CN104774251A - 参与花青苷生物合成调控的myb转录因子 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一个参与菊花花瓣花青苷生物合成调控的MYB转录因子CmMYB6，其编码区序列含765个核苷酸。CmMYB6氨基酸序列中含有保守的R2R3 MYB结构域，并在R3结构域内存在一个[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R基序和一个ANDV基序，前者可与bHLH相互作用，后者为参与花青苷生物合成调控的MYB转录因子的特征基序。CmMYB6的基因表达在花瓣发育过程中呈上调趋势，与花青苷合成呈显著正相关，可诱导花青苷合成关键基因CmDFR启动子的活性，与MrbHLH1协同表达时，诱导效能显著增强，可强烈诱导烟草叶片花青苷的积累。因此，可用于植物花青苷生物合成的转录调控，修饰植株色泽。
Description
技术领域
本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一个参与菊花花瓣花青苷生物合成转录调控的MYB转录因子CmMYB6（SEQ：NO. 22）。
背景技术
菊花是我国传统名花，亦是世界重要花卉之一，为仅次于玫瑰的世界第二大切花。我国自主培育了近250个切花菊品种，其中单头切花大菊占切花产量总数的一半左右。花色是菊花重要的观赏性状之一，单头切花大菊的花色多以原始色系黄、白为主，除此黄、白之外，我国自主培育的菊花品种还有绿、青、粉红、红、紫和间色等其他色系，多色系的菊花存在有助于改善切花菊文化的发扬及其产业的多元化。
花青苷是众多红粉色系菊花品种的主要呈色色素，其积累量越高花色越偏红紫色。花青苷的生物合成起始于苯丙氨酸途径，由多个酶参与催化，编码这些酶的基因转录水平受到MYB、bHLH和WD40 转录因子形成的MBW转录复合体的协同调控。在这三类转录因子中，MYB转录因子对花青苷的生物合成调控具有最高的特异性。
MYB是高等植物中成员众多的一类转录因子，依据结构划分，多数MYB成员属于R2R3类，可参与植物表皮细胞分化、气孔细胞运动、黄酮类化合物（黄烷酮，花青苷和原花青苷）生物合成调控、抵御冷害和干旱、糖响应和抗真菌感染等生命进程。参与植物花青苷生物合成调控的MYB成员，已在众多植物体内得到鉴定，然而菊花中参与花青苷生物合成转录调控的MYB成员至今未见报道，极大地限制了菊花花色品质改良育种及其产业多元化的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一个参与菊花花瓣花青苷生物合成转录调控的MYB转录因子CmMYB6，其核苷酸序列如SEQ：NO. 22所示，具体特征如下：
1. 序列特征
菊花CmMYB6（SEQ：NO. 22）的编码序列全长为765个核苷酸，可编码一个含255氨基酸的蛋白。CmMYB6蛋白序列中含有保守的R2R3 MYB结构域，在MYB转录因子大家族中属于R2R3亚组。在CmMYB6的R3 MYB结构域中，存在一个保守的[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R基序，可与bHLH转录因子相互作用，共同行使功能。此外，R3 MYB结构域中还含有一个ANDV基序，该基序存在于许多参与花青苷生物合成调控的MYB转录因子序列中。
2. 基因功能
在菊花花瓣的发育过程中，CmMYB6（SEQ：NO. 22）的基因表达呈显著上升趋势，与花青苷的积累呈良好正向相关性。CmMYB6可显著诱导菊花花青苷合成关键基因CmDFR启动子活性，进而增强花青苷的积累，且这一诱导效应受到bHLH转录因子的加强。
本发明的另一个目的是提供MYB转录因子CmMYB6（SEQ：NO. 22序列）在植物颜色修饰的基因工程中应用，尤其在植物花青苷生物合成的转录调控中的应用。
CmMYB6与MrbHLH1协同在烟草叶片瞬时表达时，可强烈诱导花青苷的积累，使得叶片呈现红色表型。基于此，CmMYB6（SEQ：NO. 22）可用于植物花青苷生物合成的转录调控，进而改变植株颜色。
CmMYB6（SEQ：NO. 22）是菊花中首例报道的可调控花青苷生物合成，进而修饰植株色泽的MYB成员。
本发明以紫色切花菊‘阿美地’为试材，应用RACE、实时定量PCR和瞬时表达等生物学技术，分离鉴定出参与‘阿美地’花瓣花青苷生物合成调控的MYB成员CmMYB6 （SEQ：NO. 22）。研究发现，随着‘阿美地’花瓣中花青苷的积累，CmMYB6表达上调，与其呈良好正向相关；CmMYB6可增强菊花花青苷生物合成关键基因CmDFR启动子活性，且与MrbHLH1协同表达可显著诱导烟草叶片花青苷的积累。本发明利用RACE、实时定量PCR、双荧光素酶系统技术和烟草瞬时表达技术，分离并鉴定出菊花CmMYB6（SEQ：NO. 22）对花青苷生物合成具有转录调控效应，可应用到植物颜色修饰的基因工程中。
附图说明
图1：菊花4个MYB基因在花瓣发育过程及不同组织中表达模式分析。
图2：菊花4个MYB基因在不同组织中表达模式分析。
图3：菊花4个MYB基因对花青苷合成基因CmDFR启动子的调控效应分析。
图4：CmMYB6（SEQ：NO. 22）诱导花青苷生物合成功能的鉴定。
具体实施例
下面结合附图和实施例，以不具有调控花青苷生物合成功能的基因CmMYB3（SEQ：NO. 19）、CmMYB4（SEQ：NO. 20）和CmMYB5（SEQ：NO. 21），以及CmMYB6（SEQ：NO. 22）为例，对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。
在下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》（第三版）。
实施例1：菊花CmMYB基因克隆
依据菊花RNA-Seq数据库信息，筛选出四个可能参与菊花花青苷生物合成调控的MYB转录因子CmMYB3、CmMYB4、CmMYB5和CmMYB6，其中CmMYB6已含有部分开放型阅读框（ORF）序列及3’ 非编码区（3' UTR）序列（SEQ：NO. 1），CmMYB4 （SEQ：NO. 2）和CmMYB5（SEQ：NO. 3）已含有部分ORF序列及5’ UTR序列。应用基因特异引物2（GSP2）SEQ：NO. 4、SEQ：NO. 5和SEQ：NO. 6，以及巢式基因特异引物2（NGSP2）SEQ：NO. 7、SEQ：NO. 8和SEQ：NO. 9，利用3' cDNA末端快速扩增（3' RACE）技术分别获得 CmMYB3（SEQ：NO. 10）、CmMYB4（SEQ：NO. 11）和CmMYB5（SEQ：NO. 12）的（3' UTR）序列。进而应用基因特异引物1（GSP1）SEQ：NO. 13和SEQ：NO. 14，以及巢式基因特异引物1（NGSP1）SEQ：NO. 15和SEQ：NO. 16，利用5' cDNA末端快速扩增（5' RACE）技术分别获得CmMYB3（SEQ：NO. 17）和CmMYB6（SEQ：NO. 18）的5' 非编码区（5' UTR）序列。
RACE程序中第一轮PCR程序为94oC，5min，5个循环的94oC 10 s和72oC 2 min 30 s，5个循环的94oC 10 s，70oC 30s和72oC 2 min 30 s，30个循环的94oC 10 s，67oC 30s和72oC 2 min 30 s，72oC 10 min，4oC hold。第二轮PCR程序为94oC，5min，30个循环的94oC 10 s，65oC 30s和72oC 2 min 30 s，72oC 10 min，4oC hold。
RACE第一轮PCR体系为10×Ex-Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L GSP1或GSP2 0.5 μL，下游引物UPM 2 μL， Ex-Taq 0.1 μL，cDNA 0.5 μL，加灭菌双蒸水至20 μL。第二轮PCR体系为10×Ex-Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L NGSP1或NGSP2 0.5 μL，下游引物NUP 2 μL，Ex-Taq 0.1 μL，稀释10倍的第一轮PCR产物1 μL，加灭菌的双蒸水至20 μL。
根据3' 和5' UTR拼接得到自起始密码子（ATG）至终止密码子的CmMYB3（SEQ：NO. 19）、CmMYB4（SEQ：NO. 20）、CmMYB5（SEQ：NO. 21）和CmMYB6（SEQ：NO. 22）的全长序列。
实施例2：菊花CmMYB基因表达模式分析
（一）实验方法
利用Primer Premier 5，依据CmMYB3（SEQ：NO. 10）、CmMYB4（SEQ：NO. 11）、CmMYB5（SEQ：NO. 12）和CmMYB6（SEQ：NO. 1）的3' UTR序列分别设计实时定量PCR（QPCR）引物组合SEQ：NO. 23和SEQ：NO. 24、SEQ：NO. 25和SEQ：NO. 26、SEQ：NO. 27和SEQ：NO. 28及SEQ：NO. 29和SEQ：NO. 30，PCR产物包含终止密码子，长度分别为198 bp、222 bp、136 bp和154 bp。以菊花actin基因（SEQ：NO. 31）的表达为内参分析各个MYB转录因子的表达模式，其QPCR引物组合为SEQ：NO. 32和SEQ：NO. 33。所有QPCR引物特异性经熔点曲线分析、凝胶电泳分析和QPCR产物再测序验证。
分别提取四个‘阿美地’花瓣发育阶段以及嫩叶和嫩茎的RNA，参照cDNA合成kit（Bio-Rad，USA）说明书，合成cDNA。参照Ssofast EvaGreen Supermix kit（Bio-Rad，USA）说明书开展QPCR分析，采用20 μL体系：其中10 μL 2 ×Ssofast EvaGreen Supermix (Bio-Rad，USA)，1.0 μL上游引物（10 μM），1.0 μL下游引物（10 μM），2.0 μL稀释的cDNA和6.0 μL H2O。QPCR程序为：94oC，10 min；45个循环的94oC 10 s和60oC 30 s。
（二）实验结果
基因表达分析结果说明，CmMYB3（SEQ：NO. 19）和CmMYB6（SEQ：NO. 22）的基因表达在‘阿美地’花瓣的发育过程中与花青苷积累呈良好正向相关（附图1），且具有显著的组织特异性（附图2），而CmMYB4（SEQ：NO. 20）和CmMYB5（SEQ：NO. 21）的基因表达则与花青苷合成无明显相关性（附图1和2）。
实施例3：调控靶基因活性分析
（一）实验方法
应用引物组合SEQ：NO. 34和SEQ：NO. 35、SEQ：NO. 36和SEQ：NO. 37、SEQ：NO. 38和SEQ：NO. 39及SEQ：NO. 40和SEQ：NO. 41，扩增CmMYB3（SEQ：NO. 19）、CmMYB4（SEQ：NO. 20）、CmMYB5（SEQ：NO. 21）和CmMYB6（SEQ：NO. 22）的全长序列，分别搭载到pGreenII 0029 62-SK表达载体上，构建重组表达载体CmMYB3-SK、CmMYB4-SK、CmMYB5-SK或CmMYB6-SK。构建表达载体选用Fast stat high fidelity PCR system 酶，PCR体系为 Buffer（with Mgcl2）3 μL，dNTP（2.5 μM）2.4 μL，上下游引物（10 μM）各1 μL，cDNA 0.6 μL，酶0.3 μL，水21.3 μL。将最终确认正确构建的表达载体电转化入GV3101::pSoup农杆菌感受态细胞中，挑选3个阳性克隆，用25%灭菌甘油保存，放于-80oC。
将存放于-80oC的甘油菌划线接种于含25 μg/ml庆大霉素、5 μg/ml四环素和50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28oC培养48h，选取少量菌落涂布到新的相同LB固体培养基上，28oC培养12h。刮取生长良好的菌落，用渗透液（10 mM MES，10 mM MgCl2，150 mM 乙酰丁香酮，pH 5.6）悬浮，调其OD600为0.75左右。
利用双荧光素酶系统，分析不同MYB转录因子与菊花花青苷合成基因CmDFR启动子间是否存在调控效应。将含有不同重组表达载体的农杆菌按照两种方案进行组合处理， 将含有CmMYB3-SK、CmMYB4-SK、CmMYB5-SK或CmMYB6-SK的农杆菌菌株分别与含有CmDFR-LUC的农杆菌菌株按照10:1比例混合； 将含有CmMYB3-SK、CmMYB4-SK、CmMYB5-SK或CmMYB6-SK的农杆菌菌株分别与含有MrbHLH1-SK的农杆菌菌株按照1:1比例混合，再按照10:1比例与含有CmDFR-LUC的农杆菌菌株混合。农杆菌菌株混合后，分别注射到本氏烟草叶片中，每株烟草注射3片叶片。每个基因的3个阳性克隆各重复一次上述操作，构成3个生物学重复。
注射后的烟草于16h：8h光暗周期、25oC、75%空气湿度的条件下培养3天，应用Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega，USA）和Modulus Luminometer（Promega，USA）检测叶片中两种荧光素酶（LUC和REN）的比值，据此分析转录因子与目标基因启动子之间的调控效应。
（二）实验结果
双荧光素酶瞬时表达分析结果显示，4个MYB成员中，仅CmMYB6（SEQ：NO. 22）具有激活菊花花青苷合成基因CmDFR启动子的效应，且在MrbHLH1协同表达时，该效应得到显著增强（附图3）。
实施例4：诱导花青苷积累分析
（一）实验方法
将分别含CmMYB6-SK、MrbHLH1-SK或pGreenII 0029 62-SK的GV3101::pSoup农杆菌菌株按照1:1比例组合成农杆菌混合液，包括：CmMYB6-SK + pGreenII 0029 62-SK，MrbHLH1-SK + pGreenII 0029 62-SK、CmMYB6-SK + MrbHLH1-SK。选取一株长势优良普通烟草植株的3片嫩叶，以每片叶片中心叶脉为分界线，用无针头注射器在叶片左侧注射CmMYB6-SK + pGreenII 0029 62-SK混合液，右侧注射CmMYB6-SK + MrbHLH1-SK混合液；另一株烟草3片嫩叶的左侧注射MrbHLH1-SK + pGreenII 0029 62-SK混合液，右侧注射CmMYB6-SK + MrbHLH1-SK混合液。注射部位为远离叶片中心叶脉的表皮细胞内，烟草于16h：8h光暗周期、25oC、75%空气湿度的条件下培养8天，观察叶片的注射部位有无花青苷的积累。每个基因的3个阳性克隆各重复一次上述操作，构成3个生物学重复。
（二）实验结果
分析结果显示，注射CmMYB6-SK + MrbHLH1-SK混合农杆菌的烟草叶片表皮细胞内可显著积累花青苷，使得注射部位呈现明显的红色（附图4）。
本发明利用RACE、实时定量PCR、双荧光素酶系统技术和烟草瞬时表达技术，分离并鉴定出菊花CmMYB6（SEQ：NO. 22）对花青苷生物合成具有转录调控效应，可应用到植物颜色修饰的基因工程中。
<110> 浙江大学
<120> 参与花青苷生物合成调控的MYB转录因子
<160> 41
<210> 1
<211> 722
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 1
GATATGCTTCTCAGGAACTGTATTCAGAAACATGGCGAAGGGAAATGGCACCTTATTCCTCTTAAAGCCGGTTTAAGCCGATGTAGGAAGAGTTGTAGGTTGCGATGGTTAAATTATCTAAGGCCAAATATAAAGAAAGGAGATTTTGAAGAAGATGAGATTGATCTCATTCTAAGGCTTCACAAGCTTCTAGGCAACAGATGGTCACTGATTGCTGGGAGAATACCAGGAAGAACTGCTAATGACGTGAAGAACTACTGGAACACACATATTCGGCCACGGTCCAACAAACAAAATAATGAAGCTAAAGACATTACCACGGCCGTCACAGTTATTAAGCCTCAACCACGGATCTTGTCTAAAACCGTAAATTCTAACCCACCCATTGCAGCTCCTCAAGACTATAACCTAGTAAGGTCAACACATGATGGTGTCGAAACTGCCTTTGATATATCCTCAGGGTATATCTCGTCACCCATCGTATCAGATGCCAAGATTGACAAGTATTTGGTTGAGTTATTTGACAATGAGGATAAGGAATTTGACGGCGAAATAGGGTGGTCATTAGATGGTTGTCCATTCCAAGGGGAGGCTTTAGATGCAGAGCAAGAAGATGGTGAAAGCAGTGTGTTTGATTTACCCATAGACGAGTTCATGTGGGACTTTTTAAATTCGGACCAACTATGATATTGCAATCCTTTATCACTCGTCTTCATGTGAGC
<210> 2
<211> 326
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 2
GCTGCAGGAATTCGAATTCCAAAAAGCCGGCCTATCATATCTCTCTCTCTTGAAAAAACTCAAAAATTGGGAAGTTCAAAGAAGAAAGTCTAAATATGGGAAGGTCACCTGATTGTGAAAAAGCACACACAAACAAAGGTGCATGGACCAAAGAAGAAGATGATCGGTTGATAGCTTATATTAGAACCCATGGTGAAGGCTGCTGGAGGTCACTACCTAAAGCTGCTGGCCTTTTACGGTGTGGTAAAAGCTGTCGTCTCAGGTGGATCAATTATCTTCGCCCTGATCTTAAACGTGGCAATTTTACTGAAGATGAAGATGAACTT
<210> 3
<211> 618
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 3
ATTCAAAAAAAAAATGAAAGAGAGAGAAAAACTAGAAACAAAAGAAGAAAGATCTGAGGAGGGGGAAAATGGTGAGAGCACCTTGTATTGATAAAAATGGTATTAAAAAAGGTGCCTGGAGTGAAGAAGAAGATAATAAGCTACGTGATTATATCGAACGTTATGGTCACTGGAATTGGCGCGAACTTCCTAAATATGCTGGTTTGGCAAGGTGTGGCAAGAGTTGTAGATTGCGGTGGATGAATTATTTAAGACCGAGTGTCAAACGCGGGAATTTCACCAAGGAAGAAGAGGATATCATCATTAAACTTCATCTCGACATGGGAAACAAGTATGTGGTCTAACTAACCTTTTGAATCGAATTTAGTTATAGTAGATTTTATTAAAAATGGTCTCCTAAATCACGAGCTAGCTGATTCAAGTAGCGTTAAACTAAGCTCTAGTTTGTTTTGCCACACACCCGTAGGATTAGTGAATTAGGGATAAATCACATAAATATGTTCTTGCTGTTTTGTTTTGCTTAATGCTGATTAGGTTGATCCAACTTATAGTCGGTAAAAAAGAAATTGGAGAAAGTCACTGCTATAAAGATTTTTGCCGTTTTGCAGATGGTCAGCG
<210> 4
<211> 23
<212> 碱基序列
<213> 人工序列
<400> 4
CAGGTGGTCTTTGATAGCAGCCC
<210> 5
<211> 25
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 5
AGTCTAAATATGGGAAGGTCACCTG
<210> 6
<211> 28
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 6
GGAATTGGCGCGAACTTCCTAAATATGC
<210> 7
<211> 28
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 7
CCCTCCTACGATAACCATTCCACAAACG
<210> 8
<211> 27
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 8
GGTAAAAGCTGTCGTCTCAGGTGGATC
<210> 9
<211> 25
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 9
CGACATGGGAAACAAGTATGTGGTC
<210> 10
<211> 793
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 10
CCCTCCTACGATAACCATTCCACAAACGATCATTAAACGCAGAGGTAGAACTAGCCGGTCCAAAATGAAGATCAACAAAACATATAGATCCTCTTCCAATAATAACACTAGGGTTGTTCCAGTTGTCCCTTTATCAAAAGGACACTCGGAACAACCAATTAAACAGCAGACCAAGCCTGTCAAAGATGGTCATGTTTGCATGGACCCTGGTGCCCCAAGCTATGAAGATAAATTAAATGATGCCCAATGCTGTGATGATGAAATTTTTCGATTTATTGAAACCATGGACCAGCAATTAATGTCAATGGATCCGAACGATGAATATTCGTTCACAGAAAGAGATGGAGTCGTTACTAGTGAAGAGGAAACACACAATGCAAGTGAGCCCAAGAGTGTAGAAGCTGGTGGTGCAAATTCATCTAGCACGGTTTCGTATGATAATTGGAATTGGGATTTTGATGTTGAAGATGGTATATTAGGTTTAGGAGGTCAAGAAGAAGAGGACATTTTGTCATGGCCATGGGAGAGCACTACAACAGATTATGACAATATTTTAGGTTCAGATGCATGGCTTCTTTCTTAATATGTTAGTACGTGTACAAATACAAGTGTGCCATTTAGTAGTAAACCACTCAAATTATGTATACTAGGTTATAATAGGATAGTGATTTGAATTATGCTATCTGCATATAAATAAATCCATTATGTGCAGTGTTCTTTGATATACGATGAAATTCACATAATATTCGAAAATGTTTAGGGTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
<210> 11
<211> 991
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 11
GGTAAAAGCTGTCGTCTCAGGTGGATCAATTATCTTCGCCCTGATCTTAAACGTGGCAATTTTACTGAAGATGAAGATGAACTTATTATCAAACTTCATAGCCTCCTTGGCAACAAGTGGTCTTTAATAGCTGGAAGATTGCCAGGAAGAACAGATAACGAGATAAAAAACTACTGGAACACACACATCAGAAGAAAGCTTCTAAACCGTGGAATTGATCCAGCAACTCACCGCCCAGTCACCGACCACCCCACGACCACCAACACCACCACAACAACCGTCACCACCACCGTGAACAACAACCATAATGTCACCTCACCACCACCAGACATCATATCTTTTGCAACCACAAAAACAACAGACCATGTAGTCAAAAATGAAGACATGGAACAAGACACTAAGCTCAATATCACCTCACCTGATCAAAAACAAGAAAGATGTCCAGATTTGAACTTGGAGTTAAGAATTGGCCCACCACAACATCATAGTAGTAATATGATACCATCAATATCATACATGCAACAACCTTTGATGACTGGTGGAACAATATGTTTTGCGTGCAGTTTAGGTGTACAAGATAACAAGGAATGCAGGTGTAGTACTAATGGTACAAGTGGTAACAACAACAACAACGTTGGTTTTGATTTCTTTAAAATAAAAAATGGCGCTTTGGACTATAGAAGCTTGGAGATGAAATAATAATATTTTTTAACTTTATGGGTAACTTTTTTTTATTTGATAAGAACAATATCTTGTTTTTTTTTTTACTAGAAGTATGATTTCTAGTTTTATTTTTCTTTTTTCTTTTTGTACAATTATGATATAATGGTAAATTTAGTTTATAGAAAAGTAAATAGTGATATTTTTTTCACTCGTATAGTCGTATGCAAGCTAAGTATGAATGTCATTGCTTGTAAGATGTATTTGCTACTTTGTTAGTTTTAATATTACTATTGACGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
<210> 12
<211> 855
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 12
CGACATGGGAAACAAGTATGTGGTCTAACTAACCTTTTGCATCGAATTTTAGTTACAGTGGATTTTATTAAAAAAAAAATCTACTAAATCACGAGCTAGCTGATTCAAGTAGCGTTAAACTAAGCTCTAGTTTGTTTTGCCACACACCCGTAGGATTAGCGAATTAGGGACAATCACATAAATATATTCTTGCCGTTTTGTTTTGCTTATTGCTGATTAGGTTGATCCAACTTATAGTCAGTAAATAAGAAATTGGAGAAAGTCACTGCTGTAAAGATTTTTGCCCGTTTTGCAGATGGTCAGCGATTGCTGCCCTGTTACCAGGAAGAAGTGACAACGAAATCAAGAACCATTGGCACACGCACTTGAAAAAACGCAGTACCAAACAAAATCACCACGTCGTTCACGAAGTAAAAGATGAACAAAAACTTAACGTTTCAAGGATTATAAACTTTTCTGTTTTACCTCCAAGCGTTGTGTCAACATCTAGTGACAATCGAGTTACAAATGAATATACAGCGTCTCACATGATATCCCATGAATCGGCAGTATCACAGAGAAATTCTGATGACTCAACATCACGTCCCTGTGTACAACACCGATTACTAATTGATTTGAACCAAGAATATGTAGAATCATGGGAGGAAGATAACAAGTTAAAGAAGGAGTTCGTGTGTTGATACAGTTTTAGGTAAAACAAAGATAGAAATTATTATTGTTATAAAGTTAGCTTATATCTTTCCTTCCCCAATTAGCGGATTGAAAACCATCCATAGTGTTGTTTTGTACATGAACATCAATTTGCTCAAGTTTTGATATAAATTTGCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
<210> 13
<211> 26
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 13
TTTGATTTCGTTGTCTGTTCGCCCGG
<210> 14
<211> 24
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 14
CGATGGGTGACGAGATATACCCTG
<210> 15
<211> 23
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 15
CAGTCTACAACTCTTCCCACACC
<210> 16
<211> 24
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 16
CTGTTGCCTAGAAGCTTGTGAAGC
<210> 17
<211> 202
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 17
ACATGGGGGTACATCTTCATACAGTTTTGTCTCAAATATGGGAAGAGCACCGTGTTGCCAAAAAATAGGGTTGAAGAGGGGAAGGTGGACCGCCGAAGAAGACAAGATACTTTCCGACTACATTCAAACTCATGGTGAAGGCTCATGGAGATCTTTACCCAAAAATGCCGGATTACTAAGGTGTGGGAAGAGTTGTAGACTG
<210> 18
<211> 280
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 18
ACATGGGGGAGTACAGAAAAATGAGACCGAGTAGTAGTACAGGTTTAAGGTTGAAGAAAGGTGCATGGACTCCCAAAGAAGACATGCTTCTCAGGAACTGTATTCAGAAACATGGCGAAGGCGAATGGCATCTAATTCCTCTTAAAGCCGGTTTAAGCCGATGTAGGAAGAGTTGTAGGTTGCGATGGTTAAATTATCTAAGGCCAAATATAAAGAAAGGAGATTTTGAAGAAGATGAGATTGATCTCATTCTAAGGCTTCACAAGCTTCTAGGCAACAG
<210> 19
<211> 957
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 19
ATGGGAAGAGCACCGTGTTGCCAAAAAATAGGGTTGAAGAGGGGAAGGTGGACCGCCGAAGAAGACAAGATACTTTTCGACTACATTCAAACTCATGGTGAAGGCTCATGGAGATCGTTACCCAAAAATGCCGGATTACTAAGGTGTGGGAAGAGTTGTAGACTGAGATGGATAAACTACTTGAGATCGGATGTGAGAAGAGGTAACATATCCAAGGAGGAGGAACAAATAATTACCAGCCTGCATGCATCTTTAGGTAACAGGTGGTCTTTGATAGCAGCCCACTTGCCCGGGCGAACAGACAACGAAATCAAAAACTACTGGAACTCCCACCTCAGCCGAAAGATCCTCCCGTCACGAAGAATTATATCGAACCCTCCTACAATAACCATTCCACAAACGATCATTAAACGCAGAGGTAGAACTAGCCGGTCCAAAATGAAGATCAACAAAACATATAGATCCTCTTCCAATAATAACACTAGGGTTGTTCCAGTTGTCCCTTTATCAAAAGGACACTCGGAACAACCAATTAAACAGCAGACCAAGCCTGTCAAAGTTGGTCACGTTTGCATGGACCCTGGTGCCCCAAGCTATGCAAATGAATTAAATGATGCCCAATGCTGTGATGATGAAATTTTTCGATTTATTGAAATCATGGACCAGCAATTAATGTCGATGGATCCGAATGATGAATATTCGTTCACAGAAAGAGATGGAGTCGTTACTAGTGAAGAGGAAACACACAATGCAAGTGAGCCCAAGAGTGTAGAAGCTGGTGGTGCAAATTCATCTAGCACGGTTTCGTATGATGATTGGAATTGGGATTTTGATGTTGAAGATGGTATATTAGGTTTAGGAGGTCAAGAAGAAGATGACATTTTGTCATGGCCATGGGAGAGCACTACAACAGATTATGACAATATTTTAGGTTCAGATGCATGGCTTCTTTCTTAA
<210> 20
<211> 846
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 20
ATGGGAAGGTCACCTTGTTGTGAAAAAGCACACACAAACAAAGGTGCATGGACCAAAGAAGAAGATGATCGGTTGATAGCTTATATAAGAACTCATGGTGAAGGCTGCTGGAGGTCACTTCCTAAAGCTGCTGGCCTTTTAAGGTGTGGTAAAAGCTGTCGTCTCAGGTGGATCAATTATCTTCGCCCTGATCTTAAACGTGGCAATTTTACTGAAGATGAAGATGAACTTATTATCAAACTTCATAGCCTCCTTGGCAACAAGTGGTCTTTAATAGCTGGAAGATTGCCAGGAAGAACAGATAACGAGATAAAAAACTACTGGAACACACACATCAGAAGAAAGCTTCTAAACCGTGGAATTGATCCAGCAACTCACCGCCCAGTCACCGACCACCCCACCACCACCACGACCACCACAACCACAGCCGTCACCACCACCGTGAACAACAACCATAATGTCACCTCACCACCACCAGACATCATATCTTTTGCAACCACAAAAACAACAGCCCATGTAGTAAAAAGTGAAGACATGGAAGAAGACACTAAGCTCAATATCACCTCACCTGATCAAAAACAAGAAAGATGTCCAGATTTGAACTTGGAGTTGAGAATTGGCCCACCACAACATCATAGTAGTAATATGATACCATCAATATCATACATGCAACAACCTTTGATGACTGGTGGAACAATATGTTTTGCGTGCAGTTTAGGTGTGCAAGATAACAAGGAATGCAGGTGTAGTACTAATGGTACAAGTGGTAACAACAACAACGTTGGTTTTGATTTCTTTAAAATAAAAAATGGCGCTTTGGACTATAGAAGCTTGGAGATGAAATAA
<210> 21
<211> 648
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 21
ATGGTGAGAGCACCTTGTATTGACAAAAATGGTATTAAAAAAGGAGCCTGGAGTGAAGAAGAAGATAATAAGCTACGTGATTATATTGAACGTTATGGTCACTGGAATTGGCGCGAACTTCCTAAATATGCTGGTTTGGCAAGGTGTGGCAAGAGTTGTAGATTGCGGTGGATGAATTATTTAAGACCGAGTGTCAAACGCGGGAATTTCACCAAGGAAGAAGAGGATATCATCATTAAACTTCATCTAGATATGGGAAACAAATGGTCAGCGATTGCTGCCCTGTTACCAGGAAGAAGTGACAACGAAATCAAGAACCATTGGCACACGCACTTGAAAAAACGCAGTACCAAACAAAATCACCACGTCGTTCACGAAGTAAAAGATGAACAAAAACTTAACGTTTCAAGGATTATAAACTTTTCTGTTTTACCTCCAAGCGTTGTGTCAACATCTAGTGACAATCGAGTTACAAATGAATATACAGCGTCTCACATGATATCCCATGAATCGGCAGTATCACAGAGAAATTCTGATGACTCAACATCACGTCCCTGTGTACAACACCGATTACTAATTGATTTGAACCAAGAATATGTAGAATCATGGGAGGAAGATAACAAGTTAAAGAAGGAGTTCGTGTGTTGA
<210> 22
<211> 765
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 22
ATGGGGGAGTACAGAAAAATGAGACCGAGTAGTAGTACAGGTTTAAGGTTGAAGAAAGGTGCATGGACTCCCAAAGAGGACATGCTTCTCAGGAACTGTATTCAGAAACATGGCGAAGGCAAATGGCATCTAATTCCTCTTAAAGCCGGTTTAAGCCGATGTAGGAAGAGTTGTAGGTTGCGATGGTTAAATTATCTAAGGCCAAATATAAAGAAAGGAGATTTTGAAGAAGATGAGATTGATCTCATTCTAAGGCTTCACAAGCTTCTAGGCAACAGATGGTCACTGATTGCTGGGAGAATACCAGGAAGAACTGCGAATGACGTGAAGAACTACTGGAACACACATATTCGCCCACGGTCCAACAAACAAGATAATGAAGCTAAAGACATTACCACGGCCGTCACAGTTATTAAGCCTCAACCACGGATCTTGTCTAAAACCGTAAATTCTAACCCACCCATTGCAGCTCCTCAAGACTATAACCTAGTAAGGTCAACACATGATGGTGTCGAAACTGCCTTTGATATATCCTCAGGGTATATCTCGTCACCCATCGTATCAGATGCCAAGATTGACAAGTATTTGGTTGAGTTATTTGACAATGAGGATAAGGAATTTGACGGCGAAATAGGGTGGTCATTAGATGGTTGTCCATTCCAAGGGGAGGCTTTAGATGCGGAGCAAGAAGATGGTGAAAGCAGTGTGTTTGATTTGCCCATAGACGAGTTCATGTGGGACTTTTTAAATTCGGACCAACTATGA
<210> 23
<211> 22
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 23
TCATCTAGCACGGTTTCGTATG
<210> 24
<211> 24
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 24
TGGCACACTTGTATTTGTACACGT
<210> 25
<211> 24
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 25
TGGACTATAGAAGCTTGGAGATGA
<210> 26
<211> 24
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 26
GCTTGCATACGACTATACGAGTGA
<210> 27
<211> 20
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 27
AATCGGCAGCATCACAGAGA
<210> 28
<211> 24
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 28
CACACGAACTCCTTCTTTAACTTG
<210> 29
<211> 24
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 29
ACGGCGAAATAGGGTGGTCATTAG
<210> 30
<211> 25
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 30
GGATTGCAATATCATAGTTGGTCCG
<210> 31
<211> 532
<212> DNA序列
<213>菊花（Chrysanthemum morifolium）
<400> 31
GTTCCCTGGCATTGCTGACAGGATGAGCAAGGAAATCACCGCTCTTGCTCCCAGCAGCATGAAGATCAAGGTCGTTGCACCCCCAGAGAGAAAATACAGTGTCTGGATCGGAGGATCTATCCTTGCATCACTCAGCACCTTCCAACAGATGTGGATCTCCAAGGGTGAATACGACGAGTCTGGCCCATCCATTGTTCACAGGAAGTGCTTCTAAGTATGGATTTTGTTGCTTTTGAAGATTGAATTTCTTTTGGTTTTTGGTTTTTTTTATTGCCTTTCTTTTTCGTGTTATGTTTCATGTGAACTAAGTAAGGCTGGCAGACGTTGGGCCATGGGGAAAGTGAAGGGGATTAACACCACGTTCATCTCTTAATCCATCACTCTGCTCTACCCCATTTGTCGATTGTTGCCAGAGATGTTTGTAGTTGGAGAGTGGTTGTGATGTCTTATTATGAATTCAAACTGTCGGTCTTTTTTTAATCCGTTTGTTGGCAATAATTATGTCAATGTCTACTGTATCAGAAATTATCTT
<210> 32
<211> 20
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 32
CACCCCCAGAGAGAAAATAC
<210> 33
<211> 20
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 33
ATCTGTTGGAAGGTGCTGAG
<210> 34
<211> 21
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 34
ATGGGAAGAGCACCGTGTTGC
<210> 35
<211> 21
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 35
TTAAGAAAGAAGCCATGCATC
<210> 36
<211> 20
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 36
ATGGGAAGGTCACCTTGTTG
<210> 37
<211> 20
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 37
TTATTTCATCTCCAAGCTTC
<210> 38
<211> 24
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 38
ATGGTGAGAGCACCTTGTATTGAC
<210> 39
<211> 25
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 39
TCAACACACGAACTCCTTCTTTAAC
<210> 40
<211> 21
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 40
ATGGGGGAGTACAGAAAAATG
<210> 41
<211> 20
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 41
TCATAGTTGGTCCGAATTTA
Claims (5)
1. 一个参与花青苷生物合成调控的MYB转录因子，其特征在于，是参与菊花花瓣花青苷生物合成转录调控的MYB转录因子CmMYB6，其核苷酸序列如SEQ：NO. 22所示。
2.根据权利要求1所述的一个参与花青苷生物合成调控的MYB转录因子，其特征在于，所述MYB转录因子的编码序列全长为765个核苷酸，可编码一个含255氨基酸的蛋白，CmMYB6蛋白序列中含有保守的R2R3 MYB结构域，在MYB转录因子大家族中属于R2R3亚组，在CmMYB6的R3 MYB结构域中，存在一个保守的[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R基序，可与bHLH转录因子相互作用，共同行使功能。
3.根据权利要求2所述的一个参与花青苷生物合成调控的MYB转录因子，其特征在于，所述R3 MYB结构域中还含有一个ANDV基序，该基序存在于许多参与花青苷生物合成调控的MYB转录因子序列中。
4.权利要求1所述一个参与花青苷生物合成调控的MYB转录因子CmMYB6在植物颜色修饰的基因工程中应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述转录因子CmMYB6在植物花青苷生物合成的转录调控中应用，进而改变植株颜色。
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