，把95％乙醇作为空白对照组，借助可见光分光光度计分别在波长663nm、645nm下测定对应的吸光度。叶绿素浓度的计算公式如下：
总叶绿素浓度
Figure BDA0002018261850000071
2)H2O2测定：取0.1g样品，加入3mL预冷的磷酸钾buffer(即PBS，50mM,pH 6.5),冰浴研磨。匀浆液以6000g，4℃离心25min,上清即为H2O2提取液。加入1mL 0.1％四氯化钛(含20％H2SO4)。取适量混合液于离心管中，在6000g，4℃条件下在低温高速离心机中离心15min后取上清测定波长410nm时的OD值。计算公式如下：
H2O2(μmol L-1)＝OD410×3000/28
Cd含量测定：水稻根茎叶样品取样之后于105℃烘2h后，于65℃烘至恒重。称取一定量水稻样品，用酸混合液进行微波消解后，再利用原子吸收(atomic absorptionspectrophotometry，AAS)法测定水稻茎、叶、稻米等部位的Cd含量。
实施例二、实验结果：
1、MSL1基因的表达特性分析：
如图4所示，利用MSL1-GUS转基因水稻的GUS染色检测MSL1基因的时空特异性表达。发现MSL1在花药及节中表达量较高。利用实时定量PCR检测水稻镉处理后MSL1基因表达。4周龄的水稻幼苗在10μM CdCl2处理1-24h内，水稻根中MSL1的表达量没有显著的变化。在镉胁迫24h后，水稻叶中MSL1的表达量上升显著。
2、MSL1RNAi载体的构建及水稻转基因：
PCR扩增MSL1RNAi 250bp的片段，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳。KpnⅠ/SacⅠ双酶切克隆载体pMD19-MSL1RNi质粒得到序列大小一致的片段。KpnⅠ/SacⅠ双酶切中间载体p1300-MSL1RNi1质粒片段大小吻合。KpnⅠ/SacⅠ和BamHⅠ/SpeⅠ分别双酶切鉴定MSL1基因的植物RNAi表达载体。利用农杆菌介导的方法，将RNAi表达载体转化水稻中花11。PCR反应、双酶切验证电泳以及农杆菌介导的水稻转基因过程见图5。
3、MSL1RNAi转基因水稻对镉胁迫的响应分析：
构建MSL1RNAi载体，利用农杆菌介导方法转化水稻中花11，获得转基因植株并进行鉴定，发现MSL1RNAi转基因植株没有生育缺陷，发育正常。在60μM CdCl2处理后，MSL1RNAi植株与野生型ZH11相比，苗长势较差，黄色叶片更多，丙二醛MDA和H2O2的增加程度较高，RNAi植株表现为对镉更敏感，地上部镉积累量更高(图6-9)。
3.1表型观察
在60μmol/L的CdCl2处理14d后，观察并比较RNAi转基因株系(i4；i8；i11)与野生型ZH11水稻植株在镉处理前后下的表型(图6)。MSL1干涉表达的转基因植株相比野生型ZH11，苗相对长势较差，而ZH11植株的幼苗比较健壮，绿色叶片较多，这些表型特征说明相比于野生型ZH11植株，MSL1干涉表达株系对重金属镉的胁迫更为敏感，受到的伤害更大。
3.2生理指标测定
3.2.1叶绿素
无论是在镉胁迫条件下还是在非胁迫处理条件下，ZH11植株中的叶绿素含量都明显比RNAi转基因水稻(i4；i8；i11)中的叶绿素含量要低。在镉胁迫处理之后，RNAi转基因水稻株系和ZH11植株中叶绿素含量均有不同程度的下降，ZH11水稻植株中叶绿素含量下降了5.9％，而RNAi转基因水稻株系(i4；i8；i11)分别下降7.7％、11.3％和12.3％(图7)，发现在镉胁迫处理下，RNAi转基因水稻株系中叶绿素遭受的破坏程度比ZH11植株更大。
3.2.2H2O2
无论是在非镉胁迫条件还是在镉处理条件下，ZH11水稻植株的H2O2含量都显著低于RNAi转基因水稻株系。在镉处理下，RNAi转基因水稻株系和ZH11植株中的H2O2含量均有不同程度的上升，相比ZH11水稻植株和RNAi转基因水稻株系体内过氧化氢的增加量，发现RNAi转基因水稻(i4；i8；i11)中H2O2上升量均大于ZH11植株(图8)。这表明在镉胁迫条件下，植株所受到的氧化胁迫程度较高，而MSL1的干涉表达可以在一定程度上降低水稻对镉胁迫的耐受性。
3.3RNAi转基因水稻和ZH11水稻不同器官的镉含量分析
在镉处理条件下，无论是野生型水稻还是转基因水稻，不同部位镉积累含量从高到低依次均为根、茎、叶。野生型ZH11植株的根中镉含量显著高于RNAi转基因水稻株系，而茎和叶中则正好相反，即MSL1的RNAi转基因株系(i4；i8；i11)茎和叶中镉的积累量都要高于野生型ZH11水稻植株(图9)。由此可见，水稻根部是镉积累的主要器官，而MSL1的RNA干涉则会降低水稻根对镉的保持力并增加镉向地上部分的转运量，从而导致地上部分镉积累量增加。
综上，本申请发现了一种RNAi片段及其应用，并以水稻为例进行验证，获得了没有生育缺陷，发育正常的MSL1RNAi转基因植株。镉处理后，MSL1RNAi转基因水稻植株降低了对镉胁迫的耐受性，对重金属镉的胁迫更为敏感，提高了对镉向地上部的转运和积累。本领域技术人员在不背离本发明精神的情况下，可以做出变型或改动，其同样在权利要求范围之内。
序列表
<110> 中国计量大学
<120> MSL1的RNAi片段及其在提高植物镉胁迫敏感性中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial primer)
<400> 1
gccgtcctct ctctgtatgc 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial primer)
<400> 2
ggggacagtg tggctgac 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial primer)
<400> 3
ccatgctctc gatcgcct 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial primer)
<400> 4
cctaccgcag caggggat 18
<210> 5
<211> 250
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 5
ccatgctctc gatcgcctcc cgctcgccct cgccggcgtt gattgcacct cacgcctccg 60
cccgcgccac cggtcttcgt gctccgttcg ccggcaaccg cattgtgggg tgggggtggg 120
gggatcaaac caaatcaggt acggatcgta atcgcgcatc gatctgtgtc gtcctgttcc 180
tgcgcgtccg ctccggcgag cccacgcagg cgccgcggga tccccctgct gcggtaggcg 240
gcggcggctg 250

Claims (14)

1.RNAi片段在提高水稻镉胁迫敏感性中的应用，所述的RNAi片段序列如SEQ ID NO.5所示。
2.含有序列如SEQ ID NO.5所示的RNAi片段载体在提高水稻镉胁迫敏感性中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的载体由如下方法构建而来，将所述的RNAi片段正反双向插入到p130035SI-X的两个多克隆位点，即将上述核酸序列的5′克隆进载体p130035SI-X的BamHⅠ酶切位点，将3′克隆进p130035SI-X的SpeⅠ酶切位点；同时将上述核酸序列的5′克隆进载体p130035SI-X的SacI酶切位点，将3′克隆进p130035SI-X的KpnⅠ酶切位点。
4.RNAi片段在培育镉胁迫敏感性提高的转基因水稻中的应用，所述的RNAi片段序列如SEQ ID NO.5所示。
5.含有序列如SEQ ID NO.5所示的RNAi片段载体在培育镉胁迫敏感性提高的转基因水稻中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的载体由如下方法构建而来，将所述的RNAi片段正反双向插入到p130035SI-X的两个多克隆位点，即将上述核酸序列的5′克隆进载体p130035SI-X的BamHⅠ酶切位点，将3′克隆进p130035SI-X的SpeⅠ酶切位点；同时将上述核酸序列的5′克隆进载体p130035SI-X的SacI酶切位点，将3′克隆进p130035SI-X的KpnⅠ酶切位点。
7.一种培育镉胁迫敏感性提高的转基因水稻的方法，其特征在于，将RNAi片段或载体导入水稻中，获得镉胁迫敏感性提高的转基因水稻；所述的RNAi片段序列如SEQ ID NO.5所示；所述的载体含有序列如SEQ ID NO.5所示的RNAi片段。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的载体由如下方法构建而来，将所述的RNAi片段正反双向插入到p130035SI-X的两个多克隆位点，即将上述核酸序列的5′克隆进载体p130035SI-X的BamHⅠ酶切位点，将3′克隆进p130035SI-X的SpeⅠ酶切位点；同时将上述核酸序列的5′克隆进载体p130035SI-X的SacI酶切位点，将3′克隆进p130035SI-X的KpnⅠ酶切位点。
9.RNAi片段在调控水稻镉胁迫中的应用，所述的RNAi片段序列如SEQ ID NO.5所示。
10.含有序列如SEQ ID NO.5所示的RNAi片段载体在调控水稻镉胁迫中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的载体由如下方法构建而来，将所述的RNAi片段正反双向插入到p130035SI-X的两个多克隆位点，即将上述核酸序列的5′克隆进载体p130035SI-X的BamHⅠ酶切位点，将3′克隆进p130035SI-X的SpeⅠ酶切位点；同时将上述核酸序列的5′克隆进载体p130035SI-X的SacI酶切位点，将3′克隆进p130035SI-X的KpnⅠ酶切位点。
12.RNAi片段在调控水稻对镉的吸收和转运中的应用，所述的RNAi片段序列如SEQ IDNO.5所示。
13.含有序列如SEQ ID NO.5所示的RNAi片段载体在调控水稻对镉的吸收和转运中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的载体由如下方法构建而来，将所述的RNAi片段正反双向插入到p130035SI-X的两个多克隆位点，即将上述核酸序列的5′克隆进载体p130035SI-X的BamHⅠ酶切位点，将3′克隆进p130035SI-X的SpeⅠ酶切位点；同时将上述核酸序列的5′克隆进载体p130035SI-X的SacI酶切位点，将3′克隆进p130035SI-X的KpnⅠ酶切位点。
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