CN115960189A - 一种文冠果蛋白及其编码基因在提高植物花瓣中花青素的含量中的应用 - Google Patents
一种文冠果蛋白及其编码基因在提高植物花瓣中花青素的含量中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种文冠果蛋白及其编码基因在提高植物花瓣中花青素的含量中的应用，涉及生物技术领域。本发明要求保护如下(1)‑(4)任一项所述的物质在提高植物花瓣中花青素的含量中的应用：(1)氨基酸序列如SEQIDNO.10所示的文冠果蛋白；(2)编码所述文冠果蛋白的DNA分子；(3)含有所述DNA分子的载体；(4)含有所述DNA分子的微生物菌株。本发明提供的文冠果蛋白及其编码基因是文冠果花瓣中花青素合成的关键蛋白和基因，能够正向调控花青素的合成，为观赏型文冠果新品种的创制提供了理论依据，具有重要的指导意义和实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种文冠果蛋白及其编码基因在提高植物花瓣中花青素的含量中的应用。
背景技术
文冠果(Xanthoceras sorbifolium)是木本油籽灌木，具有很强的抗寒、抗旱、耐盐碱等生理特性，通常作为水土保持、荒山绿化的先锋树种。文冠果种仁油可作为高品质的食用油并且种仁中含油率高，是一种木本粮油植物。此外，文冠果花色品种多样、花色艳丽，具有很高的观赏价值，是珍贵的园林绿化树种，因此文冠果具有广泛的生态、农业、园艺和商业意义。文冠果白花花系在开花过程中伴随着花瓣内轮基部颜色的逐渐改变，花色具有渐变性。花色具有渐变性使植物更具观赏性，与具有单一花色的植物相比，花色渐变的植物在观赏价值方面更加具有竞争力。
通过对文冠果花色渐变调控机制的解析，筛选出调控花青素合成的关键基因，为观赏型文冠果新品种的创制提供了理论依据，具有重要的指导意义和实际应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供种文冠果蛋白及其编码基因在提高植物花瓣中花青素的含量中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的文冠果蛋白及其编码基因是文冠果花瓣中花青素合成的关键蛋白和基因，能够正向调控花青素的合成。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供如下(1)-(4)任一项所述的物质在提高植物花瓣中花青素的含量中的应用，
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的文冠果蛋白；
(2)编码所述文冠果蛋白的DNA分子；
(3)含有所述DNA分子的载体；
(4)含有所述DNA分子的微生物菌株。
进一步地，通过提高所述文冠果蛋白的表达来提高植物花瓣中花青素的含量。
进一步地，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明还提供一种提高植物花瓣中花青素的含量的方法，包括使所述植物中氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的文冠果蛋白的表达量提高的步骤。
进一步地，所述方法具体包括：
(1)将如SEQ ID NO.9所示的DNA分子连接到表达载体中，得到重组载体；
(2)将所述重组载体通过农杆菌转化法转化到植物植株中，得到含有所述DNA分子的转基因植株。
进一步地，所述DNA分子的获得方法包括：
(1)从文冠果花样品中提取得到总RNA，并反转录得到cDNA；
(2)以所述cDNA为模板，采用SEQ ID NO.1-2所示的引物对，进行PCR扩增，得到所述DNA分子。
进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：cDNA 1.0μL，5×Reaction Buffer 4.0μL，High Pure dNTP 0.5μL，10μM上游引物0.2μL，10μM下游引物0.2μL，Q5 Polymerase 0.2μL，ddH2O 13.9μL。
进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：95℃10min，95℃30s，58℃30s，72℃2min，72℃10min，循环35次。
进一步地，所述表达载体为pBI121载体。
本发明公开了以下技术效果：
通过对文冠果花色渐变调控机制的解析，筛选出了四个可能调控花青素合成的XsMYB113转录因子基因，即XsMYB113-1、XsMYB113-2、XsMYB113-3和XsMYB113-4。上述四个基因对文冠果花瓣中花青素的含量均具有正向调控作用，但是四个基因的调控能力不同，其中XsMYB113-1基因调控花青素合成的能力最强。转基因实验证明，XsMYB113-1是文冠果花瓣中花青素合成的关键基因，起主要调控花青素合成的作用。XsMYB113-1基因为观赏型文冠果新品种的创制提供了理论依据，具有重要的指导意义和实际应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为文冠果基因组中四个花青素相关MYB转录因子染色体位置示意图；
图2为文冠果四个XsMYB113转录因子基因及其附近的转座子结构示意图；
图3为文冠果四个XsMYB113基因的氨基酸排列对比图；
图4文冠果四个XsMYB113基因在花色渐变S1到S4过程中的转录组水平分析；
图5为RT-PCR检测文冠果四个XsMYB113基因在花色渐变S1到S4过程中的转录水平；使用三个独立的技术重复和三个生物样品进行实验；
图6为简化的MYB113调控花青素合成通路中结构基因示意图；
图7为文冠果四个XsMYB113基因过表达烟草在含有抗生素的筛选培养基上分化出的愈伤组织；
图8为文冠果四个XsMYB113基因过表达烟草转基因株系PCR鉴定；
图9为RT-PCR检测过表达转基因烟草中各XsMYB113基因的转录本丰度；使用NtEF1-α作为内参基因，使用三个独立的技术重复和三个生物样品进行实验；
图10为烟草中过表达文冠果四个XsMYB113基因的植物体表型；选择3个不同独立的转基因植株个体，3个独立个体表型均一致，比例尺＝10厘米；
图11为烟草中过表达文冠果XsMYB113基因花的表型；选择3个不同独立的转基因植株个体，3个独立个体表型均一致，比例尺＝1厘米；
图12为不同的XsMYB113转基因株系及野生型叶片和花提取花青素后的图片；使用1％HCl甲醇溶液(V/V)，从烟草野生型、OE-XsMYB113-1/#4、OE-XsMYB113-2/#11、OE-XsMYB113-3/#2和OE-XsMYB113-4/#7的转基因株系中提取花和叶中总花青素，WT：野生型；OE：过表达；
图13为野生型和过表达XsMYB113转基因烟草植物的叶片和花中总花青素含量的测定；这些实验对每个独立的转基因株系重复三次，根据Student’s t-test，双星号和三星号表示转基因株系中花青素含量与野生型相比存在显著差异，分别为**：P<0.01，***：P<0.001；
图14为文冠果四个XsMYB113基因在转基因烟草T1代中的表型。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中，农杆菌GV3101购自北京擎科生物科技有限公司。
实施例1
一、材料方法
1.1实验材料
本实施例采用的文冠果材料均取自于东北林业大学理化实验楼林场(E126°64’N45°72’，哈尔滨市，黑龙江省，中国)和内蒙古自治区赤峰市阿鲁科尔沁旗昆都经济林厂(E119°96’N44°24’，内蒙古赤峰市，中国)，以文冠果白花花系的全部花朵为材料，将文冠果开花过程根据花瓣内轮基部的颜色不同而分为4个不同的发育时期，并命名为发育时期1到发育时期4(用S1–S4来表示)。各个花发育时期的花(花蕾)分别选自3棵独立不同的树，各时期样品均同时采集3份作为3个生物学重复。样品取材后立即包裹锡箔纸放入液氮中速冻，置于-80℃冰箱中保存以便后续实验使用。其中部分样品用于花青素含量的检测，部分用于使用重亚硫酸盐测序法进行全基因组DNA甲基化测序，全基因组小RNA测序，部分用于转录组测序，其他材料用于实验室常规实验DNA、RNA提取检测实验。
为了对文冠果中基因的功能进行转基因分析，我们使用了由云南省烟草农业科学研究院提供的烟草(Nicotiana tabacum L.)品种云87野生型品种作为转基因材料，该烟草品种由母本云烟2号和父本K326杂交培育而来。收集转基因或野生型烟草植物的新鲜叶和花，用于提取DNA和RNA，以鉴定其基因型并分析基因表达量。
1.2实验试剂及仪器
1.2.1实验试剂
花青素的提取：1％盐酸甲醇溶液，甲醇：盐酸(V/V)99：1。
DNA提取试剂：2％CTAB，5M NaCl，1M Tris-HCl，0.5M EDTA，CTAB，ddH2O，巯基乙醇，酚：氯仿：异戊醇(V/V/V)：25:24:1，异丙醇，无水乙醇，75％乙醇，RNAase，氯仿。
RNA提取试剂：TRIzol试剂(Ambion)，酚：氯仿：异戊醇(V/V/V)：125:24:1，无水乙醇，75％乙醇，ddH2O，RNaseZapTM RNase。
MOPS电泳缓冲液：0.2M MOPS(pH 7.0)，20mM乙酸钠，10mM EDTA(pH 8.0)。
反转录试剂盒：北京全式金公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix kit反转录试剂盒。
RT-PCR：rTaq(Takara)，dNTP(Takara)，10×reaction Buffer(Takara)，琼脂糖(Invitrogen)。
载体构建：Q5超高保真DNA聚合酶(NEB)，5×Q5 Reaction Buffer(NEB)，HighPure dNTP(全式金)，rTaq(Takara)，10×Reaction Buffer(Takara)，全式金公司的克隆载体(
-Blunt Cloning Kit)，pBI121载体，XbaI(NEB)，SacI(NEB)，HindIII(NEB)，PstI(NEB)，T4 DNA连接酶(NEB)，酶切缓冲液10×CutSmart Buffer(NEB)，dNTP(Takara)，DNA胶回收试剂盒(Thermo Fisher Scientific)。
LB固体培养基：蛋白胨(生工生物)10g/L，酵母提取物(生工生物)5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉(生工生物)10g/L。
液体LB培养基：蛋白胨(生工生物)10g/L，酵母提取物(生工生物)5g/L，NaCl10g/L。
植物培养基：1/2MS(Murashige and Skoog)培养基，MS 2.17g/L，1％的蔗糖溶液，调节PH至5.8，琼脂粉(生工生物)6g/L，高温高压灭菌。
卡那霉素(Kanamycin)，利福平霉素(Rifampicin)，头孢(Cephalosporins)，筛选培养基(1/2MS+NAA+6-BA)，生根培养基(1/2MS+NAA)。
1.2.2实验仪器
-80℃冰箱(Panasonic)，PCR仪(Eppendorf)，紫外分光光度计(INESA，上海，中国)，Nanodrop 2000，琼脂糖凝胶电泳仪(Bio-Rad)，琼脂糖凝胶成像仪(Tanon)，恒温水浴锅，恒温摇床，植物恒温培养箱，超净工作台，精密天平，磁力搅拌器，台式高速离心机(Thermo Fisher Scientific)。
1.2.3分析软件
引物设计使用Primer 5.0和SnapGene软件。数据处理使用Microsoft Office中的PowerPoint，Excel，作图使用GraphPad Prism8，序列比对使用Geneious 4.8.4和DNA MAN6.0，进化树分析使用MEGA 7，进化树作图修饰使用iTOL v6(Interactive Tree OfLife)https://itol.embl.de/，DNA甲基化、siRNA丰度可视化软件使用IGV 2.7.0(IntegrativeGenomics Viewer)和IGB(Integrated Genome Browser)，本地序列比对和序列提取等使用TBtools完成。
1.3实验方法
1.3.1进化树分析
通过与拟南芥、葡萄、柑橘、杨树、苹果、茶树、番茄等物种中已报道的正调控花青素合成MYB基因比对，通过使用TBtools软件进行本地blastp提取文冠果中MYB基因同源物种，筛选并去除低于40％的蛋白质序列相似性的基因进行进一步分析。然后在本地服务器上使用MEGA 7中的最大似然法构建了系统发育树，Bootstrap值为1000。
1.3.2RNA提取、反转录、RT-PCR
RNA的提取：文冠果花等样品利用TRIzol法进行总RNA的提取
(1)在研钵中均匀喷雾去污溶液RNaseZapTM RNase，充分润湿研钵，置于冰上。
(2)从-80℃冰箱中取出文冠果花样品并迅速置于液氮中冷冻，防止RNA降解，并预冷研钵。
(3)取适量的液氮于研钵中，并加入样品进行研磨，将样品研磨至细粉状后，转移到液氮预冷的1.5mL离心管中并迅速加入1mL TRIzol试剂，在旋转机上旋转30min。
(4)加入200μL氯仿并上下翻转20s充分混匀，将1.5mL离心管放入预冷的4℃离心机中离心10min，转速13,000rpm。
(5)使用移液枪将离心后的上清液(约450μL)转移到新的离心管中并加入等体积125:24:1(V/V/V)的酚：氯仿：异戊醇，轻轻充分混匀后于冰上静置20min。
(6)使用离心机转速为13,000rpm离心10min后，去除上清液，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀，重复洗2遍。
(7)将去除乙醇后的1.5mL离心管置于离心机中离心2min，转速13,000rpm，使用移液枪将多余的乙醇吸出，并倒置于干净的滤纸上。
(8)室温下放置10min后，加入50μL的ddH2O溶解后，置于-80℃冰箱中保存。
RNA质量检测：吸取2μL RNA进行MOPS琼脂糖凝胶电泳检测。
RNA的浓度值测定：吸取1μL RNA使用Nanodrop 2000进行浓度测定。
反转录：
使用PrimeScriptTM RT试剂盒和gDNA Eraser(Takara Biomedical TechnologyCo.，Ltd.，Beijing，China)按照制造商的说明书将RNA样品(1μg)反转录为cDNA。
RT-PCR：反应程序为95℃10min；95℃30s，58℃30s；72℃30s；72℃10min。
(1)将RNA提取原液稀释至500ng/μL，然后使用反转录试剂盒进行反转录，反应体系及PCR程序如下所示(表1)：
表1 RNA反转录体系
反应程序：42℃30min，85℃5s，4℃10min。
(2)将第一步反转录得到的cDNA稀释10倍，并以稀释后的液体为模板，进行RT-PCR实验，反应体系及反应程序如下(表2)：
表2 RT-PCR反应体系
反应程序如下：95℃10min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，72℃10min，循环35次。
反应结束后，制作琼脂糖凝胶电泳跑胶，120V电压，进行20min，在紫外凝胶成像系统上观察结果。
文冠果各时期花RNA被用来检测各时期基因的转录水平，烟草RNA被用来鉴定烟草转基因株系中外源基因的表达量。
1.3.3 RT-PCR引物设计
以之前发布的文冠果基因组(assembly ASM343084v1)为参考基因组，通过与拟南芥等物种中已报道的花青素相关MYB转录因子基因序列比对，分析出文冠果中花青素相关MYB转录因子，并使用SnapGene软件设计RT-PCR引物，所设计的RT-PCR引物序列如表3所示。
表3文冠果四个XsMYB113基因RT-PCR引物序列
1.3.4 MYB基因染色体定位
以发布的文冠果基因组(assembly ASM343084v1)为参考基因组，根据MYB基因的注释信息，使用TBtools软件中Amazing Gene Location From GTF/GFF将MYB基因在染色体上定位，并作图。
1.3.5转座子分析与鉴定
文冠果XsMYB113基因簇附近的转座子注释使用RepeatMasker(http://repeatmasker.org)完成。
1.3.6甲基化、小RNA可视化作图
文冠果甲基化和小RNA数据的可视化作图使用IGV软件完成。
1.3.7候选基因的克隆及超表达载体的构建
根据文冠果参考基因组中的基因信息，获得文冠果四个XsMYB113基因的DNA序列信息，用于克隆并构建超表达载体。使用SnapGene设计克隆引物，并在哈尔滨擎科生物科技有限公司合成引物。
过表达XsMYB113-1基因的载体构建引物序列为：
上游克隆引物，5'～3'(Primer-XhoI-F)：
CCCTCGAGATGGTGGGTTCTGTTGACGCAGTGCTG(SEQ ID NO.1)。
下游克隆引物，5'～3'(Primer-SacI-R)：
CGAGCTCCTAAATTGCAATAAGAATATCCCAAAGA(SEQ ID NO.2)。
过表达XsMYB113-2基因的载体构建引物序列为：
上游克隆引物，5'～3'(Primer-BamHI-F)：
CGGGATCCATGTACGCACATCGCATTTATTTA(SEQ ID NO.3)。
下游克隆引物，5'～3'(Primer-SacI-R)：
CGAGCTCTTACGTTGCATTTGCTGCTTCTGTAGT(SEQ ID NO.4)。
过表达XsMYB113-3基因的载体构建引物序列为：
上游克隆引物，5'～3'(Primer-BamHI-F)：
CGGGATCCATGATGGACATGTCGTCCATGGAGGGAA(SEQ ID NO.5)。
下游克隆引物，5'～3'(Primer-KpnI-F)：
GGGGTACCTTAAATAGCATTTGCTTCTTCTGTAGTT(SEQ ID NO.6)。
过表达XsMYB113-4基因的载体构建引物序列为：
上游克隆引物，5'～3'(Primer-BamHI-F)：
CGGGATCCATGGAGGGAAATCTAGGAGTTCGAA(SEQ ID NO.7)。
下游克隆引物，5'～3'(Primer-KpnI-F)：
GGGGTACCTTAAATTGCACGTGCTTCTTCTGTAGTT(SEQ ID NO.8)。
上述引物中下划线部分表示限制性内切酶的酶切位点所剪切的碱基序列。
提取文冠果花的总RNA，经反转录后得到文冠果cDNA，然后使用Q5超高保真DNA聚合酶(NEB)进行克隆基因，分别将四个基因XsMYB113-1、XsMYB113-2、XsMYB113-3和XsMYB113-4从文冠果花的cDNA中克隆，构建到pBI121载体中。
基因克隆反应体系如下(表4)：
表4基因克隆反应体系
反应程序为：95℃10min，95℃30s，58℃30s，72℃2min，72℃10min，循环35次。反应结束后，制作琼脂糖凝胶电泳跑胶，120V电压下电泳进行20min，在紫外凝胶成像系统上观察结果。
然后将克隆到的DNA片段连入到全式金公司的克隆载体(
-Blunt CloningKit)中送至测序公司测序，将克隆的DNA片段连入克隆载体中的反应体系如下(表5)：
表5基因片段与克隆载体连接反应体系
反应程序为：22℃30min，立即置于冰上或4℃
然后转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆送至公司测序，待测序结果返回使用Geneious4.8.4进行序列比对确认无突变后，利用限制性内切酶和T4 DNA连接酶的方法将基因克隆到pBI121载体中。利用限制性内切酶同时将测序正确的含DNA片段的克隆载体和pBI121表达载体同时做酶切反应，酶切反应体系如下(表6)：
表6限制性内切酶酶切载体反应体系
反应程序：37℃水浴锅中酶切1h，然后利用胶回收试剂盒(Thermo FisherScientific)分别回收DNA片段以及载体。
胶回收步骤如下：
(1)首先在琼脂糖凝胶成像系统上分别将DNA片段和载体从琼脂糖凝胶中切下，分别置于干净的离心管中。
(2)加入溶胶液(Binding Buffer)于55℃水浴锅中加热10min至琼脂糖胶彻底溶解。
(3)离心管中加入硅珠后充分混匀，于55℃水浴锅中加热5min。
(4)于离心机上12000rpm离心5min。
(5)除去上清液后，加入Washing Buffer清洗2遍。
(6)除去多余底部液体，于室温(约10min)晾干，充分晾干酒精后，加入一定量的ddH2O水溶解。
胶回收完毕后，在Nanodrop 2000上测浓度，按照摩尔质量比约3:1的量加入PCR管中，再加入T4 DNA连接酶连接，具体反应体系如下(表7)：
表7 T4 DNA连接酶反应体系
反应程序：16℃水浴中过夜连接，然后转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆进行PCR鉴定。
1.3.8农杆菌转化
过表达载体构建完毕后，将四个过表达载体质粒转化到农杆菌中，经过PCR鉴定后供烟草遗传转化实验使用。
质粒转化农杆菌感受态细胞：
将构建完毕的携带目的基因的过表达载体转入大肠杆菌感受态细胞中用于植物的遗传转化使用。
(1)首先从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态(GV3101)细胞于冰上融化，每管农杆菌感受态细胞中加入5μL质粒(约1μg)，使用枪头轻轻旋转，边加入边旋转使质粒与感受态细胞混匀，于冰上静置30min。
(2)将上述混有感受态和质粒的离心管轻轻置于液氮中冷冻5min，随后立即置于37℃水浴锅中静置5min，置于冰上静置2min，然后在超净台中加入500μL无抗性的LB培养液，置于28℃摇床中培养1h，转速约为170rpm。
(3)将离心管置于离心机中4000rpm离心2min进行富集，去掉400μL的上清液，剩余100μL的液体使用移液枪重悬，均匀涂布在含有利福平霉素和卡那霉素的LB平板上，倒置于28℃恒温培养箱中培养2天。
(4)挑取单克隆扩大培养后，进行菌液PCR鉴定，将阳性克隆保存，并加入等体积40％甘油保存于-80℃冰箱中。
1.3.9烟草遗传转化及转基因植株筛选
将四个过表达载体通过农杆菌转化法转化到烟草内，具体遗传转化方法及操作步骤如下：
(1)首先将烟草(云87)种子置于1.5mL离心管中，加入1mL 5％次氯酸钠溶液于室温放置10min进行种子消毒，再用灭菌的蒸馏水洗5遍，再加入0.1％的琼脂糖重悬，置于4℃冰箱中春化2天。
(2)将经过春化后的种子置于1/2MS培养基中，置于恒温植物培养箱中，温度设置为25℃，在培养箱中培养7天后，待种子发芽后烟草小苗长到4叶期的时候，将小苗移到土中继续生长。
(3)按照营养土：蛭石＝3:1的比例将土拌均匀，将烟草小苗转移到拌好的土中置于16h光照、8h黑暗的植物培养室，温度保持在25℃左右培养。
(4)待植物生长至6叶期，叶片膨大的时候，用剪刀取烟草新长出的幼嫩叶子置于三角瓶中，加入5％次氯酸钠溶液保持10min在室温下进行叶片表面消毒，期间不断摇晃，充分消毒，使用灭菌蒸馏水清洗5遍。
(5)使用灭菌的剪刀将烟草叶片剪成1cm×1cm的小块，避开叶脉部分，待侵染。
(6)转化前4天先将-80℃冰箱中保存的待转化的农杆菌在LB平板上划线，进行活化，于28℃培养箱中培养2天，挑取单克隆，经过菌液PCR鉴定后待用。
(7)转化前1天将鉴定过的农杆菌转移至100mL的含有卡那霉素和利福平霉素抗性的LB培养液中在28℃摇床中进行扩大培养，过夜摇菌。
(8)转化当天使用紫外分光光度计不断检测农杆菌菌液吸光值，待OD600＝0.5时停止摇菌，将菌液转入50mL离心管中，4000rpm离心15min进行集菌，去上清后使用转化液重悬农杆菌待使用。
(9)将准备好的烟草叶片小块全部置于待转化的农杆菌转化液中，将叶片重复与菌液接触，转化时间5min，然后使用灭菌蒸馏水洗5遍，置于干净的滤纸上吸干叶片表明的水分。
(10)将叶片放置在共培养培养基中，黑暗处理，放置在25℃培养箱中处理3天。
(11)将叶片夹出置于头孢水中进行消毒2min，然后使用灭菌蒸馏水清洗5遍，在灭菌滤纸上吸干水分后，将叶片正面朝上，置于含有卡那霉素(50mg/L)抗性的筛选培养基(NAA、6-BA)中，于25℃植物培养室中进行培养20天。
(12)待叶片边缘分化出愈伤组织后，根据植物分化情况进行继代培养。待分化出的芽长出茎后，用刀将单个芽切下，然后置于生根培养基(NAA)中培养30天。
(13)待烟草单株生根后，将烟草从培养基中转移至营养土：蛭石＝3:1的土中，置于16h光照、8h黑暗的植物培养室，温度保持在25℃左右培养。
1.3.10植物总DNA提取(CTAB法)
使用CTAB法提取文冠果和烟草中的植物总DNA，文冠果DNA被用来克隆基因使用。提取烟草DNA被用来鉴定转基因株系，检测是否转基因成功。
1.3.11检测转基因植株引物设计
针对烟草转基因株系设计特异性检测引物，在DNA层面上，使用PCR方法在烟草总DNA中检测转基因载体DNA，特异性引物一条设计为载体片段，另一条设计在目的基因的DNA序列中，用于检测转基因阳性株系。在RNA层面上，使用RT-PCR的方法在烟草总cDNA中检测目的基因在野生型和转基因株系中的表达水平，实现对转基因烟草株系的鉴定，设计的特异性引物如下表所示(表8)：
表8用于检测烟草转基因株系的引物
1.3.12转基因烟草叶片花青素的提取与测定
将待测样品四个XsMYB113基因的转基因株系及野生型烟草使用1％盐酸甲醇溶液的方法提取花中总花青素，并使用紫外分光光度计测定吸光值。
二、结果与分析
2.1花青素相关MYB转录因子分析
文冠果花色渐变过程是一个花青素积累的过程，我们首先分析了文冠果基因组中有关花青素调控的转录因子。我们在文冠果基因组中一共找到四个MYB基因在进化上与已知其他物种中能够调控花青素的基因具有最近的亲缘关系。它们的基因号分别是EVM0022315、EVM0000778、EVM0004297和EVM0021961，我们定位了这四个基因所处在文冠果基因组中的位置，结果如图1所示，这四个基因的位置都分布于文冠果12号染色体臂上，并且是连续排列的。
我们将文冠果中的这四个基因和拟南芥的四个MYB转录因子蛋白序列比对并构建进化树后发现，文冠果的四个MYB转录因子都与拟南芥AtMYB113基因聚在同一分支，亲缘关系最近。于是我将文冠果中的四个MYB转录因子基因分别命名为XsMYB113-1(EVM0022315)、XsMYB113-2(EVM0000778)、XsMYB113-3(EVM0004297)和XsMYB113-4(EVM0021961)。综上所述，这四个基因可能就是在文冠果中调控花青素生物合成的MYB转录因子基因。
XsMYB113-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。XsMYB113-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。XsMYB113-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。XsMYB113-4的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
2.2 XsMYB113基因簇结构及表达分析
通过生物信息分析的方法可知文冠果四个XsMYB113转录因子基因在文冠果12号染色体上形成一个基因簇，经过进一步对这些基因附近的序列比对分析后，如图2所示，我们发现这些基因附近存在不同种类的转座子元件(表9)，它们的长度也都各不相同。其中，XsMYB113-1基因的启动子区域存在一个RTE类型的non-LTR转座子，其长度约为350bp。XsMYB113-2基因的启动子区域存在一个hAT类型的DNA转座子，其长度约为2.6kb。此外，XsMYB113-4基因的启动子区域也存在一个Polinton类型的DNA转座子，其长度约为440bp。经过分析，文冠果这四个XsMYB113转录因子基因在文冠果12号染色体上与转座子相互穿插，形成一个基因-转座子簇。
表9 XsMYB113/TE基因簇及ROS1基因附近转座子注释信息
通过对文冠果这四个XsMYB113转录因子基因的氨基酸序列比对，如图3所示，我们发现这四个基因属于R2R3型的MYB转录因子，并且这四个基因都含有完整的R2和R3保守结构域，说明这四个基因都具有发挥其正常功能的潜力。并且四个基因的氨基酸序列相似度较高，总体相似性为67.2％。
通过提取转录组中数据来获得文冠果在花色渐变过程中(S1–S4)，四个XsMYB113转录因子基因的转录水平。结果发现，如图4所示，从转录丰度的变化趋势上看，四个基因的转录丰度变化趋势都是先上升，到S4时期时降低。再从转录丰度的大小来看，XsMYB113-1和XsMYB113-2的转录丰度最大值在整体上高于XsMYB113-3和XsMYB113-4两个基因。为了验证转录组测序的结果，使用RT-PCR验证四个XsMYB113转录因子基因的转录水平，如图5所示，实验验证的四个基因的转录水平变化趋势与转录组测序的结果一致，都是S1到S3时期转录水平增加，S4时期下降。文冠果这四个XsMYB113转录因子基因的表达水平的变化趋势与花色渐变过程中花青素的积累正相关，说明这些基因可能都参与了在文冠果花色渐变过程中花青素的生物合成过程。
此外，如图6所示，已有研究表明，在其他物种中已有实验证据表明MYB113基因编码R2R3型MYB转录因子，可以与其他类型的转录因子结合形成复合体来转录激活花青素合成通路(ABP)中的结构基因，其中包括F3'H和DFR基因。
2.3 XsMYB113基因功能分析
为了进一步验证文冠果XsMYB113基因功能，我们在野生型文冠果中通过提取总RNA，经反转录成cDNA后，设计引物并克隆了四个XsMYB113基因的CDS序列，将它们分别构建到pBI121载体中，并将这些载体使用叶盘转化法转入烟草植物体中，对比烟草野生型，观察过表达四个文冠果XsMYB113基因的烟草表型，看是否在转基因烟草体内有花青素的积累。在烟草组织培养的过程中，在含有抗生素的筛选培养基上分化了20天左右，我们观察到在过表达XsMYB113-1基因的载体分化出的愈伤组织中观察到了部分愈伤组织的颜色变成紫红色，如图7所示，但是在转入了其他三个基因的过表达载体分化出来的愈伤组织中，我们观察到没有紫红色愈伤的出现或者没有其他颜色的变化。
待烟草分化成独立植株后，通过提取转基因烟草的基因组DNA，设计特异性引物，利用PCR鉴定转基因烟草中的载体标签来鉴定转基因阳性植株。结果，yun87-p35S::XsMYB113-1转基因株系中共获得18株转基因阳性植株，yun87-p35S::XsMYB113-2转基因株系获得16株阳性个体，yun87-p35S::XsMYB113-3共获得15株转基因阳性株系，yun87-p35S::XsMYB113-4转基因株系中共获得16株阳性植株(图8)。并且提取四个XsMYB113基因过表达烟草转基因株系总RNA，反转录后利用RT-PCR检测野生型和转基因株系中的XsMYB113基因表达量，结果显示，四个文冠果XsMYB113基因的转录水平在各转基因株系中都处于较高水平，对照野生型烟草中没有表达(图9)。
鉴定完转基因株系后，我们对过表达XsMYB113基因的烟草进行了表型观察和对比，如图10和图11所示，在成熟植物中，超表达文冠果XsMYB113-1转基因株系具有合成大量花青素的能力，具体表型为在烟草植株整体上都大量合成了花青素，转基因株系植物的根、茎、叶片、花中都积累的大量的花青素，在超表达XsMYB113-1基因株系的种皮中也合成了大量花青素，相比野生型种皮表型出紫红色的表型。我们在观察转基因株系花的表型时发现，在超表达XsMYB113-1的转基因株系烟草的花中也显著合成了大量的花青素。如图12和图13所示，通过分别提取转基因株系叶片和花中的花青素，并测量花青素的含量，我们发现超表达XsMYB113-1的转基因株系中叶片和花中的花青素含量远远高于野生型，并且在四种XsMYB113基因过表达株系中的花青素含量也是最高的，实际花青素的测量值结果与表型观察一致。同时，我们通过表型观察发现，在超表达文冠果XsMYB113-4的转基因株系中，当烟草植株生长到一定时期后，随着叶片的逐渐扩大、成熟，叶片的外缘叶尖的部分会首先发生颜色的变化，表现为在叶边缘处先积累了一定量的花青素，是叶片颜色发生改变。随着叶片的逐渐生长，绿色的叶片中全部都会积累一定量的花青素，变成浅紫红色。再随着叶片的衰老，叶片中的叶绿素逐渐降解后，叶片中还保留了一定量的花青素，此时的叶片颜色表型为浅紫红色。虽然我们在超表达文冠果XsMYB113-4的转基因成熟植株中观察到了花青素积累，但是我们在其组培再生过程中，没有观察到类似于超表达文冠果XsMYB113-1转基因株系的愈伤组织会变成紫红色的表型。但是经过对XsMYB113-4的转基因成熟植株中花和叶片内的花青素测量，我们发现，对比野生型，三个独立的转基因株系在叶片和花中都合成了大量的花青素，但是XsMYB113-4的转基因株系花中的花青素含量没有XsMYB113-1中合成的多，但是含量高于XsMYB113-2和XsMYB113-3转基因株系。随后，我们观察了超表达XsMYB113-2和XsMYB113-3基因的转基因烟草表型，结果发现在二者成熟的转基因株系的植物体中没有出现颜色的变化，但是在XsMYB113-2和XsMYB113-3转基因株系花中出现了比野生型花的颜色更红的表型，尤其是在XsMYB113-2的转基因株系中。在对这两个转基因株系进行叶片和花中的花青素总量的提取和鉴定过程中发现，如图12和图13所示，过表达XsMYB113-2和XsMYB113-3的转基因株系成熟植物叶片表型与野生型一致，且都没有检测到花青素。但是在这两个基因的转基因株系花中都检测出花中的花青素含量均高于野生型烟草花中的花青素含量，但是比XsMYB113-1的转基因株系花中花青素含量少。但是，仅仅通过表型观察我们无法确认相比野生型过表达XsMYB113-2和XsMYB113-3的转基因株系中是否有花青素含量的增加。
此外，为了探究外源的文冠果MYB转录因子被转入到烟草体内所引起的内源花青素大量的积累是否与烟草内源调控花青素的MYB转录因子的表达相关，当烟草中外源MYB表达后，是否会产生同源序列之间的相互作用，导致激发烟草内源的MYB基因表达，造成花青素的积累。根据之前的报道，我们针对烟草中能正调控花青素的内源MYB转录因子NtAN2基因设计了RT-PCR引物，检测并比较其在四种烟草转基因株系和野生型烟草中的表达量是否有差异，以NtEF1α作为内参基因。但RT-PCR结果显示，NtAN2基因的表达在野生型和四种转基因株系中均未检测到任何表达量(RT-PCR未检测到，结果未展示)，表明四个文冠果XsMYB113转录因子基因都没有与NtAN2发生同源基因间的相互作用，外源的文冠果XsMYB113基因不会影响烟草内源基因NtAN2的表达。这个结果说明XsMYB113-1可能是一个在文冠果中调控花青素非常关键的基因。
综上，通过在烟草中分别异源过表达文冠果四个XsMYB113基因，我们可以得出，这四个基因都有正调控花青素合成的能力，但是四个基因的调控能力不同，其中文冠果XsMYB113-1基因调控花青素合成的能力最强，XsMYB113-3最弱。
此外，为了分析过表达文冠果四个XsMYB113基因在烟草中表达的遗传稳定性，我们收到了各个基因的转基因T0代株系的种子，将种子灭菌后种到含有抗生素的1/2MS培养基上催芽。如图14所示，通过对10天大小的各基因转基因株系幼苗表型观察，发现文冠果XsMYB113-1基因转基因株系幼苗中仍然表型出紫红色的表型，植物叶片、下胚轴和根部均有花青素的合成。而XsMYB113-2、XsMYB113-3和XsMYB113-4基因的转基因株系幼苗表型与野生型一致，没有明显颜色变化。
我们在文冠果中通过与不同物种中能够调控花青素的MYB基因构建系统进化树后，最终确认了文冠果中只有四个MYB基因与这些已有研究表型能够调控花青素的转录因子亲缘关系最近，处于同一进化枝中，并且四个基因都属于R2R3型MYB转录因子，在染色体上串联在一起形成基因簇。保守域分析发现四个蛋白序列中R2、R3保守域的结构都很完整，这说明了它们潜在功能上的完整性。在文冠果花色渐变过程中，四个基因的表达丰度都随着花青素的积累而增加，表明了它们都可能参与了花青素的生物合成过程。随后，对四个R2R3型MYB转录因子在烟草中进行异源表达证明了它们的功能，与野生型烟草相比，每个基因的过表达株系中都积累了不同水平的花青素，说明这四个基因在文冠果中都能够正调控花青素的合成。在过表达XsMYB113-1基因的烟草过表达株系中的花青素含量是最高的，并且在文冠果花色渐变过程中的转录丰度相对其他三个基因也是较高的，说明XsMYB113-1基因在文冠果花色渐变过程中起主要调控花青素合成的作用。
在验证文冠果四个XsMYB113基因功能时，我们分别构建四个基因的超表达载体转入烟草中进行异源表达检测，结果我们发现XsMYB113-1基因的烟草转基因株系中合成了大量花青素，而其他三个基因的过表达株系中只在烟草花中检测到了花青素的积累。在过表达了XsMYB113-1的烟草组培再生过程中，我们发现在一些以愈伤组织中也会积累花青素，一直到分化出幼苗直至整个生长发育阶段都有大量的花青素积累。与此不同的是，我们观察到虽然XsMYB113-4的烟草转基因株系植物体和花中都有较多花青素的合成，但是在过表达XsMYB113-4的烟草组培再生过程中，没有观察到在愈伤组织或者分化出的幼苗中有花青素的积累，但是当幼苗生长到一定的阶段后，在转基因植物的叶片外边缘开始逐渐积累花青素，并逐渐扩散在整片叶子中都有合成。同样，在转基因植物的茎中，新长出来的幼嫩的茎中没有观察到花青素的合成，当植物生长到一定的阶段时，茎基部出现了花青素的积累。所以我们推测，XsMYB113-4基因在文冠果中调控花青素的合成可能是具有很强的特异性。此外，我们观察了XsMYB113基因在转基因烟草中的遗传稳定性，结果XsMYB113-1的T1代幼苗中可以观察到仍然有大量的花青素合成，而在XsMYB113-4的T1代10天的幼苗中我们没有发现任何花青素的积累表型，与组织培养过程中所观察到的结果一致。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.如下(1)-(4)任一项所述的物质在提高植物花瓣中花青素的含量中的应用，
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的文冠果蛋白；
(2)编码所述文冠果蛋白的DNA分子；
(3)含有所述DNA分子的载体；
(4)含有所述DNA分子的微生物菌株。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过提高所述文冠果蛋白的表达来提高植物花瓣中花青素的含量。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
4.一种提高植物花瓣中花青素的含量的方法，其特征在于，包括使所述植物中氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的文冠果蛋白的表达量提高的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括：
(1)将如SEQ ID NO.9所示的DNA分子连接到表达载体中，得到重组载体；
(2)将所述重组载体通过农杆菌转化法转化到植物植株中，得到含有所述DNA分子的转基因植株。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述DNA分子的获得方法包括：
(1)从文冠果花样品中提取得到总RNA，并反转录得到cDNA；
(2)以所述cDNA为模板，采用SEQ ID NO.1-2所示的引物对，进行PCR扩增，得到所述DNA分子。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：cDNA1.0μL，5×Reaction Buffer 4.0μL，High Pure dNTP 0.5μL，10μM上游引物0.2μL，10μM下游引物0.2μL，Q5 Polymerase 0.2μL，ddH2O 13.9μL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95℃10min，95℃30s，58℃30s，72℃2min，72℃10min，循环35次。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pBI121载体。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116555328A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-08-08 | 东北林业大学 | 文冠果XsMYB113-1基因在植物遗传转化体系建立中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110099668A1 (en) * | 2007-05-01 | 2011-04-28 | Jasbir Singh | Expressing GLK in plants |
| CN110066326A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-07-30 | 山东师范大学 | 调控植物花青素合成的盐芥转录因子EsMYB41及其编码基因和应用 |
| CN113621039A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-11-09 | 云南农业大学 | 花色苷合成相关蛋白IbMYB113及其编码基因与应用 |
| CN115011612A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-09-06 | 洛阳师范学院 | 促进植物器官产生花青素的色泽基因ZjFAS2及其应用 |
-
2022
- 2022-09-05 CN CN202211076896.2A patent/CN115960189B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110099668A1 (en) * | 2007-05-01 | 2011-04-28 | Jasbir Singh | Expressing GLK in plants |
| CN110066326A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-07-30 | 山东师范大学 | 调控植物花青素合成的盐芥转录因子EsMYB41及其编码基因和应用 |
| CN113621039A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-11-09 | 云南农业大学 | 花色苷合成相关蛋白IbMYB113及其编码基因与应用 |
| CN115011612A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-09-06 | 洛阳师范学院 | 促进植物器官产生花青素的色泽基因ZjFAS2及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MENGKE WANG等: "Integrated transcriptomics and metabolomics analysis to characterize the optimal picking time in yellowhorn (Xanthoceras sorbifolium) flowers", 《INDUSTRIAL CROPS & PRODUCTS》, 22 July 2022 (2022-07-22), pages 1 - 9 * |
| 樊松乐;王纪坤;谢贵水;王萌;王立丰;: "R2R3型MYB转录因子HbMYB88结构和功能分析", 植物研究, no. 01, 31 December 2020 (2020-12-31), pages 108 - 118 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116555328A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-08-08 | 东北林业大学 | 文冠果XsMYB113-1基因在植物遗传转化体系建立中的应用 |
| CN116555328B (zh) * | 2023-05-12 | 2024-06-14 | 东北林业大学 | 文冠果XsMYB113-1基因在植物遗传转化体系建立中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115960189B (zh) | 2024-05-17 |
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