CN110628781B - 一种兰花中促进花色苷形成的r2r3 myb转录因子 - Google Patents

一种兰花中促进花色苷形成的r2r3 myb转录因子 Download PDF

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Abstract

本发明公开了两种兰花中促进花色苷形成的R2R3MYB转录因子。其中的转录因子如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述的转录因子是从卡特兰中分离和鉴定出的。通过相应的转录因子能够丰富兰科植物花朵红色性状的转基因材料库，为未来培育兰花红色性状花朵的分子育种提供了有力支持。

Description

一种兰花中促进花色苷形成的R2R3 MYB转录因子
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种兰花中促进花色苷形成的R2R3 MYB转录因子。
背景技术
由于兰科植物具有特殊的花形和丰富的花色，因此其许多自然种和栽培品种具有很高的观赏价值且在世界上广受大众欢迎。其中，蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.)、文心兰(oncidium spp.)和卡特兰(Cattleya spp.)最所受市场欢迎，知名度最高，且种类繁多。花色是这些兰花的重要观赏特性之一，也是它们观赏价值主要贡献者。因此，根据市场大众的喜爱对兰花花色进行育种改良是育种者们的主要目标之一。
目前兰花育种的主要手段是通过种间杂交进行选育。在育种过程中随机性和盲目性较高，通常要耗费大量的时间和精力经过多代的选育才能得到理想中的品种。近年，随着科学技术的飞速发展，利用转基因技术的靶向分子育种技术在农作物和园艺花卉得到了广泛的运用。所述分子育种主要通过转基因技术将控制相关表型性状的基因在目标植物中过表达或敲除，从而使植物获得或丢失相应的表型，最终得到理想的品种。因此，获得控制相关表型性状的基因是分子育种的前提基础和重要资源。
花色苷是使植物花朵显橘红色到蓝紫色的主要显色物质，其在植物体内的主要合成通路已得到了详细的描述。花色苷合成的调控机制也在许多模式和非模式植物中得到了报道。其中，R2R3 MYB转录因子在花色苷合成的调控机制中扮演了重要的角色，它能够通过促进或者抑制花色苷合成通路中的结构基因的表达，从而增加或减少花色苷在花朵中的积累量，最终决定花朵的颜色。目前，在兰科植物中仅在蝴蝶兰、文心兰和石斛兰中分离和鉴别出了3个能够促进兰花花青素合成的R2R3 MYB转录因子。蝴蝶兰中的PeMYB2通过农杆菌侵染的瞬时过表达技术在白花蝴蝶兰中得到验证，在白色花瓣中过表达PeMYB2后，使其白色花瓣显现红紫色。而文心兰中OgMYB1的功能则通过离子轰击的瞬时过表达技术在黄花文心兰中得到了验证，在黄色花瓣中过表达OgMYB1后，其黄色的花瓣中出现了红色的斑点。此外，Li等在石斛兰中也通过离子轰击技术瞬时过表达DhMYB2后，使石斛兰白色的花瓣上出现了红色斑点。
尽管已有三例能够促进花色苷合成的R2R3 MYB转录因子在兰科植物中得到了报道。但是，相对于兰科植物庞大的类群和丰富的色彩变化，以及物种间同源基因的差异性和特异性，仅三例能够促进花色苷合成的R2R3 MYB转录因子对于未来兰科植物花色的分子育种改良远远不够。因此，补充和扩大不同兰科植物促进花色苷合成的R2R3 MYB转录因子资源，是未来整个兰科观赏花卉的花色分子改良育种的重要基础和前提。
发明内容
本发明的目的是提供一种兰花中促进花色苷形成的R2R3 MYB转录因子及其方法，来扩充和丰富兰科植物控制花朵红色性状的R2R3 MYB转录因子库。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种兰花中促进花色苷形成的R2R3 MYB转录因子—RcPAP1，其CDS序列如SEQ IDNO：1所示。
一种兰花中促进花色苷形成的R2R3 MYB转录因子—RcPAP2，其CDS序列如SEQ IDNO：2所示。
本发明的两个R2R3 MYB转录因子的功能通过瞬时过表达技术在蝴蝶兰的花瓣中得到了验证，它们能够促进花色苷在蝴蝶兰花瓣中的积累，使白色的花瓣呈现紫红色。因此，这两个R2R3 MYB转录因子能够丰富兰科植物花朵红色性状的转基因材料库，为未来培育兰花红色性状花朵的分子育种提供了有力支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1为利用本发明在蝴蝶兰花瓣中进行瞬时过表达的照片示意图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明提供的技术方案具体是从卡特兰Rhyncholaeliocattleya Beauty Girl‘KOVA’(KOVA)中分离和鉴定出两个能够促进花朵合成花色苷的R2R3 MYB转录因子，分别为Rhyncholaeliocattleya Promoted Anthocyanin Pigmentation 1(RcPAP1)和Rhyncholaeliocattleya Promoted Anthocyanin Pigmentation 2(RcPAP2)。
其中，R2R3 MYB家族中的一些成员能够结合在花色苷合成通路中结构基因的启动子上激活花色苷合成通路结构基因的表达，从而促进花色苷的合成。这些能够促进花色苷合成的R2R3 MYB在不同的植物中都有相似的保守功能结构域，也有不同的特异性序列片段。对于功能被证实的R2R3 MYB可当作基因材料，通过转基因技术可用于分子育种。本发明分离和鉴定出的这两个转录因子丰富了兰科植物花朵红色性状的转基因材料库，为未来培育兰花红色性状花朵的分子育种提供了有力支持。
对于不同植物的转录因子虽然功能相似，但是其CDS并不完全相同。而不同的MYB的CDS特异性区域可能决定了它们所催化生产的花色苷种类，并且还可能限定了它们只能在某些植物中发挥功能。因此，在兰科中发现和鉴定出不同植物类群的促进花色苷合成的R2R3 MYB，便能够丰富兰科植物转基因分子育种的基因材料库，为未来培育红色性状花朵的兰花提供支持。
本发明中分离和鉴定出的两个转录因子分别如下：
第一个转录因子RcPAP1的CDS序列为：
ATGGAAAGGGATTCATGTTGTTCGAAGGAAGGGCTCAACAAGGGAGCATGGACTGCCGCTGAAGACAAGCTCTTGATCACGTATGTCAATACTTATGGAGAAGGCAAATGGACAACAGTTCCCCATATAGCCGGGCTGAAAAGATCTGGGAAGAGCTGCCGACTCCGATGGTTAAACTACCTGAGGCCTGACGTCAAACGTGGAAACTTCTCCGAGGAAGAGGACGACCTCATCATCAGGCTTCATAAGCTCCTCGGCAATAGATGGTCTCTGATTGCTGGAAGGCTACCAGGAAGAACTGATAATGAAATAAAAAACTACTGGAACACAACCTTGGCGAAGAAGTCGCGCTTCATGCATCTATCTCAAATCCATCAGCCAAGCAACTTACAAAGGCCCCCAGCTTTTGATCATCTACTGCCATCATCGTCGACATATCCATCTTCTCAAGCCACAAATAATAAAACTTTGAACCGACCTATGGTCATAAGGTGCGACAAAGTAGTTTTTCCAGTAGGAGAATCTAGTGTTGTGGCGGCTTCTGTGATGCCTGAAACCATCAAAGATGGCACCATTATTGAAGAAGAACTGGTTCAAGTTAAGGAGAATATGGTCATGAAATGCAGCTTTGATGGAAATGTTGCAGTTTCTGATCAAGCTGTAATGGAATTCAACGGATTGCCGGATTTTGAGAGCTGGATGCTGAATGATGTGGATGGTGATTGCCTTCCTGATGCTGAGAATGTAGAATGGTTAACTTCTTTATTTGATATAGAAGGTGAGCTGCATAAGCAATTA
第二个转录因子RcPAP2的CDS序列为：
ATGGGAAGGAGTTCTTACTCTTTCGAGGAGGGGCTCAACAAGGGAGCATGGACTACCTCCGAAGACAACCTCTTGATAAATTACATCAATAAACATGGAGAAGGCAAATGGACGATGATTCCGTATAAAGCAGGCCTTAAGAGGTCAGGGAAGAGCTGCCGTCTCCGATGGCTGAACTACCTGAGGCCCAACGTCAAACGTGGGAACTTTTCCGAGGAAGAAGATGACCTCATCATCAGGCTTCATAAGCTCCTCGGCAATAGATGGTCTCTGATTGCTGGAAGACTGCCAGGCAGAACGGATAATGAAGTAAAAAACTATTGGAACACAACTTTAGGCCGAAAGGTGAATCAACCATGCACCATAAAAAGGCCACCAGCTTCAAATGCTTTAATGCCATCATCACCATTACAAGCCACAAGTGATACAACTTTGATTCGAACAAAGGCCATAAGGTGCAATAAATTAGCTTTTCCATTACTGCTTCCATCTTTTTCAGGAAGCAAGCAGGAGATACCAACAAAGCGATTAGCAGGAGAGTCTAACGCTATGATGACTAATGAGATGCCTGAAAGCAGCAAAGTTAGCCCCAACGTCGAAGAAGAGCTATTTCAGGAGGAGGAGAATATGGTTCTGAACTATGGTAGCTTTGGTGATGACATCATTGCCGCATTTCCGAATCAAGCTACAATGGAGTTTGACGAATTGATGGATTTTGAGAGGTGGATGCTAATTGATGACAATGTTGACTATCTTGTTGATGCTGATCAAATACAGTCGCTGACCTCTTTATTTGATATAGAAGGAAGCAAGCAGGAGATACCAACAAAGCAATTAACAGGAGAGTCTAAGGCTATTGTGGCTAATGAGATGCCTGAAAGCATCAAAGTTGGCCCCAACATCGCAGAAGAGCTATTTCAGGAGGAGGAGAATATGAATTTGAACTACGGTAGCTTTGATGATGACGTCATTGTTGCATTTCCAAATCAGGCTGTAATGGAATTTGACGGATTAGTGGATTTTAAGTGTTGGATGCAGATTGATGAGGATGTTGACTATCTTCCTTATGCTGATCAAATACAGTCACTGACCTCTTTGTTCGATATAGGAGGTGAATTCTAG
上述两个转录因子应用于兰花中进行转基因育种，则可以有效促进兰花中花色苷的形成，培育出花朵具有红色性状的兰花。
下面将以在蝴蝶兰中进行瞬时过表达RcPAP1和RcPAP2为例，对利用上述两个本发明提供的转录因子进行转基因育种的实现过程进行描述，进而验证相应的转基因育种过程的可行性。
本发明提供的利用上述转录因子RcPAP1和RcPAP2进行兰花中促进花色苷形成的具体实现过程如下：
步骤1，从KOVA花瓣中提取RNA(核糖核酸)，并反转录成cDNA(互补DNA或拷贝DNA)。然后利用RcPAP1、RcPAP2的克隆引物分别将其完整的CDS从KOVA的cDNA库中克隆出来。
步骤2，对克隆出来的RcPA(RcPAP1和RcPAP2)序列进行测序，以确定得到的是其完整的CDS序列。
步骤3，将得到的完整的RcPA(RcPAP1和RcPAP2)的CDS序列利用T4连接酶连接到表达载体PCAMBIA1304上。
步骤4，将构建好的表达载体转入到农杆菌Eha105中。将转化好的带有表达载体的农杆菌放入5ml加有卡那霉素和利福平抗生素的LB液体培养基中，在震荡培养箱中27度200转每分钟，培养14-16小时。
步骤5，将培养好的农杆菌放入离心机，6000转每分钟，27度离心10分钟。
步骤6，进行离心处理后，倒掉上清液，然后加入含有1mM的MES和100μM的乙酰丁香酮的MS缓冲液，将OD600调为1为止。
步骤7，将配好的侵染液放入恒温培养箱27度静置1个小时。
步骤8，利用注射器将侵染液注射到距离开花1-2天的白花蝴蝶兰的花苞的花瓣中，然后放在温室，昼夜温差在24～30度，正常光照。
步骤9，经过6-7天后，表型便可出现。
相应的表型出现后的拍照结果如附图1所示：
在图1中，Mock为空白对照；EV为空载体表达对照；OE-RcPAP1和OE-RcPAP2分别为RcPAP1和RcPAP2的过表达植株。从图1中可以明显看见，过表达这两个转录因子后，白色的蝴蝶兰花瓣出现了明显紫红色，进而表明利用本发明提供的RcPAP1和RcPAP2两个转录因子进行转基因育种促进花色苷的形成是可行且有效的。
以上仅以蝴蝶兰为例，相应的转录因子也可以应用于其他种类的兰花中，以促进其花色苷的形成。经过上述实现方案可以看出，本发明可以丰富兰科植物花朵中促进花色苷合成的转基因材料库，利用本发明通过转基因技术可培育出花朵具有红色性状的兰花。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
序列表
<110> 中国林业科学研究院林业研究所
<120> 一种兰花中促进花色苷形成的R2R3 MYB转录因子
<160> 2
<210> 1
<211> 798
<212> mRNA
<213> 卡特兰的R2R3 MYB转录因子1（Rhyncholaeliocattleya PromotedAnthocyanin Pigmentation 1）
<400> 1
ATGGAAAGGGATTCATGTTGTTCGAAGGAAGGGCTCAACAAGGGAGCATGGACTGCCGCT
GAAGACAAGCTCTTGATCACGTATGTCAATACTTATGGAGAAGGCAAATGGACAACAGTT
CCCCATATAGCCGGGCTGAAAAGATCTGGGAAGAGCTGCCGACTCCGATGGTTAAACTAC
CTGAGGCCTGACGTCAAACGTGGAAACTTCTCCGAGGAAGAGGACGACCTCATCATCAGG
CTTCATAAGCTCCTCGGCAATAGATGGTCTCTGATTGCTGGAAGGCTACCAGGAAGAACT
GATAATGAAATAAAAAACTACTGGAACACAACCTTGGCGAAGAAGTCGCGCTTCATGCAT
CTATCTCAAATCCATCAGCCAAGCAACTTACAAAGGCCCCCAGCTTTTGATCATCTACTG
CCATCATCGTCGACATATCCATCTTCTCAAGCCACAAATAATAAAACTTTGAACCGACCT
ATGGTCATAAGGTGCGACAAAGTAGTTTTTCCAGTAGGAGAATCTAGTGTTGTGGCGGCT
TCTGTGATGCCTGAAACCATCAAAGATGGCACCATTATTGAAGAAGAACTGGTTCAAGTT
AAGGAGAATATGGTCATGAAATGCAGCTTTGATGGAAATGTTGCAGTTTCTGATCAAGCT
GTAATGGAATTCAACGGATTGCCGGATTTTGAGAGCTGGATGCTGAATGATGTGGATGGT
GATTGCCTTCCTGATGCTGAGAATGTAGAATGGTTAACTTCTTTATTTGATATAGAAGGT
GAGCTGCATAAGCAATTA
<210> 2
<211> 1122
<212> mRNA
<213> 卡特兰的R2R3 MYB转录因子2（Rhyncholaeliocattleya PromotedAnthocyanin Pigmentation 2）
<400> 2
ATGGGAAGGAGTTCTTACTCTTTCGAGGAGGGGCTCAACAAGGGAGCATGGACTACCTCC
GAAGACAACCTCTTGATAAATTACATCAATAAACATGGAGAAGGCAAATGGACGATGATT
CCGTATAAAGCAGGCCTTAAGAGGTCAGGGAAGAGCTGCCGTCTCCGATGGCTGAACTAC
CTGAGGCCCAACGTCAAACGTGGGAACTTTTCCGAGGAAGAAGATGACCTCATCATCAGG
CTTCATAAGCTCCTCGGCAATAGATGGTCTCTGATTGCTGGAAGACTGCCAGGCAGAACG
GATAATGAAGTAAAAAACTATTGGAACACAACTTTAGGCCGAAAGGTGAATCAACCATGC
ACCATAAAAAGGCCACCAGCTTCAAATGCTTTAATGCCATCATCACCATTACAAGCCACA
AGTGATACAACTTTGATTCGAACAAAGGCCATAAGGTGCAATAAATTAGCTTTTCCATTA
CTGCTTCCATCTTTTTCAGGAAGCAAGCAGGAGATACCAACAAAGCGATTAGCAGGAGAG
TCTAACGCTATGATGACTAATGAGATGCCTGAAAGCAGCAAAGTTAGCCCCAACGTCGAA
GAAGAGCTATTTCAGGAGGAGGAGAATATGGTTCTGAACTATGGTAGCTTTGGTGATGAC
ATCATTGCCGCATTTCCGAATCAAGCTACAATGGAGTTTGACGAATTGATGGATTTTGAG
AGGTGGATGCTAATTGATGACAATGTTGACTATCTTGTTGATGCTGATCAAATACAGTCG
CTGACCTCTTTATTTGATATAGAAGGAAGCAAGCAGGAGATACCAACAAAGCAATTAACA
GGAGAGTCTAAGGCTATTGTGGCTAATGAGATGCCTGAAAGCATCAAAGTTGGCCCCAAC
ATCGCAGAAGAGCTATTTCAGGAGGAGGAGAATATGAATTTGAACTACGGTAGCTTTGAT
GATGACGTCATTGTTGCATTTCCAAATCAGGCTGTAATGGAATTTGACGGATTAGTGGAT
TTTAAGTGTTGGATGCAGATTGATGAGGATGTTGACTATCTTCCTTATGCTGATCAAATA
CAGTCACTGACCTCTTTGTTCGATATAGGAGGTGAATTCTAG

Claims (2)

1.一种兰花中促进花色苷形成的转录因子，其特征在于其CDS序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种兰花中促进花色苷形成的转录因子，其特征在于其CDS序列如SEQ ID NO：2所示。
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