CN114634941A

CN114634941A - 陆地棉GhPP2Cs基因及其在植物矮化中的应用

Info

Publication number: CN114634941A
Application number: CN202210530963.7A
Authority: CN
Inventors: 郭惠明; 芦俊超; 张倩倩; 刘满; 吕依然; 程红梅
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Baoding Branch Biochemical Technology Co ltd
Priority date: 2022-05-16
Filing date: 2022-05-16
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2042-05-16
Also published as: CN114634941B

Abstract

本发明公开了陆地棉GhPP2Cs基因及其在植物矮化中的应用。本发明从陆地棉中分离得到GhPP2Cs基因，包括GhPP2C1基因、GhPP2C2基因或GhPP2C3基因，其CDS的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1‑SEQ ID No.3所示。本发明在棉花中分别沉默了GhPP2C1、GhPP2C2、GhPP2C3基因，结果发现沉默GhPP2C1和GhPP2C2基因后棉花植株出现了矮化表型，qRT‑PCR分析表明相比于对照植株来说，GhPP2C1和GhPP2C2基因的表达水平下降了65%‑70%。由此，本发明所提供的GhPP2C1和GhPP2C2基因能应用于降低棉花株高或培育棉花矮化新品种等方面。

Description

陆地棉GhPP2Cs基因及其在植物矮化中的应用

技术领域

本发明涉及植物蛋白磷酸酶2C基因，尤其涉及从陆地棉中分离的GhPP2Cs基因，本发明进一步涉及它们在植物矮化中的应用，属于棉花蛋白磷酸酶2C基因和应用领域。

背景技术

植物矮化，从宏观方面来讲，就是指植物相较于自身的物种来说所产生的一些矮小或者株高降低的表型特征，直观的体现在植物节间高度或者节间数目有明显的降低。在微观方面，植物细胞的伸长或者细胞的分裂受到了抑制，细胞数量和大小显著降低，影响植物的生长发育，导致植物矮化。

随着世界人口的不断增加和可使用耕地面积的不断减少，如何在有限面积内提高农作物的产量成为了首要亟待解决的问题。株高作为一种重要的农艺性状，不仅影响植物的株型结构、顶端优势和生物量，而且与农作物的产量息息相关（NIU Y, CHEN T, ZHAO C,et al. Improving crop lodging resistance by adjusting plant height and stemstrength [J]. Agronomy, 2021, 11(12): 2421）。上世纪在全球范围内掀起的"绿色革命"，就是引进了水稻和小麦的矮化种质，显著增加了作物的产量，缓解了当时的粮食危机给人们带来的压力。究其原因，作物的矮化可以提高植株的抗倒伏性、肥力耐受性，可以通过合理密植提高作物的群体光利用效率，进而提高作物的产量。尽管利用作物基因培育矮化作物的概念早已提出，但是由于矮化基因资源的匮乏、遗传转化技术的限制和产出作物的品质等原因，能够在农业上大规模种植的矮化品种还是相对较少。在农业种植和生产中，防止作物疯长使用最多的还是化学生长抑制剂。这类化学生长抑制剂如何让作物矮化的具体作用机制还不是很清楚，并且是否会在作物中残留进而影响到人们的身体健康也是个值得思考的问题。除此之外，化学生长抑制剂也可能会对土壤造成危害，对植物生长环境造成破坏等。因此，加快作物矮化基因的发掘和应用，培育出能够稳定遗传的作物矮化品种十分重要。

棉花（Cotton）作为世界上重要的油料作物和纺织作物之一，在世界农业生产和工业生产中占据重要地位。随着科技的发展，在农业上实现现代化是农业领域的巨大进步，而农业生产的全程机械化则是实现农业现代化的一个重要指标。在中国棉花的主要种植区，机械化越来越多的应用到棉花从播种到收获的各个环节中。特别是在中国新疆地区，由于天气较为干旱，水肥条件不足，光照时间长等原因，大部分地区的棉花种植密度很高，长此以往形成了“矮、密、早”的种植模式。矮化的棉花由于株高降低，株型较为紧凑，因此易于管理和机械化采收，显著降低了劳动强度和人工成本。并且，株高降低，避免了营养物质的长时间运输造成的损耗，使营养物质更加集中的运输到棉铃中，提高了整株的经济效益（王坤波, 刘正德. 试论棉花矮化育种 [J]. 中国棉花, 1996, 23(9): 2.）。在棉花中筛选矮化基因，研究棉花矮化的分子机制，培育具有优良性状的矮化棉花品种不仅能够丰富棉花矮化基因资源，而且对于提高棉花的产量也有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供从陆地棉中分离的GhPP2Cs基因；

本发明目的之二将所述的陆地棉中分离的GhPP2Cs基因应用于植物矮化。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：

本发明的一方面是提供了从陆地棉中分离的GhPP2Cs基因，包括GhPP2C1基因、 GhPP2C2基因或GhPP2C3基因：

其中，所述GhPP2C1基因的CDS的核苷酸序列为（a）或（b）或（c）所示：

(a)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID No.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；(c)与SEQ ID No.1的核苷酸序列至少有80%以上同源性的多核苷酸序列；优选的，与SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有85%以上同源性的核苷酸序列；更优选的，与SEQ ID No.1的核苷酸序列至少有90%以上同源性的核苷酸序列。

所述GhPP2C2基因的CDS的核苷酸序列为（a）或（b）或（c）所示：

(a)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID No.2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；(c)与SEQ ID No.2的核苷酸序列至少有80%以上同源性的多核苷酸序列；优选的，与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有85%以上同源性的核苷酸序列；更优选的，与SEQ ID No.2的核苷酸序列至少有90%以上同源性的核苷酸序列。

所述GhPP2C3基因的CDS的核苷酸序列为（a）或（b）或（c）所示：

(a)SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID No.3的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；(c)与SEQ ID No.3的核苷酸序列至少有80%以上同源性的多核苷酸序列；优选的，与SEQ ID No.3的多核苷酸序列至少有85%以上同源性的核苷酸序列；更优选的，与SEQ ID No.3的核苷酸序列至少有90%以上同源性的核苷酸序列。

本方面的另一方面是提供了一种使棉花矮化的方法，包括：敲除棉花中的GhPP2C1基因或GhPP2C2基因，或者使棉花中的GhPP2C1基因或GhPP2C2基因进行功能缺失突变；譬如，将GhPP2Cs基因编辑载体或GhPP2Cs基因敲除载体转化到棉花中，敲除棉花中的GhPP2C1基因或GhPP2C2基因或者使棉花中的GhPP2C1基因或GhPP2C2基因产生功能缺失突变，所得到的转基因棉花的生长表现出矮化。

本发明的又一方面是提供一种培育矮化棉花新品种的方法，包括：将GhPP2Cs基因编辑载体或GhPP2Cs基因敲除载体转化到棉花中，从所得到转基因阳性植物中筛选得到矮化棉花新品种。

相应的，本发明还提供了一种增加棉花株高的方法，包括：构建含有GhPP2C1基因或GhPP2C2基因的植物重组表达载体；将植物重组表达载体转化到棉花中，使GhPP2C1基因或GhPP2C2基因在棉花中进行过表达或超表达。

本发明公开了含有所述GhPP2Cs基因的重组载体；所述重组载体可以将GhPP2Cs基因进行敲除或突变的GhPP2Cs基因编辑载体或GhPP2Cs基因敲除载体，所述的所述重组载体也可以是GhPP2Cs基因的过表达载体。

本领域人员可以采用常规的基因编辑技术或基因敲除载体的构建方法构建GhPP2Cs基因编辑载体或GhPP2Cs基因敲除载体，或者按照本领域的常规构建方法构建含有GhPP2Cs基因的植物重组表达载体，这些方法均为本领域技术人员所熟练掌握，譬如将所述GhPP2Cs可操作的与表达调控元件相连接得到重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区，GhPP2Cs基因和3′非编码区组成；其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

在本发明中，可以采用任何植物转化方法将本发明所构建的重组植物表达载体引入到目标植物的细胞、组织或器官中，得到转化体；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到完整的植株及其无性系或其后代；所述的转化方法包括：农杆菌介导的转化、原生质体转化、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将编码基因提供给植物。利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株。

所述的目标植物包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。最优选的，所述的目标植物是棉花。

本发明还公开了含有所述GhPP2Cs基因的重组宿主细胞或重组菌；其中，所述重组菌包括但不限于重组大肠杆菌。

通过本发明所披露的方法获得的转基因植物细胞和植物也可以进一步用于后续的转化程序中，例如用来引入其它的嵌合基因。

本发明整体技术方案详述

本发明通过KEGG分析转录组数据，发现差异表达基因主要富集在植物激素途径，在此途径中发现了表达下调的5个陆地棉PP2C基因，命名为GhPP2C1-GhPP2C5。qRT-PCR分析表明，这些基因的表达水平相比于R15来说在L28和L30中显著降低，与转录组结果相一致。

本发明进一步在棉花数据库中检索了陆地棉中的PP2C基因，发现了265个可能的PP2C基因。进化关系分析表明陆地棉中PP2C基因可分为12个亚家族，39个陆地棉PP2C基因被分为A亚家族，转录组数据中GhPP2C1-GhPP2C4属于A亚家族成员。其中GhPP2C1-GhPP2C3与拟南芥A亚家族成员AtHAI1/2/3和AtAHG3亲缘关系更近。

本发明对GhPP2C1-GhPP2C3进行亚细胞定位预测，结果显示它们均定位在细胞核中。随后的亚细胞定位实验结果表明：GhPP2C2-GhPP2C3基因定位在细胞核中，GhPP2C1定位在细胞核和细胞膜中。理化性质分析GhPP2C1-GhPP2C4蛋白都是不稳定性蛋白，存在Ser、Thr磷酸化位点，二、三级结构主要是无规则卷曲。

本发明在陆地棉受体R15中分别沉默了GhPP2C1、GhPP2C2、GhPP2C3基因，结果发现沉默GhPP2C1和GhPP2C2基因后，棉花植株出现了矮化表型，qRT-PCR分析表明相比于对照植株来说，GhPP2C1和GhPP2C2基因的表达水平下降了65% -70%。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“重组植物表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

术语“转化”指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

附图说明

图1为GhPP2C基因在不同材料中的表达水平。

图2为GhPP2Cs基因亚细胞定位片段电泳检测；M：Marker III，1：GhPP2C1基因，2：GhPP2C2基因，3：GhPP2C3基因。

图3为GhPP2Cs基因大肠杆菌菌液PCR的电泳鉴定；A：GhPP2C1基因，B：GhPP2C2基因，C：GhPP2C3基因，M：Marker III，1-9：9个单克隆泳道。

图4为GhPP2Cs基因菌液PCR的电泳鉴定；A：GhPP2C1基因，B：GhPP2C2基因，C：GhPP2C3基因，M：Marker III，1-8：8个单克隆泳道。

图5为GhPP2Cs基因VIGS片段电泳检测；M：Marker III，1-2：GhPP2C1基因，3-4：GhPP2C2基因，5-6：GhPP2C3基因，P：阴性对照。

图6为GhPP2Cs基因大肠杆菌菌液PCR的电泳鉴定；A：GhPP2C1基因，B：GhPP2C2基因，C：GhPP2C3基因，M：Marker III，1-5：5个单克隆泳道。

图7为GhPP2Cs基因菌液PCR的电泳鉴定；A：GhPP2C1基因，B：GhPP2C2基因，C：GhPP2C3基因，M：Marker III，1-3：3个单克隆泳道。

图8为GhPP2Cs基因的亚细胞定位；GFP:绿色荧光蛋白，Bright: 明场，H2B: 核定位红色荧光蛋白，Merge: 融合场。Scale bars = 20 μm。

图9为在陆地棉受体R15中沉默GhPP2C1或GhPP2C1后的棉花表型分析；Bar =2 cm。

图10为沉默GhPP2C1和GhPP2C2后的棉花株高统计结果。

图11为qPCR检测GhPP2C1和GhPP2C2基因的表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实验例1GhPP2Cs基因的筛选及生物学信息分析

⒈实验材料

⑴植物材料

本实验室保存的陆地棉受体R15。

⑵实验试剂及耗材

棉花总RNA提取试剂盒为RNA Easy Fast Plant Tissue Kit，购自天根生化科技（北京）有限公司。RNA反转录以及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）所用试剂为HiScript III RTSuperMix for qPCR (+gDNA wiper)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

⒉实验方法

⑴GhPP2Cs基因的筛选

对转录组测序结果进行分析，筛选GhPP2Cs基因。

⑵GhPP2Cs基因的生物信息学分析

利用cottonFGD（https://cottonfgd.org/）中的南农陆地棉数据库获得陆地棉中所有GhPP2Cs的氨基酸序列。拟南芥80个AtPP2Cs 家族成员氨基酸序列可从拟南芥数据库（https://www.arabidopsis.org/）中获得。使用 CLUSTALX比对多个序列。系统发育分析采用在线网站iTOL（https://itol.embl.de/）和MEGA程序（7.0版）的邻接法完成。利用在线网站CELLO V.2.5（http://cello.life.nctu.edu.tw/）进行基因的亚细胞定位预测。利用在线网站ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析基因编码蛋白质理化性质。利用在线网站NetPhos（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php.NetPhos-3.1）分析蛋白磷酸化位点。利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）网站分析蛋白质的二级结构。利用Swiss Model（https://www.swissmodel.expasy.org/）网站分析蛋白质的三级结构。

⑶棉花总RNA的提取及cDNA的合成

①棉花总RNA的提取

取不同株系的棉花幼嫩叶片，使用液氮在研钵中将其迅速研磨成粉末，取100mg粉末进行棉花总RNA的提取。研钵、研磨棒和药勺均提前经过酒精灼烧灭菌处理。后续具体操作步骤参照RNA Easy Fast Plant Tissue Kit试剂盒步骤进行。RNA提取完成后，使用超微量分光光度计NanoDrop-2000检测RNA浓度， RNA可立即用于反转录合成cDNA或将提取的RNA于-80 ℃保存。

②cDNA的合成：按照本领域的常规方法合成cDNA。

⑷ qRT-PCR分析

使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂进行qRT-PCR分析，每组设置三个重复，棉花 ubq 基因用作内部对照，根据2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量。反应体系如下表1所示：

表1 qRT-PCR反应体系

按下列表2所述的条件进行qPCR反应：

表2 qRT-PCR反应条件

⒊实验结果

⑴GhPP2Cs基因的获得

对转录组数据进行分析，发现差异表达基因的KEGG富集分析主要富集在植物激素途径，并且在植物激素ABA信号通路中存在差异表达基因。通过进一步分析富集在ABA信号中的差异表达基因，发现了5个PP2C基因（Gh_A13G0184、Gh_D05G3907、Gh_D10G2305、Gh_D12G2424和Gh_D13G0010），分别命名为GhPP2C1、GhPP2C2、 GhPP2C3、GhPP2C4、GhPP2C5，它们的基因表达量在共同差异表达基因中被明显下调。

⑵GhPP2Cs基因的生物信息学分析

① GhPP2Cs家族成员的系统进化树分析

已知拟南芥中存在80个PP2C家族成员，被分为12个亚组。为了获得陆地棉中的所有PP2Cs家族成员，在棉花数据库（https://cottonfgd.org/search/）中的南农陆地棉基因组数据库中检索了关键词PP2C以及Protein Phosphatase 2C，

在陆地棉基因组中共发现了265个PP2C家族成员。将265个GhPP2Cs基因的氨基酸序列与拟南芥80个AtPP2Cs基因的氨基酸序列使用CLUSTALX软件进行序列比对，采用在线网站iTOL进行进化树的绘制，分析它们的进化关系。结果表明，陆地棉265个PP2Cs家族成员可分为12个亚组（A-L），其中A亚组存在39个PP2Cs家族成员，并且从转录组中获得的5个GhPP2C中，GhPP2C1-GhPP2C4是A亚组PP2C成员。

②GhPP2Cs家族A亚组成员的系统进化树分析

将拟南芥中A亚组9个PP2Cs家族成员与陆地棉A亚组39个PP2Cs家族成员进行系统进化树绘制，分析它们的进化关系。结果发现，GhPP2C1、GhPP2C2和GhPP2C3与拟南芥中的A亚组的PP2Cs家族成员AtHAI1/2/3和AtAHG3有着密切的关系。

③GhPP2Cs的亚细胞定位预测

亚细胞定位可以精确地观察到表达蛋白在细胞内的具体位置，判断其发挥功能的可能场所。使用亚细胞定位在线网站CELLO V.2.5对GhPP2C1-GhPP2C4基因的亚细胞定位进行了预测，亚细胞定位结果如表3所示。GhPP2C1、GhPP2C2、GhPP2C3编码蛋白可能定位于细胞核中，GhPP2C4编码蛋白可能定位于叶绿体中（*表示概率的显著性），暗示了GhPP2C可能在不同细胞场所发挥不同的功能。

表3亚细胞定位预测

⑶GhPP2Cs基因的qRT-PCR检测

在转录组数据中，GhPP2C1-GhPP2C4基因的表达量相比于转基因受体材料R15在L28和L30矮化材料中是显著下调的。使用qRT-PCR进一步验证了GhPP2C1-GhPP2C4基因在3种材料中的表达量，结果如图1所示：这些基因在R15中表达量最高，在L28和L30中表达量相对较低，这与转录组结果相一致。并且与R15相比，这些基因在L28和L30的表达分别下降了约40%-80%和60%-90%。

实验例2 GhPP2Cs基因的克隆及功能的初步分析

⒈实验材料

⑴植物材料

将R15棉花种植在含有营养土壤的花盆中，温室（25 ± 3°C，50%湿度，16小时光照/8小时黑暗）培养。烟草：本实验室保存的本氏烟草，播撒在营养土中，待发芽后一周移苗到单个花盆中。

⑵菌株与质粒

菌株：大肠杆菌：Fast-T1大肠杆菌感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。农杆菌：GV3101、EHA105农杆菌感受态细胞购自北京擎科生物科技有限公司，保存于-80 °C。细胞核定位Marker农杆菌H2B-mCherry由中国农业科学院生物技术研究所王磊研究员团队惠赠。

质粒：亚细胞定位所用质粒pCambia 1302由本实验室保存。VIGS质粒pTRV1（192）、pTRV2（156）以及pTRV-CLA1均由河北农业大学马峙英教授团队惠赠。

⒉实验方法

⑴棉花总RNA的提取及cDNA的合成

棉花总RNA的提取及cDNA的合成方法参考实验例1。

⑵GhPP2Cs基因的克隆与产物回收

GhPP2C1，GhPP2C2，GhPP2C3基因的CDS序列分别为SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。根据GhPP2C1，GhPP2C2，GhPP2C3基因的CDS序列，设计引物使用R15cDNA作为PCR扩增模板，扩增GhPP2C1-GhPP2C3基因片段用于亚细胞定位，扩增时需要去掉终止密码子，避免翻译提前终止，导致下游荧光信号GFP表达受阻。此外，根据序列设计针对不同基因的VIGS特异性引物，扩增特异性VIGS片段。PCR扩增体系如下表4所示，一些操作在冰上进行。

表4 PCR扩增反应体系

PCR反应程序如下表5所示：

表5 PCR扩增反应程序

取5 μL PCR产物，经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测目标条带大小是否正确，然后进行PCR产物的回收。PCR产物的回收使用TIANquick Midi Purification Kit进行。PCR产物回收完成后，吸出1 μL使用超微量分光光度计检测回收的DNA片段浓度与纯度，DNA应在OD₂₆₀处有显著吸收峰，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7-1.9，可将回收后的DNA片段存放于-20 °C冰箱中备用。

⑶质粒酶切回收与连接

分析pCambia 1302载体和pTRV2载体的多克隆位点，选择合适的酶切位点进行载体的酶切反应。使用NcoI-HF单酶切pCambia 1302质粒用于GhPP2C基因的亚细胞定位实验。使用XbaI-HF 和KpnI-HF双酶切pTRV2载体用于VIGS实验。将酶切后的载体片段与基因的片段经过无缝克隆的方法进行连接反应。

⑷重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞及单克隆的鉴定

⑸质粒提取

质粒提取方法参考TIANprep Mini Plasmid Kit试剂盒说明书进行。提取的质粒使用超微量分光光度计检测浓度与纯度，质粒DNA应在OD₂₆₀处有显著吸收峰，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7-1.9。

⑹质粒转化农杆菌感受态细胞

质粒转化GV3101农杆菌的电击法转化在超净工作台中进行，质粒转化EHA105农杆菌的热激法转化在超净工作台中进行。

⑺亚细胞定位

（1）挑选生长状况良好、含有5片左右真叶的本氏烟草准备进行GhPP2C1- GhPP2C3基因的亚细胞定位实验。（2）活化菌株。将-80 °C保存的pCambia 1302空载、pCambia 1302-GhPP2C农杆菌、农杆菌P19和核定位Marker农杆菌H2B分别加入到含有50 μg/mL的Kan和50μg/mL的Rif的LB液体培养基中，在摇床（28 °C，200 rpm）中活化菌株。（3）重新吸取已经活化成功的菌液1 mL加入到20 mL含有50 μg/mL的Kan、50 μg/mL的Rif的LB液体培养基（含有15 μM的AS）中28 ℃、200 rpm扩大培养至OD₆₀₀= 0.5-0.6。（4）在离心机转速5000 rpm下将农杆菌菌液离心10分钟，弃掉上清，用渗透液（含10 mM MgCl₂，10 mM MES pH = 5.6，150 μM AS）悬浮农杆菌菌体至OD₆₀₀ = 1.2，室温静置2-3h。（5）将含pCambia 1302和pCambia1302-GhPP2C的农杆菌悬浮液分别与P19农杆菌和H2B农杆菌悬浮液等体积混合。（6）选取生长状况良好的烟草叶片，用注射器将悬浮液轻轻注射到烟草叶片背面。以绿色荧光蛋白pCambia 1302-GFP为对照，以H2B-mCherry作为核定位信号标记。在21°C暗培养16小时后转为8小时光照培养。注射两天后，使用LSM 700共聚焦显微镜观察烟草注射区域的荧光信号。

⑻VIGS实验

VIGS在多种植物中被认为是研究基因功能和基因组学功能的一种有效工具，目前被广泛应用。为了研究沉默GhPP2C1、GhPP2C2和GhPP2C3是否影响棉花的株高，进行了如下的VIGS实验：

（1）活化菌株：将-80 °C保存的含pTRV2（空载）、pTRV2-GhPP2C、pTRV2-CLA1和192的农杆菌菌液加入到含有50 μg/mL的Kan和50 μg/mL的Rif的LB液体培养基中，在摇床（28°C，200 rpm）中活化菌株。（2）吸取已经活化成功的菌液加入到含有50 μg/mL的Kan、50 μg/mL的Rif的LB液体培养基（此培养基含有10 mM的MES pH = 6.5和20 μM的AS）中28 ℃、200rpm扩大培养至OD₆₀₀= 1.2。（3）4℃，5500 rpm离心10 min。（4）弃掉上清保留沉淀的菌体，并用无菌水重悬，离心清洗两次。（5）用渗透液（含有10 mM MgCl₂，10 mM MES pH = 5.6，20μM AS）悬浮农杆菌菌体至OD₆₀₀= 1.2。（6）室温静置3 h。（7）侵染前，将缓冲液重悬的pTRV2（空载）、pTRV2-GhPP2C、pTRV2-CLA1菌株悬浮液分别与pTRV1（192）的菌株悬浮液等体积混合均匀。（8）农杆菌菌液的接种：采用叶片针筒浸润法，选取生长状况良好且只长出两片子叶的棉花幼苗。先用注射器针头轻轻刺破子叶背面造成微伤口，不要刺穿叶片，然后用去针头的注射器从背面伤口处注入菌液，使两片子叶完全被浸透。不作处理的植株作为对照。

注射植物类型如下：

pTRV1+pTRV2：实验负对照。

pTRV1+CLA1：出现白化表型，说明VIGS结果可信：实验正对照。

pTRV1+ pTRV2-GhPP2C：实验组材料。

（9）基因沉默后植株的培养：基因沉默接种后的植株先置于23 °C黑暗培养24 h，然后在16 h/8 h光/暗周期、温度23 °C下培养3-4周后观察表型并检测基因沉默效率。

⑼ qRT-PCR分析

VIGS沉默GhPP2C基因的表达后，qRT-PCR分析基因的沉默效率，具体方法可参考实验例1的有关内容。

⒊实验结果

⑴GhPP2Cs基因的克隆与分析

①GhPP2Cs基因亚细胞定位载体的构建

提取R15棉花总RNA后，以反转录的cDNA为模板，以1302-GhPP2C1-F和1302-GhPP2C2-R、1302-GhPP2C2-F和1302-GhPP2C2-R、1302-GhPP2C3-F和1302-GhPP2C3-R为引物扩增GhPP2C1、GhPP2C2和GhPP2C3基因用于亚细胞定位的基因片段，电泳检测PCR扩增条带的大小，结果如图2所示。扩增出的基因片段的大小符合目标基因GhPP2C1、GhPP2C2和GhPP2C3片段的537 bp，1233 bp和1251 bp的预期，回收纯化PCR产物。

将pCambia 1302载体使用NcoI-HF单酶切，回收酶切产物，使用无缝克隆的方法将酶切后的pCambia 1302载体分别与PCR扩增的GhPP2C1、GhPP2C2和GhPP2C3基因片段相连接，转化Fast-T1大肠感受态细胞，待平板上长出单克隆后，挑取单克隆，使用pCambia 1302载体通用测序引物1302-F和1302-R进行菌液PCR验证，电泳检测PCR扩增条带的大小，结果如图3所示。由于使用的是载体通用测序引物，因此琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小会比目的片段大小稍大，分别为705 bp，1401 bp，1419 bp，符合预期结果。将鉴定结果为阳性克隆所对应的菌液吸取150 μL测序。待测序完成后，测序正确的菌液在摇床中过夜摇菌，第二天保菌并提取质粒。质粒提取完成后，热激法转化EHA105农杆菌感受态细胞，待2-3天后平板上长出单克隆后，挑取单克隆，使用pCambia 1302载体通用测序引物1302-F和1302-R进行菌液PCR验证，电泳检测PCR扩增条带的大小，结果如图4所示。经过琼脂糖凝胶电泳检测后，条带大小与转化大肠杆菌后的琼脂糖凝胶电泳结果相一致，大小分别为705 bp，1401bp，1419 bp。选择条带大小正确的农杆菌菌液在含有Kan和Rif抗生素的LB液体培养基中过夜摇菌，第二天使用甘油保菌，存放于-80 °C，GhPP2C1、GhPP2C2和GhPP2C3基因用于亚细胞定位的载体构建完成，准备进行亚细胞定位实验。

②GhPP2Cs基因VIGS载体的构建

在构建GhPP2Cs基因的VIGS载体时，首先对GhPP2C1、GhPP2C2和GhPP2C3基因的CDS片段进行序列比对，选择特异性的片段作为VIGS片段。根据序列比对结果，设计的用于VIGS实验的GhPP2C1、GhPP2C2和GhPP2C3基因的片段大小分别为327 bp，399 bp，399 bp。以R15棉花cDNA为模板，使用特异性的VIGS引物VIGS-GhPP2C1 F和VIGS-GhPP2C1 R、 VIGS-GhPP2C2 F和VIGS-GhPP2C2 R、VIGS-GhPP2C3 F和VIGS-GhPP2C3 R扩增GhPP2C1、GhPP2C2和GhPP2C3基因用于VIGS的基因片段，电泳检测PCR扩增条带的大小，结果如图5所示。扩增出的基因片段的大小符合预期结果，分别是327 bp，399 bp，399 bp，然后回收纯化PCR产物。

将pTRV2载体使用XbaI-HF和KpnI-HF双酶切，回收酶切产物，使用无缝克隆的方法将酶切后的pTRV2载体分别与PCR扩增的GhPP2C1、GhPP2C2和GhPP2C3基因VIGS片段相连接，转化Fast-T1大肠感受态细胞，待平板上长出单克隆后，挑取单克隆，使用pTRV2载体通用测序引物pTRV2-F和pTRV2-R进行菌液PCR验证，电泳检测PCR扩增条带的大小，结果如图6所示。由于使用的是载体通用测序引物，因此琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小会比目的片段大小稍大，分别为854 bp，926 bp，926 bp，符合预期结果。将鉴定结果为阳性克隆所对应的菌液吸取150 μL测序。待测序完成后，测序正确的菌液在摇床中过夜摇菌，第二天保菌并提取质粒。质粒提取完成后，热激法转化EHA105农杆菌感受态细胞，待2-3天后平板上长出单克隆后，挑取单克隆，使用pTRV2载体通用测序引物pTRV2-F和pTRV2-R进行菌液PCR验证，电泳检测PCR扩增条带的大小，结果如图7所示。经过琼脂糖凝胶电泳检测后，条带大小与转化大肠杆菌后的琼脂糖凝胶电泳结果相一致，大小分别为854 bp，926 bp，926 bp。选择条带大小正确的农杆菌菌液在含有Kan和Rif抗生素的LB液体培养基中过夜摇菌，第二天使用甘油保菌，存放于-80 °C。GhPP2C1、GhPP2C2和GhPP2C3基因用于VIGS的载体构建完成，准备进行VIGS实验。

⑵GhPP2Cs基因的亚细胞定位分析

对GhPP2Cs基因编码蛋白进行了亚细胞定位实验，结果如图8所示，GhPP2C1-GFP融合蛋白的GFP信号定位于细胞膜和细胞核，而GhPP2C2-GFP和GhPP2C3-GFP融合蛋白的GFP信号定位于细胞核，表明GhPP2C1- GhPP2C3主要在细胞核中发挥作用。作为对照的35::GFP融合蛋白定位于细胞膜和细胞核，H2B红色荧光蛋白作为定位于细胞核的Marker蛋白。

⑶GhPP2Cs基因沉默表型分析

对GhPP2C1- GhPP2C3基因进行了VIGS实验，结果如图9和10所示， GhPP2C1或者 GhPP2C2基因被沉默后的棉花植株生长速度明显低于不作处理的对照植株R15。统计学分析表明相比于对照植株R15来说，GhPP2C1或者 GhPP2C2基因被沉默后的棉花植株株高降低了大约25%。TRV::CLA1：沉默棉花GhCLA1基因，导致棉花产生白化的表型，用作阳性对照。GhPP2C3基因沉默后的植株由于没有表现出明显的表型差异，此后不再作为被研究的对象。

⑷GhPP2Cs基因沉默后转录水平的检测

提取对照植株R15、TRV::00以及沉默GhPP2C1或GhPP2C2基因后的棉花叶片的总RNA，qPCR检测GhPP2C1或GhPP2C2的表达量。结果如图11所示，结果表明GhPP2C1和GhPP2C2的表达量在基因沉默植株中明显低于对照，降低了约65%或70%。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 陆地棉GhPP2Cs基因及其在植物矮化中的应用

<130> BJ-2002-220404A-L

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 540

<212> DNA

<213> Cotton

<400> 1

atgaataaga agttcgtgga agatgaaaag gaacggccga agttcggaat ggcttccggt 60

tgtggaagta gacgagatat ggaagacgct gtttcgattc atccttcgct ttgtaaacaa 120

agctctcaag ttcaaatttc gtcggatatt cactttttcg gtgtcttcga cggccacggc 180

tgcactcatg ttgcgatgaa gtgtagagat cgatttcacg agatagtgaa aaaagaagtc 240

gaagcatgcg gcagtttgaa ggcggtggag tggaagaata cgatggagag aagctttgag 300

aggatggatg aagaagttag agaatggact gtaaacgcca aggagagttc tacctgccga 360

tgtgagcttc gaactccaca gtgcgacgcc gtcggatcca ccgccgtagt tgctataatc 420

accccggata atatcattgt cgctaattgc ggtgattctc gcgctgtttt gtgtcgaaat 480

ggtgccgctt tcccgctctc cgacgatcac aagccggatc gacccgatga attgctctga 540

<210> 2

<211> 1254

<212> DNA

<213> Cotton

<400> 2

atggcggaga tctgttacgg agttgtgagc gaaggcgaag catcaatacc gtgcgagccg 60

agttcacgtg cagcaaggag gcgtaggatg gagattagac gaattaaaat cgtcgacgtg 120

gctccatctg aagctgacaa cggccggaaa cgcaagaacc tgcaagctta cggagcatca 180

ttttctctgg actgtgaaaa cgctgtagaa aattgtgcct ccgatgagga cggaaaaaag 240

cgaactgtta aacctaaaaa tggaagacta aaaacgaaag gaacaataat gaaaagtaac 300

tcgagtccct cgcttttgat acctgaaatc gattcagagt tacatcctaa attcggtgtc 360

gcttcggttt gtggtaggag aagagacatg gaagacgccg tcgctattca tccgtctttc 420

catcgtcaag gccaggactc tgccgccatt ggcttccact attttggcgt ctatgatggt 480

cacggttgct ctcatgtggc gatgaggtgc agagagcgtt tacatgagct ggtgaaagaa 540

gagttggcca gtgaggagga atggaaaggt gctatggagc gtagcttcac gcgcatggat 600

aaggaagtga taaagtggaa cgagagcgtg gatggtgcta attgccgatg cgagttacag 660

tcacccgagt gtgatgcggt tggatctaca gctgttgtcg ctatcgtaac gcctgataaa 720

gttgttgttg ctaactgtgg tgattcgaga gctgttttgt gtcgtaacgg caggcctgtt 780

cctttatcgt ccgatcataa gccggatcgt ccggatgagc tgaaccggat ccaagaagcg 840

ggaggtcggg tcattttctg ggatggtcct cgagttctgg gagtcctcgc gatgtcaaga 900

gccataggtg ataactactt gaaaccctac gtgagctgtg agccggaggt tacagtaacg 960

gatcgaacgg cagaggacga atgtttgatt ctggcgagtg acggtttatg ggacgtggta 1020

tcaaatgata ctgcatgcgg ggtggcgcgc atgtgtttga ggggaaagtg tgatgtacag 1080

gcgccgctat tgtcaccgga aggagaggcg gttgtagggt cgatgatggg aggaggagag 1140

atcccggaca aggcgtgcgc tgatgcgtcc atgttgttga caaagctggc gttggccagg 1200

catagtacgg acaatgttag cgtagtcgtg gtggatctaa ggagagccac gtaa 1254

<210> 3

<211> 1236

<212> DNA

<213> Cotton

<400> 3

atggctggag tttgctgtgg agttgttcct gaaagtgaaa ctgcagctgc ggtcgaacaa 60

acatcgaaat catctcgtcg ccggagaatg gaagttcgtc cgtttaagtt tgtggctgac 120

gctgccgttc aaccgccgtc ggaaaacggc cggaaacgtc agaagcttga tctcgatctc 180

gtcctcccgg cttctcctcg tgactgtgat aacgctgttg agagctccgg tactaacaag 240

gttaacggag atcaggaaat taatgaaggt ttaaattcta atagaatagt agaattagaa 300

aaggaattgc cgaagtttgg tttgacttcc gtttgtggtc gacgacgaga tatggaagac 360

tccgtttcaa ttcatccgtc gttctgtaaa ctaaccagtg aagctcaaat ttcgtcggat 420

attcactttt tcgccgtgtt cgacggccat ggctgctctc atgttgcgat gaagtgtaga 480

gatcggtttc atgagatagt aaaagaagaa atcgaagcct gcggaggaga aaaggcggtg 540

gagtggaagc gaaccatgga gagaagcttt gagaggatgg atatggaagt tcaacaatct 600

acggtggact ccgtagagaa tccgaattgc cgatgcgaac tccaaactcc acagtgcgat 660

gccgtcggat ctaccgctgt ggttgccgtt gtcactcagg ataagatcat cgtagctaac 720

tgcggtgatt cccgcgctgt cttgtgccaa aacggcgtcg ctcttcccct ctccgacgat 780

cacaagccgg atcgacccga tgaactgctc cgaatcgaag aagccggtgg tcgagtaatt 840

tactgggatg gagctcgagt tcttggtgtt ttagccatgt caagagcaat aggtgataat 900

tatttaaagc ccttcgttat accagaacca gaggtaacaa taacagagag aagcagcaga 960

gatgaatgtt taatattagg aagcgatgga ctatgggacg tggtgacaaa cgagacagct 1020

tgtggggtgg cgcgtatgtg tttacgcgct caaaagccag catcaccacc tatgtctccg 1080

gatagtgacg cggtggttcg cggtgctgga gtggagagtt cggataaggc ttgttgggat 1140

gcttccattt tattaaccaa attggctttg gctagacata gtaccgataa cgttagtgtt 1200

gtcgttgttg atttgaagga aaatcaacag ttataa 1236

Claims

1.从棉花中分离的GhPP2Cs基因，其特征在于，包括GhPP2C1基因、GhPP2C2基因或GhPP2C3基因；

所述GhPP2C1基因的CDS的核苷酸序列为（a）、（b）或（c）所示：

(a)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID No.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；(c)与SEQ ID No.1的核苷酸序列至少有80%以上同源性的多核苷酸序列；

所述GhPP2C2基因的CDS的核苷酸序列为（a）、（b）或（c）所示：

(a)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID No.2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；(c)与SEQ ID No.2的核苷酸序列至少有80%以上同源性的多核苷酸序列；

所述GhPP2C3基因的CDS的核苷酸序列为（a）、（b）或（c）所示：

(a)SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID No.3的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；(c)与SEQ ID No.3的核苷酸序列至少有80%以上同源性的多核苷酸序列。

2.以权利要求1所述GhPP2Cs基因为靶基因构建的基因编辑载体或基因敲除载体。

3.含有权利要求2所述基因编辑载体或基因敲除载体的宿主细胞。

4.含有权利要求1所述GhPP2Cs基因的植物重组表达载体。

5.含有权利要求4所述植物重组表达载体的宿主细胞。

6.权利要求1所述的GhPP2Cs基因在使棉花矮化中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括：敲除棉花中的GhPP2C1基因或GhPP2C2基因，或者使棉花中的GhPP2C1基因或GhPP2C2基因进行功能缺失突变。

8.权利要求2所述的基因编辑载体或基因敲除载体在使棉花矮化中的应用。

9.一种矮化棉花品种的培育方法，其特征在于，包括：将权利要求2所述的GhPP2Cs基因编辑载体或GhPP2Cs基因敲除载体转化到棉花中，从所得到阳性转基因棉花中筛选得到矮化棉花新品种。

10.一种促进棉花长高的方法，其特征在于，包括：构建含有权利要求1所述GhPP2Cs基因的植物重组表达载体；将该植物重组表达载体转化到棉花中，使GhPP2Cs基因在棉花中进行过表达或超表达。