CN105463012B - 具有黄瓜CsMADS09基因的表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄瓜基因CsMADS09的表达载体及其在增加果荚数量中的应用，属于生物技术领域。该表达载体为含有双35S启动子和黄瓜CsMADS09基因植物表达载体。在拟南芥中过量表达CsMADS09，获得的CsMADS09转基因植株顶端果荚数明显增加。利用CsMADS09基因获得的果荚数增加的特性可以有效地利用到其它物种上来增加产量。

Description

具有黄瓜CsMADS09基因的表达载体及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种黄瓜MADS-box基因CsMADS09过表达载体及其应用。

背景技术

MADS-box基因是一类序列特异的调节基因家族，它所编码的MADS-box蛋白因子为转录因子，其主要功能是激活或抑制基因的转录反应。MADS-box转录因子是通过二聚体的形式以其保守结构域与特定的DNA序列相结合来调控基因的表达。

在植物中，MADS-box基因的分布几乎遍布整个植物界，除在双子叶植物拟南芥、金鱼草、葡萄、矮牵牛和杨树等植物中广泛存在外，在单子叶的水稻、玉米、小麦、高粱等中也大量分布。MADS-box基因一般以基因家族的形式存在，在植物生长发育不同阶段如苗期、花期、在植物的不同部位，如营养器官根、茎、叶和生殖器官花、果实、种子中MADS-box基因都有不同程度的表达，并在其中起重要的调控作用。

MADS-box基因最显著的作用是参与花器官的形态建成。研究表明，双子叶拟南芥花器官的发育可以归纳为花发育的ABCDE模型。该模型认为，花器官是A、B、C、D和E五类基因共同表达的结果，这五类基因基本上都为MADS-box基因。A类基因 (APETALA1, AP1；APETALA2, AP2)单独决定萼片，A类基因和B类基因 (APETALA3, AP3; PISTILLATA, PI)共同决定花瓣，B类基因和C类基因 (AGAMOUS, AG) 共同决定雄蕊，C类基因单独决定心皮，同时，C基因还参与分生组织决定性的调控。D类基因SEEDSTICK（STK）的功能与C基因部分重叠，影响胚珠的发育。E基因SEPALLATA1-SEPALLATA4（SEP1-SEP4）在全局上对花瓣、雄蕊和雌蕊进行调控。

MADS-box基因还参与其它生长发育过程，在拟南芥中分离出了与开花早晚相关的AGL20、AGL24、COSANS、SOC1、FLC、FLM、FRI和SVP等。在番茄中分离出一个与其成熟相关的MADS基因LeMADS-RIN，在香蕉中分离出一个在香蕉后熟过程中起重要作用的MuMADS1基因。耧斗菜的FRUITFULL-like参与叶的发育，胡椒的CaJOINTLESS基因可以抑制茎的分生组织的生长。MADS-box基因通常以基因家族的形式存在，目前仅对极少部分的成员进行克隆的功能的鉴定分析，大多数的成员需要进行深入的研究，这也暗示MADS-box可能还参与许多我们还不清楚的发育和调控过程。

黄瓜属葫芦科植物，广泛分布于中国各地，为主要的温室产品之一。2009年黄瓜基因组测序的完成为从分子水平上研究黄瓜基因的相关功能提供了可能。

MADS-box基因在植物的各个生长发育阶段起着重要的作用，但其在黄瓜中的功能还知之甚少，值得进一步的研究。我们的研究发现，黄瓜中的CsMADS09基因的过量表达的拟南芥顶端的果荚数明显增加，利用这一特性可运用到其它物种上来增加产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄瓜CsMADS09基因花特异表达载体及及其增加果荚数量中的应用，该载体含有黄瓜CsMADS09，基因的上游连有双35S启动子。

本发明的上述植物表达载体为PHB-CsMADS09，由下述方法构建而成：

（1）根据CuGI（http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp）上公布的黄瓜CsMADS09的序列（Csa013130），设计两端引物：CsMADS09-F：5’-aaaaAAGCTTATGGGAAGAGGTAGGGTTCA-3’（含Hind III位点）CsMADS09-R：5’-aaaaTCTAGATTACCCAATGTTTAGAGAGG-3’（含XbaI位点）。以黄瓜花蕾的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得CsMADS09全长。

（2）回收CsMADS09的cDNA全长，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-CsMADS09。

（3）使用Hind III和XbaI酶切pMD18-CsMADS09，回收CsMADS09片段，同时用HindIII和XbaI酶切PHB，回收后连接，转化感受态细胞，获得植物表达载体PHB-CsMADS09。

本发明的另一目的是公开黄瓜CsMADS09在遗传改良中的基因工程应用，该基因导入拟南芥后，获得的CsMADS09转基因植株的果荚数量增加，萼片膨大卷曲、萼片异生出类似柱头状的器官，可以应用在生产实践中改造花卉的形状和提高作物的产量。

附图说明

图1为本发明中CsMADS09全长扩增后的电泳示意图；

图2为本发明表达载体PHB-CsMADS09的Hind III和XbaI双酶切电泳检测图；

图3为转基因植株的PCR鉴定图；

图4为过量表达CsMADS09的转基因拟南芥植株的表达分析，其中A为野生型；B-C为转基因植株株系。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。

实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连) 产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，TRIzoL Reagent RNA 提取试剂购自invitrogen公司，高保真酶KOD-Plus购于TOYOBO公司，DNaseⅠ购于天根生化科技（北京）有限公司，DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例１：表达载体PHB-CsMADS09的构建

(1)引物设计：

根据CuGI（http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp）上公布的黄瓜CsMADS09的序列（Csa013130），设计两端引物：CsMADS09-F：5’-aaaaAAGCTTATGGGAAGAGGTAGGGTTCA-3’（含Hind III位点）CsMADS09-R：5’-aaaaTCTAGATTACCCAATGTTTAGAGAGG-3’（含XbaI位点）。

（2）黄瓜花蕾总RNA的提取

所用黄瓜品种为华北型黄瓜。取长度约0.7 mm的花蕾1mg，取材后立刻冻到液氨中，采用TRIzol（Invitrogen，USA）试剂法提取总RNA：加1.5 ml Trizol后，室温放置5 min，使其充分裂解。12,000rpm 离心5 min，弃沉淀。加200 ul氯仿，振荡混匀后室温放置15min。4℃ 12,000g 离心15 min。吸取上层水相，至另一离心管中。加0.5ml 异丙醇，混匀，室温放置30 min。4℃ 12,000g 离心10 min，弃上清。用1ml 75%乙醇洗涤2次沉淀。4℃ 8,000g 离心5 min，弃上清。室温晾干10 min。用50uL H₂O（Rnase free）溶解RNA。

（3）黄瓜花蕾总cDNA第一链的合成

黄瓜花蕾RNA用DNaseⅠ处理后用于以Oligo(dT)₁₈为引物的反转录：取RNA 15 uL，加Oligo(dT)₁₈ 1uL，混匀，70℃保温5min，立即冰水浴，稍离心，依次加入10×M-MLV Buffer2 uL、dNTP (10mM) 1 uL、RNasin (40U/uL) 1 uL、M-MLV (200U/uL) 1uL，总体积20 uL，混匀，42℃保温60min，95℃ 10min 灭活M-MLV酶活性，-20℃保存。

（4）CsMADS09基因的扩增

设计特异性引物: CsMADS09-F和CsMADS09-R为引物，以第一链产物为模板，用长片段、高保真酶KOD-Plus进行PCR扩增，PCR 反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s；55℃ 30s；68℃ 1.0 min，40个循环；68℃ 5 min。PCR 产物用1.5%琼脂糖进行电泳检测，扩增片段大小与预期大小基本一致（图1）。

（5）CsMADS09片段的胶回收

对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。

（6）CsMADS09片段加尾

取1.5 ml灭菌的eppendorf管，依次加入回收的PCR产物14μl、10× Taq DNA聚合酶缓冲液2μl、10mM dNTP 2μl、Taq DNA聚合酶2μl；72℃处理45 min；先加0.18 mL无菌水，再加20μl 3M醋酸钠，混匀，最后加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀2hr，12,000rpm，4℃离心10min。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀2次。DNA晾干后加入20μL无菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于-20℃保存备用。

（7）CsMADS09片段的T/A克隆和测序

将回收片段连接到pMD18载体上，其具体步骤为：向1.5 ml离心管中分别加入：CsMADS09片段的cDNA 5μl、pMD18载体0.5μl、10×T4 DNA连接酶缓冲液 1μl, T4 DNA连接酶 1μl，加无菌水至10μl，用封口膜封好；置于16℃连接4-6h。将100μl 感受态肠杆菌E.coli DH5α加入连接体系中混匀；混合液冰浴30 min，42℃热刺激90 s后，冰浴5 min；加入800μl LB液体培养基，37℃、200 rpm摇床培养45min 使菌体复苏；培养结束后，常规3,000 rpm 离心2 min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml 时，使用移液枪混匀，接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37℃过夜培养；挑取菌落接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，收集菌体，采用质粒抽提试剂盒提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒pMD18-CsMADS09，具体方法为：向0.5 ml的离心管中分别加入：质粒DNA（50ng/μl）2μl、Hind III 0.5μl、XbaI 0.5μl、10×buffer（M）2μl，使用无菌水补足20μl；37℃反应4h；然后将酶切正确的重组质粒pMD18-CsMADS09进行测序验证插入基因的正确性。

（8）表达载体PHB-CsMADS09的构建

使用Hind III和Xba I对质粒pMD18-CsMADS09和PHB载体进行双酶切，分别获得5’端带有Hind III和3’端带有Xba I的CsMADS09片段和PHB载体，电泳后分别进行胶回收，16℃连接4-6h；将100μl感受态肠杆菌E.coli DH5α加入6μl连接体系中混匀；混合液冰浴30min，42℃热刺激90s后，冰浴5 min；加入800μl LB液体培养基，37℃、200 rpm 摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后，常规3,000 rpm 离心1 min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml时，使用移液枪混匀，接入带有Kan抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37℃过夜培养；挑取菌落接种于LB液体+Kan的培养基，37℃、180rpm培养12h后，提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒PHB-CsMADS09，具体方法为：向0.5 ml 的离心管中分别加入：质粒DNA（50ng/μl）2 μl、Hind III 0.5μl、XbaI 0.5μl、10×buffer（M）2μl，使用无菌水补足20 μl；37℃反应4h；经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现，重组质粒PHB-CsMADS09可酶切出预期大小左右的片段（图2）。将酶切正确的重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序进行序列验证（其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示），经测序发现，获得的CsMADS09的序列比预测的序列多出42bp，具体位置为SEQ ID NO1的第433-474bp。最后获得表达载体命名为PHB-CsMADS09。

实施例2：PHB-CsMADS09转农杆菌GV3101

（1）农杆菌感受态细胞制备

挑取农杆菌GV3101单菌落接种于5ml YEB培养基中，28℃摇培过夜，按1:100的比例接种于50 ml YEB培养基中扩培，28℃继续培养约6-7h至OD600=0.4-0.6。将菌液置于冰上30min；5,000 rpm，4℃离心5min，弃上清，将菌体悬于10 ml 0.15 M NaCl 中；5,000rpm，4℃离心5min，弃上清，菌体用1 ml 20 mM CaCl₂，4℃）轻轻悬浮，每管 200μl分装，或加入终浓度为 20％的无菌甘油，-70℃保存。

（2）农杆菌的转化及鉴定

将10μl 质粒DNA加入200μl农杆菌感受态中，混匀，冰浴30min，液氮冷冻 3-5min，37℃水浴5min，加入1ml YEB培养基，28℃摇培3-4h。1,0000rpm，室温离心 30s，弃上清，加入200μl YEB培养基重悬菌体，涂于YEB培养基上，28℃培养2天；碱裂解法提取农杆菌质粒DNA，酶切验证。质粒再重新转化大肠杆菌（DH5α），过夜培养后，挑取单菌落液体培养，提取质粒DNA，再用酶切鉴定。

实施例3：含PHB-CsMADS09的农杆菌GV3101转化拟南芥

（1）拟南芥的种植

①）所用的拟南芥为Columbia野生型拟南芥，为江西农业大学作物生理生态与遗传育种重点实验室保存。将当年收获的种子种植后4度春化72 h，隔年种子种植后春化24h。然后转入人工培养室中在相对湿度80%，恒温20-24℃，光照强度80-200 μmol/M2/S，光照周期为8 h黑暗﹑16 h光照培养。所用的土为3份蛭石，1份珍珠岩和2份黑土混合而成。

② 将营养土用塑料盆装好，在托盘里加入营养液，待营养土吸水潮湿后，开始点种。

③ 将拟南芥的种子放在平铺的纸上，用牙签将拟南芥的种子点在土上。用保鲜膜盖好，暗培养两天，四天后揭掉保鲜膜正常培养。

④ 土稍干时可再浇一次营养液，以后浇水即可。若要做转化，待抽薹2到3cm时，剪除顶花序，用营养液再浇灌一次。

⑤ 种子的收集：拟南芥完全成熟后，停止浇水待植株干燥后将拟南芥剪下放在一张干净的光面纸上收集种子，尽量将杂物去干净，便于筛选。

（2）拟南芥的转化和转化子的筛选

① 制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10 ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液OD600当在1.2到1.6之间。室温5,000 rpm离心10min。弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使OD600在0.8左右。

② 先将植株上已长出的果荚及开放的花剪掉，再将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株，主要喷洒在花序上。盖上透明的塑料盖子以保持湿度，移入恒温室避光培养，第二天可开盖，正常光照培养。

③ 一周后再喷洒一次，收种子，在相应的抗性1/2 MS平板上筛选转化子。

④ 转化子的筛选：种子消毒，先用70%乙醇浸泡10 min，在上述处理时要不时地使种子悬浮，并换一次70%乙醇。最后用无菌水洗四次。

⑤ 处理后的种子用Top agar（0.1%琼脂水溶液）均匀涂布在相应的抗性固体筛选培养基表面，每块150 mm直径的平皿最多种1500棵。

⑥ 4℃春化2到3天，移入22℃恒温室培养。将筛选得到的转化子长到合适的大小后移栽到土壤中。

实施例4：转基因植株的鉴定和分析

(1)拟南芥DNA的提取

将适量的经筛选的拟南芥叶片放入1.5 ml的离心管中，加入400 μl的SDS抽提缓冲液，用蓝色小棒研磨成浆状，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），猛烈摇匀，12,000rpm，离心10 min。取上清至新的离心 管中，加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M 醋酸钠 (PH5.2)，剧烈混匀使DNA成团，放入-20℃沉淀2hr以上。随后12,000 rpm，离心10min。弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤一次后室温晾干，加适量的TE或超纯水溶解。

（2）转基因拟南芥植株的鉴定

以抽提的DNA为模板、使用引物CsMADS09-F和CsMADS09-R进行PCR扩增CsMADS09片段，PCR的25μl体系为：PCR缓冲液（10×）2.5μl、Taq 0.5μl、cDNA模板2μl、10mM dNTP 0.5μl、10μM CsMADS09-F和CsMADS09-R引物各1μl、使用无菌水补足25μl。反应条件为：94℃5min，35个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，72℃反应10min。检测结果如图3所示。

(3)转基因拟南芥植株表型分析

通过PCR和RT-PCR的结果，对获得的阳性植物进行观察，获得的CsMADS09转基因植株的顶端的果荚数量增加到2-3个（图4）。

SEQ ID NO：1

〈210〉：1

〈211〉:648

〈212〉：DNA

〈213〉：黄瓜（Cucumis sativus L.）

〈400〉: 1

ATGGGAAGAG GTAGGGTTCA ATTGAAAAGG ATTGAGAACA AAATAAACAG GCAAGTAACT 60

TTCTCAAAAA GGAAAGCTGG ATTACTGAAG AAGGCTCATG AAATCTCTGT TCTTTGTGAT 120

GCTGAAGTTG CTTTGATTGT TTTCTCCCAC AAAGGAAAAC TCTTTGAATA CTCCTCTGAT 180

TCCAGCATGG AGAAAATACT TGAACGGTAT GAGAGATATT CTTTTGTGGG AAGGCAACAA 240

AATGCAGCTT CTGAATCTGA ATTTTCTTAT GAAAATTGGA CTCTTGAATA CTACAGACTC 300

AAGTCCAAAG TCGAACTTCT ACAACGAAAC AACAGTCATT ATATGGGAGA AGATTTGGAT 360

TCGTTGAGTG TCAAAGAACT GCAAAACTTG GAACAACAAA TTGACACTGC ACTTAAACAT 420

GTTCGAACCA GAAAAAACCA ACTTATGTTT GAGTCCATCA CTGACCTCCA AAAAAAGGTA 480

AGAAATATAG AGGAGAACAA TGTCCAACTG GCTAAGCAGA TAAAGGAGAA AGAGAAGAGT 540

GTAGCATTGG CACAACAAGC AGAATGGGAG CACCAGCAAC AGCAGGGTTA CAATGCTTTG 600

TCTTTCTTAT TCCCACCACC TCCTCATCCC TCTCTAAACA TTGGGTAA 648

Claims (1)

1.具有CsMADS09基因的表达载体在增加拟南芥果荚数量上的应用, 该表达载体含有黄瓜CsMADS09的编码区全长、双35启动子，所述CsMADS09基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。