CN115011612A

CN115011612A - 促进植物器官产生花青素的色泽基因ZjFAS2及其应用

Info

Publication number: CN115011612A
Application number: CN202210752899.7A
Authority: CN
Inventors: 李世鹏; 陈叶
Original assignee: Luoyang Normal University
Current assignee: Luoyang Normal University
Priority date: 2022-06-28
Filing date: 2022-06-28
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2042-06-28
Also published as: CN115011612B

Abstract

本发明公开了一种促进植物器官产生花青素的色泽基因ZjFAS2基因及其应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。同源瞬时转化白熟期枣果实时，果皮由浅绿色变为红色；异源转化烟草时，烟草花瓣中花青素含量显著性提高。本发明首次克隆的ZjFAS2基因与其编码的蛋白，促进果实和花瓣的花青素积累，本发明对于丰富现有花青生物合成途径的调控网络、解析枣果实色泽形成分子调控机理、改良枣果实的品质等具有重要的意义。

Description

促进植物器官产生花青素的色泽基因ZjFAS2及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种促进植物器官产生花青素的色泽基因ZjFAS2及其应用。

背景技术

叶绿素、类胡萝卜素和类黄酮类色素是决定果实颜色的三大类植物色素，果皮的颜色是各类色素综合作用的结果。花青素属于类黄酮类物质，在自然状态下，花青素在植物体内常以糖苷的形式存在，由于糖的种类、数量和结合位置的不同形成各式各样的花色苷。

花青素合成起始于苯丙氨酸代谢途径(Phenylpropanoid pathway)，在苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia Lyase,PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(Cinnamate 4-hydroxylase，C4H)、4-香豆醇辅酶A连接酶(4-coumaryol CoA ligase,4CL)的作用下生成对-香豆酰辅酶A(p-Coumaroyl CoA)。对-香豆酰辅酶A在查尔酮合酶(Chalcone Synthase,CHS)和查尔酮异构酶(Chalcone Isomerise,CHI)的作用下合成黄烷酮柚皮素(Naringenin)。黄烷酮柚皮素在黄烷酮-3-羟化酶(Flavanone 3-hydroxylase,F3H)/黄烷酮-3’-羟化酶(Flavanone-3’-hydroxylase,F3’H)/黄烷酮-3’5’-羟化酶(Flavanone-3’5’-hydroxylase,F3’5’H)，二氢黄酮醇-4-还原酶(Dihydroflavonol 4-reductase,DFR)和花青素合成酶(Anthocyanin Synthase,ANS)的作用下合成花青素(Anthocyanidins)。随后，经过一系列的糖基化、甲基化、酰基化修饰后形成稳定的花青素苷(Anthocyanins)。最后由液泡转运蛋白将花青素苷转运到液泡中储存。

R2R3-MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40蛋白是花青素合成的主要调控因子。MYB、bHLH转录因子可结合在花青素合成酶的启动子上激活花青素合成基因的活性。WD40蛋白为转录因子MYB、bHLH相互作用提供支架平台，并促进MYB、bHLH转录因子的活性。MBW复合体(MYB-bHLH-WD40,MBW complex)通过调控合成酶基因的转录水平影响花青素在植物不同发育时期、不同组织的积累。目前，有关花青素调控机理的研究主要集中在MYB和bHLH转录因子的研究，而有关WD40蛋白的研究较少。

WD40蛋白是指具有WD40结构域的一类蛋白质。典型的WD40结构域由多个WD40重复序列组成，每个重复序列由40-60个氨基酸组成，N端以甘氨酸-组氨酸开始，C端以色氨酸-天冬氨酸终止。WD40蛋白广泛存在于真核生物中，在多种细胞功能中发挥了重要作用，例如免疫反应、染色质重塑、细胞壁形成、转录调控、蛋白酶体降解、细胞骨架组织等。目前，有关植物WD40蛋白调控花青素生物合成的研究主要涉及两类WD40蛋白。第一类是TTG1及其同源蛋白。在拟南芥中，TTG1蛋白与MYB转录因子(PAP1/2、GL1、MYB5、MYB75、MYB113/114)、bHLH转录因子(GL3、EGL3、TT8)相互作用形成MBW复合物，进而激活花青素生物合成途径。矮牵牛(AN11蛋白)、玉米(PAC1蛋白)、紫苏(PFWD蛋白)、葡萄(WDR1/2蛋白)等植物中的TTG1同源蛋白展现出相似的调控模式。第二类是COP1及其同源蛋白。COP1是光诱导植物生长发育的关键调控因子，通过与上游光受体蛋白(CRYs、PHYs和UVR8)和下游目标蛋白(HY5、MYB)相互作用调节植物花青素的积累。

现有研究表明，红枣色素主要是类黄酮类物质。花青素属于类黄酮类物质，是使植物的花、果、叶、茎等呈现蓝、紫、红等颜色的化学成分。花青素合成基因ZjANS和ZjUFGT在枣果成熟期花青素的积累过程中发挥了重要作用。ZjDFR参与调控采后枣果实色泽变化过程。ZjMYB5、ZjTT8和ZjWDR3(ZjTTG1)可协同激活ZjANS和ZjUFGT启动子的转录活性。ZjMYB108基因可能参与调控枣果花青素生物合成。目前，有关枣果实色泽分子调控机理的研究报道较少，且主要集中在同源基因的分析、克隆和异源功能验证，缺乏对枣果自身色泽调控关键基因的筛选与功能研究。

FAS2属于WD40基因家族。已报道的FAS2的基因功能包括：①FAS2和FAS1、MSI1组成蛋白质复合体CAF-1，该蛋白质复合体参与维持芽和根顶端分生组织的稳定和功能。②FAS2的突变导致拟南芥中同源重组和T-DNA整合的频率增加。目前，尚无该基因参与花青素调控的报道。

发明专利2021111777127公开了一种促进植物器官产生红色色泽的PpHSP20-like1基因及其应用。该发明的PpHSP20-like1基因是一个热激蛋白基因，完整编码框长度为1179个碱基，编码蛋白含393个氨基酸。PpHSP20-like1异源转化拟南芥使叶片和花萼变红，花色苷含量从无到有；同源瞬时转化白肉桃果实，果肉变红，该发明首次克隆的PpHSP20-like1基因与其编码的蛋白促进如果实红肉色泽形成，结果对于丰富红肉色泽成因基础理论、开发分子标记、改良现有红肉桃缺陷、提高优质红肉桃育种效率等实际应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进植物器官产生花青素的色泽基因ZjFAS2。

本发明的再一目的在于提供上述基因编码的蛋白。

本发明的再一目的在于提供上述蛋白及编码基因的应用。

根据本发明具体实施方式的促进植物器官产生花青素的色泽基因ZjFAS2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

ATGAAAGGAGGAACCGTCCAGATCAACTGGCACGAAACCAAACCAGTCTTAACCCTTGATTTCCACCCAGTCTTTGGTATTCTTGCCACCGGTGGCGCCGATTTCGACATCAAGCTTTGGTCAATAAAATCTGCTGATGCAGAGAACAATGTTCCAACAGTTTCATATCAAAGTAGTCTTTCTTACCACACTGCAGCTGTAAATGTCATCCGATTCTCGCCATCTGGAGAGCAACTTGCCTCTGGTGCTGATGGAGGTGAGATGATCATATGGAAGTTACATCCTACAGAAACTGGTCAAACATGGAAGGTTCTTAAGACGCTATCATTTCACCGCAAGGATGTTCTGGATTTAGAGTGGTCTACTGATGGTTCATTTCTCATATCTGGATCAGTTGATAATTCTTGCATCATATGGGATGTGAACAAAGGTTCTGTCCATCAGATTTTGGATGGCCATTTCCATTATGTTCAAGGTGTGGCATGGGATCCATTAGAGAAGTATGTTGCTTCCCTTAGTTCGGATAGATCCTGCAGAATATATGTCAATAAGCCTCAAACAAAAGCAAAAGGCATTGAGAAGATGACTTATGCTTGTCAGCATGTAATAATAAAGGCAGAACAGCCAATGGCTGATGATAAGGCTTTGAGAAGCCATCTCTTCCATGATGAGACATTGCGCTCTTTCTTCCGCAGATTAGCCTGGTCACCTGAAGGATCATTTTTACTTGTTCCAACAGGATCTTACAAAATTTCAGCTGCACTTGAATCCATAAACACAGCATATATTTTCTCTCGGAAAGACCTTTCTAGGCCCACTATACAGCTTCCTGGTGCCAGTAAACCTGTTGTAGCCGTTCGATTTTGTCCTCATCAATTTAGCCTTCGGGGATCAGATCCATCTGGATTCTTCAATCTCCCTTATCGTCTCATTTTTGCGGTGGCCACTTTGAATTCTTTGTATATTTATGACACAGAGAGCATTACTCCAATTACAATCTTGGCTGGTCTTCATTATGCGGCCATAACTGACATTGCTTGGTCATCTGATGCCCGTTATCTAGCATCATCCTCGCAAGATGGTTACTGCACCTTGTTAGAATTTGATGGTGATGAGCTCGGTACACCCATTGTTTTATCAGAACAAAAGAAAGTCATGGGAGATGAAAAGATAAACCCTGTTCAGATGCCTGAGAACATGGTAATTGAAGCAACTACAAATGATGGTCACATTTCAGCAAATAACACGCCAATGGAAGCAGATGGTGACGTGGTGAAACAAGAATCACCAAGCTCCTCGAAGACTCCCATCGTGAATAAGCCCACAAAGAGGCGGATTACACCTATGGCTATTGATCCATGA

本发明发现，ZjFAS2瞬时表达果实中的花青素含量显著性提高，且ZjFAS2基因的表达量与花青素含量呈显著正相关。烟草遗传转化实验也表明，ZjFAS2基因的表达能够显著提高转基因阳性单株花瓣中的花青素含量。上述实验结果证明ZjFAS2基因可以促进植物器官产生花青素。

本发明还提供上述ZjFAS2基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

MKGGTVQINWHETKPVLTLDFHPVFGILATGGADFDIKLWSIKSADAENNVPTVSYQSSLSYHTAAVNVIRFSPSGEQLASGADGGEMIIWKLHPTETGQTWKVLKTLSFHRKDVLDLEWSTDGSFLISGSVDNSCIIWDVNKGSVHQILDGHFHYVQGVAWDPLEKYVASLSSDRSCRIYVNKPQTKAKGIEKMTYACQHVIIKAEQPMADDKALRSHLFHDETLRSFFRRLAWSPEGSFLLVPTGSYKISAALESINTAYIFSRKDLSRPTIQLPGASKPVVAVRFCPHQFSLRGSDPSGFFNLPYRLIFAVATLNSLYIYDTESITPITILAGLHYAAITDIAWSSDARYLASSSQDGYCTLLEFDGDELGTPIVLSEQKKVMGDEKINPVQMPENMVIEATTNDGHISANNTPMEADGDVVKQESPSSSKTPIVNKPTKRRITPMAIDP

本发明提供上述基因ZjFAS2在促进植物器官积累花青素中的应用，尤其是在促进烟草花瓣和枣果实花青素积累的应用。

本发明还提供包含上述促进枣果实花青素积累的基因ZjFAS2的重组表达载体，优选为pART-CAM。将本发明的ZjFAS2基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为，将ZjFAS2基因插入到质粒pART-CAM上的Xba I和Xho I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于启动子的下游并受其调控，得到重组表达质粒pART-CAM。

本发明还提供含有促进枣果实花青素积累的基因ZjFAS2的重组菌株，优选为重组农杆菌，例如将含有促进植物器官产生花青素的色泽基因ZjFAS2重组质粒转化农杆菌，即得到含有基因ZjFAS2的重组农杆菌。

本发明还提供上述重组菌株在促进植物器官积累花青素中的应用，尤其是在促进烟草和枣促进烟草花瓣和枣果实花青素积累的应用。

本发明还提供促进植物器官积累花青素积累的方法，所述方法包括在植物中过表达上述促进枣果实花青素积累的基因ZjFAS2的步骤。

根据本发明具体实施方式的促进植物器官积累花青素积累的方法，其中使用的引物序列如下：

P1：5’-ATGAAAGGAGGAACCGTCCAGATC-3’；

P2：5’-TCATGGATCAATAGCCATAGGTG-3’。

根据本发明具体实施方式的促进植物器官积累花青素积累的方法，所述植物包括烟草和枣，本发明中，所述植物的器官包括花瓣、花蕾、幼嫩叶片、果皮、果肉等，具体的包括烟草的花朵和枣果皮、枣树花蕾、枣树幼嫩叶片和枣头。

本发明的有益效果：

1.本发明提供一个新的正调控花青素合成的基因ZjFAS2，其可以促进植物器官花青素的积累，如促进烟草花瓣和枣果实花青素的积累。本发明克隆的ZjFAS2基因丰富现有花青生物合成途径中的调控基因。

2.同源瞬时转化白熟期枣果实中的花青素含量和ZjFAS2基因的表达量呈显著性正相关。本发明有助于更好地了解枣果实红色色泽形成的分子作用机制。

3.ZjFAS2基因属于WD40基因家族，本发明为进一步研究WD40基因家族调控花青素积累提供了数据支持。

4.本发明的ZjFAS2基因应用于枣果实色泽改良，为枣树分子育种提供了新的基因。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示枣果实从坐果开始到果实成熟的7个时期的不同形态；

图2显示扩增ZjFAS2基因cDNA全长PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。M是Marker，泳道2是ZjFAS2基因cDNA全长。

图3显示pClone007 Blunt-ZjFAS2大肠杆菌菌液PCR鉴定阳性克隆琼脂糖凝胶电泳图。M是Marker，泳道1-6是pClone007 Blunt-ZjFAS2大肠杆菌单菌落1-6号菌液PCR产物。

图4显示pART-CAM-ZjFAS2大肠杆菌菌液PCR鉴定阳性克隆琼脂糖凝胶电泳图。M是Marker，泳道1-7是pART-CAM-ZjFAS2大肠杆菌单菌落1-7号菌液PCR产物。

图5显示pART-CAM-ZjFAS2农杆菌菌液PCR鉴定阳性克隆琼脂糖凝胶电泳图。M是Marker，泳道1-6是pART-CAM-ZjFAS2农杆菌单菌落1-6号菌液PCR产物，泳道7是ddH₂O PCR产物，泳道8是pART-CAM-ZjFAS2质粒PCR产物。

图6显示pART-CAM-ZjFAS2转烟草流程图。图A是本氏烟草无菌苗的获得，图B是诱导愈伤，图C是诱导芽分化，图D是生根培养。

图7显示pART-CAM-ZjFAS2转基因烟草PCR鉴定阳性植株琼脂糖凝胶电泳图。M是Marker，泳道1-5是pART-CAM-ZjFAS2转基因烟草PCR产物，泳道6是阴性对照：空载体转基因烟草PCR产物，泳道7是空白对照：ddH₂OPCR产物，泳道8是阳性对照：pART-CAM-ZjFAS2农杆菌菌液PCR产物。

图8显示pART-CAM-ZjFAS2烟草转基因阳性单株和野生型对照株花瓣中总花青素含量。OE1-OE5是pART-CAM-ZjFAS2烟草转基因阳性单株1-5号花瓣中总花青素含量，WT是野生型对照株花瓣中总花青素含量。

图9显示空载体瞬时表达枣果实和pART-CAM-ZjFAS2瞬时表达枣果实表型。CK是空载体瞬时表达枣果实表型，OE1-OE3是pART-CAM-ZjFAS2瞬时表达1-3号枣果实表型。

图10显示空载体瞬时表达枣果实和pART-CAM-ZjFAS2瞬时表达枣果实果皮中总花青素含量。CK是空载体瞬时表达枣果实果皮中总花青素含量，OE1-OE3是pART-CAM-ZjFAS2瞬时表达枣果实1-3号果皮中总花青素含量。

图11显示空载体瞬时表达枣果实和pART-CAM-ZjFAS2瞬时表达枣果实果皮中ZjFAS2的相对表达量。CK是空载体瞬时表达枣果实果皮中ZjFAS2基因的相对表达量，OE1-OE3是pART-CAM-ZjFAS2瞬时表达枣果实1-3号果皮中ZjFAS2基因的相对表达量。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实验材料：

RNA提取试剂盒：TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，宝日医生物技术(北京)有限公司；

cDNA合成试剂盒：PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser，宝日医生物技术(北京)有限公司；

高保真DNA聚合酶；TransStrart FastPfu Fly DNA Polymerase，北京全式金生物技术(TransGen Biotech)股份有限公司；

PCR产物纯化试剂盒：普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司，货号DP209；

质粒pEASY-Blunt：pClone007 Blunt Vector Kit，北京擎科生物科技有限公司；

大肠杆菌感受态细胞：Stellar Competent Cells，宝日医生物技术(北京)有限公司；

回收试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，货号：DP209；

大肠杆菌DH5a感受态细胞：宝日医生物技术(北京)有限公司；

质粒提取试剂盒：质粒小提中量试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；

农杆菌GV3101：宝日医生物技术(北京)有限公司；

DNA提取试剂盒：TransDirect Plant Tissue PCR Kit，北京全式金生物技术(TransGen Biotech)股份有限公司；

荧光定量PCR：TB

Premix Ex Taq^TM II(Tli RNaseH Plus)，宝日医生物技术(北京)有限公司；

实时定量PCR仪：CFX96 Real-Time PCR Detection System(伯乐(Bio-Rad)公司。

本发明以‘蜂蜜罐’(枣果实的着色模式第一类)和‘胎里红’(枣果实的着色模式第二类)着色关键时期的果实为实验材料，进行了生理学、代谢组学和转录组学分析，具体的，

本发明对枣果实形态学观察，将其从坐果开始到果实成熟分为7个时期(图1)。对花青素、叶绿素和类胡萝卜素含量测定，本发明发现花青素是导致果实色泽呈现紫红色的主要因素。

基于总花青素含量测定结果，本发明进一步选择枣果发育关键时期的枣果皮，对其进行了转录组测序。本发明发现多个R2R3-MYB基因、bHLH基因和WD40基因在枣果实不同发育时期呈现出差异表达。将总花青素含量和R2R3-MYB基因、bHLH基因、WD40基因进行相关性分析，本发明发现WD40基因(ZjFAS2)的表达量与总花青素的积累呈现显著相关性。通过枣果实瞬时表达和烟草遗传转化实验，证明ZjFAS2基因正调控花青素的积累。

实施例1 ZjFAS2基因的克隆和序列分析

以‘冬枣’参考基因组LOC107425703序列为参考序列，设计引物(上游引物P1和下游引物P2)用于从‘胎里红’幼嫩紫色果皮中扩增果实色泽相关ZjFAS2基因。

按照RNA提取试剂盒说明书提取‘胎里红’幼嫩紫色果皮总RNA。利用cDNA第一链合成试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA。

以此cDNA为模板，采用上游引物P1(5’-ATGAAAGGAGGAACCGTCCAGATC-3’)和下游引物P2(5’-TCATGGATCAATAGCCATAGGTG-3’)通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR反应体系(50μl)如下：

PCR程序：

取100μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，利用紫外凝胶成像仪看到约为1,300bp的条带，与预期大小一致，如图2所示。

用PCR产物纯化试剂盒回收ZjFAS2基因片段。将该回收纯化的DNA片段与克隆载体质粒pEASY-Blunt按照说明书进行连接。

将得到重组质粒pClone007 Blunt-ZjFAS2转化大肠杆菌感受态细胞，用卡那霉素(50mg/L)标记筛选阳性克隆，并进行菌液PCR鉴定，上游引物P1(5’-ATGAAAGGAGGAACCGTCCAGATC-3’)和下游引物P2(5’-TCATGGATCAATAGCCATAGGTG-3’)，得到含有预期片段大小的条带，如图3所示。

将阳性重组质粒的菌液进行测序。ZjFAS2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包含1362个碱基，编码454个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，分子量为50.062kDa，等电点为6.39。

实施例2 ZjFAS2基因过表达载体的构建

以pClone007 Blunt-ZjFAS2的菌液为模板，采用上游引物P1和下游引物P2通过高保真DNA聚合酶(TransStrart FastPfu Fly DNA Polymerase，北京全式金生物技术(TransGen Biotech)股份有限公司)进行PCR扩增。

P1：5’-ATTTGGAGAGGACACGCTCGAGATGAAAGGAGGAACCGTCCA-3’；

P2：5’-CTCATTAAAGCAGGACTCTAGATCATGGATCAATAGCCATAGGTGT-3’；

PCR反应体系(50μl)如下：

PCR程序：

取100μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，利用紫外凝胶成像仪看到约为1,300bp的条带(图3)，与预期大小一致。用PCR产物纯化试剂盒回收ZjFAS2基因片段。

用Xba I和Xho I双酶切质粒pART-CAM，酶切后，琼脂糖凝胶电泳获取载体大片段对应条带的凝胶，胶回收试剂盒回收酶切产物。

双酶切反应体系：

37℃酶切2.5h；65℃，20min失活。

将目的DNA片段和线性化载体通过T4连接酶连接，通过热激法转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。挑取单克隆进行菌液PCR检测，如图4所示。

随机挑选3管具有预期条带大小的菌液进行测序。根据测序结果选择ZjFAS2基因序列正确的单克隆按照质粒提取试剂盒回收pART-CAM-ZjFAS2质粒，-20℃保存。

采用冻融法，将pART-CAM-ZjFAS2质粒和pART-CAM空载体转化农杆菌GV3101。挑取单克隆进行菌液PCR检测如图5所示，产物片段与预期目的片段大小一致，表明成功获得了具有ZjFAS2基因过表达载体的农杆菌。

实施例3转ZjFAS2基因烟草株系的获得和鉴定

将本氏烟草种子经无菌水冲洗干净，75％乙醇消毒1min，次氯酸钠溶液(有效氯为2％)消毒15min，无菌水冲洗3-5次，无菌滤纸吸干种子表面的水分，接种于LS培养基(pH5.8)上(图6-A)。

将pART-CAM-ZjFAS2甘油菌在LB固体培养基(50mg/L壮观霉素+50mg/L利福平)上划线，28℃培养两天后，挑取单克隆接种到5ml含LB液体培养基(50mg/L壮观霉素+50mg/L利福平)中，28℃，220rpm恒温震荡培养过夜至OD600约为0.6时，5,000rpm离心10min收集菌体，将收集的菌体用MS液体培养基重悬至OD₆₀₀＝0.4。

取无菌嫩叶片，去掉边缘及主脉，再剪成0.5*0.5的小块。将剪好的外植体置于重悬好的农杆菌菌液中，轻柔摇晃5min，用无菌滤纸吸干外植体表面的菌液，将其置于共培养培养基(MS+6-BA 1mg/L，PH 5.8)上黑暗培养2-3天(图6-B)。

共培养后，将外植体转移到芽诱导分化培养基(MS+6-BA 1mg/L+Timentin 300mg/L+Kan 100mg/L，pH5.8)上。诱导生芽，每两周更换一次培养基(图6-C)。

当抗性芽长到2cm时切下，转入生根培养基中(1/2MS+Timentin 300mg/L+IAA0.5mg/L+Kan 100mg/L，pH5.8)，待形成完整小植株(图6-D)。

切取部分叶片，使用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，用上游引物P1(5’-ATGAAAGGAGGAACCGTCCAGATC-3’)和下游引物P2(5’-TCATGGATCAATAGCCATAGGTG-3’)检测阳性植株(图7)。

实施例4烟草转基因阳性株系和空载体对照株花瓣中总花青素含量检测

称取样品花瓣约0.1g，加液氮研磨成粉末。将提取物溶于10mL 1％盐酸-甲醇溶液(v/v)中，4℃孵育24h。然后在4℃下以13,000rpm离心20min。以1％盐酸甲醇溶液作为空白对照，在紫外分光广度计上，用1cm厚比色皿，在波长530nm和A657 nm处测定吸光度。

花青素含量＝(A₅₃₀-0.25×A₆₅₇)×M^-1，其中M是用于提取的植物材料的重量(g)。

结果如图8所示，烟草转基因阳性株系花瓣中总花青素含量显著性高于空载体对照株花瓣中总花青素含量。

实施例5 pART-CAM-ZjFAS2重组表达载体瞬时转化枣果实

含有空载体和pART-CAM-ZjFAS2的农杆菌摇菌至OD₆₀₀值达到0.8-1.0。以6,000rpm离心5min收集菌体，然后用MS液体培养基重悬菌体，OD₆₀₀值调至0.8。使用5mL注射器将悬浮液缓慢注入坐果约60天的‘蜂蜜罐’青色果实中，套袋遮光3天后，去除遮光袋后保持果实继续自然发育。

结果如图9所示，注射pART-CAM-ZjFAS2悬浮液的果实在注射3-7天后出现明显的红色斑块，而注射空载体悬浮液的果实在注射后果实色泽无明显变化。

实施例6空载体和pART-CAM-ZjFAS2瞬时转化枣果皮中总花青素含量检测

称取样品果皮约0.1g，加液氮研磨成粉末。将提取物溶于10mL 1％盐酸-甲醇溶液(v/v)中，4℃孵育24h。然后在4℃下以13,000rpm离心20min。以1％盐酸甲醇溶液作为空白对照，在紫外分光广度计上，用1cm厚比色皿，在波长530nm和A657 nm处测定吸光度。

结果如图10所示，pART-CAM-ZjFAS2瞬时转化枣果皮中总花青素含量显著性高于空载体对照枣果皮中总花青素含量。

实施例7 qPCR检测空载体和pART-CAM-ZjFAS2重组表达载体瞬时转化枣果皮中ZjFAS2基因的表达量

用RNA提取试剂盒提取空载体和pART-CAM-ZjFAS2重组表达载体瞬时转化枣果皮中总RNA，再用cDNA第一链合成试剂盒反转录成cDNA。每个样品的浓度稀释至100ng/μl作为模板，用上游引物：5’-TCCAGATCAACTGGCACGAAACCA-3’和下游引物：5’-ATGTCGAAATCGGCGCCACC-3’进行荧光定量PCR反应。qPCR反应体系(25μl)如下：

如图11所示，qPCR结果表明，ZjFAS2基因在pART-CAM-ZjFAS2瞬时转化枣果皮中的表达量显著性高于空载体对照枣果皮中的表达量。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 洛阳师范学院

<120> 促进植物器官产生花青素的色泽基因ZjFAS2及其应用

<141> 2022-06-24

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1362

<212> DNA

<213> Ziziphus zizyphus

<400> 1

atgaaaggag gaaccgtcca gatcaactgg cacgaaacca aaccagtctt aacccttgat 60

ttccacccag tctttggtat tcttgccacc ggtggcgccg atttcgacat caagctttgg 120

tcaataaaat ctgctgatgc agagaacaat gttccaacag tttcatatca aagtagtctt 180

tcttaccaca ctgcagctgt aaatgtcatc cgattctcgc catctggaga gcaacttgcc 240

tctggtgctg atggaggtga gatgatcata tggaagttac atcctacaga aactggtcaa 300

acatggaagg ttcttaagac gctatcattt caccgcaagg atgttctgga tttagagtgg 360

tctactgatg gttcatttct catatctgga tcagttgata attcttgcat catatgggat 420

gtgaacaaag gttctgtcca tcagattttg gatggccatt tccattatgt tcaaggtgtg 480

gcatgggatc cattagagaa gtatgttgct tcccttagtt cggatagatc ctgcagaata 540

tatgtcaata agcctcaaac aaaagcaaaa ggcattgaga agatgactta tgcttgtcag 600

catgtaataa taaaggcaga acagccaatg gctgatgata aggctttgag aagccatctc 660

ttccatgatg agacattgcg ctctttcttc cgcagattag cctggtcacc tgaaggatca 720

tttttacttg ttccaacagg atcttacaaa atttcagctg cacttgaatc cataaacaca 780

gcatatattt tctctcggaa agacctttct aggcccacta tacagcttcc tggtgccagt 840

aaacctgttg tagccgttcg attttgtcct catcaattta gccttcgggg atcagatcca 900

tctggattct tcaatctccc ttatcgtctc atttttgcgg tggccacttt gaattctttg 960

tatatttatg acacagagag cattactcca attacaatct tggctggtct tcattatgcg 1020

gccataactg acattgcttg gtcatctgat gcccgttatc tagcatcatc ctcgcaagat 1080

ggttactgca ccttgttaga atttgatggt gatgagctcg gtacacccat tgttttatca 1140

gaacaaaaga aagtcatggg agatgaaaag ataaaccctg ttcagatgcc tgagaacatg 1200

gtaattgaag caactacaaa tgatggtcac atttcagcaa ataacacgcc aatggaagca 1260

gatggtgacg tggtgaaaca agaatcacca agctcctcga agactcccat cgtgaataag 1320

cccacaaaga ggcggattac acctatggct attgatccat ga 1362

<210> 2

<211> 453

<212> PRT

<213> Ziziphus zizyphus

<400> 2

Met Lys Gly Gly Thr Val Gln Ile Asn Trp His Glu Thr Lys Pro Val

1 5 10 15

Leu Thr Leu Asp Phe His Pro Val Phe Gly Ile Leu Ala Thr Gly Gly

20 25 30

Ala Asp Phe Asp Ile Lys Leu Trp Ser Ile Lys Ser Ala Asp Ala Glu

35 40 45

Asn Asn Val Pro Thr Val Ser Tyr Gln Ser Ser Leu Ser Tyr His Thr

50 55 60

Ala Ala Val Asn Val Ile Arg Phe Ser Pro Ser Gly Glu Gln Leu Ala

65 70 75 80

Ser Gly Ala Asp Gly Gly Glu Met Ile Ile Trp Lys Leu His Pro Thr

85 90 95

Glu Thr Gly Gln Thr Trp Lys Val Leu Lys Thr Leu Ser Phe His Arg

100 105 110

Lys Asp Val Leu Asp Leu Glu Trp Ser Thr Asp Gly Ser Phe Leu Ile

115 120 125

Ser Gly Ser Val Asp Asn Ser Cys Ile Ile Trp Asp Val Asn Lys Gly

130 135 140

Ser Val His Gln Ile Leu Asp Gly His Phe His Tyr Val Gln Gly Val

145 150 155 160

Ala Trp Asp Pro Leu Glu Lys Tyr Val Ala Ser Leu Ser Ser Asp Arg

165 170 175

Ser Cys Arg Ile Tyr Val Asn Lys Pro Gln Thr Lys Ala Lys Gly Ile

180 185 190

Glu Lys Met Thr Tyr Ala Cys Gln His Val Ile Ile Lys Ala Glu Gln

195 200 205

Pro Met Ala Asp Asp Lys Ala Leu Arg Ser His Leu Phe His Asp Glu

210 215 220

Thr Leu Arg Ser Phe Phe Arg Arg Leu Ala Trp Ser Pro Glu Gly Ser

225 230 235 240

Phe Leu Leu Val Pro Thr Gly Ser Tyr Lys Ile Ser Ala Ala Leu Glu

245 250 255

Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Ile Phe Ser Arg Lys Asp Leu Ser Arg Pro

260 265 270

Thr Ile Gln Leu Pro Gly Ala Ser Lys Pro Val Val Ala Val Arg Phe

275 280 285

Cys Pro His Gln Phe Ser Leu Arg Gly Ser Asp Pro Ser Gly Phe Phe

290 295 300

Asn Leu Pro Tyr Arg Leu Ile Phe Ala Val Ala Thr Leu Asn Ser Leu

305 310 315 320

Tyr Ile Tyr Asp Thr Glu Ser Ile Thr Pro Ile Thr Ile Leu Ala Gly

325 330 335

Leu His Tyr Ala Ala Ile Thr Asp Ile Ala Trp Ser Ser Asp Ala Arg

340 345 350

Tyr Leu Ala Ser Ser Ser Gln Asp Gly Tyr Cys Thr Leu Leu Glu Phe

355 360 365

Asp Gly Asp Glu Leu Gly Thr Pro Ile Val Leu Ser Glu Gln Lys Lys

370 375 380

Val Met Gly Asp Glu Lys Ile Asn Pro Val Gln Met Pro Glu Asn Met

385 390 395 400

Val Ile Glu Ala Thr Thr Asn Asp Gly His Ile Ser Ala Asn Asn Thr

405 410 415

Pro Met Glu Ala Asp Gly Asp Val Val Lys Gln Glu Ser Pro Ser Ser

420 425 430

Ser Lys Thr Pro Ile Val Asn Lys Pro Thr Lys Arg Arg Ile Thr Pro

435 440 445

Met Ala Ile Asp Pro

450

Claims

1.一种促进植物器官产生花青素的色泽基因ZjFAS2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的ZjFAS2基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的促进植物器官产生花青素的色泽基因ZjFAS2在促进植物器官积累花青素中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因ZjFAS2在促进烟草花瓣和枣果实花青素积累的应用。

5.包含权利要求1所述的促进植物器官产生花青素的色泽基因ZjFAS2的重组表达载体。

6.权利要求5所述的重组表达载体在促进植物器官积累花青素中的应用。

7.包含权利要求1所述的促进植物器官产生花青素的色泽基因ZjFAS2的重组菌株。

8.权利要求7所述的重组菌株在促进植物器官积累花青素中的应用。

9.促进植物器官积累花青素积累的方法，其特征在于，所述方法包括在植物中过表达权利要求1所述的促进枣果实花青素积累的基因ZjFAS2的步骤。

10.根据权利要求9所述的促进植物器官积累花青素积累的方法，其特征在于，所述植物包括烟草和枣。