CN101451138A - 一种植物单性结实调控基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与植物单性结实相关的基因，特别涉及调控茄子单性结实的生长素响应因子SmARF8，该基因cDNA序列全长3750bp。本发明还涉及将本发明的单性结实相关基因在茄子中干涉表达的方法。本发明的基因可以使转基因植物发生单性结实，从而提高品质，延长保鲜贮藏期，并且操作方法简单。

Description

一种植物单性结实调控基因及其应用

技术领域

本发明涉及利用分子生物学方法从植物中分离得到植物单性结实调控基因及其应用，特别涉及茄子调控单性结实的生长素响应因子基因及其应用。

背景技术

开花植物的果实发育和种子的产生依赖于柱头的授粉和子房的双受精过程。不利的环境条件会阻碍很多植物的果实产生和发育，过高或过低的温度和湿度都会对果实生长过程的每一个环节造成不利影响，如花粉的形成、传播和萌发、受精和种子成熟过程等等，从而影响作物的产量和质量。另外果实中种子的生长发育，会使果实加快衰老，产量和商品性降低，影响销售。单性结实是指植物不经过授粉和受精就能正常结果和果实生长的现象，能在低温或高温等不利于授粉和受精的逆境条件下产生无籽的果实。同时，单性结实的果实因不经受精而无籽，品质明显提高，商品性得到改善，保鲜贮藏期延长，更受消费者的欢迎。因此，世界各国都十分重视作物单性结实的研究。

许多激素如GA，生长素和细胞分裂素，都参与到果实和种子发育的信号传导过程，它们的含量和活性增加会促进结果和果实生长，促进包括细胞分裂、细胞增大和产生种子等过程的果实成熟。拟南芥等作物在施加外源生长素的情况下，能诱导产生单性结实。Rotino等采用基因工程手段成功，在子房和卵子中表达生长素合成基因，使茄子子房中的生长素含量大大增加，导致茄子子房未经受精而直接膨大发育成果实，获得了单性结实品种，并在番茄(Solanaceae)、葡萄(Vitaceae)等蔬菜水果上得到广泛利用。

Ulmasoy等(Ulmasov T.，Hagen G and Guilfoyle TJ.Dimerization and DNA bindingof auxin response factors.Plant J，1999(19)：309-319；Ulmasov T.，Hagen G andGuilfoyle T J.Activation and repression of transcription by auxin response factors.Proc Natl Acad Sci USA，1999(96)：5844-5849.)研究表明生长素响应因子(AuxinResponse Factors)，简称ARFs，能和生长素早期诱导基因如Aux/IAA、SAUR和GH3等家族的启动子响应元件(AuxREs)TGTCTC特异结合，是生长素调控植物生长发育的关键基因。拟南芥突变体fwf(arf8-4)(fruit without fertilization)能在去雄下未经授粉和受精单性结实产生无籽果实，基因克隆表明是由于ARF8基因翻译起始位点ATG突变为ATA引起的。拟南芥ARF8基因编码阅读框T-DNA插入突变体arf8-1和arf8-6在去雄情况下均能单性结实，而编码阅读框上游942bp处的T-DNA插入突变体arf8-5则未能在去雄下单性结实。这些结果说明拟南芥ARF8基因的编码区域突变功能缺失而导致单性结实。Goetz等将突变基因arf8-4转基因到番茄中表达发现同样能在去雄下未经授粉和受精而单性结实，形成无籽果实。并从番茄中克隆获得了SlARF8基因，结果域分析发现拥有与ARF8基因同样的保守功能域，因此推断它与拟南芥ARF8基因同样的方式控制果实发育。这些结果都表明了ARF8基因能直接调控植物单性结实，并且保守功能域行使主要功能。这为生长素调控植物单性结实的分子机制提供了直接的证据。但到目前为止仍未见到关于茄子单性结实的分子调控的报导。茄子(Solanum melongena L.)在世界各地普遍栽培，是我国城乡居民喜食的主要蔬菜种类之一，因此获得茄子的调控单性结实基因，利用转基因植物培育无籽或少籽茄子品种具有重大的经济利益。

发明内容

本发明的目的是提供一种调控植物调控单性结实的生长素响应因子基因，特别是茄子生长素响应因子基因及其应用，以使具有生长素响应因子基因的转基因植物能单性结实。

本发明提供的利用分子生物学手段从茄子中分离得到的生长素响应因子基因，命名为SmARF8。所述SmARF8的核苷酸序列是序列表中的SEQ ID NO：8，长度为3750bp。所述茄子生长素响应因子表达的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID NO：9。

本发明还提供了一种获得上述生长素响应因子的方法。是以茄子根茎叶的总RNA反转录获得的cDNA为模板，以引物P1(SEQ ID NO：1)和引物P2(SEQ ID NO：2)进行PCR扩增克隆茄子中的ARFs基因片段(SEQ ID NO：3)，所得ARF基因片段长度为477bp。根据克隆获得的茄子ARF基因片段分别设计5′-RACE引物(SEQ ID NO：4)和3′-RACE引物(SEQ ID NO：5)。根据Clontech公司的RACE试剂盒SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit(PT3269-1)，分别做5′-RACE和3′-RACE试验，进行全长cDNA的克隆。得到长度为3750bp的cDNA全长序列SmARF8(SEQ ID NO：8)。BLASTN分析结果表明，该序列与拟南芥调控单性结实基因ARF8cDNA序列的一致性为53.7％，氨基酸序列的同源性为54.7％。

本发明提供了一种利用SmARF8构建植物表达载体及其转化茄子的方法。

附图说明

图1 茄子总RNA提取的糖凝胶电泳分析

图2 SmARF8RT-PCR扩增产物凝胶电泳分析

图3 5′-RACE和3′-RACE扩增片段琼凝胶电泳分析

图4 SmARF8全长cDNA的序列扩增产物凝胶电泳分析

图5 SmARF8氨基酸序列的结构域分析

图6 SmARF8及其蛋白的氨基酸序列系统进化树

具体实施方式

下面结合本发明的具体实施例，作进一步详述。

实施例1：茄子中的ARFs基因的克隆与分离

1.1 试验材料及试剂

材料：杭州红茄植株由浙江省农业科学院蔬菜所提供。植株种于室温，于旺盛生长期分别取根、茎、叶、花蕾、花朵、果实，液态冷冻后保存于-72℃超低温冰箱。试剂：总RNA的提取试剂盒(RNeasy Plant Mini Kit)购自QIAGEN公司。MMLV逆转录酶购自Promega公司，Taq DNA聚合酶和pMD-19T载体购自宝生物公司(大连)有限公司(TaKaRa)。SMARTTMRACE cDNAAmplification Kit(PT3269-1)购自Clontech公司，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。凝胶回收试剂盒购自杭州Vgene公司。序列测定均由北京华大生物技术有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA第一链的合成

取茄子不同组织用液氮碾磨后，参照RNeasy Plant Mini Kit试剂盒说明书的步骤提取总RNA，将它们等量混合，以SuperScript TM II反转录酶合成cDNA第一链。

采用1％凝胶电泳检测RNA的完整性。从图1可以清晰地看到28S和18S rRNA的2条主带，28S/18S的亮度比大于2，最前面的5S rRNA隐约可见。这表明总RNA纯度较高，符合试验要求。

1.2.2 获得茄子中生长素响应因子基因

1)由于ARFs家族基因的同源域保守性，根据已知序列的保守域设计简并引物P1(SEQ IDNO：1)和P2(SEQ ID NO：2)。

P1：5′GGAAG(A)TTT(C)AGGCAT(C)ATC(T)TTTC G 3′

P2：5′CA(T)GTC(T/A)GATTCA(G)TCCCAA(T/C)CCAACC 3′

2)以步骤1.2.1中获得的茄子cDNA第一链为模板，P1/P2引物进行RT-PCR扩增。

试剂材料：反应体积为50μl，5μl Taq缓冲液(10×)，；lμl dNTPs(2.5mmol·L^-1)，；2μl的P1(10μM)，；2μl的P2(10μM)，；0.2μl；1μl Tag酶(5U·μL-1)。

反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，然后72℃延伸10min。

结果检测：PCR产物经1.0％凝胶电泳检查，表明扩增得到一条约500bp的条带，如图2所示。用PCR产物纯化试剂盒将特异性扩增片段回收，与pMD-19T载体连接，转化大肠杆菌(E.coli)DH5α。对候选克隆进行PCR鉴定，筛选出阳性重组子，送北京华大基因公司进行测序。测序后的准确长度为477bp，编码130个氨基酸。其核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

将核酸序列比对(BLASTN)表明，它与拟南芥ARF8基因的相关区段有54％的一致性，将序列在NCBI网站上进行blast序列分析，与拟南芥ARF8序列同源性最高。

3)利用RACE试剂盒扩增基因

根据克隆获得的SmARF8基因片段序列(SEQ ID NO：3)，分别设计ARF5′-RACE引物P3(SEQ ID NO：4)和3′-RACE引物P4(SEQ ID NO：5)

P3：5′CAAACAGCATCCGGAACCTCATACC 3′

P4：5′CCTCAAACTGTCATGCCTTCTTCGGTC 3′

以茄子不同组织的混合cDNA为RACE模板，根据Clontech公司的RACE试剂盒SMART^TMRACE cDNA Amplification Kit(PT3269-1)，分别做5′_-RACE和3′-RACE试验，进行全长cDNA的克隆，得到如图3所示的5′-RACE和3′-RACE扩增片段。

反应体系：5μl cDNA模板，5μl Taq Buffer(10×)，1μl特异引物(10mmol·L-1)，5μl 10×Universal Primer A mix(10×)，1μl dNTPs(10mmol·L-1)，lμl 50×Advantage2 Polymerase Mix，加dd H₂O至50ul。

PCR反应程序：5次循环：94℃ 30s，72℃ 3min，5次循环：94℃ 30s，70℃ 30s，72℃3min，25次循环：94℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 3min。经扩增，5′-RACE PCR反应出现一条明亮的特异性条带，如图3所示，回收并进行克隆。经测序得到1686bp的扩增片段，其中470bp与简并引物克隆得到的片段的5′-末端序列重叠。于791bp处发现起始密码子atg，其前端序列为5′-端非翻译区，这表明SmARF8基因的5′-端序列已经获得。3′-RACE PCR反应出现一条明亮的特异性条带，如图3所示。克隆测序得到2261bp的特异条带，其中313bp与SmARF8片段的3′-末端序列重叠，在3′-RACE片段中还含有23个T碱基的寡核苷酸序列，说明已经获得了完整的cDNA3′-末端序列。将5′-端序列(SEQ ID NO：10)、基因片段(SEQ ID NO：3)与3′-端序列(SEQ ID NO：11)进行拼接，整合后得到含有poly A尾部结构的、完整的cDNA拼接序列，长度为3750bp(SEQ ID NO：8)。

DNAStar分析表明，在完整的cDNA序列3464bp处发现终止密码子taa；3676-3699bp处发现poly A转录终止信号，其余序列为3′-端非翻译区。分析表明完整的ORF序列长度为2676bp(SEQ ID NO：12)。

4)全长cDNA的序列扩增

根据拼接完整的cDNA序列设计全长引物，扩增区域不包括cDNA的非翻译区。

正向引物FP：5′GGGGTTTTATACTTTTTGGGGTTGC 3′(SEQ ID NO：6)，

反向引物RP：5′AGACTTGGCCCTTCCTCGTCTTTAG 3′(SEQ ID NO：7)

反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3min，进行35个循环，然后72℃延伸10min。

全长cDNA的扩增：提取茄子的总RNA，用引物FP、RP按常规方法进行RT-PCR反应。结果有明亮的特异性条带出现如图4所示，约为3000bp，将之回收并克隆。经测序得到2911bp的特异片段，测序结果与拼接而成的序列一样。ORF Finder分析：整个序列编码1个完整的ORF(SEQ ID NO：12)。表明茄子生长素响应因子基因SmARF8的全长序列已经克隆获得。条带用PCR产物纯化试剂盒将特异性扩增片段回收，与pMD-19T载体连接，转化大肠杆菌(E.coli)DH5α。对候选克隆进行PCR鉴定，筛选出阳性重组子，送北京华大基因公司进行测序，获得茄子生长素响应因子基因SmARF8(SEQ ID NO：8)，其全长为3750bp。

实施例2全长cDNA序列及结构域分析

新克隆的茄子SmARF8序列全长3750bp，开放阅读框2676bp，编码891个氨基酸，其氨基酸序列与拟南芥的ARF8一致性为54.7％，与水稻的OsARF8一致性为68.2％；氨基酸序列与番茄的S1ARF8一致性达到54.4％。

SmARF8蛋白氨基酸序列分析表明，与拟南芥ARF8基因一样，具有这个家族基因序列的典型特征。我们将水稻OsARF8、拟南芥ARF8、黄瓜CsARF3、番茄S1ARF8及茄子SmARF8基因氨基酸序列用clustW 1.83程序进行同源保守域分析，再用Gendoc分析。ARFs家族基因在N-末端含有一个300aa左右的保守域，它在ARF1基因中验证具有DNA结合域的功能(Ulmasov T，Hagen G，Guilfoyle TJ.1997a.ARF1，a transcription factor that bindsto auxin response elements.Science.1997 Jun 20；276(5320)：1865-1868)，被称为DNA-结合域(DBD)，能跟生长素响应基因AuxRES的启动子序列中的保守回文重复序列TGTCNC特异结合。氨基酸序列保守性分析结果如图5表明，新克隆的茄子SmARF8基因在N-端序列与其他物种的这段保守域同源性非常高，含有一个完整的N-端DNA-结合域。拟南芥的ARFs家族基因除了ARF3和ARF17外，都拥有一个C-末端保守域(CTD)，它含有与Aux/IAA蛋R白中的区域III和IV相似的保守域，具有蛋白互作功能，能使ARF和Aux/IAA蛋白形成同源或异源二聚体(Ulmasov T，Murfett J，Hagen G，Guilfoyle TJ(1997b)Aux/IAA proteinsrepress expression of reporter genes containing natural and highly active syntheticauxin response elements.Plant Cell 9：1963-1971；Ulmasov T，Hagen G，Guilfoyle TJ.1999a.Dimerization and DNA binding of auxin response factors.Plant J19：309-319b.，Tom J.Guilfoyle，and Gretchen Hagen.Auxin Response Factors.J Plant Growth Regul，2001，20：281-291.)。而ARFs家族基因含有同样的两个保守域III和IV，表明他们也是生长素的响应基因。茄子SmARF8基因同样拥有非常保守的CTD，同源性分析结果显示与其他物种的CTD域几乎一致。SmARF8基因在DNA结合域和C-末端之间的区域是不保守的，但是富含脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基。在这个区域并具有转录因子的特征区域核定位序列PQRNKRPR。表明它具有ARFs家族基因的典型特征。SmARF8拥有与ARF8一致的保守功能域，表明该基因具有调控单性结实的功能。

实施例3不同物种ARF家族基因的系统进化树分析

为了比较克隆得到的茄子SmARF8基因与其他物种ARFs家族基因的亲缘关系，分别下载拟南芥、水稻、黄瓜和番茄中已经公布的ARFs家族基因序列。以各基因的全长氨基酸序列进行联配，并用phylip软件构建成系统进化树。结果如图6所示，可见SmARF8基因与ARF8、OsARF8、S1ARF8、CsARF3、CsARF4、OsARF6a、OsARF6b聚集在一个分支上，其他基因与他们都没有聚集在一起。表明他们的亲缘关系非常近。其中与调控拟南芥单性结实的基因ARF8亲缘关系非常密切，表明该基因具有调控单性结实的功能。

实施例4利用SmARF8构建植物表达载体

以茄子cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，所用引物为P-U(SEQ ID NO：13)，P-L(SEQ ID NO：14)：

P-U：5′CAGTTTCAACATCAACAGCGAACC3′

P-L：5′ACAAATGGAGTAACCCGAGAAG3′

其反应条件为：P-U和P-L引物分别为2μl(10μmol·L-1)，5μl Taq Buffer(10×)，1μl dNTPs(2.5mmol·L-1)，Taq酶2U，加ddH2O至50μl。反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，然后72℃延伸10min。将特异性扩增片段回收，分别以正向、反向锚定连接到pBSSK-in载体的内含子结构2端，构建含目的序列反向重复结构的RNA干涉中间载体。对候选克隆进行PCR鉴定，筛选出阳性重组子。将含有内含子结构和正反基因片断的载体片断克隆到含超强启动子的35S-1300表达载体，然后电击法将载体转化到根癌农杆菌。

实施例5利用构建植物表达载体转化茄子的方法(农杆菌介导法)

将转化有1300-SmARF8干涉表达载体的农杆菌单菌落，在YEP液体培养基中培养过夜，直到菌液OD₆₀₀值为0.1。菌液离心后，沉淀用MS基本培养基重新悬浮。杭州红茄叶片或者子叶外植体在MS培养基上预培养2天，在农杆菌悬浮液中浸润5分钟，在无菌滤纸上沥干，然后重置回预培养的瓶子中继续培养48小时后，转移到含有卡那霉素和氯霉素的MS选择培养基上生长，获得愈伤组织。将愈伤组织转移到不含NAA的MS培养基上培养，经茎分化和伸长后，然后在V3培养基上进行生根培养，获得茄子SmARF8基因被干涉表达的能单性结实的转基因植株。

序列表

<110>浙江省农业科学院

<120>一种植物单性结实调控基因及其应用

<130>参见说明书内

<160>14

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>引物1

<400>1

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>引物2

<400>2

<210>3

<211>477

<212>DNA

<213>茄子基因片段

<400>3

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>5′-RACE引物

<400>4

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>3′-RACE引物

<400>5

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>正向引物

<400>6

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>反向引物

<400>7

<210>8

<211>3750

<212>DNA

<213>茄子生长素相应因子基因全长序列

<400>8

<210>9

<211>891

<212>PRT

<213>茄子生长素相应因子氨基酸序列

<400>9

<210>10

<211>1686

<212>DNA

<213>5’-RACE扩增片段

<400>10

<210>11

<211>2207

<212>DNA

<213>3′-RACE扩增片段

<400>11

<210>12

<211>2676

<212>DNA

<213>ORF编码阅读框序列

<400>12

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>P-U引物1

<400>13

<210>14

<211>22

<212>DNA

<213>P-U引物2

<400>14

Claims (10)

1.一种DNA序列，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。

2.根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列来自茄子。

3.根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列为调控单性结实的生长素响应因子基因。

4.根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列编码序列表中SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

5.一种植物表达载体，其特征在于，其含有权利要求1至3中任一项的DNA。

6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体为pBSSK-in载体。

7.一种转基因植物，其特征在于，所述转基因植物含有权利要求所述的1至3中任一项的DNA。

8.根据权利要求7所述的转基因植物，其特征在于，将权利要求5所述的载体用电击法转化到农杆菌中，利用农杆菌介导法将所述载体转化到植物中。

9.根据权利要求7至8所述任一项的转基因植物，其特征在于，所述转基因植物为茄子。

10.根据权利要求7至8所述任一项转基因植物，其特征在于，所述转基因植物是含有调控单性结实的生长素响应因子基因的转基因茄子。

Images