CN110483629A

CN110483629A - 调控植物花色素苷积累的转录因子、重组真核表达载体及应用

Info

Publication number: CN110483629A
Application number: CN201910878096.4A
Authority: CN
Inventors: 钟春梅
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-09-17
Filing date: 2019-09-17
Publication date: 2019-11-22
Anticipated expiration: 2039-09-17
Also published as: CN110483629B

Abstract

本申请公开一种调控植物花色素苷积累的转录因子，所述转录因子为SEQ ID No.1所示的基因序列或该基因序列的同源序列，或者所述转录因子为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的同源序列。一种重组真核表达载体，其包含如前所述的转录因子的基因序列，或者编码如前所述的转录因子的氨基酸序列。如前所述的调控植物花色素苷积累的转录因子在调控植物花色素苷积累、在调控植物花色变浅、在调控植物黄酮醇积累以及在促进植物黄酮醇合成中的应用。本申请的来源于非洲菊的GhMYB1a属于MYB转录因子，参与非洲菊花色调控，具体机理是GhMYB1a促进黄酮醇合成导致花色变浅。

Description

调控植物花色素苷积累的转录因子、重组真核表达载体及应用

技术领域

本申请涉及一种植物次生代谢物调控领域，尤其涉及一种调控植物花色素苷的积累的转录因子、重组真核表达载体及应用。

背景技术

MYB(v-myb avian myeloblastosisi viral oncogene homolog,v-myb禽成髓细胞瘤病毒致癌基因同系物)转录因子是植物中广泛存在的一大类转录因子,在植物生长发育、胁迫应答和此生代谢等方面起着重要的作用。MYB转录因子的N端具有高度保守的DNA结合结构域，又被称之为MYB结构域。1982年，首次从引起禽急性成髓细胞白血病病毒AMV和E26中发现了MYB转录因子基因v-MYB。随后研究者在多种脊椎动物和植物中都发现了MYB的同源基因。

MYB转录因子参与调控植物类黄酮合成，参考图1，类黄酮生物合成途径为苯丙烷类代谢的分支，以苯丙氨酸为前体，通过不同生物合成途径中的催化反应可以生成不同类型的类黄酮，如花色素苷、黄酮醇和原花色素。就花色素苷的合成途径而言，其通常分为三个阶段：前期的苯丙烷途径，中期的类黄酮途径，以及后期的花色素苷特异途径。

花色素苷，又名花青苷，是植物中重要的次生代谢物质，主要分布在植物的花、果实和叶等器官的细胞液泡中，使得植物呈现出从橘红到蓝紫等不同的颜色。对植物而言，花色素苷起着重要的功能，花瓣中的花色素苷使花朵呈色，有助于植物授粉，而果实中花色素苷则在种子传播过程中起着重要的作用。花色素苷在植物抵抗紫外辐射、低温胁迫和干旱胁迫中亦发挥至关重要的作用。对于人类而言，花色素苷的抗氧化性还有益于人类身体健康，如抗癌和抵抗神经及心血管疾病；另外，园艺产业的发展也离不开对观赏性植物的花色和叶色的关注。

转录因子MYB、bHLH(Basic helix-loop-helix)和WD40参与调控植物花色素苷合成。MYB常与bHLH和WD40蛋白形成“MBW”蛋白三元复合体其作用，通过形成复合体共同促进下游花色素苷合成途径关键结构基因表达，从而促进花色素苷合成。除花色素苷合成的激活子外，一些花色素苷合成的抑制子也被发现，而这些花色素苷抑制子多数不用形成“MBW”复合体，可独立作用。

发明内容

本申请的目的是，验证一种MYB转录因子在调控植物花色素苷积累方面的功能，并将其应用在调控植物花色素苷积累的实践中，或者将其应用在调控植物花色变浅的实践中，或者将其应用在调控植物黄酮醇积累的实践中，或者将其应用在促进植物黄酮醇合成的实践中。

为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

一种调控植物花色素苷积累的转录因子，所述转录因子为SEQ ID No.1所示的基因序列或该基因序列的同源序列，或者所述转录因子为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的同源序列。

一种重组真核表达载体，其包含如前所述的转录因子的基因序列，或者编码如前所述的转录因子的氨基酸序列。

所述重组真核表达载体在植物中实现同源转化表达，或实现异源转化表达。

优选地，所述重组真核表达载体在非洲菊中实现同源转化表达。

可选择地，所述重组真核表达载体在非洲菊除外的植物中实现异源转化表达。更优选地，所述重组真核表达载体在烟草和拟南芥中实现异源转化表达。

如前所述的调控植物花色素苷积累的转录因子在调控植物花色素苷积累中的应用。

如前所述的调控植物花色素苷积累的转录因子在调控植物花色变浅中的应用。

如前所述的调控植物花色素苷积累的转录因子在调控植物黄酮醇积累中的应用。

如前所述的调控植物花色素苷积累的转录因子在促进植物黄酮醇合成中的应用。

与现有技术相比较，本申请具有如下优势：

(1)本申请的调控植物花色素苷积累的转录因子不形成“MBW”复合体，能实现调控花色素苷的积累，为园艺领域花色调控提供了一种新的手段。

(2)本申请的调控植物花色素苷积累的转录因子在非洲菊及其同源物种能够发挥作用，在非洲菊的异源物种中同样能够发挥作用，说明该转录因子可以推广至大部分的植物中发挥作用。

(3)本申请的调控植物花色素苷积累的转录因子通过调节黄酮醇的合成来影响花色素苷的积累，为增加一个调控花色的手段提供了必要的条件。

附图说明

图1为植物花色素苷合成途径示意图，其中向上的粗箭头指示出GhMYB1a调控下被上调的基因。

图2为本申请的验证超表达GhMYB1a抑制花瓣花色素苷积累的实验结果。

图3为本申请的GhMYB1a氨基酸序列比对和系统进化树分析结果。

图4为本申请的验证GhMYB1a促进黄酮醇的合成的实验结果。

图5为本申请的GhMYB1a互作蛋白分析结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细描述。

植物花色素苷合成途径为三个阶段(参考图1)：前期的苯丙烷途径，中期的类黄酮途径，以及后期的花色素苷特异途径，具体为：

苯丙烷途径，苯丙氨酸经苯丙氨酸裂解酶催化生成肉桂酸；肉桂酸经肉桂酰羟化酶催化生成香豆酸；香豆酸经香豆酰CoA连接酶催化生成香豆酰CoA；

类黄酮途径，香豆酰CoA和丙二酰CoA在查尔酮合成酶的催化下生成查尔酮；查尔酮在查尔酮异构酶的催化下生成柚皮素；柚皮素经类黄酮3-羟化酶催化生成二氢山奈酚；二氢山奈酚经类黄酮3’-羟化酶催化生成二氢檞皮素；进一步地，二氢山奈酚和二氢檞皮素在黄酮醇合成酶的催化下分别生成山奈酚和檞皮素，山奈酚和檞皮素同属于黄酮醇物质。

花色素苷特异途径，二氢檞皮素在二氢黄酮醇还原酶的催化下生成无色花色素；无色花色素在花色素合成酶的催化下生成花色素；花色素在类黄酮糖基转移酶等糖基转移酶的催化下生成花色素苷；

另外，还有原花色素合成途径，无色花色素在无色花色素还原酶的催化下生成原花色素；花色素在花色素还原酶的催化下也生成原花色素。

实施例一

以金黄色非洲菊(Gerbera hybirda)品种“深圳5号”的舌状花花瓣为材料，克隆了一个MYB转录因子基因，其cDNA序列如SEQ ID No.1所示，命名为GhMYB1a，该GhMYB1a所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述GhMYB1a与收录在NCBI数据库中的芬兰的非洲菊品种Terra Regina的转录因子GMYB1(GenBank登录号AJ554697)的核苷酸序列相似度为99％。本领域技术人员应当理解，GMYB1和GhMYB1a之间为同源序列，相似度越高，功能越相近，由此，可以通过研究GhMYB1a的功能来推及到GMYB1的功能以及GhMYB1a的其他同源序列的功能。

构建GhMYB1a超表达载体并瞬时转化到同源的非洲菊花瓣中,使非洲菊花瓣瞬时超表达GhMYB1a,通过表型分析发现超表达GhMYB1a抑制了非洲菊花瓣花色的形成(图2中的D)。

所述GhMYB1a超表达载体属于人工合成的重组真核表达载体，具体为连接有目的基因(GhMYB1a)的pCamG质粒。本领域技术人员应当理解，根据实验的需要，目的基因(包括但不限于GhMYB1a)可以连接到不同的表达载体上形成包含有所述目的基因的重组真核表达载体，或者该重组真核表达载体能够编码目的基因所编码的氨基酸序列，其所产生的肽链或者蛋白质能在转染细胞内发挥作用。

MYB家族的花色素苷合成抑制子，通常抑制花色素苷合成途径的结构基因如查尔酮合成酶基因、类黄酮3-羟化酶基因、二氢黄酮醇还原酶基因、花色素合成酶基因和类黄酮糖基转移酶基因等的表达。然而，利用qRT-PCR对GhMYB1a超表达非洲菊花瓣中的花色素苷合成途径的结构基因(包括类黄酮3’-羟化酶基因、二氢黄酮醇还原酶基因和花色素合成酶基因)进行表达量分析，与野生型相比，GhMYB1a超表达的非洲菊花瓣中的二氢黄酮醇还原酶基因和花色素合成酶基因表达均上调(图2中的E)。该结果表明，超表达GhMYB1a并不能抑制花色素苷合成途径中的关键结构基因的表达，暗示GhMYB1a可能通过其他途径抑制非洲菊花瓣的着色，而非通过抑制花色素合成关键基因的表达。

进一步地，对GhMYB1a蛋白的氨基酸序列进行深入分析，结果如图3所示，GhMYB1a与拟南芥AtMYB12、AtMYB11和葡萄VvMYBF1同源，并且在其C端含有SG7([K/R][R/x][R/K]xGRT[S/x][R/G]xx[M/x]K)和SGY-2([W/x][L/x]LS)两个保守结构域。进一步地，系统进化树分析结果表明，GhMYB1a与拟南芥R2R3-MYB第7亚家族的MYB转录因子的其中几个基因(如AtMYB11、AtMYB12、AtMYB111)所编码的蛋白质属于同一类蛋白，表明GhMYB1a也属于R2R3-MYB第7亚家族。已有研究表明，拟南芥第7亚家族MYB、葡萄VvMYBF1、龙胆花GtMYBP3等调控黄酮醇的合成。另外，拟南芥的AtMYB12在烟草中异源表达促进了苯丙氨酸裂解酶、查尔酮合成酶、类黄酮3-羟化酶等基因表达，而且AtMYB12超表达烟草的花瓣花色显著下降，该表型与上述GhMYB1a超表达非洲菊花瓣类似。因此，推测GhMYB1a可能与黄酮醇的合成相关。

如图1所示，黄酮醇合成酶(FLS)是黄酮醇合成途径中的关键结构基因，为了解GhMYB1a能否调控类黄酮合成，利用qRT-PCR对GhMYB1a超表达非洲菊花瓣中的黄酮醇合成酶的表达量进行分析。结果如图4的C所示，在非洲菊中超表达GhMYB1a基因导致花瓣中FLS基因表达量显著增加，说明GhMYB1a通过促进FLS的表达，进而促进黄酮醇的合成。另外,实验发现GhMYB1a超表达也引起花色素苷合成以及原花色素合成途径中的结构基因二氢黄酮醇还原酶、花色素合成酶和无色花色素还原酶表达增加，推测是负反馈调节机制所导致的结果，具体是：由于二氢山奈酚和二氢檞皮素都是黄酮醇、花色素苷和原花色素的合成底物，黄酮醇合成途径、花色素苷合成途径和原花色素合成途径会共同竞争底物，当GhMYB1a促进FLS更多地利用底物合成黄酮醇，其他两个合成途径也会通过上调结构基因来共同竞争底物(见图1)。

进一步地，如图5所示，通过BiFC技术(bimolecular fluorescencecomplementation，双分子荧光互补分析技术)发现GhMYB1a自身互作，形成同源二聚体来发挥调控作用，区别于其他通过形成“MBW”三元复合物来发挥作用的MYB转录因子。

实施例二

以烟草材料，构建GhMYB1a超表达载体并且通过叶盘侵染法转化到异源的烟草中，并且成功得到GhMYB1a超表达烟草转基因植株(OE1)，通过表型分析发现，超表达GhMYB1a烟草的花瓣花色变浅(图2中的A)。利用qRT-PCR对GhMYB1a超表达烟草中的花色素苷合成途径的结构基因(查尔酮合成酶基因、类黄酮3-羟化酶基因、类黄酮3’-羟化酶基因、二氢黄酮醇还原酶基因、花色素合成酶基因和类黄酮糖基转移酶基因)进行表达量分析，与野生型相比，GhMYB1a超表达烟草中的查尔酮合成酶基因、类黄酮3-羟化酶基因、二氢黄酮醇还原酶基因、花色素合成酶基因和类黄酮糖基转移酶基因表达均上调(图2中的B和C)。该结果与实施例一所述的GhMYB1a超表达非洲菊花瓣中的结果相似，也与已报道的AtMYB12超表达烟草的结果相似，进一步验证GhMYB1a与黄酮醇的合成相关。

如图1所示，黄酮醇合成酶(FLS)是黄酮醇合成途径中的关键结构基因，为了解GhMYB1a能否异源调控类黄酮合成，利用qRT-PCR对GhMYB1a超表达烟草中的黄酮醇合成酶的表达量进行分析。结果如图4的A和B所示，在烟草中超表达GhMYB1a基因导致烟草花瓣中FLS基因表达量显著增加；进一步利用高效液相色谱检测GhMYB1a超表达烟草花瓣中的黄酮醇(山奈酚和檞皮素)的含量，发现与野生型相比，GhMYB1a超表达烟草花瓣中的檞皮素的含量无显著性差异，而山奈酚的含量显著增加。结合实施例一所述的GhMYB1a超表达非洲菊花瓣中的结果，表明GhMYB1a通过促进黄酮醇合成途径中的FLS的表达来影响花瓣中黄酮醇的合成。

综上所述，本申请的来源于非洲菊的GhMYB1a属于MYB转录因子，参与非洲菊花色调控，具体机理是GhMYB1a促进黄酮醇合成导致花色变浅。因此可以利用GhMYB1a或其同源基因构建重组真核表达载体，以对植物的花色素苷积累进行调控；或者利用GhMYB1a或其同源基因构建重组真核表达载体，以对植物的黄酮醇的积累进行调控。

上述实施例为本申请较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本申请的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本申请的保护范围之内。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>华南农业大学

<120>调控植物花色素苷积累的转录因子、重组真核表达载体及应用

<160>2

<210>1

<211>1226

<212>DNA

<213>金黄色非洲菊（Gerbera hybirda）

<220>

<221> GhMYB1a

<223>反转录DNA序列

<400>1

ataaatattt ctttcttttc ttatacatat atgtaatata tagcagcaac actggaaaaa 60

ccctcctagt gtaagtatgg gaagagcgcc atgctgtgag aaggtagggt tgaagagggg 120

gaggtggact gccgaagaag acgacatact gactaactac attaaaactc atggcgaagg 180

ctcttggagg tctttaccca aaaatgctgg gttgctgcga tgtgggaaga gttgcaggct 240

aagatggatt aactacctga gatctgatat aaagagaggt aatatatcta aggaggacga 300

agatgtcata accaagctgc atgcatcttt gggcaacagg tggtccttaa tagctgccca 360

cttgcccgga cgaacagaca acgaaatcaa aaactactgg aactctcact tgagccggaa 420

aattatcccc tcaagaaggc tgttaaacac accggcgaca cctgttccgg ccaagttatc 480

atcacacccc ttaaacaaac gcaaaggcag aaccagccga tctgccatga agataaacaa 540

aactcataaa tcttcgtctc gtgatattgg tgctaataac cgtgaggtcg atggtgccat 600

tgacacgacg cctctggcac cttctataga gaaagaaagt aacgtttaca tggagccttg 660

tgccgccagt catgagtact cggatgatgg acaaaagaga gagaggcatg acaatgaagc 720

tgaggtggtt gatgatgtag ggatgttttg ctttaatgag attatggacg gaggtgcgtt 780

aacggatcca catggggttt tgtccttggc tgagaaggag acagaaaaag acttggccct 840

catgaatgtt gtcactagtg aggaggaaag acaaaatgta agtgagccca ttagtataat 900

tggaggagaa gaagtcaaca agacaggatc atgtgctaca agcacatcaa cagattcgtg 960

taatgttggt gatcatgata acattttgtc agggccatgg gattggaaat ggaattttga 1020

cgttgaagaa ggtatgttag ggttaggggt tgaggatgaa gataacattt tgtcatggcc 1080

atgggagagc acaacgacga cagatagtgg gaatggggat accgattttg taggggagga 1140

tcttgagaaa caaaatgcta tggttgcatg gcttctttct taattagtgg attcaatatc 1200

ttttcttcct tgtgcaaacc tttgta 1226

<210>2

<211>368

<212>PRT

<213>金黄色非洲菊（Gerbera hybirda）

<220>

<221> GhMYB1a

<400>2

Met Gly Rrg Ala Pro Cys Cys Glu Lys Val Gly Leu Lys Arg Gly Arg

1 5 10 15

Trp Thr Ala Glu Glu Asp Asp Ile Leu Thr Asn Tyr Ile Lys Thr His

20 25 30

Gly Glu Gly Ser Trp Arg Ser Leu Pro Lys Asn Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Ser Asp

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Asn Ile Ser Lys Glu Asp Glu Asp Val Ile Thr Lys

65 70 75 80

Leu His Ala Ser Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Ala His Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Ile Ile Pro Ser Arg Arg Leu Leu Asn Thr Pro Ala Thr

115 120 125

Pro Val Pro Ala Lys Leu Ser Ser His Pro Leu Asn Lys Arg Lys Gly

130 135 140

Arg Thr Ser Arg Ser Ala Met Lys Ile Asn Lys Thr His Lys Ser Ser

145 150 155 160

Ser Arg Asp Ile Gly Ala Asn Asn Arg Glu Val Asp Gly Ala Ile Asp

165 170 175

Thr Thr Pro Leu Ala Pro Ser Ile Glu Lys Glu Ser Asn Val Tyr Met

180 185 190

Glu Pro Cys Ala Ala Ser His Glu Tyr Ser Asp Asp Gly Gln Lys Arg

195 200 205

Glu Arg His Asp Asn Glu Ala Glu Val Val Asp Asp Val Gly Met Phe

210 215 220

Cys Phe Asn Glu Ile Met Asp Gly Gly Ala Leu Thr Asp Pro His Gly

225 230 235 240

Val Leu Ser Leu Ala Glu Lys Glu Thr Glu Lys Asp Leu Ala Leu Met

245 250 255

Asn Val Val Thr Ser Glu Glu Glu Arg Gln Asn Val Ser Glu Pro Ile

260 265 270

Ser Ile Ile Gly Gly Glu Glu Val Asn Lys Thr Gly Ser Cys Ala Thr

275 280 285

Ser Thr Ser Thr Asp Ser Cys Asn Val Gly Asp His Asp Asn Ile Leu

290 295 300

Ser Gly Pro Trp Asp Trp Lys Trp Asn Phe Asp Val Glu Glu Gly Met

305 310 315 320

Leu Gly Leu Gly Val Glu Asp Glu Asp Asn Ile Leu Ser Trp Pro Trp

325 330 335

Glu Ser Thr Thr Thr Thr Asp Ser Gly Asn Gly Asp Thr Asp Phe Val

340 345 350

Gly Glu Asp Leu Glu Lys Gln Asn Ala Met Val Ala Trp Leu Leu Ser

355 360 365

Claims

1.一种调控植物花色素苷积累的转录因子，其特征在于：所述转录因子为SEQ ID No.1所示的基因序列或该基因序列的同源序列，或者所述转录因子为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的同源序列。

2.一种重组真核表达载体，其特征在于，其包含如权利要求1所述的转录因子的基因序列，或者编码如权利要求1所述的转录因子的氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的重组真核表达载体，其特征在于，所述重组真核表达载体在植物中实现同源转化表达，或实现异源转化表达。

4.如权利要求3所述的重组真核表达载体，其特征在于，所述重组真核表达载体在非洲菊中实现同源转化表达。

5.如权利要求3所述的重组真核表达载体，其特征在于，所述重组真核表达载体在非洲菊除外的植物中实现异源转化表达。

6.如权利要求5所述的重组真核表达载体，其特征在于，所述重组真核表达载体在烟草和拟南芥中实现异源转化表达。

7.如权利要求1所述的调控植物花色素苷积累的转录因子在调控植物花色素苷积累中的应用。

8.如权利要求1所述的调控植物花色素苷积累的转录因子在调控植物花色变浅中的应用。

9.如权利要求1所述的调控植物花色素苷积累的转录因子在调控植物黄酮醇积累中的应用。

10.如权利要求1所述的调控植物花色素苷积累的转录因子在促进植物黄酮醇合成中的应用。