CN102787124A

CN102787124A - 一个番茄果实成熟基因SlNAC3及其应用

Info

Publication number: CN102787124A
Application number: CN2012102964623A
Authority: CN
Inventors: 韩芹芹; 高凯; 宋玉竹; 夏雪山
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2012-08-21
Filing date: 2012-08-21
Publication date: 2012-11-21

Abstract

本发明公开了一种番茄果实成熟基因SlNAC3及其应用，番茄SlNAC3基因具有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列或编码如SEQIDNO.2所示氨基酸序列的蛋白质；具有典型的NAC家族保守结构域，编码NAC蛋白；本发明采用功能基因组学相关技术证实番茄SlNAC3基因在番茄果实成熟中发挥重要作用。将本发明果实成熟基因SlNAC3构建到植物表达载体上并转入番茄中干涉表达，转基因番茄会表现出果实成熟延缓的能力，可以直接用于生产中控制果实的成熟进程。

Description

一个番茄果实成熟基因SlNAC3及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程领域，具体是从番茄 (Solanum lycopersicum ) 中获得一个新的果实成熟基因SlNAC3及其应用。

背景技术

植物转录因子的研究是功能基因组学研究中的一个重要内容。在植物特异蛋白中，转录因子占到13% (Bapat VA, Trivedi PK, Ghosh A, Sane VA, Ganapathi TR, Nath P. Ripening of fleshy fruit: Molecular insight and the role of ethylene. Biotechnol Adv, 2010, 28: 94–107)。植物转录因子主要分为MYB、bZIP (basic-domain leucine-zipper)、WRKY、DREB (dehydration responsive element binding protein)、NAC等。其中，NAC 转录因子是近年来新发现的具有多种生物学功能的特异转录因子 (冶晓芳，唐益苗，高世庆，杨颖，刘美英，王永波，赵昌平. 植物NAC 转录因子的研究进展. 生物技术通报, 2009, 10:20-25)。其命名是基于最初发现的该家族的几个基因NAM (NO APICAL MERISTEM）、ATAF1-2、CUC2 (CUP-SHAPED COTYLEDON) (Gutierrez RA, Green PJ, Keegstra K, Ohlrogge JB. Phylogenetic profiling of the Arabidopsis thaliana proteome: what proteins distinguish plants from other organismsGenome Bio, 2004, 5:53) 首字母的缩写。目前，在拟南芥基因组中已发现了109 个NAC 转录因子(Yamasaki K, Kigawa T, Inoue M, Watanabe S, Tateno M, Seki M, Shinozaki K, Yokoyama S. Structures and evolutionary origins of plant-specific transcription factor DNA-binding domains. Plant Physiology and Biochemistry, 2008, 46:394-401)，水稻中发现了75 个NAC 转录因子，在其他植物如小麦、大豆、玉米、油菜、棉花、甘蔗等中都相继发现了NAC 转录因子。NAC 转录因子在调控植物生长发育、逆境胁迫应答、生长素传导叶片凋亡等中都起着重要的作用 (冶晓芳，唐益苗，高世庆，杨颖，刘美英，王永波，赵昌平. 植物NAC 转录因子的研究进展. 生物技术通报, 2009, 10:20-25)。除此之外，NAC 基因在次生壁加厚和维管组织的形成中也发挥重要作用。NST1 (NAC Secondary Wall Thickening Promoting Factors) 和NST2在花药开裂中有功能冗余性，这两者的突变体都会导致花药内壁的次生壁无法正常加厚 (Pirrello J, Regad F, Latche A, Pech JC, Bouzayen M. Regulation of tomato fruit ripening. CAB Reviews, 2009, 4:051)。NAC 家族成员—NON RIPENING (NOR) 突变后，番茄果实不能正常成熟 (Matas AJ, Gapper NE, Chung MY, Giovannoni JJ, Rose JK. Biology and genetic engineering of fruit maturation for enhanced quality and shelf-life. Curr Opin Biotechnol, 2009, 20:197-203)，显示转录因子NAC 在调控浆果类果实的成熟过程中也有重要功能。

番茄等浆果类蔬菜在储藏、运输和销售的过程中，很容易软化腐烂，给商业生产带来极大的经济损失。因此通过育种的方式控制其成熟度和硬度是目前蔬菜生产中亟待解决的问题。与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也高，但是具有常规育种所不具备的优势。主要体现在：转基因育种技术体系的建立使可利用的基因资源大大拓宽；转基因育种技术为培育高产、优质、高抗，适应各种不良环境条件的优良品种提供了崭新的育种途径；另外，利用转基因育种技术可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择，同时随着对基因认识的不断深入和转基因手段的完善，对多个基因进行定向操作也将成为可能，这在常规育种中是难以想象的；除此之外，转基因技术可以大大提高选择育种效率，加快育种进程，显示了常规育种无可比拟的优势。

番茄是研究浆果类果实的一种模式植物。本发明就是利用转基因育种技术，从番茄野生型Ailsa Craig中克隆得到一个新的NAC成员—SlNAC3。干涉SlNAC3的转基因番茄显示果实成熟进程变慢，通过合理利用这种转基因材料可以调节番茄的上市时间，为生产服务。

发明内容

本发明的目的是提供一种番茄果实成熟基因SlNAC3，其具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质；其具有典型的NAC家族保守结构域，编码NAC蛋白。

本发明另一目的是将番茄果实成熟基因SlNAC3应用在控制番茄以及其他呼吸跃变型果实（呼吸跃变型果实是指某些肉质果实从生长停止到开始进入衰老之间的时期，其呼吸速率的突然升高，例如苹果、香蕉、番茄、鳄梨、芒果等）成熟进程中；具体是将基因SlNAC3构建到植物表达载体上并导入番茄中表达，对分别获得的SlNAC3超量和干涉转基因番茄进行果实成熟相关生理生化和分子生物学检测，确认SlNAC3可以改变番茄果实的成熟进程，为后期利用该基因改良番茄以及其他呼吸跃变型果实成熟进程的能力奠定基础。

本发明分别分离克隆番茄Ailsa Craig中携带的一个番茄果实成熟基因的完整cDNA片段和C-端特异性末端序列片段，利用农杆菌介导法使目的基因转入受体植物中并分别超量表达和干涉表达，进而通过实验验证该基因在番茄果实成熟过程中所起的作用，为后期利用该基因改良番茄以及其他呼吸跃变型果实成熟进程的能力奠定基础。

对SlNAC3基因进行序列分析，结果表明SlNAC3全长cDNA为1318bp，具有990bp的开放阅读框(ORF)，201bp的5’非翻译区和390bp的3’非翻译区，编码含有329个氨基酸的蛋白质。蛋白质预测大小为37KD，其N端序列包括160个氨基酸，位于16-176位氨基酸。SlNAC3编码蛋白具有NAC家族的保守结构域，与来自苹果 (Malus domestica)、桃 (Prunus persica)和香瓜 (Cucumis melo) 以及其他物种的NAC蛋白高度相似，分析显示该序列N端有5个保守的NAC结构域。干涉表达SlNAC3 C-端特异性末端可以显著延迟番茄果实成熟的进程。

上述基因可以用于控制番茄和其他呼吸跃变型果实的成熟进程，具体操作如下：

（1）基因的获得：以番茄野生型Ailsa Craig为材料，提取果皮的总RNA，利用RT-PCR分别扩增得到SlNAC3 3’端特异性末端和全长基因序列，然后分别将其连接到pMD-18T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆。

（2）植物表达载体构建与遗传转化：

对序列进行酶切位点分析后，用BamHⅠ和XhoⅠ对带有目的基因全长片段的克隆载体和表达载体pBI121双酶切后进行连接，构建超量表达载体；利用SlNAC3-a和SlNAC3-b一对引物扩增SlNAC3基因的3’端特异性末端，PCR产物回收后通过BP反应，连接pHellsgate 2载体，构建干涉表达载体。

提取重组表达载体菌液的质粒，利用电转化法导入根癌农杆菌C58，利用农杆菌介导的遗传转化法转化番茄植株，对转基因植株进行抗生素（卡那霉素）筛选和RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) 筛选阳性转基因植株进行后续分析，以野生型和转化空载体的植株作为对照。

（3）转基因番茄果实成熟特性分析：将生长健壮的转基因植株和野生型植株(非转基因对照)，分别种植于花盆中。记录其果实达到成熟的时间，检测果实成熟相关指标（包括果实呼吸速率、果实乙烯释放速率和果实硬度等），从而验证SlNAC3干涉转基因番茄的果实成熟显著延迟。

本发明为控制番茄果实成熟进程提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育转基因植物能克服传统育种的不足，不仅育种周期短，而且操作简单。将SlNAC3基因在番茄中干涉表达，能够显著延缓果实成熟的进程，从而可以人为控制果实上市时间，并且不改变果实的口感特征，相比用人工激素处理果实更加绿色环保，效果也更加稳定，因而具有明显的优势和不可取代的重要性。它可以为呼吸跃变型果实大规模生产提供方便，可以合理调控果实上市时间，大量减少因果实过熟腐烂造成的损失，可为农业生产节约成本且提高管理水平，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1 是本发明SlNAC3全长片段（A）和3’端特异性片段（B）扩增结果示意图，其中：M是marker；

图2是本发明采用NPTII引物检测部分阳性转基因单株的电泳结果；其中：M是Marker；CK’是以非转基因的Ailsa Craig为模板的PCR产物；CK是以阳性质粒pMD-18T-SlNAC3为模板的PCR产物；1-8是转基因植株。

图3是本发明超量表达(SlNAC3^OE)和干涉表达(SlNAC3^RNAi)转基因番茄果实达到不同成熟时期（绿熟期MG，破色期Br，黄熟期Or，红熟期R）所需要的时间(开花后天数)比较结果示意图；其中WT为对照Ailsa Craig。

图4是本发明超量表达(SlNAC3^OE)和干涉表达(SlNAC3^RNAi)转基因番茄果实不同成熟时期（绿熟期MG，破色期Br，黄熟期Or，红熟期R）果实呼吸速率比较结果示意图；其中WT为对照Ailsa Craig。

图5是本发明超量表达(SlNAC3^OE)和干涉表达(SlNAC3^RNAi)转基因番茄果实不同成熟时期（绿熟期MG，破色期Br，黄熟期Or，红熟期R）果实乙烯释放速率比较结果示意图；其中WT为对照Ailsa Craig。

图6是本发明超量表达(SlNAC3^OE)和干涉表达(SlNAC3^RNAi)转基因番茄果实不同成熟时期（绿熟期MG，破色期Br，黄熟期Or，红熟期R）果实硬度比较结果示意图；其中WT为对照Ailsa Craig。

具体实施方式

下面结合附图，用本发明的实施例进一步说明本发明的实质性内容，但本发明保护范围不局限于所述内容；本发明中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1：SlNAC3全长基因和3’端特异性片段的克隆

用液氮将番茄Ailsa Craig红熟期果实的果皮研磨成粉末以后，转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA。采用逆转录酶M-MLV (天根)以总RNA为模板合成cDNA 第一链，反应体系和操作过程为：取5 μg 总RNA，依次加入50 ng oligo(dT) 15，2 μL dNTP (2.5mM each)，最后添加ddH₂O (无RNA酶)至反应体积为13.5 μL；混匀后，70℃加热变性5min后迅速在冰上冷却5min，然后依次加入4 μL 5×First-stand buffer、0.5 μL RNA酶抑制剂 (200U)、1 μL 反转录酶 (200U)、1 μL二巯基苏糖醇(0.1M)，混匀并短时离心，42℃温浴1.5h，取出后95℃加热5min，终止反应。cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cDNA为模板，扩增SlNAC3全长基因（引物序列为5’-CTCACAGCACACACACCATTTCTCT-3’和5’-CCAAATCCAGCAATCCCACTAATCT-3’）。采用大连宝生物的高保真DNA聚合酶ex taq扩增出目的基因，PCR反应条件：94℃ 3min；94℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 1.5min，28cycles；72℃ 5 min。反应体系(20 μL)为1 μL cDNA、2 μL 10×Buffer、0.4 μL dNTP (10mM each)、0.1 μL 正向引物(20μM)、0.1 μL 反向引物(20μM)、0.2 μL ex Taq DNA polymerase (5U/μL)、16.2 μL ddH₂O。PCR结束后，取5 μL用于琼脂糖凝胶电泳，检测扩增到目的大小的片段（如图1所示）。

将PCR得到的全长SlNAC3片段进行TA克隆，使用的试剂盒为pMD-18T vector kit (大连宝生物)，反应体系和操作过程为：取1.5 μL PCR产物，依次加入1 μL pMD18-T vector (50ng/μL) 和2.5 μL 2×Ligation solution I，混匀置于16℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中。在涂于含有β-半乳糖苷酶(X-Gal)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑选若干个白色菌落，摇菌后用扩增SlNAC3的特异引物鉴定插入方向正确的克隆载体。

对于PCR得到的3’端特异性片段，设计SlNAC3 3’UTR片段引物，直接在引物的前面加上attB位点（引物序列为5’-AAAAAGCAGGCT-(CGCTCTAGAACTAGTGGATC)-3’和5’-AGAAAGCTGGGT-(GTAAAACGACGGCCAGT) -3’）。反应条件如下：94℃ 2min；94℃ 15S; 70℃ 30s，68℃ 2min，30 cycles；68℃ 5min。然后以此PCR产物为模板，利用attB-adapter上下游引物（引物序列为5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3和5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’）进行第二次PCR反应。反应条件如下：94℃ 2min；94℃ 15S; 66℃ 30s，68℃ 2min，30 cycles；68℃ 7min。在PCR体系中添加1U的Taq 聚合酶，72℃孵育8min，得到具有3’poly (A)的产物。用琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，纯化回收。

实施例2：植物表达载体构建

超量表达载体构建：采用碱裂解法分别提取实施例1得到的克隆载体以及植物表达载体pBI121的质粒，取1μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性和浓度高低。用BamHI (Fermentas)和Xhol I (Fermentas)分别对质粒pMD-18T-SlNAC3和pBI121进行双酶切(100 μL体系)，反应体系和操作过程为：取10 μL pMD-18T- SlNAC3或pBI121质粒、依次加入10 μL 10×Tango buffer、2 μL XbaI、2 μL SalI、76 μL ddH2O，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应。将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后对SlNAC3片段和pBI121大片段分别进行胶回收，整个过程使用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒 (上海生工)。具体操作流程为：切下含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶块置于1.5 mL离心管中，按400 μL/100 mg琼脂糖凝胶的比例加入Binding Buffer Ⅱ，置于60℃水浴10min，使胶彻底融化；将融化的凝胶溶液转移至2 mL收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min后离心1min (6,000g/min)；取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，再将UNIQ-10柱放入收集管中，加入500 μL Wash Solution，室温离心1min (8,000g/min)，再重复此步骤一次；取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，再将UNIQ-10柱放入收集管中，室温离心2min (12,000g/min)；取下UNIQ-10柱放入新的1.5 mL离心管中，在膜中央加入预热的20 μL Elution Buffer，室温放置2min，室温离心1min (12,000g/min)，离心管中收集液体即为回收的DNA片段。取1 μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。

利用T4 DNA Ligase (大连宝生物)，将回收的SlNAC3片段和pBI121载体片段连接起来，反应体系(20 μL)和操作过程为：取10 μL SlNAC3 DNA片段依次加入2 μL pBI121载体DNA、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、5 μL ddH2O，混匀后短时离心，置于16℃金属浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50mg/L卡那霉素(kanamycin，Km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增SlNAC3的特异引物进行PCR，挑选出SlNAC3与pBI121成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入适量甘油并置于-80℃保存备用。

用碱裂解法提取并纯化上述大肠杆菌中的pBI121- SlNAC3质粒。并制备农杆菌C58菌株的感受态细胞，操作过程为：将实验室保存的C58菌株在LB固体培养基(含利福平20mg/L)上划线，28℃培养至长出单菌落后，挑取一个单克隆于含20mg/L利福平的2 mL LB液体培养基，28℃振荡培养至混浊；取5 mL菌液转接于含20mg/L利福平的100 mL LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；4℃离心5min (5,000g/min)收集菌体，弃上清，加入10 mL预冷的0.1M CaCl₂，轻轻充分悬浮菌体，冰浴20min；接着4℃离心5min (5,000g/min)收集菌体，弃上清，加入4 mL预冷的含15%甘油的0.1M CaCl₂溶液，充分悬浮后分装于1.5 mL离心管中，每管200 μL，液氮速冻后置于-80℃保存备用。

干涉表达载体构建：SlNAC3 3’UTR片段的PCR产物回收后，溶于TE缓冲液，进行BP反应。反应体系中包括PCR产物50-100 ng，pHellsgate 2载体2 μL，5*BP克隆酶反应缓冲液4 μL，BP克隆酶混合物4 μL，补充TE缓冲液（PH8.0）至20 μL。反应体系置25℃温育16 h后加入2 μL蛋白酶K溶液，37℃温育10 min以终止BP反应。从而获得携带有反向重复目的基因的片段。筛选阳性克隆。

采用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体（超量表达和干涉表达载体）转入所制备的农杆菌C58感受态细胞中。操作步骤为：取2 μg 表达载体质粒加入含有200 μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5min，接着转入液氮中冷冻1min，然后迅速置于37℃水浴5min，之后立即冰浴2min，加入800 μL LB液体培养基，28℃振荡培养4h。将活化后的农杆菌涂于含有50mg/L 卡那霉素的LB固体培养基上，28℃静止培养。挑选单菌落摇菌，用扩增SlNAC3的特异引物进行PCR，检测表达载体是否转入农杆菌中。对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：番茄的遗传转化

采用的遗传转化体系为农杆菌介导的遗传转化方法，农杆菌菌株是C58，转化受体材料是番茄野生种Ailsa Craig。将番茄饱满的种子经过次氯酸钠溶液(有效氯含量2%) 浸泡15 min，然后将种子用蒸馏水洗净播于1/2 MS的培养基上，置25℃，光周期为16 h光/8 h暗的条件下进行培养，至无菌苗长至7-9 d时切取子叶，在1/2 MS的培养基上暗培养一天。取重悬浓度为OD600≈0.5的农杆菌浸染叶片5 min，用灭菌滤纸将多余菌液吸干后重新放置在铺有滤纸的预培养基上，暗培养2 d后转移至筛选培养基 (基础培养基MS+玉米素2.0 mg/L+ 卡那霉素100 mg/L + 头孢100 mg/L) 对叶片进行分化培养，两周继代一次，等形成愈伤组织后转移至筛选培养基 (基础培养基MS+玉米素0.2 mg/L+卡那霉素100 mg/L + 头孢霉素100 mg/L)，至抗性芽长到一定大小后将其切下放入生根培养基中使其生根，把生根后的抗性苗转移至灭菌的基质中驯化培养一周，最后将番茄苗转移至温室或大棚中栽培。

实施例4：转基因番茄植株的PCR阳性检测

再生幼苗移栽成活后，提取转基因单株以及对照Ailsa Craig的幼嫩叶片总RNA，逆转录生成第一链cDNA，Ailsa Craig的cDNA作为阴性对照，用表达载体所含NPTII引物（引物序列为5’-AGACAATCGGCTGCTCTGAT-3’以及 5’-TCATTTCGAACCCCAGAGTC-3’）对得到的转基因材料进行阳性检测。PCR反应总体系为25 μl，包含1 × PCR buffer (含Mg²⁺)、dNTPs 0.38 mmol/l、正反向引物各0.62 μmol/L、Taq酶1.2 U、模板约60 ng。反应程序为95 ℃预变性5 min、94 ℃ 45 s、58 ℃ 45min、72 ℃ 1.5 min，33个循环，72 ℃ 延伸10 min。最终的PCR产物用浓度为0.8 %的琼脂糖凝胶电泳进行分析，凝胶成像系统对电泳图谱进行观察并记录（图2所示），选择阳性转基因植株。

实施例5：果实开花后成熟时间统计

在番茄材料开花后进行人工辅助授粉并挂牌标注日期，统计不同转基因材料达到果实不同成熟时期（绿熟期，破色期，黄熟期和红熟期）的时间（用番茄开花后天数DPA计量）（如图3所示）。干涉表达转基因番茄的果实成熟相比对照AC显著延迟，最终成熟时间比对照番茄Ailsa Craig延迟了26天。这说明干涉SlNAC3基因以后番茄果实的成熟进程显著延迟；而超量表达转基因番茄的成熟时间与对照番茄Ailsa Craig相比较，成熟进度变快，但是差异不显著。

实施例6：果实呼吸速率的检测

对转基因果实成熟期进行观察，并随机采摘转基因材料和对照果实绿熟期，破色期，黄熟期和红熟期的果实，采用CEA-800型红外线CO2分析仪测定果实的呼吸强度，结果表示为CO2 ml/kg/h，每时期每样品测定三个果实，并做三次生物学重复（如图4所示）。结果显示，超量表达转基因番茄和对照番茄Ailsa Craig在果实成熟的过程中，都有一个呼吸释放的高峰，显示了呼吸跃变型果实的典型特征；然而在干涉转基因番茄果实发育成熟的整个过程中，呼吸速率都没有发生显著的变化，没有呼吸跃变高峰的出现。表明SlNAC3基因被干涉以后，其果实成熟进程受阻。

实施例7：果实乙烯释放的测定

随机采摘转基因材料和对照不同成熟期果实进行乙烯测定。用聚丙烯薄膜将果实密封后置于25℃ 48h，用注射器从中吸取1ml气体，注入气相色谱仪 (Agilent 6890N, USA) 检测乙烯含量，记录出峰时间和峰面积，并与标准乙烯对比计算样品的乙烯释放量，以ul/L表示。每时期每样品测定三个果实，并做三次生物学重复（如图5所示）。检测结果与实施例6的结果相似，超量表达转基因番茄和对照番茄Ailsa Craig在果实成熟的过程中，都有乙烯释放的高峰，而这也是呼吸跃变型果实的另一典型特征；然而在干涉转基因番茄果实发育成熟的整个过程中，乙烯释放速率都没有发生显著的变化。更充分的表明SlNAC3基因被干涉以后，其果实成熟进程受到抑制。

实施例8：果实硬度的检测

采取转基因和对照不同成熟时期的果实，用硬度计（Model GY-1, Cany Precision Instruments Co., Ltd, Shanghai, China）测定每个果实果顶和赤道对称的四个点，以柱形探头刺破5mm果皮时所消耗的力（N）表示（如图6所示）。结果表明在干涉表达转基因果实发育的前期，其果实硬度与对照番茄Ailsa Craig相比较没有显著差异，但到了果实发育的最终阶段果实硬度是对照的一半，表明干涉转基因番茄在发育的后期阶段软化速度降低。而超量表达转基因番茄的果实硬度与对照没有显著差异，随着果实的发育成熟果实硬度逐渐降低。这表明干涉转基因番茄果实的成熟软化受到抑制，而超量表达转基因番茄的成熟进程没有发生显著变化。上述实验结果表明，干涉表达SlNAC3基因可以显著抑制番茄果实的成熟进程。

序列表(SEQ ID)

<110> 昆明理工大学

<120> 一个番茄果实成熟基因SlNAC3及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1318

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<220>

<221> CDS

<222> (243)..(1235)

<400> 1

tctagaacta gtggatcccc cgggctgcag gaattcgatt gctgcaggct gattttctgt 60

atttttgtac tactaactca cagcacacac accatttctc tctctcttct aagctgaatt 120

ttcgtatcat acaatttact ctttctttct ttttttttat tattattttt attatatagt 180

tttataatca ggtcgctctg attaaatata tttgaaaatt tttatcaaat aatattgtgg 240

tc atg gag agt acc gat tca tca acc ggc tct cat cat caa cca caa 287

Met Glu Ser Thr Asp Ser Ser Thr Gly Ser His His Gln Pro Gln

1 5 10 15

ttg cca cct gga ttt cga ttt cat cca act gat gaa gag ctt gtg gtt 335

Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Val

20 25 30

cat tat ctt aag aaa aga gtt gcc tct gtt cct ctt cct gtt tct att 383

His Tyr Leu Lys Lys Arg Val Ala Ser Val Pro Leu Pro Val Ser Ile

35 40 45

att gct gaa gtt gat ctt tac aaa ttt gat cct tgg gaa cta cct gca 431

Ile Ala Glu Val Asp Leu Tyr Lys Phe Asp Pro Trp Glu Leu Pro Ala

50 55 60

gct aag gcg aca ttt gga gaa caa gaa tgg tat ttc ttc agt cca aga 479

Ala Lys Ala Thr Phe Gly Glu Gln Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg

65 70 75

gat aga aaa tat cct aac ggg gcg cgc cca aat agg gcg gca act tcc 527

Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ala Arg Pro Asn Arg Ala Ala Thr Ser

80 85 90 95

ggt tat tgg aag gct acc gga acc gac aag ccg gtg ctc acc gcc ggc 575

Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Thr Asp Lys Pro Val Leu Thr Ala Gly

100 105 110

ggg acc caa aaa gta ggt gtc aaa aag gca ttg gtg ttt tat ggt ggc 623

Gly Thr Gln Lys Val Gly Val Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Gly Gly

115 120 125

aaa cca ccc aaa ggg gtg aag aca aat tgg att atg cat gaa tat agg 671

Lys Pro Pro Lys Gly Val Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr Arg

130 135 140

ctt gct gat aat aaa aca aat aat aag ccc cct ggt tgt gac ctt gcc 719

Leu Ala Asp Asn Lys Thr Asn Asn Lys Pro Pro Gly Cys Asp Leu Ala

145 150 155

aat aaa aaa tca cta agg cta gat gat tgg gtt tta tgt agg att tac 767

Asn Lys Lys Ser Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr

160 165 170 175

aag aag aat aat act caa agg cca att gat cat gaa aga gat gat ttg 815

Lys Lys Asn Asn Thr Gln Arg Pro Ile Asp His Glu Arg Asp Asp Leu

180 185 190

aat att gat atg atg atg gga tca tca tca att cat cca tca tgt ata 863

Asn Ile Asp Met Met Met Gly Ser Ser Ser Ile His Pro Ser Cys Ile

195 200 205

cca aat tca atg tca atg cca aat ata ttt ggt caa cca aaa ata cca 911

Pro Asn Ser Met Ser Met Pro Asn Ile Phe Gly Gln Pro Lys Ile Pro

210 215 220

caa cta aaa tct tca aat ttt ggc act aca tta att cat gat caa aat 959

Gln Leu Lys Ser Ser Asn Phe Gly Thr Thr Leu Ile His Asp Gln Asn

225 230 235

ggc caa aat tta tat gaa ggt gga tca caa tat tct tca aaa agg cca 1007

Gly Gln Asn Leu Tyr Glu Gly Gly Ser Gln Tyr Ser Ser Lys Arg Pro

240 245 250 255

cta gca aat ttg tat tgg aat gat caa gat gga gga gct agt aac gat 1055

Leu Ala Asn Leu Tyr Trp Asn Asp Gln Asp Gly Gly Ala Ser Asn Asp

260 265 270

aat tct caa tca aca aaa agg ttt ttg aca gaa aat atg gaa gat gga 1103

Asn Ser Gln Ser Thr Lys Arg Phe Leu Thr Glu Asn Met Glu Asp Gly

275 280 285

tta aat atg aat gct cga gca gat gaa caa aat gga tct atc gta agt 1151

Leu Asn Met Asn Ala Arg Ala Asp Glu Gln Asn Gly Ser Ile Val Ser

290 295 300

ctt ctc agt caa caa caa gtt ctt ggg tct cta agt gaa gga gtt ttt 1199

Leu Leu Ser Gln Gln Gln Val Leu Gly Ser Leu Ser Glu Gly Val Phe

305 310 315

cga caa cct cat tca ggc atg aat tgg tac tct taa aatatcgaat 1245

Arg Gln Pro His Ser Gly Met Asn Trp Tyr Ser

320 325 330

tataatataa aaaaaatata cgatattatt ataccataca aattaaaggt gtttgattat 1305

tacaggatcc taa 1318

<210> 2

<211> 330

<212> PRT

<213> Solanum lycopersicum

<400> 2

Met Glu Ser Thr Asp Ser Ser Thr Gly Ser His His Gln Pro Gln Leu

1 5 10 15

Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Val His

20 25 30

Tyr Leu Lys Lys Arg Val Ala Ser Val Pro Leu Pro Val Ser Ile Ile

35 40 45

Ala Glu Val Asp Leu Tyr Lys Phe Asp Pro Trp Glu Leu Pro Ala Ala

50 55 60

Lys Ala Thr Phe Gly Glu Gln Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp

65 70 75 80

Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ala Arg Pro Asn Arg Ala Ala Thr Ser Gly

85 90 95

Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Thr Asp Lys Pro Val Leu Thr Ala Gly Gly

100 105 110

Thr Gln Lys Val Gly Val Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Gly Gly Lys

115 120 125

Pro Pro Lys Gly Val Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu

130 135 140

Ala Asp Asn Lys Thr Asn Asn Lys Pro Pro Gly Cys Asp Leu Ala Asn

145 150 155 160

Lys Lys Ser Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Lys

165 170 175

Lys Asn Asn Thr Gln Arg Pro Ile Asp His Glu Arg Asp Asp Leu Asn

180 185 190

Ile Asp Met Met Met Gly Ser Ser Ser Ile His Pro Ser Cys Ile Pro

195 200 205

Asn Ser Met Ser Met Pro Asn Ile Phe Gly Gln Pro Lys Ile Pro Gln

210 215 220

Leu Lys Ser Ser Asn Phe Gly Thr Thr Leu Ile His Asp Gln Asn Gly

225 230 235 240

Gln Asn Leu Tyr Glu Gly Gly Ser Gln Tyr Ser Ser Lys Arg Pro Leu

245 250 255

Ala Asn Leu Tyr Trp Asn Asp Gln Asp Gly Gly Ala Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ser Gln Ser Thr Lys Arg Phe Leu Thr Glu Asn Met Glu Asp Gly Leu

275 280 285

Asn Met Asn Ala Arg Ala Asp Glu Gln Asn Gly Ser Ile Val Ser Leu

290 295 300

Leu Ser Gln Gln Gln Val Leu Gly Ser Leu Ser Glu Gly Val Phe Arg

305 310 315 320

Gln Pro His Ser Gly Met Asn Trp Tyr Ser

325 330

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcacagcac acacaccatt tctct 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccaaatccag caatcccact aatct 25

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaaaagcagg ctcgctctag aactagtgga tc 32

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agaaagctgg gtgtaaaacg acggccagt 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agacaatcgg ctgctctgat 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcatttcgaa ccccagagtc 20

Claims

1.一种番茄果实成熟基因SlNAC3，其特征在于：其具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质。

2.权利要求1所述的番茄果实成熟基因SlNAC3在控制番茄以及其他呼吸跃变型果实成熟进程中的应用。