CN103215277A - 从玉米中分离出来的phr基因及其克隆方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了从玉米中分离出来的PHR基因及其克隆方法和应用，包括ZmPHR1和ZmPHR2，序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示。通过玉米PHR基因功能鉴定和玉米PHR基因在低磷处理下的表达分析，以及在模式植物拟南芥中过表达玉米PHR基因，证实其在耐低磷信号通路中的重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及的从玉米中分离出来的PHR基因及其克隆方法和应用。
背景技术
玉米是重要的粮食作物和经济作物，但又属于缺磷敏感的农作物，土壤低磷严重影响着玉米的正常生长发育。潘光堂等通过对多份玉米自交系进行耐低磷力鉴定，筛选出了一批耐低磷种质，耐低磷玉米自交系178就属于其中一个表现优异的种质（张吉海et al.,2008）。研究开发并利用耐低磷玉米自交系178中的优异基因资源，对研究玉米低磷分子机制和培育耐低磷玉米新品种具有重要意义。
植物在遭受低磷胁迫下，会通过磷胁迫信号传递途径，引起一系列相关基因做出应答，调节对磷的吸收、利用、自我平衡，以适应低磷胁迫环境。转录因子调控下游基因的转录起始和表达效率,在基因的调控网络中作用相当于开关基因。在众多磷胁迫应答基因形成的低磷信号途径网络中，MYB类转录因子PHR基因在信号通路中起着至关重要的调控作用。PHR基因属于植物重要转录因子MYB家族中的重要成员，它不仅具有MYB家族含有3个R1R2R3重复结构特征，而且具有预测的coiled-coil(CC)结构域。在许多磷胁迫应答基因的上游顺式元件中，都能找到PHR1的结合位点，成为基因工程改良作物耐低磷的关键靶基因(Franco-Zorrilla et al.,2004)。
在拟南芥中，PHR1基因的突变，引起一系列低磷应答基因不表达或表达量的降低，证明其在低磷胁迫信号通路中的重要作用（Rubio et al.,2001）。最近，有研究表明，PHR1也参与miRNA399的调控，而miRNA399在低磷胁迫中下调了许多应答低磷下游基因的表达。值得注意的是，Zhou等（2008）所在课题组，尽管早先成功地从水稻中克隆了具有bHLH结构域的OsPTF1转录因子，但仍然特别注重研究拟兰芥中具有MYB类结构域特征的AtPHR1转录因子，课题组从水稻中分离出了与该基因同源的水稻磷胁迫转录因子基因（OsPHR2），干涉该基因后抑制了下游基因磷转运子的表达，经过量表达后，显著地提高转基因水稻植株的耐低磷特性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种从玉米中分离出来的PHR基因及其克隆方法和应用。
本发明的技术方案如下：
从玉米中分离出来的PHR基因，包括ZmPHR1和ZmPHR2，序列如SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：20所示。
所述的PHR基因，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示。
所述的PHR基因的克隆方法，包括以下步骤：1）取3叶期的耐低磷玉米自交系178幼苗，采用Trizol试剂盒提取总RNA；2）RNA反转录成cDNA：5×PrimeScriptTM Buffer2μL，PrimeScriptTM RT Enzyme MixI0.5μL，OligodTPrimer(50μM)0.5μL，Random6mers(100μM)2μL，Total RNA2μL，RNaseFree dH2O3μL；37℃反应15min；85℃放置30s终止反应；3）PCR扩增：分别用SEQ ID NO：1-4所示的引物从cDNA中扩增目的基因，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切下目的片段，用天根的琼脂糖DNA分离试剂盒回收目的片段；4）目的基因克隆：将回收的目的片段和宝生物的pMD19-T载体连接，然后将连接产物转化入大肠杆菌DH5α，经菌液PCR和质粒PCR鉴定出阳性克隆，将阳性克隆进行DNA测序。
所述的PHR基因在耐低磷植物新品种的培育中的应用。
本发明通过玉米PHR基因功能鉴定和玉米PHR基因在低磷处理下的表达分析。以及在模式植物拟南芥中过表达玉米PHR基因，证实其在耐低磷信号通路中的重要作用。
附图说明
图1ZmPHR1全长序列；
图2ZmPHR2全长序列
图3为ZmPHR基因低磷处理下组织特异性表达；a：ZmPHR1在178叶中的相对表达量；b：ZmPHR2在178叶中的相对表达量；c：ZmPHR1在178根中的相对表达量；d：ZmPHR2在178根中的相对表达量；
图4为ZmPHR2酵母转录激活功能验证；
图5为ZmPHR基因超表达拟南芥阳性材料T0代筛选结果；
图6为ZmPHR基因超表达拟南芥阳性材料检测；CK+:以含目的基因的植物表达载体为模板；CK-：以野生型拟南芥基因组DNA为模板；水：以水为模板；M：DNA marker；a：ZmPHR1转基因拟南芥检测；b：ZmPHR2转基因拟南芥检测
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1：玉米ZmPHR基因的克隆
1）总RNA提取
按照总RNA提取试剂盒Trizol(Invitrogen)的说明提取总RNA：
(1)取耐低磷玉米自交系178的根和叶放入液氮预冷过的研钵，立即加入液氮，尽可能的研磨碎样品，将样品按每管100mg分装入1.5mL离心管中，立即向每管加入1mL Trizol，剧烈振荡15sec后，室温放置5min。4℃，12000×g离心5min，吸出上清液转入另一干净的1.5mL离心管中。
(2)向每管加入200μL氯仿，剧烈振荡15秒后，室温放置5min，4℃，12000×g离心15min，吸出上清液转入另一干净的1.5mL离心管中。
(3)向每管加入600μL异丙醇，轻轻混匀后，室温放置10min，4℃，12000×g离心10min，小心倒掉管中的液体，加入1mL75%乙醇洗涤沉淀。
(4)4℃，7500×g离心5min，小心倒掉管中液体，加入1mL75%乙醇洗涤沉淀，4℃，7500×g离心5min，小心倒掉管中液体，再加入1mL无水乙醇洗涤沉淀，-20℃保存沉淀。
取部分样品倒掉乙醇，空气中干燥后，每管加入50μL RNase-Free水溶解沉淀，用核酸蛋白仪(SMARTSPECTM300型，Bio-Rad公司)测定样品的OD260、OD260/280和浓度，计算出样品的纯度。并用1%琼脂糖凝胶电泳，120V电压，20min检测RNA完整性。
2）cDNA的合成
反应体系：5×PrimeScriptTM Buffer2μL，PrimeScriptTM RT Enzyme MixI0.5μL，OligodT Primer(50μM)0.5μL，Random6mers(100μM)2μL，RNaseFree dH2O3μL，Total RNA2μL。37℃反应15min，85℃反应30s终止反应。
3）根据预测的候选基因ZmPHR1和ZmPHR2的基因序列,采用PrimerPremier5.0软件设计全长引物：
ZmPHR1-F CGCTCGAGCTCTGTTGGAG
ZmPHR1-R GGTCGGAGACCAAACTAAAGC
ZmPHR2-F CGCACCCCCCGCAAACATC
ZmPHR2-R TACCCCATAACTTCGGGGATAGCTC
4）PCR反应
反应体系为：TaKaRa LA Taq（5U/μL）0.5μL，2×GC Buffer I（5mM Mg2+Plus）25μL，dNTP Mixture（各2.5mM）8μL，cDNA模板0.5μL，ForwardPrimer(20μM)1μL，Reverse Primer(20μM)1μL，ddH2O14μL。
反应条件：95℃反应3min；95℃反应30s，52℃反应30s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃再延伸10min。
电泳结果如图1和图2所示，ZmPHR1和ZmPHR2全长cDNA序列大小分别为为1936bp和1743bp。
5）PCR目的片段回收纯化
采用北京天根生物科技有限公司的Universal DNA Purification Kit纯化PCR回收产物，操作步骤如下：
（1）向吸附柱CB2中加入500μL平衡液BL，12000r/min室温离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（2）用干净的手术刀，将单一的目的条带从琼脂糖中切下（尽可能的切除多余凝胶）放入干净的1.5mL PE管中，称其重量；
（3）向凝胶中加入等体积的溶液PC（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL PC溶液），混匀后置于55℃水浴锅内，放置10min使胶块彻底融化，期间不断温和地上下翻转离心管；
（4）将吸附柱放入2mL收集管中，将融化的凝胶液（冷却至室温）转移到吸附柱中，12000r/min室温离心1min；
（5）取下吸附柱，倒掉收集管中废液，将吸附柱放入原收集管中，加入700μL漂洗液PW，12000r/min室温离心1min；
（6）重复步骤（5）；
（7）倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入原收集管中，12000r/min室温离心2min，尽量出去残余液体；
（8）将吸附柱放入一个干净的1.5mL PE管中，在吸附膜中间位置悬空加入40μL65～70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2min,12000r/min室温离心2min回收DNA片段。
6）目的基因克隆
将回收的目的片段和宝生物的pMD19-T载体连接，然后将连接产物转化入大肠杆菌DH5α，经菌液PCR和质粒PCR鉴定出阳性克隆，将阳性克隆进行DNA测序。
实施例2：玉米ZmPHR基因低磷处理下组织特异性表达
1）材料处理
选用饱满一致的耐低磷自交系178（178是由美国杂交种P78599经自交，在自交后代中选择得到的自交系，为中国农业大学公共发放材料）的种子，在28℃光照培养箱中催芽至3叶1心期，选取整齐一致的幼苗进行处理，两个供磷水平为低磷(1μM/L)和高磷(1mM/L)，培养条件为每天光照12小时，温度保持在28℃，营养液配方参考Hoagland营养液配方。
2）总RNA提取和反转录为cDNA
取178低磷处理0h、6h、12h、24h、48h、72h后的根系和叶片提取总RNA并反转录成cDNA。提取总RNA和反转录成cDNA方法见实施例1。
3）设计荧光定量PCR特异性引物
4）以实施案例2步骤2）中反转录成的cDNA为模板，进行实时定量PCR反应，反应程序为：95℃反应30s；95℃反应5s，59.1℃（ZmPHR1）/60.7℃（ZmPHR2）30s，95℃10s后采集荧光信号，共40个循环；从65℃每隔0.5℃采集荧光信号，直至95℃进行溶解曲线分析。
5）结果如图3所示，从a和b图对比可以看出，ZmPHR1和ZmPHR2在低磷胁迫下叶中的表达量出现明显差异，ZmPHR2在叶中显著的上调表达。
实施例3：玉米ZmPHR2基因转录激活功能验证
1）ZmPHR2转录激活功能验证载体构建
（1）选取目的片段
2：ZmPHR2全长CDS，164-1513bp；
2-1:164-949bp；
2-2:980-1513bp。
依据目的片段设计带酶切位点特异性引物
（2）以实施例1中克隆测序的ZmPHR2序列为模板，进行PCR反应，取反应产物连接pMD19-T载体连接，然后将连接产物转化入大肠杆菌DH5α，经菌液PCR和质粒PCR鉴定出阳性克隆，将阳性克隆进行DNA测序。
（3）用EcoR I和Sal I同时双酶切pGBKT7和连接有目的片段的pMD19-T载体，然后将酶切产物连接，转化DH5α，经菌液PCR和质粒PCR鉴定出阳性克隆，并提取质粒保存。
2）转录功能鉴定
将构建好的载体转化入酵母Y2HGold菌株中，筛选出阳性克隆。在营养缺陷型固体培养基SD/–Trp，SD/–Ade/–His/–Trp/X-α-Gal上进行转录激活功能验证。结果如图4左图在SD/–Trp上筛选结果；图4右图为SD/–Ade/–His/–Trp/X-α-Gal筛选结果。表明ZmPHR2具有转录激活功能区域为C末端。
实施例4：玉米ZmPHR基因转化拟南芥用过表达载体构建
1）根据实施例1中克隆得到的ZmPHR1和ZmPHR2序列和pCAMBIA3301载体MCS位点设计带酶切位点引物
2）以实施例1中克隆测序的ZmPHR1和ZmPHR2序列为模板，进行PCR反应，取反应产物连接pMD19-T载体连接，然后将连接产物转化入大肠杆菌DH5α，经菌液PCR和质粒PCR鉴定出阳性克隆，将阳性克隆进行DNA测序。
3）用Xba I和Sac I同时双酶切pCAMBIA3301和连接有目的片段的pMD19-T载体，然后将酶切产物连接，转化DH5α，经菌液PCR和质粒PCR鉴定出阳性克隆，并提取质粒保存。然后将提取的质粒转化入农杆菌DHA105中，筛选出阳性克隆，以待转化拟南芥中。
4）转化拟南芥
（1）种植拟南芥直至到出现花苞。
（2）转化拟南芥
接种农杆菌DHA105于YEP培养液中，28℃，3000rpm摇过夜，约30小时。将活化的菌液转至含300mL YEP+Kna+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，直至OD600在1.5～3.0之内时，可收集菌体于250mL离心瓶（灭菌）,4℃，4000rpm离心10min。用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600约为0.8-1.0左右即。转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。
5）阳性过表达材料筛选
待转化的拟南芥材料收种后，将种子播种到营养土中，待长到4叶时进行筛选试验，选择合适的除草剂浓度梯度，喷洒到待鉴定的转基因拟南芥幼苗上，结果如图5图和图6，T0代共筛选出ZmPHR1和ZmPHR2拟南芥阳性材料分别为2和11株，能够成活的拟南芥幼苗收种再进行筛选，直至T3代。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.从玉米中分离出来的PHR基因，其特征在于，包括ZmPHR1和ZmPHR2，序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示。
2.根据权利要求1中所述的PHR基因，其特征在于，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示。
3.权利要求1或2所述的PHR基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：1）取3叶期的耐低磷玉米自交系178幼苗，采用Trizol试剂盒提取总RNA；2）RNA反转录成cDNA：5×PrimeScriptTM Buffer2μL，PrimeScriptTM RTEnzyme MixI0.5μL，OligodT Primer(50μM)0.5μL，Random6mers(100μM)2μL，Total RNA2μL，RNase Free dH2O3μL；37℃反应15min；85℃放置30s终止反应；3）PCR扩增：分别用SEQ ID NO：1-4所示的引物从cDNA中扩增目的基因，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切下目的片段，用天根的琼脂糖DNA分离试剂盒回收目的片段；4）目的基因克隆：将回收的目的片段和宝生物的pMD19-T载体连接，然后将连接产物转化入大肠杆菌DH5α，经菌液PCR和质粒PCR鉴定出阳性克隆，将阳性克隆进行DNA测序。
4.权利要求1或2中所述的PHR基因在耐低磷植物新品种的培育中的应用。
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